JPS59500812A - Thermostabilization of plasma proteins - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 補体系、すなわち免疫応答エフェクター機構は、宿主内における抗体／抗原複合 体の存在によって活性化される一連の蛋白質でろって、ある種の蛋白質加水分解 工程および蛋白質結合現象を開始させて宿主からの抗原の排除を促進する。補体 系の活性化に対する生理学的応答には急性９局所炎症、血管の拡張および間質空 間への体欣の浸出などがある。[Detailed description of the invention] The complement system, the immune response effector mechanism, regulates antibody/antigen complexes within the host. A series of proteins that are activated by the body's presence, resulting in certain types of protein hydrolysis The process and protein binding events are initiated to facilitate elimination of the antigen from the host. complement Physiological responses to activation of the system include acute local inflammation, vasodilation, and interstitial space. There is a seepage of the body into the space.

ヒトの補体系にはＣＪ’−コンポーネント、すなわち、セリンエヌテラーゼ（ｅ Ｊ−エヌテラーゼ）を含む蛋白質ザブコンポーネントの複合体が包含され、これ はこの機構の蛋白質分解順序にり・かわっている。補体系の０１コンポーネント の活性化および０１−エフ４ラーゼの活性・はＣ１−エヌテラーゼの活性をコン トロールする血清阻害剤、ずなわ、ちＣ１−インアクティベーター（ＣＪｌ害剤 ）にＪ：って調節されている。このインアクティベーター蛋白質の機能的欠損は 遺伝性脈管神経性浮腫と呼ばれる症状を招く。これは補体系が抑制されないで反 復して活性化されることによって生じ、その症状は活性化部位に局所性急性炎症 をみる病相期のくり返しである。活性化が気管上部の感受性の高い部位に起これ ・　ば、２それに伴う血管の拡張および組織間隙への体液浸出により窒息をみる ことがある。The human complement system contains a CJ'-component, namely serine enterase (e This includes a complex of protein subcomponents, including J-Enterase). changes in the order of proteolysis in this mechanism. 01 component of the complement system activation and the activity of 01-F4rase controls the activity of C1-enterase. Serum inhibitor, Zunawa, C1-inactivator (CJl inhibitor) ) and J: are adjusted. The functional deficiency of this inactivator protein is This leads to a condition called hereditary vasoneural edema. This means that the complement system is not suppressed and The symptoms are caused by local acute inflammation at the activated site. It is a cycle of repeated disease phases. Activation occurs in sensitive areas of the upper trachea ・For example, 2. Asphyxiation occurs due to the accompanying expansion of blood vessels and fluid leakage into interstitial spaces. Sometimes.

、遺伝性脈管浮腫における帥張の急性発症には、機能的に活性な血清Ｃ１−イン アクティベーター（ｃｚ　−ＩＮＡ）を好ましくは濃縮血漿分画として投与する と有効であ゛　る□。しかしながら、最近、臨床的置換療法として用いられてい るＣＪ！−ＩＮＡの濃縮血漿は輸血性肝炎の原因として重要視されるようになっ た。したがって、生物学的に活性なＣｊ！−工ＮＡを高収率に含−付し、しかも Ｂ型肝炎゛ウイルヌ（以下Ｈ’Ｉ３’Ｖという）を媒介す“る可能性が最小限に 抑えられたＣターＩＮＡ濃縮物の製造に研究努力が向けられてきたのである。, acute onset of swelling in hereditary angioedema requires functionally active serum C1-inhibitor. The activator (cz-INA) is preferably administered as a concentrated plasma fraction. It is valid. However, recently it has been used as a clinical replacement therapy. Ru CJ! - INA concentrated plasma has become important as a cause of transfusion-induced hepatitis. Ta. Therefore, biologically active Cj! - Contains engineered NA in high yield, and The possibility of transmitting hepatitis B virus (hereinafter referred to as H'I3'V) is minimized. Research efforts have been directed toward producing reduced C-tar INA concentrates.

現在のｅ、ｌＩＮＡの精製法には、通常、゛ポリエチレングリコール（ｐｇｏ） 沈殿工程が含まれ゛、この工程によって無関係の補体系蛋白質が除去される。し かし、ウィルスへの感染の可能性は残っている。安全な血□清ア不活性のだめの 旧来の低温殺菌法では、枢・要な低温殺菌条件で（：’ｆ　−Ｉ’　Ｎ　Ａか変 性されてしまうので、安全な臨床用ＣＱ−Ｉ　Ｎ　Ａのｉ造には使用できない。Current purification methods for e.INA usually include polyethylene glycol (PGO). A precipitation step is included, which removes extraneous complement system proteins. death However, the possibility of virus infection remains. Safe blood □ Serum inert tank In the traditional pasteurization method, under the key pasteurization conditions (:'f-I'NA or It cannot be used to create a safe clinical CQ-INA.

Ｌ’ｊ！−ＩＮＡの熱安定性を改良しよう、との試みでも、活性物質の回収を有 意に改善されていない。血漿蛋白質、アルブミンおよび抗トロンビンＩＩＩの低 温殺菌に際しての熱安定化にそれぞれ有効に用いられているＮ−アセチルドリプ トノ７ネート、カプリル酸ナトリウムおよびクエン酸の使用も、低温殺菌時のＣ １工ＮＡの保護には適当でなかった。クエン酸す）　ＩＪウムの存在下における 低温殺菌の間に熱変性に由来するＣｊ！−ＩＮＡ活性の喪失は、通常２５係以上 で、経済的に問題があるばかりでなく、変性した蛋白質が大量に患者に注入され ると、連続投与の場合に副作用を生じることになる。Ｂ型血友病の治療にあたっ て置換療法に用いられる第Ｘ因子のような他の血漿蛋白質の低温殺菌に際しても 熱変性が問題になる。L’j! - Attempts to improve the thermal stability of INA have also resulted in recovery of the active substance. It has not been improved in any way. Low plasma protein, albumin and antithrombin III N-acetyl drip, which is effectively used for thermal stabilization during thermal sterilization. The use of tono7ate, sodium caprylate and citric acid also reduces C during pasteurization. It was not suitable for protecting 1-engine NA. citric acid) in the presence of IJium Cj resulting from heat denaturation during pasteurization! -Loss of INA activity is usually greater than or equal to 25 Not only is this an economic problem, but large amounts of denatured protein are injected into patients. If the drug is administered continuously, side effects will occur. Treating type B hemophilia and during pasteurization of other plasma proteins such as factor X used in replacement therapy. Heat denaturation becomes a problem.

本発明はクエン酸カリウムまたはクエン酸アンモニウムの存在下に蛋白質を加熱 することを特徴とする血漿蛋白質の熱安定化方法に関する。本発明（工とくに、 クエン酸カリウムまたはクエン酸アンモニウムノ存在下に第１Ｘ因子または（： １ＩＮＡ血漿濃縮ＪＰ／Ｊを低温殺菌する方法に関する。さらに本発明は、公知 の蛋白質分離技術に従ってＣ１ＩＮＡまたは第Ｘ因子を部分精製し、得られた部 分精製分画を、クエン酸カリウムまたはクエン酸アンモニウムの存在下に、通常 の低温殺菌の時間および温度条件下で加熱することを特徴とする、血漿またはそ の分画からの低温殺菌ＣＩ工ＮＡまたは第Ｘ因子濃縮物の製造方法に関する。The present invention heats proteins in the presence of potassium citrate or ammonium citrate. The present invention relates to a method for thermally stabilizing plasma proteins. The present invention (in particular, Factor 1X or (: This invention relates to a method for pasteurizing 1INA plasma concentrate JP/J. Furthermore, the present invention C1INA or factor X is partially purified according to the protein separation technique of The purified fractions are typically treated in the presence of potassium citrate or ammonium citrate. plasma or its plasma, characterized by heating under pasteurization time and temperature conditions of The present invention relates to a method for producing pasteurized CI engineering NA or factor X concentrates from fractions of.

