JPS5944658A - Analytical element - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To enable the analysis of the reduction type coenzyme in a biological fluid sample, by using an analytical element incorporated therein with an electron transmitting agent and a dye forming material in the state that both materials cannot react substantially with each other in either one layer of a reagent layer and a developing layer. CONSTITUTION:This analytical element has a substrate such as, for example, cellulose acetate, having light transmittability and impermeable to liquid, a reagent layer consisting of a gelatin dervi. such as gelatin or the like contg. at least one kind of reagent which reacts with the component in a fluid sample, and a developing layer such as brush polymer which penetrates the components in said fluid sample into said reagent layer. The element is constituted in this case by incorporating an electron transmitting agent such as, for example, N-methyl phenazinmethosulfates and a dye forming meterial of tetrazolium salts in either one layer of said reagent layer and developing layer in the stage that both materials cannot react with each other until the fluid sample is applied. The storage stability of the reagent is improved by the above-mentioned constitution and the analytical element having excellent colorability and good performance is obtd. by the above-mentioned constitution.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明、分析化学、特に流体中の予め定められた特定成
分を分析する分析素子に関し、更に詳しくは生物学的流
体試料中の還元型補酵素を分析するための分析素子に関
する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to analytical chemistry, particularly to an analytical element for analyzing predetermined specific components in a fluid, and more particularly to an analytical element for analyzing reduced coenzymes in biological fluid samples. Regarding elements.

従来、流体試料中の検体成分を分析する方法に関して
は、多数開発がなされてきたが、これらは大別して溶液
内での反応系と固相の反応系との（以種類に分けられる
。溶液系における分析反応（以下、ウェット。ケミスト
リーと略す）は、用手法と呼ばれる全く機械を用いない
分析方法から、近年病院の臨床検査室等において多用さ
れている自動定量分析装置まで多々知られている。Conventionally, many methods have been developed for analyzing analyte components in fluid samples, but these can be roughly divided into two types: reaction systems in solution and reaction systems in solid phase. A wide variety of analytical reactions (hereinafter referred to as wet chemistry) are known, ranging from analytical methods called manual methods that do not use any machines at all, to automated quantitative analyzers that have been frequently used in hospital clinical laboratories in recent years.

ウェット・ケミストリーに関しては、流体試料中または
流体試料から由来する還元型補酵素を検出する方法とし
て、分光光度計を用いた初速度広やホルマザン色素の生
成を利用した比色法等がある。Regarding wet chemistry, methods for detecting reduced coenzymes in or derived from fluid samples include wide initial velocity using a spectrophotometer and colorimetry using the production of formazan dye.

ホルマザン色素形成を利用した比色法は、流体試料また
は流体試料から由来する還元型ピリジンヌクレオチドの
電子が、電子伝達体であるジアホラーゼまたはフェナゾ
ニウム塩類を介してテトラゾリウム塩に伝達され、その
結果ホルマサン色素が生成される。In the colorimetric method using formazan dye formation, electrons from a fluid sample or a reduced pyridine nucleotide derived from a fluid sample are transferred to a tetrazolium salt via an electron carrier, diaphorase or phenazonium salts, and as a result, a formazan dye is formed. generated.

しかしながら、上記の方法は緩衝液および乳酸塩の存在
下で電子伝達剤とテトラゾリウム塩が共存していると、
試薬の安定性が非常に悪化するという重大な欠点を有す
るだけでなく、試薬の混合時における精度の低下や、水
に不溶性であるホルマザン生成による水溶液中での沈澱
が原因となって起る精度の低下ならびに再現性の劣化等
の問題点を有している。However, the above method does not work if the electron transfer agent and tetrazolium salt coexist in the presence of a buffer and lactate.
Not only does it have the serious disadvantage of very poor stability of the reagent, but also the accuracy decreases when mixing the reagent and the accuracy that occurs due to precipitation in the aqueous solution due to the formation of formazan, which is insoluble in water. This method has problems such as a decrease in performance and a deterioration in reproducibility.

すなわち、上記の方法は分析素子の安定性、精度等に関
して欠点を有し、また操作も煩雑であっで熟練した操作
技術を必要とし、莫大な時間と労力をも必要とされる方
法に属する。That is, the above-mentioned method has drawbacks in terms of stability, precision, etc. of the analytical element, and is also complicated and requires a skilled operating technique, and belongs to methods that require an enormous amount of time and effort.

これに対して同相の分析反応する以下、ドライ・ケミス
トリーと略す）を用いる分析法も広範に用いられている
が、これらにろ紙等に試薬を含浸させた形で提供される
。On the other hand, analytical methods using in-phase analytical reactions (hereinafter referred to as dry chemistry) are also widely used, but these are provided in the form of filter paper or the like impregnated with reagents.

上記のろ紙は、例えば米国特許第３，０５０，３７３号
あるいは同第３，０６０，５２３号等に記載されている
ようにろ紙の如き吸水性繊維費担体に試薬溶液を含浸さ
せ、乾燥させて作られるものである。The above-mentioned filter paper is produced by impregnating a water-absorbing fiber carrier such as filter paper with a reagent solution and drying it, as described in, for example, U.S. Pat. No. 3,050,373 or U.S. Pat. It is something that is made.

これらは一般に分析試験紙または単に試験片と呼称され
るもので、上記の試験片上に流体試料を滴下するか、ま
たは流体試料中へ試験片を浸漬させ試験片の色変化また
は濃度変化を肉眼判定か、または反射濃度計により測定
し、流体試料中の特定成分の濃度レベルを決定するもの
である。These are generally referred to as analytical test strips or simply test strips, and a fluid sample is dropped onto the test strip, or the test strip is immersed in the fluid sample, and the change in color or concentration of the test strip is visually determined. or by a reflection densitometer to determine the concentration level of a particular component in a fluid sample.

