JPS5942262B2 - 酵素免疫測定法用不溶化抗体及び不溶化抗原 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素免疫化学的測定に用いる不溶化抗体および
不溶化抗原に関する。

近年生体内の生理活性物質や生体に投与した薬剤等の血
中、尿中濃度測定の手段としては、種々の免疫化学的方
法が用いられている。

なかでも、放射性同位元素を抗原または抗体の標識剤と
して用いる放射免疫測定法（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ−
ａｓｓａｙ以下ＲＩＡと略す。）は、測定感度が高く定
量性に優れているので、広く利用されている。し力化な
がら、ＲＩＡは放射性同位元素を用いるので、その取扱
者は高等の知識と技術が要求され、また高価な機器と設
備とを必要とし、更に環境汚染など制約も多い。そこで
最近、放射性同位元素の代わりに酵素を用いる酵素免疫
分析法（Ｅｎ２’ｙｍｅｉｎｍｌｕｎｏａｓｓａｙ以下
ＥＩＡと略す。

）が開発されているが、このＥＩＡはＲＩＡに匹敵する
測定感度と精度を有し、かつより簡便に測定できるので
、広い応用範囲をもつている。前記ＲＩＡとＥＩＡとは
その測定原理が共通しており、従来競合法およびサンド
イッチ法と呼ばれる２つの方法があるが、その測定原理
について以下簡単に説明する。

１、競合法： 測定する未知の量の非標識抗原と、標識剤で標識した標
識抗原の一定量とを、対応する抗体の一定量に競合反応
させると、非標識抗原と標識抗原とはそれぞれの存在量
に比例して抗体に結合し、非標識抗原の増減に反比例し
て抗体に結合する標識抗原の量が増減する。

次いで、抗体に結合した標識抗原と結合しなかつた標識
抗原とを適当な方法で分離し、抗体に結合した標識抗原
または結合しなかつた標識抗原の標識剤の活性を測定し
、同時に濃度既知の標準物質を用いて同様に操作して作
成した標準曲線により未知の量の非標識抗原量を測定す
る。２、サンドイッチ法： 測定する未知の量の非標識抗原に、その抗原に対する抗
体を不溶化した抗体を反応させると、両者は結合して抗
原抗体複合体を形成する。

この複合体を反応混液から一且分離し、これと、抗体に
標識剤を結合させた標識抗体の一定量とを反応させ、抗
原抗体複合体に結合した標識抗体と結合しなかつた標識
抗体とに分離し、そのいずれかの分画の標識剤の活性を
測定し、同時に濃度既知の標準物質を用いて同様に操作
して作成した標準曲線により未知の量の非標識抗原量を
測定する。前記競合法において、抗体に結合した標識抗
原と結合しなかつた標識抗原とを、分離する方法として
は、クロマト法、ゲル済過法、デキストラン炭末法、二
抗体法、固相法などが用いられているが、抗体を不溶性
の担体に結合させた不溶化抗体を用いる固相法が、操作
の簡便性から実地の測定には有利である。

またサイドイツチ法では、通常、抗体を不溶性の担体に
結合させて不溶化し、抗原との反応のパートナ一とする
とともに、抗原との反応によつて生じた抗原抗体複合体
を反応液から分離する手段としている。

前記の抗体を不溶化するための担体としては、従来セル
ロース粉末、淵紙、カルボキシメチルセルロース、イオ
ン交換樹脂、デキストラン、セフアデツクス、プラスチ
ツクフイルム、プラスチツクチユーブ、またはナイロン
、絹などの合成繊維、天然繊維などが用いられている。

これらの担体はそれぞれ一長一短があり、例えばプラス
チツクフイルム、プラスチツクチユーブ等は測定時の操
作は容易であるが、その表面積が小さいため、これに結
合する抗体または抗原の量が少なく、標準曲線の勾配が
小さいので、測定精度を上げることは困難である。一方
、セルロース粉末、セフアデツクスなどのように粉末ま
たは微粒子状のものは、表面積が大きいので標準曲線の
勾配を大きくすることができるが、これらは試験管壁等
に付着しやすいので、測定の操作時に一部が器壁等に付
着し、測定精度が低下する。本発明者らは、このような
欠点のない担体について研究を重ねた結果、血球は表面
積が大きく、取り扱いも容易であり、特に結合剤で処理
した血球は抗体または抗原を結合する能力が高く、担体
として優れた性質を示すことを見出し、本発明を完成し
た。