本発明の方法によれ（弓：、Ｃ１−■ｎＡおよび第１Ｘ因子の両者が熱変性に対 して有効に安定化されてその活性は１００ｅＩ）まで残存し、しかも低温殺菌蛋 白質へのＨＢＶ夾雑の危険が消失もしくは実質的に低下する。By the method of the present invention, both C1-■nA and factor 1X are resistant to heat denaturation. It is effectively stabilized and its activity remains up to 100 eI), and it is The risk of HBV contamination of the white matter is eliminated or substantially reduced.

さらに、本発明の方法は、他の熱感受性蛋白質の熱安定化、およびこれらの蛋白 質の低温殺菌条件下での熱変性の防止に応用できる。本発明によって熱安定化で きるこの種の血漿蛋白質の例としては、抗トロンピノ■■、第Ｘ因子、第■因子 勢を挙げることかできる。Additionally, the methods of the invention can be used to thermostabilize other thermosensitive proteins, and to It can be applied to prevent heat denaturation under high quality pasteurization conditions. Thermal stabilization according to the present invention Examples of plasma proteins from mushroom species include antitrompino, factor X, and factor We can make a big effort.

図面の簡単な説明 第１図は本発明の方法（・′Ｃ従って低温殺菌した’−”ターＩ　Ｎ４の免疫電 気泳動法による沈降曲線、ならびに比活性を示している。Brief description of the drawing Figure 1 shows the method of the present invention (Immunoelectronization of pasteurized '-'tar IN4). The sedimentation curve obtained by pneumophoresis and the specific activity are shown.

第２図は第Ｘ因子および本発明の方法に従って安定化した第１Ｘ因子の熱変性曲 想からなるグラフである。Figure 2 shows the thermal denaturation curves of factor X and factor 1 stabilized according to the method of the present invention. This is a graph consisting of thoughts.

発明の詳細な説明 本発明によれば、血漿蛋白質は、クエン酸カリウムまたはクエン酸ナトリウム２ ．０Ｍ以上から飽和までの濃度、好ましくは約２．５Ｍから飽和までの濃度の存 在によって熱変性に対して安定化される。通常、高モル凝度のクエン酸塩溶液お よび／またはクエン酸塩粉末を、蛋白質の水性懸濁液に２．０Ｍ以上のクエン酸 塩一度になる十分量を加え、ついで溶液のｐＨｔクエン酸て゛はぼ中性に調整す る。別法として、クエン酸塩の飽和溶液もしくは＠濁液のｐＨｋクエン酸でほぼ 中性に調整５ し、ついで蛋白質サンプルをクエン酸塩に加えて所望のクエン酸濃度を達成する こともできる。Detailed description of the invention According to the invention, plasma proteins are potassium citrate or sodium citrate 2 ．． The presence of concentrations from 0M or higher to saturation, preferably from about 2.5M to saturation. stabilized against thermal denaturation by Typically, citrate solutions with high molar and/or citrate powder into an aqueous suspension of protein with at least 2.0M citric acid. Add enough salt to dissolve the citric acid, then adjust the pH of the solution to near neutral. Ru. Alternatively, a saturated solution of citrate or a suspension of pH citric acid at approximately Adjust to neutral 5 and then add the protein sample to the citrate to achieve the desired citrate concentration. You can also do that.

クエン酸アンモニウム（Ａｍ−０ｉｔ　）約３．０Ｍの濃度の懸濁液を得るには 、クエン酸アンモニカムの飽和溶液（室温で３．６　Ｍ　）を蛋白質懸濁液に加 えればよいが、クエン酸カリウム（Ｋ　−ｃｉｔ　）約６．０Ｍの濃度の￥濁液 を得るには、クエン酸カリウムの室温における飽和濃度が６．０Ｍなので、高濃 度のクエン酸カリウム溶液または飽和クエン酸カリウム溶液とクエン酸塩粉末と を組合せて使用する必要かある。たとえばクエン酸カリウム６．０Ｍ濃度の懸濁 液を所望の場合は、５．０ＭＫ　−Ｃｉｔ溶液約５容量を蛋白質懸濁液約１容量 （・ζ加えて、Ｋ　−Ｃｉｔ濃度約２．５Ｍとし、ついでＫ　−Ｃｉｔ粉末を加 えてＫ　−Ｃｉｔ　３．Ｑ　Ｍ濃度の懸濁液とする。この順序ならばＰＨの上昇 は一般に８以下とわずかで、懸濁液のＰＨをほぼ中性、好ましくは約７．０から ７．５までに低下させるのに十分なりエン酸を加えるだけでよい。また別の例と しては、蛋白質サンプル１（５，３Ｍクエン酸三カリウムを、サンプル中Ｋ　− Ｃｉｔ濃度が約６．０Ｍになるような割合で加える。ついでサンプルにクエン酸 を加えてほぼ中性に調整する。To obtain a suspension of ammonium citrate (Am-0it) with a concentration of approximately 3.0M , a saturated solution of ammonium citrate (3.6 M at room temperature) was added to the protein suspension. However, a suspension of potassium citrate (K-cit) with a concentration of about 6.0M To obtain this, the saturation concentration of potassium citrate at room temperature is 6.0M, so a high concentration of potassium citrate is required. of potassium citrate solution or saturated potassium citrate solution and citrate powder Is it necessary to use them in combination? For example, suspension of potassium citrate 6.0M concentration If a liquid is desired, mix approximately 5 volumes of the 5.0MK-Cit solution with approximately 1 volume of the protein suspension. (・ζAdd K-Cit concentration to about 2.5M, then add K-Cit powder. EteK-Cit 3. Make a suspension with a concentration of Q. In this order, the PH will increase is generally as low as 8 or less, and the pH of the suspension is approximately neutral, preferably from about 7.0. Just add enough enoic acid to lower it to 7.5. Another example Then, protein sample 1 (5,3M tripotassium citrate was added to K in the sample) Add at a rate such that the Cit concentration is approximately 6.0M. Then add citric acid to the sample. Add to adjust to almost neutrality.

本発明はとくに、血漿蛋白質に付随する肝炎ウィルスの夾雑を不活性化すること を目的とした低温滅菌技術に応用できる。本発明の濃度でのクエン酸アンモニウ ムまたはクエン酸カリウムの存在は低温殺菌中のこれらの蛋白質の生物学的活性 の有意な喪失を防市し、臨床的に安全に使用できる製品の大量生産を可能にする からである。The present invention particularly aims to inactivate hepatitis virus contamination associated with plasma proteins. It can be applied to low temperature sterilization technology for the purpose of Ammonium citrate at the concentration of the invention The presence of potassium citrate or potassium citrate inhibits the biological activity of these proteins during pasteurization. Preventing significant loss of product and enabling mass production of clinically safe products It is from.