これらの試験片は、その取扱いが簡便であり、かつ直ち
に結果が得られるので有用ではあるが、その構成上から
半定量または定性分析の領域にとどまっている。Although these test pieces are useful because they are easy to handle and provide immediate results, their composition limits them to semi-quantitative or qualitative analysis.

一方、上述の如きに従来の分析方法に対して操作性の簡
便なドライ・ケミストリーを用い、その上高い定量性を
有する多層分析素子が知られている。On the other hand, as described above, multilayer analytical elements are known that use dry chemistry, which is easier to operate than conventional analytical methods, and that also have high quantitative performance.

列えば特公昭５３−２１６７７号、特開昭５５−１６４
３５６号、特願昭５６−６５４４６号、同５５−１３２
０３号ならびに同５６−１８９７８４号等に上記多層分
析素子が記載されている。For example, Tokuko No. 53-21677, Tokukai No. 55-164
No. 356, Japanese Patent Application No. 56-65446, No. 55-132
The multilayer analysis element described above is described in No. 03 and No. 56-189784.

しかしながら、上記各刊行物等に記載された構成になる
分析素子を還元型補酵素測定用に適用した場合、試薬の
安定性および測定精度等の点で充分に満足し得るもので
はなく、従って操作が簡単で、かつ試薬の安定性や測定
精度対に関して信頼性の高い多層分相素子の開発が強く
望まれているのが現状である。However, when the analytical elements having the configurations described in the above publications are applied to the measurement of reduced coenzyme, they are not fully satisfactory in terms of reagent stability and measurement accuracy, and therefore, the operation At present, there is a strong desire to develop a multilayer phase splitting element that is easy to use and highly reliable in terms of reagent stability and measurement accuracy.

本発明の目的は、従って試薬の安定性および測定精度に
優れ、かつ操作も簡単な還元型補酵素測定用分析素子を
提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to provide an analytical element for measuring reduced coenzyme that has excellent reagent stability and measurement accuracy and is easy to operate.

本発明者等は、上記に関し鋭意検討を重ねた結果、光透
過性で液体不浸透性の支持体と、流体試料中の成分と反
応する少なくとも一種の試験を含む少なくとも一層の試
薬層と、該試薬層の該支持体とは反対側に位置し、該流
体試料中の成分を該試薬層へ透過させる少なくとも一層
の展開層を有する分析素子において、上記試薬層および
展開層の少なくともいずれか一層に少なくとも一種の電
子伝達剤ならびに少なくとも一種の色素形成物質を互い
に実質的に反応し得ない状態に含浸せしめた分析素子に
より前記の目的を達成できることを見出した。As a result of intensive studies regarding the above, the present inventors have discovered that a light-transmissive and liquid-impermeable support, at least one reagent layer containing at least one test that reacts with a component in a fluid sample, and In an analytical element having at least one spreading layer located on the opposite side of the reagent layer from the support and allowing components in the fluid sample to permeate to the reagent layer, at least one of the reagent layer and the spreading layer is provided. It has been found that the above object can be achieved by an analytical element impregnated with at least one electron transfer agent and at least one color-forming substance in such a manner that they cannot substantially react with each other.

以下、本発明を更に詳細に説明する。The present invention will be explained in more detail below.

前記本発明に係わる電子伝達剤は、還元型補酵素の存在
下に還元され還元された上記電子伝達剤は前記色素形成
物質を還元し、可視部に吸収をもつ色素を形成せしめる
ものである。本発明において用いられる電子伝達剤とし
ては、Ｎ−メチルフェナジン・メトサルフェート類（例
えばＮ−メチルフェナジン・メトサルフェートまたは１
−メトキシ−Ｎ−メチルフェナジンメトサルフェー等）
、メルトラブル−、メチレンブルーおよびジアホラーゼ
を使用することができ、好ましい電子伝達剤としては、
Ｎ−メチルフェナジンメトサルフェート類を挙げること
ができる。The electron transfer agent according to the present invention is reduced in the presence of a reduced coenzyme, and the reduced electron transfer agent reduces the pigment-forming substance to form a pigment that absorbs in the visible region. As the electron transfer agent used in the present invention, N-methylphenazine methosulfate (for example, N-methylphenazine methosulfate or
-methoxy-N-methylphenazine methosulfate, etc.)
, meltlab, methylene blue and diaphorase can be used; preferred electron transfer agents include
Mention may be made of N-methylphenazine methosulfates.

一方、上記の本発明に係わる色素形成物質としては、テ
トラゾリウム塩類が好ましく用いられ、本発明において
用いられる上記テトラゾリウム塩類は、前述により色素
形成後は不に対して難溶ないしは不要性になり、通常ワ
ェット・ケミストリー法では使用が難しいものの、本発
明の分析素子においては上記色素が耐拡散性であり、不
望のリンギンクを防止し、測定の定量性を向上せしめる
点で好ましく使用することができる。On the other hand, as the pigment-forming substance according to the present invention, tetrazolium salts are preferably used, and as described above, the tetrazolium salts used in the present invention become poorly soluble or unnecessary after pigment formation, and are usually Although it is difficult to use in the wet chemistry method, the above-mentioned dye has diffusion resistance in the analytical element of the present invention, prevents undesired ringing, and can be preferably used in terms of improving the quantitative nature of measurement.