本発明は、血球の酵素活性を除去した後、タンニン酸等
の結合剤を反応させた血球を担体とする酵素免疫測定法
用不溶化抗体および不溶化抗原を提供するものである。

本発明を実施するには、通常血球をホルマリンなどの固
定剤と反応させて固定した後、ＰＨ３以下の酸性条件で
処理し、血球自体のもつ酵素活性を除去し、さらにタン
ニン酸等の結合剤を反応させる。

次いで、このように処理した血球に、抗体または抗原の
緩衝液溶液を混合して反応させ、不溶化抗体または不溶
化抗原を得る。本発明の不溶化抗体または不溶化抗原は
、従来知られている競合法およびサンドイツチ法を原理
とする各種の免疫化学的測定に利用される。

本発明に用いる血球としては、通常各種の動物例えば牛
、馬、羊、家兎、人などのホ乳類やニワト１八七面鳥等
鳥類の血球を使用し、この血球を、ホルムアルデヒド、
ピルビンアルデヒド、過酸化水素等の固定剤で処理する
。例えばホルマリンで処理するには、生理食塩水に浮遊
させた血球浮遊液（濃度約８％）と、約３％の濃度のホ
ルマリン溶液との等量を混合し、３７℃で１８時間反応
させた後、洗滌して生理食塩水に再浮遊（濃度１０％）
する。なお、血球の量は、血球浮遊液を遠心分離して得
た血球の見かけの容積で表わす。

血球中には、種々の酵素活性が存在していることが知ら
れているが、この酵素活性は標識剤である酵素の活性を
測定する際の障害となるので、少なくとも標識剤として
用いる酵素と同種の反応を触媒する酵素又は基質を共通
にする酵素の活性は除去する必要がある。

例えば、標識剤として西洋わさびパーオキシダーゼを使
用する場合には、少なくとも血球のパーオキシダーゼ活
性およびカタラーゼ活性は除去する必要がある。酵素活
性を除去する方法は、除去すべき酵素の種類によつて異
なるが、一般的にはＰＨｌ温度等をその酵素の不安定な
領域に変化させて失活させる。例えばパーオキシダーゼ
活性およびカタラーゼ活性を除去するには、血球浮遊液
をＰＨ３以下の酸性条件下に１夜４℃に保存することに
よつて、酵素活性を失活させて除去することができる。
酵素活性を除去した血球に、抗体または抗原を結合させ
るには、抗体または抗原との結合性をよくするため、結
合剤で処理することが必要である。

結合剤としては、タンニン酸、ビスジアゾベンジジン、
１，３−ジフルオロ−４，６−ジニトロベンゼン、グル
タルアルデヒド、塩化クロム等を使用することができる
。例えば、タンニン酸で処理するには、固定剤処理およ
び酵素活性除去の処理を行なつた血球を緩衝液に浮遊さ
せ、これと１／４０，０００〜１／５０の濃度のタンニ
ン酸溶液との等量を混合するか、遠心分離した前記処理
血球１ｍ１あたり前記タンニン酸溶液を１０〜５０ｍ１
の割合で加えて混合し、２０〜５６℃で３０〜９０分間
反応させる。この処理により血球１ｍ１あたり０．３〜
５００ηのタンニン酸が結合する。このように処理した
血球を担体とする不溶化抗体または不溶化抗原を製造す
るには、前記結合剤処理血球を適当な濃度に緩衝液に浮
遊させた血球浮遊液に、結合させようとする抗体または
抗原を適当な濃度に同じ緩衝液に溶解した溶液を混合し
て反応させる。結合剤処理血球（即ち担体）に結合する
抗体または抗原の量は、血球に結合している結合剤の量
が多い程多くなる。前記のようにして得られた不溶化抗
体または不溶化抗原と、酵素を標識した抗原または抗体
とを用いて、高分子物質から低分子物質にわたる生理活
性物質を測定することができる。

例えば、本発明の不溶化抗体を用いて抗原を測定するに
は、適当な濃度に希釈した被検液に不溶化抗体浮遊液を
加えて、抗原と抗体とを反応させる。反応終了後、この
反応混液に酵素で標識した標識抗原溶液を加えて反応さ
せた後、遠心して固相を分取しよく洗滌する。次いで、
この固相に適当な基質溶液を加えて反応させた後、酵素
活性を測定する。得られた測定値から、濃度既知の標準
物質を用いて同様に操作して得た標準曲線により検体の
抗原量を算出する。測定を実施するにあたつて、検体の
量、使用する試薬の濃度および量、反応温度、時間等の
種々の条件は、測定する物質の種類、使用する抗体の力
価、標識剤とする酵素の種類等によつて異なるので、各
測定係において最も適当な条件を実験的に定める。