本発明の方法は抗トロンビンｌ［Ｉ　（Ａ　Ｔ　ＩＩＩ　）ならひに第Ｘ閃子、 第■因子を含めた各種の血漿蛋白質に応用することができるが、とくに公知の熱 安定化法による低温殺菌時に熱変性に対して有効に安定化できない血漿蛋白質、 ＣｌＩＮＡおよび第■因子の場合とくに有用である。Ｃ１−工ＮＡ、第１Ｘ因子 、いずれも本発明によって安定化されるので、通常の低温殺菌条件下、たとえば 夾雑ＨＢＶが不活性される６０°Ｃ１１０時間の殺菌でも生物学的活性は完全に 保持される。The method of the present invention provides antithrombin I [I (AT III), It can be applied to various plasma proteins including factor Plasma proteins that cannot be effectively stabilized against heat denaturation during pasteurization by stabilization methods; It is particularly useful in the case of ClINA and factor II. C1-ENA, factor 1X , all of which are stabilized by the present invention, under normal pasteurization conditions, e.g. Biological activity is completely lost even after sterilization at 60°C for 110 hours to inactivate contaminant HBV. Retained.

本発明の低温殺菌法によれば、血漿蛋白質濃縮物は、クエン酸カリウムまたはク エン叡アンモニウム２．０Ｍ以上から飽和濃度までの存在下、好ましくはほぼ中 性のＰＨにおいて、６０℃（±１／２°Ｃ）からの温度で少なくとも１０時間、 低温殺菌される。本発明の実施態様を示せば、たとえば殺菌Ｃｆ−ＩＮＡ血漿濃 縮物はまず血漿冷却上清から、慣用の蛋白質分離技術、たとえばイオン交換クロ マトグラフィーおよびＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈殿を用いて製造され る。生成したＣｌＩＮＡ分画は濃縮するのか不利で、ついでＣＪ’−１ＮＡ中の クエン酸濃度が２．０　Ｍ以上から飽和濃度までとなるようにクエン酸カリウム まだはクエン酸アンモニウムを存在させて低温殺菌を行う。本発明のクエン酸カ リウムおよびクエン酸アンモニウムの効果は濃度が高いほど大きくなるので、Ｃ Ｊ！−ＩＮＡの生物学的活性を最高に維持するため、Ｃｆ−工ＮＡ濃縮物中のク エン酸塩濃度は飽和またはほぼ飽和近くにすること′ｆｉ玉好ましい。濃縮物に 安定化剤を添加するのに好ましい約２５°Ｃ伺近の温度範囲でのクエン酸塩の飽 和濃度は、クエン酸カリウムで約３．０Ｍ、クエン酸アンモニウムで約３．６　 Ｍである。安定化剤を濃縮物に添加する際の温要はもう少し普くてもよく、その 場合、飽和濃度はもう少し高くなる。臨床的に使用する場合、低温殺菌したｅｉ ＩＮＡは以汗公知の方法に従って、脱塩、濾過、凍結乾燥する。低温殺菌した第 ■因子血漿濃縮物も、はぼ同様の精製方法および特定濃度のクエン酸カリウムま たはクエン酸アンモニウムの存在下（（おける低温殺菌によって製造できる。According to the pasteurization method of the present invention, the plasma protein concentrate is In the presence of 2.0 M or more of enammonium up to a saturation concentration, preferably approximately medium at a temperature from 60°C (±1/2°C) at a normal pH for at least 10 hours. Pasteurized. Embodiments of the invention include, for example, sterile Cf-INA plasma concentrations. The condensate is first extracted from the cooled plasma supernatant using conventional protein separation techniques such as ion exchange chromatography. Manufactured using matography and PEG (polyethylene glycol) precipitation Ru. The generated ClINA fraction is disadvantageously concentrated, and then concentrated in CJ'-1NA. Potassium citrate so that the citric acid concentration is from 2.0 M or more to the saturation concentration. Pasteurization is still performed in the presence of ammonium citrate. Citric acid salt of the present invention The effect of C and ammonium citrate increases as the concentration increases, so C J! - In order to maintain the highest biological activity of INA, It is preferable that the enolate concentration be saturated or nearly saturated. to concentrate Citrate saturation at a temperature range of about 25°C, which is preferred for adding stabilizers. The total concentration is approximately 3.0M for potassium citrate and approximately 3.6M for ammonium citrate. It is M. The temperature requirements for adding stabilizers to concentrates can be a little more generous; In this case, the saturation concentration will be a little higher. For clinical use, pasteurized ei INA is desalted, filtered, and lyophilized according to a known method. pasteurized first ■Factor plasma concentrates can also be purified using the same purification method as Habo and with specific concentrations of potassium citrate or or by pasteurization in the presence of ammonium citrate.

本発明に従って低温殺菌するだめの精製Ｃ１−工ＮＡ濃絹物は、公知方法、たと えばＷｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒによＶ）　Ａｎ工ｍｐｒｏｖｅｃｌ　Ｍｅｔｈｏ ｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃ１−Ｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ 　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅと題し、Ｊｏｉｎｔ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｆ　ｔｈｅ 　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ａｃｉｅｔｉｅｓ　ｏｆ　１（ｅｍａｔｏｌ ｏｇｙａｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、　Ｍｏｎｔｒｅａｌ、　 ｉ　９８Ｑにおいてポスタ一番号８０２号として詳細が発表された方法によって 製造される。本発明における分離技術として免疫ｒｙｊ、着法を除外するもので はないが、臨床用に適した濃縮物は非特異的蛋白質分離操作を用い、ついで低温 殺菌を行う方法で十分、製造可能である。通常、ＰＥＧ沈ｊｌとイオン交換クロ マトグラフィー、たとえばＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｄｅｘおよびｃＭ　− ５ｅｐｈａｄｅｘの組み合わせにより、出発血漿分画、通常は血漿冷却上清の蛋 白質夾雑物を減少させることができる。The purified C1-ENA thick silk material that is pasteurized according to the present invention can be prepared by known methods, such as For example, according to Wickerhauser V) An engineering method d for Preparation of C1-In-activator Titled Concentrate, Joint Congress of the International 5 acieties of 1 (ematol ogyand Blood Transfusion, Montreal, According to the method whose details were announced in Poster No. 1 No. 802 in i98Q. Manufactured. The present invention excludes immuno-ryj and attachment methods as separation techniques. However, concentrates suitable for clinical use use a non-specific protein separation procedure followed by low-temperature treatment. It can be manufactured by a method that involves sterilization. Usually, PEG precipitate and ion exchange chromatography are used. Matography, e.g. DEAE-5ephadex and cM- The combination of 5ephadex reduces the protein content of the starting plasma fraction, usually the plasma cooled supernatant. It can reduce white matter impurities.

ＰＥＧ沈殿は補体コンボーネン）Ｏｆ−０５が除去されたＣｊ！−ＩＮＡを含む 上清を与えるので、ＣＪ−ＩＮＡ、精製操作にＰＥＧ沈殿工程を用いることはと くに望ましい。PEG precipitation is a complement component) Cj from which Of-05 has been removed! -Includes INA Since the supernatant is obtained, it is not necessary to use a PEG precipitation step for CJ-INA purification. Especially desirable.