本発明において有用とされる上記テトラゾリウム塩とし
ては、例えば３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，
４′−ビフェニレン）−ビス〔２−（ｐ−ニトロフェニ
ル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド）（ＮＢＴ
）、３，３′−（３，３′−ジメトキシ−４，４′−ビ
フェニレン）−ビス〔２，５−ジフェニルテトラゾリウ
ムクロリド）（ＢＴ）、３−（４′，５′−ジメチル−
トリアゾリル−２）−２，４−ジフェニルナトラソリウ
ムプロミド（ＭＴＴ）、２−（ｐ−ヨードフェニル）−
３−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル−テトラゾ
リウムクロリド（ＩＮＴ）、２，２′，５，５’−テト
ラ−（ｐ−ニトロフェニル）−３，３′−（３−ジメト
キシ−４−ジフェニレン）−ジテトラゾリウムクロリド
（ＴＮＢＴ）、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウ
ムクロリド（ＴＴ）および３，３′−（４，４′−ビフ
ェニレン）−ビス〔２，５−ジフェニルテトラゾリウム
クロリド〕（ＮＴ）等を挙げることができる。Examples of the above-mentioned tetrazolium salts useful in the present invention include 3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,
4'-biphenylene)-bis[2-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride) (NBT
), 3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)-bis[2,5-diphenyltetrazolium chloride) (BT), 3-(4',5'-dimethyl-
Triazolyl-2)-2,4-diphenylnatrasolium bromide (MTT), 2-(p-iodophenyl)-
3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-tetrazolium chloride (INT), 2,2',5,5'-tetra-(p-nitrophenyl)-3,3'-(3-dimethoxy-4- diphenylene)-ditetrazolium chloride (TNBT), 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TT) and 3,3'-(4,4'-biphenylene)-bis[2,5-diphenyltetrazolium chloride] (NT ) etc.

そして本発明においては、上記電子伝達剤と色素形成物
質とは、分析素子を構成する段階では、互いに実質的に
反応し得ない状態で分析素子内に含有せしめられている
ことを特徴とするものである。本発明で言う実質的に反
応し得ない状態とは、例えば上記両成分が分析素子内で
化学的に影響を及ぼし合わない範囲で物理的に隔離され
た状態にあることを意味している。In the present invention, the electron transfer agent and the pigment-forming substance are contained in the analytical element in a state in which they cannot substantially react with each other at the stage of constructing the analytical element. It is. The term "substantially non-reactive state" as used in the present invention means, for example, that the two components are physically isolated within the analytical element to the extent that they do not chemically influence each other.

このように両成分を互いに化学的に影響を及ぼさない状
態で分析素子の構成層に含有せしめるための手段として
は、例えば写真技術において良く知られている疎水性化
合物を親水性コロイド液中に分散、含有せしめる方法を
利用することができる。As a means for incorporating both components into the constituent layers of an analytical element in a state where they do not chemically influence each other, for example, a hydrophobic compound well known in the photographic technology is dispersed in a hydrophilic colloid liquid. , it is possible to use a method of containing the compound.

すなわち、本発明に係わる電子伝達剤と色素形成物質の
少なくともどちらか一方を、例えば米国特許第２，３０
４，９４０号および同第２，３２２，０２７号に記載さ
れた方法を利用して分析素子の構成層塗布液中に含有さ
せることが好ましい。具体的には、前記の電子伝達剤と
色素形成物質を共に、あるいはその何れか一方を油また
は高沸点有機溶媒に溶解し、得られた油状溶液を上記分
析素子構成層の塗布液中に分散せしめ、この分散液を塗
布して構成層を形成させればよい。That is, at least one of the electron transfer agent and the pigment-forming substance according to the present invention may be used in accordance with, for example, U.S. Pat.
It is preferable to incorporate it into the coating solution for the constituent layers of the analytical element using the methods described in No. 4,940 and No. 2,322,027. Specifically, the electron transfer agent and/or the pigment-forming substance are dissolved in oil or a high-boiling organic solvent, and the resulting oily solution is dispersed in the coating liquid for the layer constituting the analytical element. Then, this dispersion may be applied to form a constituent layer.

また、上記の分散方法の変形として、例えは米国特許第
２，８０１，１７１号に記載された方法を用いてもよい
。この方法では被溶解物質の油状溶媒への溶解を助ける
ためにエチルアセテートまたは低分子量ケトンのような
低分子酸の補助溶媒が使用される。Also, as a variation of the above dispersion method, for example, the method described in US Pat. No. 2,801,171 may be used. In this method, a low molecular acid cosolvent such as ethyl acetate or a low molecular weight ketone is used to aid in dissolving the substance to be dissolved in the oily solvent.

上記のようなオイルプロテクト分散法により前記両成分
の両者または、その一方を分散せしめた塗布液を用いて
分析素子の構成層を形成せしめた場合には、両成分が互
いに反応することはない。When the constituent layers of the analytical element are formed using a coating liquid in which both or one of the two components is dispersed by the oil protection dispersion method as described above, the two components do not react with each other.

また両成分のうちの一方の成分のみが、上記分散法を利
用して分散させた場合には、他方の成分は上記以外の方
法、例えば水または水と容易に混合し合う有機溶媒（例
えばメタノール、エタノール、アセトン）を用いて溶解
し、塗布液に含有せしめた場合に得られた分析素子内に
おいて両成分は互いに反応することはない。In addition, when only one of the two components is dispersed using the above-mentioned dispersion method, the other component can be dispersed using a method other than the above-mentioned method, such as water or an organic solvent that is easily miscible with water (for example, methanol). , ethanol, acetone) and incorporated into the coating liquid, the two components do not react with each other in the resulting analytical element.

本発明により構成層塗布液に含有せしめ得る電子伝達剤
および色素形成物質は、分析素子の展開層もしくは試薬
層に別々に含有せしめてもよく、また試薬層中に共に含
有させたり、試薬層が１層以上からなる場合には個々の
試薬層に別々に含有させる如き構成をとることもできる
。The electron transfer agent and the dye-forming substance that can be contained in the constituent layer coating solution according to the present invention may be contained separately in the developing layer or reagent layer of the analytical element, or may be contained together in the reagent layer or in the reagent layer. When the reagent layer is composed of one or more layers, it is also possible to adopt a structure in which the reagent layer is contained separately in each reagent layer.