標識剤として使用する酵素としては、その性質が安定で
あること、微量の活性をも測定しうることおよびその測
定操作が簡便であることが必要である。

また、抗原または抗体の担体として血球を使用する場合
には、前述のように血球に存在する種々の酵素によつて
標識剤である酵素の活性の測定に障害を生ずるおそれが
あるので、血球には存在しない酵素活性をもつ酵素を選
択するのが望ましい。しかし、これらの条件を満足する
酵素を得ることは困難であるので、前述のように血球に
存在する酵素活性を除去する。これらの諸条件を勘案す
ると、標識剤として用いる酵素としては、西洋わさびパ
ーオキシターゼ、アルカリホスフアターゼ、グルコース
オキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等が好ましい
。

本発明による不溶化抗体または不溶化抗原は、下記のよ
うに種々の特徴を有する。即ち、担体として用いる血球
は表面積が大きいうえ、結合剤処理によつて抗体または
抗原を結合する能力が向上するので、担体に結合する抗
体または抗原の量が多く、従来と同一量の抗体または抗
原を保持するためにはより少ない担体量で済むことにな
る。従つて、固相一液相間反応に伴う反応性の低下を最
少限におさえることができ、測定感度を向上させること
ができる。また、血球を処理する結合剤の量を調節する
ことによつて、血球に結合する抗原または抗体の量を調
節することができ、測定の目的に応じて、測定感度を調
節することができる。さらに、血球は遠心分離によつて
完全に沈降し、器壁等に付着して失なわれることがなく
取り扱いも容易であり、測定精度を向上させることがで
きる。なお、本明細書において、本発明の不溶化抗体ま
たは不溶化抗原を使用する測定法については、主として
抗原を測定するものとして記述したが、抗体を測定する
場合においても、高分子物質に限らずハプテンを測定す
る場合、さらには受容体を使用する測定法の場合におい
ても、同様に使用しうることは勿論である。

以下本発明を実施例によつて具体的に説明する。

実施例 １酵素活性除去血球の製造 ａ）ホルマリン固定 市販補体結合反応用緬羊血液（東芝化学製）を３０００
ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心し、血球成分を分取する。

これを生理食塩水で３回洗滌後、生理食塩水で８％の濃
度の浮遊液とする。これに、等容量の３％ホルマリン溶
液を加え、３７℃，１８時間インキユベートした。次い
で、精製水で４回洗滌し、使用時まで１０％浮遊液とし
て保存した。ｂ）酵素活性除去血球の製造 前記ａ）のホルマリン固定血球浮遊液と０５５Ｍグリシ
ン塩酸緩衝液（ＰＨ２．Ｏ）とを等量混合し、４℃に１
夜放置した。

これをリン酸緩衝食塩水ＰＨ６．４（以下ＰＢＳと略す
。）で２回洗滌し、同緩衝液で１０％浮遊液とする。実
施例 ２ α−フエトプロテインの測定 ａ）α−フエトプロテイン標準溶液の調製西ら（Ｃａｎ
ｃｅｒＨｅｓ．，３Ｏ，２７Ｏ７，（１９７０））の方
法により肝癌患者腹水より抽出・精製したα−フエトプ
ロテイン（以下ＡＦＰと略す。

）を、０．５％ツイーン２０および１％牛血清アルブミ
ン（以下ＢＳＡと略す）を含むＰＢＳで希釈し、２００
，１５０，１００，７５，５０，３０，２０，１０，５
，０ｎｇ／ＴｆＬｌの各濃度の標準溶液を調製した。ｂ
）抗ＡＦＰ抗体の製造 西らの方法により、肝癌患者腹水から精製したＡＦＰを
２Ｔｆ！９／ｍｌの濃度に生理食塩水に溶解し、その０
．５ｍ１をフロイントの完全アジユバントと混合し、ウ
サギに５回以上免疫して抗ＡＦＰ血清を得た。

この抗血清を硫酸ナトリウムで塩析してグロブリン分画
を得、抗ＡＦＰ抗体を製造した。ｃ）抗ＡＦＰ抗体感作
血球の製造 実施例１で得た血球２ｍ１を３０ｍ１０Ｉ）ＰＢＳで洗
滌した後、同緩衝液に再浮遊し、全量を６０ｍ１とする
。