ＣＪｌ、−ｆＮＡ分画はまずＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｄｅｘ上血漿冷却上 清から抽出され、ついで溶出液中の不純物をン０係ＰＥＧ　４０００で沈殿させ 、ＰＥＧ上清をＣＭ−８ｅｐｈａｄｅｘ上に吸着、溶出させる。この順序により 、残った血漿部分のエタノール分画化および臨床用アルブミンの回収のための使 用會単純化する。しかしながら、アルブミンの回収に興味がない場合は、冷却上 清に直接ＰＥＧを添加し、以後ＰＥＧ上清にひき続いてイオン交換クロマトグラ フィーを行うことができる。CJl, -fNA fraction was first cooled on DEAE-5 ephadex. It is extracted from the supernatant, and then the impurities in the eluate are precipitated with PEG 4000. , the PEG supernatant is adsorbed onto CM-8 ephadex and eluted. With this order , the use of the remaining plasma fraction for ethanol fractionation and recovery of clinical albumin. Simplify your usage. However, if albumin recovery is not of interest, cooling PEG was added directly to the supernatant, and the PEG supernatant was subsequently subjected to ion exchange chromatography. Fees can be paid.

採用した精製工程によって得られた精製Ｃｆｆ１−ＩＮＡ分画は、ついでたとえ ばＰｅ１ｌｉｃｏｎ　ＵＦ膜ンヌテムでの大バッチの限外濾過、あるいは硫酸ア ンモニウム沈殿ついで５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−５０による脱塩の小パッチ処理 によって濃縮することが望ましい。得られた濃縮物を次に本発明の方法に従って 低温殺菌し、濾過し、凍結乾燥すると、中間純度のｅｉ−ＩＮＡ＠縮物最縫物最 終製品量生産の場合、通常血漿に対する純度６０係〜１５０凱収率約１４％〜４ ５％で得られる。所望により、中間純度の最終製品をさらにヒドロキシアパタイ ト上刃ラムクロマトグラフィーに付して精製すると、大量生産の場合、血漿に対 する純度が通常４００倍まで戸外した高純度最終製品が約６係〜１７％の収率で 得られる。The purified Cff1-INA fraction obtained by the employed purification step was then For example, large batch ultrafiltration with Pelicon UF membrane Nutem or sulfuric acid solution. Ammonium precipitation followed by small patch treatment of desalination with 5ephadex G-50 It is desirable to concentrate by The concentrate obtained is then processed according to the method of the invention. When pasteurized, filtered, and lyophilized, ei-INA of intermediate purity In the case of final product production, the purity of plasma is usually 60 to 150, and the yield is about 14% to 4. Obtained at 5%. If desired, the intermediate purity final product can be further hydroxyapatized. When purified by top-bladed lam chromatography, plasma The high purity final product, which is 400 times more pure than usual, has a yield of about 6% to 17%. can get.

新鮮凍結血漿から抗好血性因子（ＡＨＦ）の回収のための冷却沈殿を除去して得 られた冷却上清をクエン酸食塩水（ａｓ）で平衡化したＤｇＡｍ−５ｅｐｈａａ ｅｘ　（６ｇ／ｌ）にバッチ法によシ吸着させた。吸着はれない蛋白質はエタノ ール分画化のだめに除去し、ＤＥＡＥケーキをＯ８緩衝液（０，５血漿容量）で 洗浄し、ついで０、．０３　Ｍクエン酸塩中２Ｍ食塩、ｐＨ６，８（０，２血漿 容量）で溶出した。溶出液を０．１血漿容量に濃縮し、０．０６　Ｍクエン酸リ ン酸（ＣＰ）緩衝液、ＰＨ７，０で平衡化し、２０　％　ＰＥ０４０００で沈殿 させた。遠心分離後、ＰＥＧ上清を等容の水で希釈し、ＰＨを６．０に調整し、 ｃ　Ｍ　−５ｅｐｈａｄｅｘ　（６ｇ／　ｌ出発血漿）に吸着させ、０．０３　 Ｍ　ＣＰ　、　ＰＨ６，０に平衡化した。０Ｍケーキを同じ緩衝液で洗浄し、０ ．０３Ｍ−ｃｐ中２Ｍ食塩１、Ｏ７，３で溶出した。溶出液を０．０２血漿容量 に濃縮し限外濾過によｐｃｓ緩衝液と平衡化した。ついで生成物を滅菌濾過し、 適宜分割して凍結乾燥すると中間純度の（Ｊ　−Ｉ　Ｎ　Ａ濃縮物が得られた。Obtained by removing cold precipitate for recovery of antihemophilic factor (AHF) from fresh frozen plasma DgAm-5ephaa was prepared by equilibrating the cooled supernatant with citrate saline (as). EX (6 g/l) was adsorbed by a batch method. Proteins that cannot be adsorbed are ethano The DEAE cake was removed with O8 buffer (0.5 plasma volume). Wash, then 0, . 03 2M NaCl in citrate, pH 6,8 (0,2 plasma volume). The eluate was concentrated to 0.1 plasma volume and diluted with 0.06 M citrate. Equilibrate with phosphoric acid (CP) buffer, pH 7.0, and precipitate with 20% PE04000. I let it happen. After centrifugation, the PEG supernatant was diluted with an equal volume of water, the pH was adjusted to 6.0, c　M　　-5ephadex　(6g/l starting plasma), adsorbed with 0.03 MCP was equilibrated to pH 6.0. Wash the 0M cake with the same buffer and ．． Eluted with 2M NaCl 1, O7,3 in 03M-cp. Eluate to 0.02 plasma volume It was concentrated and equilibrated with PCS buffer by ultrafiltration. The product is then sterile filtered and By appropriately dividing the mixture and lyophilizing it, a (J-INA concentrate) of intermediate purity was obtained.

出発血漿中に存在したＣｕ１ｔ−ＩＮＡの２９．４％が回収されたことになり純 度は９１．６倍であった。Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｇ法によって、補体コンポーネ ントＣｆ−Ｏ５は検出されなかった。29.4% of Cu1t-INA present in the starting plasma was recovered, indicating that it was pure. The degree was 91.6 times. Complement components were determined by the Ouchterlong method. No component Cf-O5 was detected.

例２ 例１に従って得られた冷却上清を５６Ｃにおいて４０９／ｌの固体ＰＥＧ４００ ０で処理した。１時間攪拌したのち、遠心分離して第１の分画を除去し、さらに ＰＥ（）　６０９／ｌ！を、最初の冷却上清の容量に対して約１０％の最終濃度 になるように、上溝に加えた。１０６Ｉ）ＰＥＧ上ｉからパンチ法でのＤＥＡＥ −セルロースへの吸着によってプロトロンビン複合体（ｐＴｃ）を抽出し、さら に’１００ｇ／ｌのＰＥＧを溶出液に、この場合も冷却上滑の最初の容量に対し て約２０係の濃度になるように加えた。２０％ＰＥＧ沈殿を遠心分離して捨て、 ２０％ＰＥＧ上清を、あらかじめクエン酸食塩液（ａｓ）中で膨潤させたＤＥＡ Ｅ−５ｅｐｈ、ａｄｅｘ　（６，５１／ｌ出発血漿）にバッチ法で吸着させた。Example 2 The cooled supernatant obtained according to Example 1 was added to 409/l of solid PEG400 at 56C. Treated with 0. After stirring for 1 hour, centrifuge to remove the first fraction, and PE() 609/l! to a final concentration of approximately 10% relative to the volume of the initial cooled supernatant. I added it to the upper groove so that it looks like this. 106I) DEAE from i on PEG by punch method - Extract the prothrombin complex (pTc) by adsorption onto cellulose and further Add 100 g/l PEG to the eluate, again on cooling and to the initial volume of the slide. and added to a concentration of about 20 parts. Centrifuge and discard the 20% PEG precipitate; 20% PEG supernatant was pre-swollen in citrate saline (as) with DEA. It was adsorbed to E-5eph, adex (6,51/l starting plasma) in a batch method.