上記のように分析素子内に含有せしめられた電子伝達剤
と色素形成物質とは、流体試料が本発明の分相素子に適
用された時に始めて還元型補酵素の存在下に前述の如く
反応を起し、所望の可視部に吸取のある色素を形成する
ことができる。The electron transfer agent and the pigment-forming substance contained in the analytical element as described above react as described above in the presence of a reduced coenzyme only when a fluid sample is applied to the phase splitting element of the present invention. It is possible to form a dye with absorption in the desired visible area.

本発明に係る上記試薬層は、該層に分析すべき検体成分
と定量反応を行なわせる試薬類を含有せしめ、該層内で
定量反応を行なわしめるために使用される。The reagent layer according to the present invention is used to contain reagents that cause a quantitative reaction with a sample component to be analyzed, and to perform a quantitative reaction within the layer.

そして上記試薬層は親水性コロイドもしくは有機溶媒に
可溶性の高分子物質を媒体とし、支持体上に塗布するこ
とによって層として設けるため、ろ紙の如き担体に試薬
を含浸させる従来のものとは異なり、均一に試薬類を含
有することが可能であり、かつ試薬の含有量を自由にコ
ントロールできるという利点を有している。このような
本発明に係る試薬層に用いられる親水性コロイド物質と
しては、天然または合成の高分子物質が好ましいが、更
に好ましくはゼラチン、変性ゼラチン等のゼラチン誘導
体、ホリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなど
があげられる。この中で特に好ましい親水性コロイド物
質としては、ゼラチン等のゼラチン誘導体を挙げること
ができるが、還元作用を有する物質の除去処理がなされ
たゼラチンが最も好ましい。The reagent layer uses a hydrophilic colloid or a polymeric substance soluble in an organic solvent as a medium and is provided as a layer by coating it on a support, unlike conventional methods in which a support such as filter paper is impregnated with a reagent. It has the advantage that reagents can be uniformly contained and the content of reagents can be freely controlled. The hydrophilic colloid substance used in the reagent layer according to the present invention is preferably a natural or synthetic polymeric substance, and more preferably gelatin, a gelatin derivative such as modified gelatin, holvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, etc. can give. Among these, particularly preferable hydrophilic colloid substances include gelatin derivatives such as gelatin, but gelatin that has been treated to remove substances having a reducing action is most preferable.

これらの親水性コロイド物質は、約１５０〜５００％の
膨潤度を有することが好ましく、また、その膜厚は所望
に応じて選択することが可能であり、少なくとも約５ミ
クロン以上であることが必要である。These hydrophilic colloid substances preferably have a swelling degree of about 150 to 500%, and the film thickness can be selected as desired, and it is necessary that it is at least about 5 microns or more. It is.

前記有機溶媒に可溶性の高分子物質としては、例えはポ
リスチレン類、ポリアクリル酸エステル類、ポリメタク
リル酸エステル類、メチルセルロース類、エチルセルロ
ース等のアルキルセルロース類、ポリビニルブチラール
、ポリビニルカーボネート等を挙げることができる。Examples of the polymeric substances soluble in the organic solvent include polystyrenes, polyacrylic esters, polymethacrylic esters, alkyl celluloses such as methyl celluloses and ethyl cellulose, polyvinyl butyral, and polyvinyl carbonate. .

上記のようにして形成される試薬層に含有される試薬は
、試料中の分析すべき検体成分およびこの成分を分析す
るために選択した分析反応によって決まることは言うま
でもない。また選ばれた分析反応が二種以上の試薬から
構成されている場合この試薬を同一試薬層内に一諸に混
合して含有させても、また、二種以上の試薬を別層とし
て含有させてもよい。これらは分析反応自体の作用機構
によって決定されることもあり、好ましくない影響を及
ぼさない限りにおいて、その構成は任意である。It goes without saying that the reagents contained in the reagent layer formed as described above are determined by the analyte component to be analyzed in the sample and the analytical reaction selected to analyze this component. In addition, if the selected analytical reaction is composed of two or more types of reagents, these reagents may be mixed and contained in the same reagent layer, or the two or more types of reagents may be contained in separate layers. It's okay. These may be determined by the mechanism of action of the analytical reaction itself, and their configuration is arbitrary as long as it does not have an undesirable effect.

一方、試料中の二種以上の検体成分を、同一の試薬層内
で分析反応を行なうことは可能である。On the other hand, it is possible to perform analytical reactions on two or more analyte components in a sample within the same reagent layer.

この際、二重以上の分析反応は相互に他を妨害しないよ
うに、また、生成した反応生生物を測定する際、同様に
互いに他に影響を及ぼさないよう分析反応を選択する必
要がある。In this case, it is necessary to select analytical reactions so that two or more analytical reactions do not interfere with each other, and similarly, when measuring the generated reaction organisms, they do not influence each other.

以上により構成された試薬層は、一般的には本発明に係
る支持体上に塗布方法によって破覆することができるが
、前述のとおり試薬層と支持体との間に本発明の目的に
適応しないものは別として各種の層を設けることができ
る。The reagent layer configured as described above can generally be destroyed by a coating method on the support according to the present invention, but as described above, there is a gap between the reagent layer and the support that is suitable for the purpose of the present invention. Various layers can be provided, except those that do not.