これに１／３００の濃度のタンニン酸溶液６０ｍ１を混
合し、５６℃で３０分間反応させた。反応終了後、ＰＢ
Ｓで２回洗滌し、同緩衝液に再浮遊して全量を２ｍ１と
した。この血球浮遊液と、前記ｂ）の抗ＡＦＰ抗体（１
〜／ｍｌ）溶液２ｍ１とを混合し、５６℃で３０分間反
応させた。５０ｍ１（７）ＰＢＳで洗滌後、１０％庶糖
、５％ＢＳＡおよび１％家兎血清を含むＰＢＳで２．５
％の濃度に浮遊して、抗ＡＦＰ抗体感作血球を得た。

ｄ）抗ＡＦＰ抗体・酵素結合物の製造 アルカリフオスフアターゼ（ベーリングマンハイム、グ
レード）溶液（５Ｔｆ！９／ｍｌ）の０．３ｍ１を遠心
分離し、上清を除去後、これに０．１ｍ１の前記ｂ）の
抗ＡＦＰ抗体０．５〜を加えた。

１夜ＰＢＳに対して透析後、４．２％グルタルアルデヒ
ド溶液０．０１ｍ１を加えて室温で２時間インキユベー
トした。

次いでこれをＰＢＳで全量１ｍ１とした後、ＰＢＳに対
して１夜透析後、セフアロース６Ｂのカラムで分画し、
抗ＡＦＰ抗体・アルカリフオスフアターゼ結合物を得た
。ｅ）ＡＦＰの測定 前記ａ）で調製した各濃度の標準ＡＦＰ溶液０．１ｍ１
を試験管にとり、これに前記ｃ）で製造した抗ＡＦＰ抗
体感作血球浮遊液をＰＢＳで０．５％に希釈したもの０
．４ｍ１を加え、室温で６０分間反応させた。

反応終了後、この反応混液に前記ｄ）の抗ＡＦＰ抗体・
アルカリフオスフアターゼ結合物溶液０．１ＴｆＬ１を
加え、室温で１２０分間反応した。次いで、遠心分離し
、固相を０．００５％シイーン２０を含む生理食塩水で
洗滌し、これに１００ヮ／ｄｌのＰ−ニトロフエニルフ
オスフエートおよび１［ＴｌＭの塩化マグネシウムを含
む基質溶液（ＰＨ９．８）３ｍ１を加え、室温で６０分
間反応した。１Ｎ一水酸化ナトリウム０．３ｍ１を加え
、反応停止後、軽く遠心して上清の吸光度（４００ｍ０
を測定した。

結果の１例を第１図に示した。た施例 ３ エストリオールの測定 ａ）エストリオール標準液の調製 工ストリオール（Ｓｉｇｒｌｌａ社製）を、１６０，４
０，１０，２５，０ｎｇ／ｍｌの濃度に０．１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳに溶解した。

））エストリオール一１６，１７−ジヘミサクシネート
・ＢＳＡ結合物の製造工ストリオール一１６，１７−ジ
ヘミサクシネート（Ａ．Ｊ．Ｏ．ＧｌＯ９，８９７（１
９７１））６００ワを、１２ｍ１のジオキサンに溶解し
、これにトリ−ｎ−ブチルアミン０，３ｍ１を添加した
後１２℃とし、イソブチルクロロカーボネート０．１７
ｍ１を加え十分撹拌した。

この溶液に、予めＢＳＡｌ．７９を精製水４０ｍ１に溶
解した後これを１Ｎ一水酸化ナトリウムでＰＨｌ２．Ｏ
とし、更にジオキサン４０ｍ１を加えて１２℃にしてお
いた溶液を混合し、４時間撹拌して反応させた後、セフ
アデツクスＧ２５で未反応の低分子物質を分離した。次
いで、これを０．１％アジ化ナトリウム水に対して透析
した後、凍結乾燥して工ストリオール一１６，１７−ジ
ヘミサクシネート・ＢＳＡ結合物を得た。つ エストロ
ン一１７−オキシム・ヘモグロビン結合物の製造エスト
ロン一１７−オキシム（Ｅｒｌａｎｇｅｒ，Ｂ．Ｆ．，
．Ｂ．Ｃ．，２３４，ｌＯ９Ｏ，（１９５９））６８７
ηを２０ｍ１のジオキサンに溶解し、これにトリ−ｎ−
ブチルアミン０．９ｍ１を添加した後１１℃とし、イソ
ブチルクロロカーボネート０．２７ｍ１を加え撹拌した
。