吸着しない蛋白質を除去したのち、生成物のＤＥＡＥケーキをｕ、１５Ｍ食塩で 洗浄し、ついで０．０３　Ｍクエン酸中２Ｍ食塩、ｐＨ６，８（２００ｍｅ／　 ｌ出発血漿）で溶出した。ＤＥＡＥ溶出液をＰｅ１ｌｉｃｏｎ　ＵＦシステムで 濃縮し、Ｏｊ、［］　６６Ｍクエン酸−リン酸緩衝液　Ｃ、Ｐ　）、ＰＨ６，１ に平衡化し、ついで、Ｑ、［ｌ　５Ｍ　−ｃｐ　ＸＰＩ−１６，０にあらかじめ 膨潤させたｃ　Ｍ−５ｅｐｈａｄｅｘ　（６ｊ／　／　／Ｉ’出発血漿）に吸着 させた。After removing unadsorbed proteins, the product DEAE cake was diluted with u, 15M salt. Washed, then 2M NaCl in 0.03M citric acid, pH 6.8 (200me/ 1 starting plasma). DEAE eluate with Pelicon UF system Concentrate, Oj, [ ] 66M citric acid-phosphate buffer C, P), PH6,1 equilibrated to Q, [l 5M -cp XPI-16,0 Adsorbed on swollen cM-5ephadex (6j////I' starting plasma) I let it happen.

ＣＭ　−５ｅｐｈａｄｅＸケーキを同一の緩衝液で洗浄し、ＣＰ緩Ｓ液中１Ｍ食 塩、ｐｔ（６，８（２０ＵＪｍｌ／１出発血漿）で溶出した。０Ｍ溶出液をつい で濃縮し、ａｓ中に平衡化し、滅菌濾過し、充填し、凍結乾燥ヂると中間純度の Ｃｊ！−工ＮＡ濃縮物製品が得られた。Wash the CM-5ephadeX cake with the same buffer and add 1M food in CP mild S solution. Elute with salt, pt(6,8 (20 UJml/1 starting plasma). The 0M eluate was then Concentrate in 100% water, equilibrate in AS, sterile filter, fill, and lyophilize to obtain a medium-purity product. Cj! - An engineered NA concentrate product was obtained.

濃縮０Ｍ溶出液をＩ　Ｑ　ｍＭ　ＫＨＰＯ，、ＰＨ７，０で平衡化し、ＯＨ−Ａ ｐａｔｉｔｅ　（４９／　７１出発血漿）上り０７トグラフイーに付すほがは、 例２の方法に従った。０Ｈ−Ａｐａｔｉｔｅ非吸着分画に等張性になるまで食塩 を加え、等張性生成物を滅菌濾過し、充填し、凍結乾燥すると、高純度のＣＪｌ −ＩＮＡ濃縮物製品が得られた。The concentrated 0M eluate was equilibrated with IQ mM KHPO, pH 7.0, and OH-A patite (plasma starting from 49/71), which was subjected to upstream 07 tography, The method of Example 2 was followed. Add salt to the non-adsorbed fraction of 0H-Apatite until it becomes isotonic. The isotonic product is sterile filtered, filled and lyophilized to produce highly pure CJl. - An INA concentrate product was obtained.

飢Ａ 例１の濃縮Ｃ’Ｍ溶出液を例６に従って平衡化し、クロマトグラフィーを行い、 食塩を等張性になるように加える別法で、以下、滅菌濾過、充填、凍結乾燥して 、高純度のＣＪ！−ＩＮＡ濃縮物製品が得られた。Hunger A The concentrated C'M eluate of Example 1 was equilibrated and chromatographed according to Example 6, Another method is to add salt to make it isotonic. , high purity CJ! - An INA concentrate product was obtained.

例１の方法で得られた中間純度の０１−工ＮＡ濃縮物を、以下のように、３Ｍク エン酸カリウムの存在下に低温殺菌した。The intermediate purity 01-ENA concentrate obtained by the method of Example 1 was added to a 3M solution as follows. Pasteurized in the presence of potassium enoate.

ａ）（？ｊ！−ＩＮＡ濃縮物５ｇ（凍結乾燥前）を水５０　ｍｌで再生した。こ のサンプルを５℃で７時間保存し、これに５Ｍ−に−ｃｉｔ（ｐＨ７，３）２５ ０ｍ／およびに一０ｉｔ粉末（１，６１，！ｉ’／ｍ／’）８０．５ｇを加え、 最終濃度を３、Ｑ　Ｍ　’−Ｋ　−Ｃｉｔとした。安定化剤を加えると蛋白質の 沈殿を生じた。得られた白濁懸濁液（ｐＨ７，７）のＰＨを６Ｍクエン酸で徐々 に７．４５に調整した。安定化懸濁面をついで６０℃±０．１℃に１０時間加熱 Ｌ７て低温殺菌した。反応混合物の上部に生成した沈殿蛋白質の固体ケーキをこ わして再懸濁し、室温で２８分間、５０　’００　ｒｐｍにおいて遠心分離した 。澄明な上清を遠沈管から注意深くサイホンで取り出したつ澄明な上清２１０肩 ｌとスラリー約２００ｍ／が得られた。上清は蛋白質を全く含まず、のちに捨て た。a) (?j!-5 g of INA concentrate (before lyophilization) was regenerated with 50 ml of water. The sample was stored at 5°C for 7 hours and added to 5M-cit (pH 7,3) 25 Add 80.5g of 10it powder (1,61,!i'/m/') to 0m/ and The final concentration was 3, QM'-K-Cit. Adding a stabilizer will improve the protein A precipitate formed. The pH of the resulting cloudy suspension (pH 7.7) was gradually adjusted with 6M citric acid. It was adjusted to 7.45. The stabilized suspension surface was then heated to 60°C ± 0.1°C for 10 hours. L7 was pasteurized. Pour the solid cake of precipitated protein that forms on top of the reaction mixture. resuspended and centrifuged at 50'00 rpm for 28 minutes at room temperature. . Carefully siphon the clear supernatant out of the centrifuge tube. About 200 m/l of slurry were obtained. The supernatant contains no protein and is discarded afterwards. Ta.