本発明に係わる展開層は、特公昭５３−２１６７７号に
記載された性能、即ち（１）一定容量の流体試料を単位
面積当り一定容量を試薬層に均一に配布し、（２）流体
試料中の分析反応を阻害する物質または要因を除去し、
（３）分光光度分析を行なう際に支持体をへて透過する
測定光を反射するバッククラウンド作用を行なう機能を
有するものであれば、任意に選択する事が出来る。従っ
て、本発明に係わる展間層は、上記３つの機能を全て行
ない得るが、また３つの機能を適宜分離し、各機能毎に
別の層を使用することも可能である。更に、３つの機能
のうち、２つの機能を有する層と、残りの他の機能を有
する層を組み合わせ使用することもできる。The spreading layer according to the present invention has the performance described in Japanese Patent Publication No. 53-21677, that is, (1) uniformly distributes a fixed volume of fluid sample per unit area to the reagent layer, and (2) distributes a fixed volume of fluid sample in the reagent layer. remove substances or factors that inhibit the analytical reaction of
(3) Any material can be selected as long as it has a background effect of reflecting measurement light transmitted through the support during spectrophotometric analysis. Therefore, the interlayer according to the present invention can perform all of the above three functions, but it is also possible to separate the three functions as appropriate and use a separate layer for each function. Furthermore, it is also possible to use a combination of a layer having two of the three functions and a layer having the remaining functions.

例えば同情特許記載の二酸化チタンおよびニ酢酸セルロ
ースから成るプラッシュポリマーと呼称される非繊維多
孔質媒体の展開層、特開昭５６−２４５７６号、特願昭
５６−１３２０３号および特願昭５６−６５４４６号な
どに記載の繊維構造展開層が挙げられる。特に上記繊維
構造展開層は、血球部分もすみやかに移送することが可
能な素材として特に有用であり、更に本発明の目的の一
つである酵素の如き巨大分子の展開移送に有用なもので
ある。For example, a spreading layer of a non-fibrous porous medium called a plush polymer consisting of titanium dioxide and cellulose diacetate is described in the Sympathy Patent, JP-A-56-24576, JP-A-56-13203 and JP-A-56-65446. Examples include the fiber structure spread layer described in No. In particular, the fiber structure spreading layer is particularly useful as a material that can quickly transport blood cell parts, and is further useful for spreading and transporting macromolecules such as enzymes, which is one of the objects of the present invention. .

本発明に係わる前記の電子伝達剤および色素形成物質は
、前述のとおり本発明の分析素子の上記試薬層ならびに
展開層の少なくともいずれか一層中にそれぞれ単独で、
もしくは同一層中に混合して含有させて使用される。具
体的には上記構成層のバインダーである高分子物質を含
有する前記の有機溶媒もしくは水溶液中に添加して分散
または溶解せしめ、これを所望の層として塗布すること
ができる。また本発明に係わる電子伝運剤ならびに色素
形成物質は、特願昭５６−１５５７８８号および同５７
−６５０５号に記載された蛋白質のような巨大分子を収
納する機能を有する巨大分子を収納し所望の呈色を行わ
しめるには、より好ましいものである。As described above, the electron transfer agent and the dye-forming substance according to the present invention are each contained singly in at least one of the reagent layer and the developing layer of the analytical element of the present invention.
Alternatively, they are used by being mixed and contained in the same layer. Specifically, it can be added to the organic solvent or aqueous solution containing the polymeric substance that is the binder of the constituent layer, dispersed or dissolved, and then applied as a desired layer. Further, the electron transport agent and the pigment forming substance according to the present invention are disclosed in Japanese Patent Application Nos. 56-155788 and 57-155.
It is more preferable to accommodate macromolecules having the function of accommodating macromolecules such as the protein described in No. 6505, and to achieve desired coloration.

上記試薬層には、用いられる試薬の特性により、写真業
界で公知であるオイルプロテクト分散法、直接分散法等
の分散法および溶解等により、試薬を含有させることが
出来る。Depending on the characteristics of the reagent used, the reagent can be contained in the reagent layer by a dispersion method such as an oil protect dispersion method or a direct dispersion method, or by dissolution, which are known in the photographic industry.

また他の付加的な添加剤として、例えば保恒剤、緩衝剤
、界面活性剤等、種々の添加剤も所望に応じて添加する
ことが出来る。In addition, various other additives such as preservatives, buffers, surfactants, etc. can be added as desired.

特に界面活性剤は流体試料を本発明の素子に適用した際
の浸透速度の調節等有効に用いることができる。In particular, surfactants can be effectively used to adjust the permeation rate when a fluid sample is applied to the element of the present invention.

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
またはカチオン性）、非イオン性を問わず界面活性剤を
使用することが可能であるが、好ましくは非イオン性界
面活性剤が有効である。非イオン性界面活性剤の例とし
ては、例えば２，５−ジ−ｔ−ブチルフェノキシポリエ
チレングリコール、ｐ−オクチルフェノキシポリエチレ
ングリコール、ｐ−イソノニルフェノキシポリエチレン
グリコール等のアルキル置換フェノールのポリアルキレ
ングリコール誘導体、高級脂肪酸のポリアルキレングリ
コールエステルなどが挙げられる。As the usable surfactant, it is possible to use both ionic (anionic or cationic) and nonionic surfactants, but nonionic surfactants are preferably effective. . Examples of nonionic surfactants include polyalkylene glycol derivatives of alkyl-substituted phenols such as 2,5-di-t-butylphenoxypolyethylene glycol, p-octylphenoxypolyethylene glycol, and p-isononylphenoxypolyethylene glycol; Examples include polyalkylene glycol esters of higher fatty acids.

これらの界面活性剤は流体試料の試薬層への浸透速度を
調節し、同時に好ましからざる「クロマトグラフィ現象
」発生を抑制する効果を有する。These surfactants have the effect of regulating the rate of penetration of the fluid sample into the reagent layer and at the same time suppressing the occurrence of undesirable "chromatographic phenomena."