スラリー２００ｍｆｆ１水６００　ｍｌで希釈すると、ＰＨは６．２５に低下し た。０．Ｉ　Ｎ　−、ＮａＯＨ５Ｑ　ｍｅとＯ−２Ｍ−Ｎａ２ｆｉＰ０４４００ 　ｍｌ’を加えて最終容量を１０５０７７／’ｉてすると、ＰＨは６．４を示し た。この浴液を一夜５℃に保存し、最終孔径０．２２　ｐのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ 　フィルターを通して澄明化すると、最終容量は９６０　ｍｌとなった。澄明生 成物を濃縮し、ＰＴＧＣ膜を用いたＰｅ１ｌｉｃｏｎ限外濾過システム（標示孔 径ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏダルトン）産よって濾過して約２００ｍ１′とした（約１ ３５０　；ｎｅ／Ｑ）流速で５時間高速循環）。得られた濃縮物を、１Ｑ　ｍＭ 　−ＮａＰＯ４＋１５０　ｍＭ　−ＮａＣ１含有リン酸食塩緩衝液（ＰＢＳ）１ ．Ｏ７，２５，２５２０ｍｒに対して透析ａｍした。透析濾過液６００　ｍｌご とにサンプルを採取し、炎光光度計を用いてカリウムの除去を監視した。透析濾 過緩衝液１８８０ｍｌを使用すると、カリウム濃度は臨床的に安全な範囲の１　 ｍＥｑ以下に低下した。（？ｊ！−工ＮＡ含有残留液をついで１６０　ｍｌに濃 縮し、Ｐｅ１ｌｉＣＯｎシステムから取り出し、ＰＢＳ緩衝液で２００　ｍｌに 希釈し、５Ｑｍｌのバイアルに２００　ｍｅずつ分割充填し、液体窒素で凍結し て凍結乾燥した。凍結乾燥サイクルは５０と１６時間であった。−次（昇華）相 での生成物の温度は一６５℃に維持され、二次相では＋２０〜２１℃に維持され た。低温殺菌されたＣ１工ＮＡＫついては生物学的活性および抗原性活性、蛋白 質濃度、ならひにヘパリン化アガロ−スケゞル中でのクロス免疫電気泳動におけ る特性を測定した。When diluting 200 mff of slurry with 600 ml of water, the pH drops to 6.25. Ta. 0. IN-, NaOH5Qme and O-2M-Na2fiP04400 When adding ml' to make the final volume 105077/'i, the pH shows 6.4. Ta. This bath solution was stored at 5°C overnight, and a Millipore tube with a final pore size of 0.22p was used. After clarification through a filter, the final volume was 960 ml. Sumiaki student The product is concentrated using a Pelicon ultrafiltration system using a PTGC membrane (marked pores). diameter i o, o o o o o dalton) and filtered to about 200 m1' (about 1 350; ne/Q) high-speed circulation for 5 hours at a flow rate). The obtained concentrate was diluted with 1Q mM -NaPO4+150mM -NaCl containing phosphate saline buffer (PBS) 1 ．． Dialysis was performed against O7,25,2520 mr. 600ml of dialysis filtrate Samples were taken at each time and potassium removal was monitored using a flame photometer. diafiltration Using 1880 ml of superbuffer, the potassium concentration is within the clinically safe range of 1. It decreased to below mEq. (?j!-The residual solution containing engineering NA was then concentrated to 160 ml. Remove from the PelliCON system and make up to 200 ml with PBS buffer. Dilute, fill 5Qml vials in 200me portions, and freeze with liquid nitrogen. and lyophilized. Freeze drying cycles were 50 and 16 hours. −Next (sublimation) phase The temperature of the product in the phase was maintained at -65°C and in the secondary phase at +20-21°C. Ta. Pasteurized C1 engineered NAK has biological and antigenic activity, protein In cross-immunoelectrophoresis in heparinized agarose scale, The characteristics were measured.

結果は第１表に示すとおりで、３．０Ｍ　−Ｋ　−Ｃｉｔの存在下における低温 殺菌工程で総計約１０係の蛋白質が失われるが、特異的活性の低下はなく、クロ ス免疫電気泳動分析における変化もきわめて小さい（第１図参照）。The results are shown in Table 1. Low temperature in the presence of 3.0M-K-Cit Approximately 10 proteins in total are lost during the sterilization process, but there is no decrease in specific activity and chromatography The changes in immunoelectrophoretic analysis are also very small (see Figure 1).

ｂ）２１０ｍ／の澄明な上清を捨てる前に、その１０ｍｅを凍結し、残りの２０ ０　ｍｚはＰＢＳ緩衝液で１０１００Ｏに希釈した。この希釈上清をＭｉｌｌｉ ｐｏｒｅ　ｇ　（孔径０．２２　ｐ　）で澄明化し、Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ　Ｐ　Ｔ 　Ｇ　Ｃ膜２パック上１５０ｍ１に濃縮し、ＰＢＳ緩衝液１８４０ｍ１に対して 透析濾過した。Ｐｅ１ｌｉｃｏｎシステムから取り出し、溶液を２００ｍｅＫＰ ＢＳ緩衝液で希釈し、分割し、凍結した。この溶液５　ｍｌに５０％トリクρル 酢酸（ＴＣＡ）第１表（３，０Ｍ−クエン酸カリウム）＊＊指定値、　＊対照サ ンプル、＋側１からの法帖乾燥サンプル 溶液２　ｍｌを加えて蛋白質の検査をした。沈殿は生成せず、検知可能な程度の 蛋白質は含まれていないことが例１の方法に従って得られた中間純度のＣ，ｌ− Ｔ、ＮＡを例５の方法に従い、３，６Ｍ　−Ａｍ　−Ｃｉｔの代わりに２−ＯＭ −Ｎａ　−ｃｔｔ、２．ｇｕ−Ｋ−Ｃｉｔ、　２．５Ｍ−に−ｃｉｔ、　３．□ ｕ−に’−ｃｉｔ、　２−ＯＭ−Ａｍ−Ｃｉｔ。b) Before discarding the clear supernatant of 210 m, freeze 10 m of it and freeze the remaining 20 m 0mz was diluted to 10100O with PBS buffer. This diluted supernatant was Clarify with pore g (pore diameter 0.22 p) and Pelicon P T Concentrate to 150 ml on 2 packs of G C membranes and add to 1840 ml of PBS buffer. Diafiltered. Remove the solution from the Pelicon system and add 200meKP. Diluted in BS buffer, aliquoted and frozen. Add 50% trickle to 5 ml of this solution. Acetic acid (TCA) Table 1 (3,0M-potassium citrate) **Specified value, *Control sample sample, Hocho dry sample from + side 1 2 ml of the solution was added and tested for protein. No precipitate formed, no detectable amount Intermediate purity C,l- obtained according to the method of Example 1 was found to be free of protein. T, NA according to the method of Example 5, 2-OM instead of 3,6M-Am-Cit -Na-ctt, 2. gu-K-Cit, 2.5M-ni-cit, 3. □ u-ni'-cit, 2-OM-Am-Cit.

２．５　Ｍ　−Ａｍ　−ｃｉｔおよび３．Ｑ　Ｍ　−Ａｍ　−（Ｅｉｔを存在さ せたほかは同様にして低温殺菌を行った。2.5 M-Am-cit and 3. Q　M　-Am　-(Eit exists) Other parts were pasteurized in the same way.

殺菌条件によるＣｊ！−ＩＮＡの熱安定性は、バルビタール緩衝液、ｐＨ８，６ ｉ用いたヘパリン化アガールゲル（室内Ｉ　＝　０．０７５、ゲル中０．０２５ 　）中で低温殺菌物を免疫電気泳動によって評価した。サンプルを１：３ク工ン 酸食塩（ａｓ）中、約１．０．ＰＥ／ｍｅに希釈した。Cj depending on sterilization conditions! -Thermal stability of INA was determined using barbital buffer, pH 8.6. Heparinized agar gel used (indoor I = 0.075, 0.025 in gel ), the pasteurized products were evaluated by immunoelectrophoresis. Sample 1:3 times In acid salt (as), about 1.0. Diluted to PE/me.

低温殺菌していない対照サンプルは・Ｃ８で希釈した。Unpasteurized control samples were diluted with C8.

操作条件は次のとおりであった。The operating conditions were as follows.

１次元’　（１６−６ｐ　７ｍｌヘパリフ）１７８ｖ、２時間 ２次元・Ｈ（Ｃ１■ＮＡに対し３　％　ＡＩ）　）　１４８　Ｖ、−夜 温度：板の下は１６℃に冷却、濃縮セル内は３℃に冷却、周囲温度２６℃ 結果は第１図に示すとおりで、低温殺菌物の免役学的反応性は対照サンプルと等 しく維持されていること残存生物学的活性は低温殺菌していない対照の比活性に 対する百分率で示す。生物学的活性はＬｅｖｙとＬｅｐｏｗの方法（Ｐｒｏｃ、 　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、＋　１０１　：６．０８　、．１ ９５９　）に従って測定した。1D' (16-6p 7ml heparif) 178v, 2 hours 2D H (3% AI for C1 NA)) 148 V, -Night Temperature: Cooled to 16℃ under the plate, cooled to 3℃ inside the concentration cell, ambient temperature 26℃ The results are shown in Figure 1, and the immunological reactivity of the pasteurized product is equal to that of the control sample. The residual biological activity should be maintained at the specific activity of the unpasteurized control. Expressed as a percentage of Biological activity was determined by the method of Levy and Lepow (Proc. Soc, Exp, Biol, Med, +101:6.08, . 1 959).

Ａ　ＨＦ回収のだめの冷却沈殿を除去したのち、冷却沈殿上清血漿をＤＥＡＥ− ８ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ　５０　（７０ｍＭクエン酸ナトリウム、ＰＨ６、乾燥重 量１．７．？／ｌ血漿）上に吸着させ、Ａ５０ケーキを７０ｍＭクエン酸ナトリ ウム、ＰＨ６で洗浄し、２００ｍＭクエン酸ナトリウム、ＰＨ６で溶出した。溶 出した第１Ｘ因子複合体（ビタミンに依存性凝血因子■、■、Ｘおよび蛋白Ｃ） を２９　ｍＭクエン酸中０．１５　Ｍ食塩、ＰＨ６に対して透析濾過して、澄明 化、濃縮（ｘ１５）Ｌ、ついでＭｉｌｅｔｉｃｈらの方法（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、＋　１０５　：３０４−３ｉ０．１９８０　）に従って硫酸化デキス トランに吸着させた。食塩の磯度を順次（０，１５Ｍ　。A: After removing the cooled precipitate from the HF recovery tank, the cooled precipitated supernatant plasma was DEAE- 8ephadex A 50 (70mM sodium citrate, PH6, dry weight Amount 1.7. ? The A50 cake was adsorbed onto 70mM sodium citrate. and eluted with 200mM sodium citrate, PH6. melt Released factor 1 X complex (vitamin-dependent clotting factors ■, ■, X and protein C) was diafiltered against 0.15 M NaCl in 29 mM citric acid, pH 6 to clear concentration (x15), followed by the method of Miletich et al. (Anal, Bio chem, +105:304-3i0.1980) I adsorbed it to Tran. The degree of saltiness is increased sequentially (0.15M).

０．２５Ｍ　、０．４５　Ｍおよび０．８０　Ｍ　）上昇させる段階溶出により 、プロトロンビン、第Ｘ因子、蛋白Ｃおよび第Ｘ因子を順次分離した。得られた 第Ｘ因子濃縮物は第Ｘ因子およびプロトロンビンを含まず、約１７．６単位第１ Ｘ因子／ｍｇ蛋白質の活性比を示した。0.25M, 0.45M and 0.80M) by increasing stepwise elution. , prothrombin, factor X, protein C and factor X were sequentially separated. obtained Factor X concentrate is free of factor X and prothrombin and is approximately 17.6 units The activity ratio of factor X/mg protein is shown.

硫酸化デキストランの代わりにデキストラン−サル７　ｘ　−）　−５ｅｐｈａ ｒｏｓｅまたはヘパリン−８ｅｐｈａｒｏｓｅも使用できる。第１Ｘ因子および 関連濃縮物の製造方法に関しては、Ｄｏｒｉｓ　Ｍｅｎａｃｈｅ　：　Ｐｒｏｔ ｈｒｏｍｂｉｎ　ＣｏｍｐｌｅｘＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ、Ｃ１１ｎｉｃａｌ 　ＵＳｅ、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ。Dextran-sal7x-)-5epha instead of sulfated dextran rose or heparin-8 epharose can also be used. factor 1X and For related concentrate manufacturing methods, see Doris Menache: Prot. hrombin Complex Concentrates, C11nical USe, Ann, N, Y, Acad.

ｓｃｉ、、　３７０　：　７４７−７５６　、１９８１および”　Ｐｌａｓｍａ 　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ　ｏｆ　ＲｅｄｕｃｅｄＴｈｒｏ ｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　Ｕｓｅ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａ ｌノ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ｔｈｅｒａｐｙ”と題した１９８２年４月２８日出願 の出願中の特許に記載されている。sci., 370: 747-756, 1981 and “Plasma Protein Concentrates of ReducedThro mbogenicity and their Use in C11nica l no Filed on April 28, 1982 entitled “Replacement Therapy” Described in a pending patent application.

例８の方法で得られた第■因子の高純度濃縮物を例６の方法に従って、３．０Ｍ −ｘ−ｃｉｔの存在下に低温殺菌した。低温殺菌しない対照サンプルと比較した 低温殺菌サンプルの熱変性をＢｕｓｂｙらの方法（ＴｈｅｒｍａｌＤｅｎａｔｕ ｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ　ｌ［、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、 。The high purity concentrate of factor Ⅰ obtained by the method of Example 8 was added to 3.0M according to the method of Example 6. Pasteurized in the presence of -x-cit. compared to unpasteurized control samples. Thermal denaturation of pasteurized samples was performed using the method of Busby et al. ration of Antithrombin [, J, Biochem, .

２５６：１２１４０−１２１４７．１９８１）によりＡＮＳ螢光法を用いて検討 した。256:12140-12147.1981) using ANS fluorescence method. did.

検査サンプルは次のとおシであった。The test samples were as follows.