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることが可
能であるが、塗布液の重積に対して１０重量パーセント
乃至０．００５重量パーセント、好ましくは６重量パー
セント乃至０．０５重量パーセント用いることができる
。The surfactant can be used in a widely selected amount, but preferably from 10% to 0.005% by weight, preferably from 6% to 0.05% by weight, based on the weight of the coating solution. be able to.

本発明の分析素子に係る前記の液体不浸透性の光透過性
支持体（以下、本発明に係る支持体と略す。）は、液体
不浸透性で、かつ光透過性であれば、その種類を問わな
いが、例えば酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレ
ート、ポリカーボネート、且たはポリスチレンのような
種々の重合体材料が、この使用目的に適する。この場合
の上記支持体の厚さは任意であるが、好ましくは約５０
ミクロンから２５０ミクロンである。また、本発明に係
る支持内の観察側の一側面は、その目的に応じて任意に
加工することは可能である。更に試薬層を積層する側の
支承体面に、場合によっては光透過性の下塗り層を使用
して試薬層と支持体との接着性を改良することが出来る
。The above-mentioned liquid-impermeable, light-transparent support (hereinafter referred to as the support according to the present invention) related to the analytical element of the present invention is liquid-impermeable and light-transparent, so long as the type thereof is A variety of polymeric materials are suitable for this purpose, such as, but not limited to, cellulose acetate, polyethylene terephthalate, polycarbonate, or polystyrene. The thickness of the support in this case is arbitrary, but preferably about 50
It is from micron to 250 micron. Further, one side surface of the observation side of the support according to the present invention can be arbitrarily processed depending on the purpose. Furthermore, it is possible to improve the adhesion between the reagent layer and the support by using a light-transmitting undercoat layer on the side of the support on which the reagent layer is laminated, depending on the case.

本発明の分析素子は種々の異なる配置のうち、任意の一
つをとることが可能である。更に本発明の試薬層と各種
の機能層、試薬含有層および部材、例えば米国特許第３
，９９２，１５８号記載の試薬層、反射層、下塗り層、
米国特許第４，０４２，３３５号記載の放射線ブロッキ
ング層、米国特許請求第４，０６６，４０３号記載のバ
リヤー層、米国特許第４，１４４，３０６号記載のレジ
ストレーション層、米国特許第４，１６６，０９３号記
載のマイグレーション阻止層、米国特許第４，１２７，
４９９号記載のシンチレーション層、特開昭５５−９０
８５６号記載の清掃層および米国特許第４，１１０，０
７９号記載の破壊性ポッド状部材等を任意に組み合わせ
て本発明の目的に合わせた分析素子を構成することが可
能である。The analytical element of the present invention can take any one of a variety of different configurations. Furthermore, the reagent layer and various functional layers, reagent-containing layers and members of the present invention, such as U.S. Pat.
, 992, 158, a reagent layer, a reflective layer, an undercoat layer,
Radiation blocking layer as described in U.S. Pat. No. 4,042,335; Barrier layer as in U.S. Pat. No. 4,066,403; Registration layer as in U.S. Pat. No. 4,144,306; U.S. Pat. No. 166,093, the migration inhibiting layer described in U.S. Patent No. 4,127,
Scintillation layer described in No. 499, JP-A-55-90
856 and the cleaning layer described in U.S. Pat. No. 4,110,0
It is possible to construct an analytical element suitable for the purpose of the present invention by arbitrarily combining the breakable pod-shaped members described in No. 79.

上記の種々の層は、従来写真工業において公知のスライ
ドホッパー塗布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等を随時
用いることで任意の膜厚の層を塗布することが可能であ
る。The various layers mentioned above can be coated to any desired thickness by using slide hopper coating, extrusion coating, dip coating, etc., which are conventionally known in the photographic industry.

本発明の分析素子を用いて検出可能な変化として分析結
果を得たのち、反射スペクトロフォトメトリーにより測
定される。このようにして得られた測定値は、あらかじ
め作製しておいて検査線に当てはめることで未知被検物
質の量を決定することかできる。After obtaining an analytical result as a detectable change using the analytical element of the present invention, it is measured by reflection spectrophotometry. The measurement value thus obtained can be prepared in advance and applied to the test line to determine the amount of the unknown test substance.

以上のように構成された本発明の分析素子は、展開層か
ら流体試料を供給した後、試薬層での分析反応を透明支
持体側から観察することにより目的を達成できる。The analytical element of the present invention configured as described above can achieve its purpose by observing the analytical reaction in the reagent layer from the transparent support side after supplying a fluid sample from the developing layer.

本発明の分析素子に適用される流体試料の量は任意に定
めることができるが、好ましくは約５０μｌから約５μ
ｌであり、更に好ましくは約２０μｌから５μｌである
。通常約１０μｌの流体試料を適用するのが好ましい。The amount of fluid sample applied to the analytical element of the present invention can be determined arbitrarily, but is preferably about 50 μl to about 5 μl.
1, more preferably about 20 μl to 5 μl. It is usually preferred to apply a fluid sample of about 10 μl.

本発明の分析素子は、全血液、血清および面漿のいずれ
の分析にも不都合なく用いることができる。更には尿、
リンパ液、髄液等の他の体液も不都合なく用いられ。全
血液を用いる場合には、必要に応じて検出のための輻射
線が血球により防害を受けるのをさけるために前述の輻
射線ブロッキング層または他の反射層を設けることがで
きる。The analytical element of the present invention can be used for the analysis of whole blood, serum, and facial plasma without any disadvantage. Furthermore, urine,
Other body fluids such as lymph and cerebrospinal fluid may also be used without disadvantage. If whole blood is used, the aforementioned radiation blocking layer or other reflective layer can be provided as necessary to prevent radiation for detection from being blocked by blood cells.

本発明の分析素子に用いられる分析反応は、その目的に
より任意に定めることができるが、例えば臨床化学の分
野に有用であり、特に生物学的液体試料、すなわち血液
または尿中の成分の分析に用いられる。これらは分析試
薬を適宜選択することで、例えばアミラーゼ、トリグリ
セリド、グルタミン酸オキザロ酢酸、トランスアミナー
ゼ、グルタミン酪ピルビン酸トランスアミナーゼ、乳酸
脱水素酵素、クレアチンホスンオキナーゼ等の多くの成
分の分析に使用し得るように容易に構成することができ
る。The analytical reaction used in the analytical element of the present invention can be arbitrarily determined depending on the purpose, but is useful, for example, in the field of clinical chemistry, and is particularly useful for analyzing components in biological fluid samples, such as blood or urine. used. These can be used for the analysis of many components such as amylase, triglyceride, glutamate oxaloacetate, transaminase, glutamine butypyruvate transaminase, lactate dehydrogenase, creatine phosunokinase, etc. by appropriately selecting analytical reagents. Can be easily configured.

以上詳細に説明した如く、本発明の分析素子は電子伝達
剤と色素形成物質とが互いに反応し得ない状態で構成層
中に含有せしめることができたので試薬の保存、安定性
が改良され、発色性に優れているだけでなく、不均一濃
度の発生や、クロマトグラフ現象もほとんど見られず、
通常の分光光度計により簡単、かつ迅速に流体試料特に
生物学的流体試料中の成分の定量分析に用いるととが可
能となり、極めて実用的に有用である。As explained in detail above, in the analytical element of the present invention, the electron transfer agent and the dye-forming substance can be contained in the constituent layers in a state where they cannot react with each other, so that the storage and stability of the reagent are improved. Not only does it have excellent color development, but there are almost no uneven concentrations or chromatographic phenomena.
A conventional spectrophotometer can be easily and quickly used for quantitative analysis of components in a fluid sample, especially a biological fluid sample, and is extremely useful for practical purposes.

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、これによって本発明の実施態様が限定されるものでは
ない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the embodiments of the present invention are not limited thereby.

実施例１ 膜厚約１８０ミクロンの透明な下引き済みポリエチレン
テレフタレート支持体上に下記第１表に示す組成で不発
明の試薬層および比較のための試薬層をそれぞれ乾燥膜
厚３５ミクロンになるように設け、次いで上記両試薬層
上に下記第２表に示す組成による展開層を設け、下記第
３表に示す如き本発明の分析素子および比較用の分析素
子を作成した。Example 1 An uninvented reagent layer and a comparative reagent layer having the compositions shown in Table 1 below were formed on a transparent subbed polyethylene terephthalate support having a film thickness of about 180 microns, each having a dry film thickness of 35 microns. Then, a developing layer having the composition shown in Table 2 below was provided on both of the above reagent layers to prepare an analytical element of the present invention and a comparative analytical element as shown in Table 3 below.

（第１表） なお、上記表の各試薬層は０．２Ｍトリスバッファーｐ
Ｈ８．４を用いて分散液を作製したものである。(Table 1) In addition, each reagent layer in the above table is 0.2M Tris buffer p.
A dispersion liquid was prepared using H8.4.

（第２表） （第３表） 上記本発明の分析素子（１〜８）および比較分析素子（
１〜４）に対して、各素子作成直後および３５℃、３日
間の保存後の反射濃度（カプリ）並びに各素子作成直後
および３５℃日間保存後ユニキットレートＬＤＨ（中外
製薬ＫＫ）を用いて確認したＬＤＨ活性１２６ロプレス
キー単位、２５３ロブレスキー単位および５０６ロブレ
スキー単位の各標準血清を１０μｌ展開層上に滴下し、
３７℃、１０分間インキュベートした後の反射濃度をλ
ｍａｘが５８０ｎｍのフィルターを用いて支持体側から
測定し、下記第４表が示す結果を得た。(Table 2) (Table 3) The analytical elements (1 to 8) of the present invention and the comparative analytical elements (
1 to 4), the reflection density (Capri) immediately after each element was created and after storage at 35°C for 3 days, and the reflection density (Capri) immediately after each element was created and after storage at 35°C for 3 days using Unikitrate LDH (Chugai Pharmaceutical KK). 10 μl of each standard serum with confirmed LDH activity of 126 Lobleski units, 253 Lobleski units, and 506 Lobleski units was dropped onto the developing layer.
The reflection density after incubation at 37°C for 10 minutes is λ
Measurement was performed from the support side using a filter with a maximum wavelength of 580 nm, and the results shown in Table 4 below were obtained.

上記表の結果から明らかなように比較分析素子はカプリ
濃度が高く、しかも呈色濃度が非常に低いのに対し、本
発明の分析素子はカプリ濃度が低く良好な呈色濃度を示
し、また３５℃、３日保存後でも比較分析素子に比し、
カプリ濃度が低く、ＬＤＨ活性に対して良好な呈色濃度
を示すことが判る。As is clear from the results in the table above, the comparative analytical element has a high Capri concentration and a very low color density, whereas the analytical element of the present invention has a low Capri density and a good color density, and also has a 35 ℃, even after storage for 3 days, compared to the comparative analytical element.
It can be seen that the capri concentration is low and shows good color density with respect to LDH activity.