（Ｊ、０２　Ｍ　ＫＰＯ４（ＰＨ７，３５）第■因子　Ｑ、１５　Ｍ食塩　２ｍ Ｍ−ＡＮ８３．５Ｍ−に−ｉｔ １　対照サンプル　１０λ　８６．７λ　ろ、６λ　０２　試験サンプル　１０ λ　１．０λ　６．６λ　８５６７λ（クエン酸嬢 度３．０　Ｍ　） 螢光の放出を測定して得られたデータをサンプル温度の函数としてプロットした 。第２図に示すように、得られた熱分解曲線から、対照サンプルの熱分解温度（ Ｔｄ）５４．５℃に比べ、試験サンプルは熱安定性を示すことがわかる。(J, 02 M KPO4 (PH7,35) Factor ■ Q, 15 M Salt 2m M-AN83.5M-ni-it 1 Control sample 10λ 86.7λ, 6λ 02 Test sample 10 λ 1.0λ 6.6λ 8567λ (Miss citric acid degree 3.0M) Data obtained by measuring fluorescence emission were plotted as a function of sample temperature. . As shown in Figure 2, from the obtained pyrolysis curve, the pyrolysis temperature of the control sample ( Td) 54.5°C, it can be seen that the test sample exhibits thermal stability.

例１０ 例９と同様の第■因子濃縮物サンプル５個を、次の処方により、６０℃で１０時 間、低温殺菌した。Example 10 Five samples of factor Ⅰ concentrate similar to Example 9 were prepared at 60°C for 10 hours according to the following formulation. Pasteurized for a while.

サンプル１５Ｍ−に−０ｉｔ　２．８　７．１　１９．９１．８−）リカル サンプル２　バリレート（力　ろ、９　７．６２８．５リウム塩） ２．０　Ｍ　−ｘ３）リ サンプル３　カルバリレート　２．６　９．０　２３．４十に一グルコネ ート １．８Ｍ−に− サンプル４　ｃｌｔｌ、８Ｍ−２，３９，１２０，９に一グルコネ１− ト サンプル５　９．９　１．９　１８．８低温殺菌サンプルはクエン酸食塩液（ク エン酸ナトリウム０．０２Ｍ、食塩０．１５　Ｍ、　ＰＨ６、＋４°Ｃ）に透析 し、サンプルのクエン酸濃度を低止させ、凝血試験に対する阻害を低下させた。Sample 15M-0it 2.8 7.1 19.91.8-) Rical Sample 2 Valerate (power, 97.628.5 lium salt) 2.0　M　-x3) Sample 3 Calvalrylate 2.6 9.0 23.4 1 in 10 glucone root 1.8M-to- Sample 4 cltl, 8M-2, 39, 120, 9 with one glue connection 1- to Sample 5 9.9 1.9 18.8 The pasteurized sample was Dialyzed against sodium enoate 0.02M, salt 0.15M, PH6, +4°C) It lowered the citric acid concentration in the sample and reduced the inhibition on coagulation tests.

透析液を３回かえ、各回１８００〜２０００ｍ１（７）新りｆｔ冷２０　ｍＭク エ：ｙ酸塩（ｐＨ６，０，１５Ｍ食塩）を導入した。総透析時間は２２時間であ った。Change the dialysate three times, each time using 1800-2000ml (7) of fresh ft cold 20mM cooler. E: Y acid salt (pH 6, 0, 15M common salt) was introduced. Total dialysis time was 22 hours. It was.

透析、低温殺菌サンプルの凝血活性は次のとおシであった。The clotting activity of the dialysis and pasteurized samples was as follows.

ウ　残存凝血活性 ン　第■因子　容　量　総第■因子　回　収　率　（非殺菌サン１　１．８　９ ．１　１６．４　８２．４　７５２　１．１　ｓ、ｏ　８．８　３０．９　４０ ．６　０．７　８．６　６　２６　２７４ｏ、ａ　７．６　６　２９２７ ｓｏ　ｉ、ｓｕ、ｏ　。C. Residual coagulation activity Factor ■ Volume Total Factor ■ times Yield rate (Non-sterilized sample 1 1.8 9 ．． 1 16.4 82.4 752 1.1 s, o 8.8 30.9 40 ．． 6 0.7 8.6 6 26 274 o, a 7.6 6 2927 so i, su, o.

、弓とＺ 国際調査報告　−, Bow and Z International search report −

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １）水性メジウム、クエン酸アンモニウムまたはクエン酸カリウム２．０Ｍ以上 からその水性メジウム中の飽和濃度までの存在下（ｔ（、蛋白質を加熱するとと 〕を特徴とする血漿蛋白質の熱安定化方法 ２）血漿濃縮物をクエン酸アンモニウムまたはクエン酸カリウム２．０Ｍ以−ヒ からその濃縮物中の飽和濃度までの存在下に低温殺菌することを特徴とする血漿 蛋白質の血漿濃縮物の低温殺菌方法 ３）　ｃｌ−ｘＮＡまたは第ＬＸ因子血漿分画の部分精製物を濃縮し、得られた 。濃縮物をクエン酸アンモニウムまだはクエン酸カリウム２．０Ｍ以上からその 濃縮物中の飽和濃度までの存在下に低温殺菌することを特徴とするＣＪ！−工Ｎ Ａまだは第■因子の低温殺菌血漿濃縮物の製造方法 ４）血漿分画はイオン交換クロマトグラフィーおよびポリエチレングリコール沈 殿によって部分精製する請求の範囲第６項記載の方法 ５）クエン酸塩は約２．５Ｍ以上の量存在させる請求の＆Ｈ１」第１項記載の方 法 ６）クエン酸塩は２．５Ｍ以上の量存在させる請求の範囲第２項記載の方法 ７）クエン酸塩は２．５Ｍ以上の量存在させる請求の範囲第６項記載の方法 ８）クエン酸塩はクエン酸アンモニウムである請求の範囲第１項から第７項まで のいずれかに記載の方法９）クエン酸塩はクエン酸カリウムである請求の範囲第 １項から第７項までのいずれかに記載の方法１０）メジウムまたは濃縮物のＰＨ はほぼ中性とする請求の範囲第１項から第７項までのいず九かに記載の方法 １[Claims] 1) Aqueous medium, ammonium citrate or potassium citrate 2.0M or more Heating a protein in the presence of (t) up to its saturation concentration in an aqueous medium ] Method for thermal stabilization of plasma proteins characterized by 2) Add plasma concentrate to ammonium citrate or potassium citrate 2.0M or more. plasma characterized in that it is pasteurized in the presence of up to saturation concentration in its concentrate. Method of pasteurization of protein plasma concentrates 3) Partially purified product of cl-xNA or factor LX plasma fraction was concentrated and obtained . Ammonium citrate concentrates and potassium citrate 2.0M or more. CJ! characterized by pasteurization in the presence of up to saturation concentration in the concentrate! - Engineering N Method for producing pasteurized plasma concentrate of factor A 4) Plasma fractionation was performed by ion exchange chromatography and polyethylene glycol precipitation. The method according to claim 6, wherein the method is partially purified by 5) The person described in item 1 of “&H1” in which citrate is present in an amount of about 2.5M or more. law 6) The method according to claim 2, wherein the citrate is present in an amount of 2.5M or more. 7) The method according to claim 6, wherein the citrate is present in an amount of 2.5M or more. 8) Claims 1 to 7 in which the citrate is ammonium citrate. 9) The citrate is potassium citrate. Method according to any of paragraphs 1 to 7 10) pH of medium or concentrate is substantially neutral, the method according to any one of claims 1 to 7. 1