実施例　２ 実施例１における試薬層（１〜４）および比較試薬層（
１〜２）の乳酸リチウムの代りにα−ケトグルタル酸４
６７ｍｇ／ｍ２、アスパラギン酸２１．３ｇ／ｍ２、グ
ルタミン酸脱水素酵素１２００ユニっト／ｍ２を加え、
０．２Ｍリン酸バッファーでｐＨ７．４に調整した以外
は実施例１と同様にして試薬層（５〜８）および比較試
薬層（３〜４）を作成し次いで実施例１の第２表に示さ
れた組成の展開層（１〜６）を設けて下記第５表に示し
た本発明に係わるＧＯＴ分析素子（９〜１６）および比
較分析素子（５〜８）を作成した。Example 2 Reagent layers (1 to 4) in Example 1 and comparative reagent layer (
α-ketoglutaric acid 4 instead of lithium lactate in 1-2)
Adding 67 mg/m2, aspartic acid 21.3 g/m2, and glutamate dehydrogenase 1200 units/m2,
Reagent layers (5 to 8) and comparative reagent layers (3 to 4) were prepared in the same manner as in Example 1, except that the pH was adjusted to 7.4 with 0.2M phosphate buffer, and then shown in Table 2 of Example 1. GOT analytical elements (9 to 16) according to the present invention and comparative analytical elements (5 to 8) shown in Table 5 below were prepared by providing spread layers (1 to 6) with the indicated compositions.

上記本発明の分析素子（９〜１６）および比較分析素子
（５〜８）に対し、実施例１と同様の操作を行ない発色
性ならびにカプリ濃度を測定した。The analytical elements (9 to 16) of the present invention and the comparative analytical elements (5 to 8) were subjected to the same operations as in Example 1 to measure color development and capri density.

（第５表） 上記測定の結果、比較分析素子でカプリが高く、呈色濃
度もまた著しく低かった。また３５℃、３日間保存後で
は比較分析素子のカプリが高く、血清滴下による発色濃
度であるか否かの識別さえ困難であつた。一方、本発明
の分析素子の保存後でもカプリ濃度が低く、ＧＯＴ活性
に対応する良好な呈色を示した。(Table 5) As a result of the above measurements, the comparative analytical element had a high capri and a significantly low color density. Furthermore, after storage at 35° C. for 3 days, the capri of the comparative analytical element was high, and it was difficult to even distinguish whether the color density was due to the dropwise addition of serum or not. On the other hand, even after storage, the analytical element of the present invention had a low capri concentration and exhibited good coloration corresponding to GOT activity.

実施例３ 実施例１における試薬層（１〜４）および比較試薬層（
１〜２）の乳酸リチウムの代りにα−ケトグルタル酸４
６７ｍｇ／ｍ２、アラニン２８．５ｇ／ｍ２グルタミン
酸脱水素１２００ユニット／ｍ２を加え０．２Ｍリン酸
バッファーでｐＨ７．４に調整した以外は実施例１と同
様にして試薬層（５〜８）および比較試験層（３〜４）
を作成し、次いで実施例１の第２表に示された組成の展
開層（１〜６）を設け、下記第６表に示した本発明に係
わるＧＰＴ分析素子（１７〜２４）および比較分析素子
（９〜１２）を作成した。Example 3 Reagent layers (1 to 4) in Example 1 and comparative reagent layer (
α-ketoglutaric acid 4 instead of lithium lactate in 1-2)
Reagent layers (5 to 8) and comparison were prepared in the same manner as in Example 1, except that 67 mg/m2, alanine 28.5 g/m2, and 1200 units/m2 of glutamic acid dehydrogenation were added and the pH was adjusted to 7.4 with 0.2 M phosphate buffer. Test layer (3-4)
was prepared, and then spread layers (1 to 6) having the compositions shown in Table 2 of Example 1 were provided, and GPT analysis elements (17 to 24) according to the present invention shown in Table 6 below and comparative analysis were prepared. Elements (9 to 12) were created.

上記本発明の分析素子（１７〜２４）および比較分析素
子（９〜１２）に対し、実施例１と同様の操作を行ない
発色件およびカプリ濃度を測定した。The same operations as in Example 1 were performed on the analytical elements (17 to 24) of the present invention and the comparative analytical elements (9 to 12) to measure color development and capri density.

（第６表） 上記の測定の結果、比較分析素子はカプリが高く、呈色
濃度も著しく低かった。また３５℃、３日間保存後では
比較分析素子のカプリが高く、血清滴下による発色濃度
であるか否かの識別が困難であった。一方、本発明の分
析素子は保存後においてもカプリ濃度が低く、ＧＰＴに
対応する良好な呈色を示した。(Table 6) As a result of the above measurements, the comparative analysis element had a high capri and a significantly low color density. Furthermore, after storage at 35° C. for 3 days, the capri of the comparative analytical element was high, making it difficult to distinguish whether the color density was due to the serum drop. On the other hand, the analytical element of the present invention had a low capri concentration even after storage, and exhibited good coloration corresponding to GPT.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 光透過性で液体不浸透性の支持体と、流体試料中の成分
と反応する少なくとも一層の試薬を含む少なくとも一層
の試薬層、該試薬層の該支持体とは反対側に位置し、該
流体本試料中の成分を該試薬層へ透過させる少なくとも
一層の展開層を有する分析素子において、上記試薬層お
よび展開層の少なくともいずれか一層に少なくとも一種
の電子伝達剤ならびに少なくとも一種の色素形成物質を
互いに実質的に反応し得ない状態に含有せしめたことを
特徴とする分析素子。a light-transparent, liquid-impermeable support; at least one reagent layer comprising at least one reagent that reacts with components in a fluid sample; In an analytical element having at least one developing layer that allows components in the sample to pass through the reagent layer, at least one of the reagent layer and the developing layer is coated with at least one electron transfer agent and at least one color forming substance. An analytical element characterized in that the element is contained in a state in which it is substantially non-reactive.