この溶液に、予めヘモグロビン（以下Ｈｂと略す）２．
４２９を精製水７０ｍ１に溶解した後ＰＨ９．５に調節
し、これにジオキサン７０ｍ１を加えて１１℃にしてお
いた溶液を混合し、４時間撹拌して反応させた後、セフ
アデツクスＧ２５のカラムで未反応の低分子物質を分離
した。これを０．１％アジ化ナトリウム水に対して透析
後、凍結乾燥してエストロン一１７−オキシム・Ｈｂ結
合物を得た。ｄ）抗エストリオール抗体の製造 前記ｂ）で製造したエストリオール一１６，１７−ジヘ
ミサクシネート・ＢＳＡ結合物を生理食塩水に溶解し、
フロイント完全アジユバントと混じ、１回２ηずつ、家
兎の背部皮下にくり返し投与する。

最終投与の１週間後に、採血して得た抗血清を硫酸ナト
リウムで塩析して、抗体グロブリンを得た。この抗体か
らブロムシアン法によりセフアロースに結合させたＢＳ
Ａを用いてＢＳＡの抗体を除去した。即ち、抗体溶液５
０ｍ１に対して２５ｍ１の割合でＢＳＡ・セフアローズ
結合物を加え、３７℃で３０分インキユベート後、４℃
に１夜放置した。これを３０００ｒ．ｐ．ｍ１０分間（
４たＣ）遠心分離して液相を分取し、エストリオールに
特異的な抗体を得た。ｅ）抗エストリオール抗体Ｆａｂ
フラグメントの製造前記ｄ）で製造した抗エストリオー
ル抗体をＰＯｒｔｅｒの方法（ＢｉＯｃｈｅｍ．Ｊ．７
３，ｌｌ９（１９５９））によりパパイン分解した後カ
ルボキシメチルセルロースカラム（ＰＨ５．５）で分画
して、抗エストリオール抗体Ｆａｂフラグメントを得た
。

ｆ）抗エストリオール抗体Ｆａｂ・酵素結合物の製造５
７ｎ９の西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＯｒｓｅｒａ
ｄｄｉｓｈＰｅｒＯｘｉｄａｓｅ以下ＨＲＰと略す）を
、１ｍ１（７）０．３Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解
し、０．１ｍ１の１％２．４−ジニトロフルオロベンゼ
ンを加え、室温で１時間撹拌した。

０．０８Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１ｍ１を加え、３
０分間室温で混合した後、１．０ｍ１（７）０．１６Ｍ
エチレングリコール溶液を加えて、室温で１時間混合し
た。

０．０１Ｍ炭酸緩衝液ＰＨ９．５に対して１夜透析した
後、これに前記ｅ）で製造した抗エストリオール抗体Ｆ
ａｂを０．０１Ｍ炭酸緩衝液ＰＨ９．５に５ヮ／ｍｌの
濃度に溶解した溶液１．０ａを加え、室温で３時間反応
させた後、５ηの水素化ホウ素ナトリウムを加え、４℃
で更に３時間反応させた。

反応終了後、ＰＢＳＰＨ７．２に対して１夜透析した後
、セフアデツクスＧ２ＯＯで分画、精製して抗エストリ
オール抗体Ｆａｂ・ＨＲＰ結合物を得た。ｇ）エストロ
ン一１７−オキシム・Ｈｂ感作血球の製造０．２７Ｍ−
ピペラジン（Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）緩衝液（ＰＨ６．
５）６．２ｍ１１エストロン一１７−オキシム・Ｈｂ生
理食塩水溶液（１即／ｍｌ）１，０ｍＺ１実施例１で製
造した血球１．０ｍ１および２．２５Ｍ塩化クロム溶液
を生理食塩水で４００倍に希釈した溶液の０，８７ｒ１
１をマイヤ一にとり、室温で５分間放置して反応させた
。

次いで、この反応液に生理食塩水３００ｍ１を加えて反
応を停止させた後、生理食塩水で３回洗滌し、２．５％
浮遊液とした。ｈ）エストリオールの測定 前記ａ）のエストリオール標準液の各０．１ｍ１と前記
ｆ）の抗エストリオール抗体Ｆａｂ−ＨＲＰ結合物溶液
０．１ｍ１を試験管にとり、室温で１時間インキユベー
トした。

次いで、前記ｇ）の工ストロン一１７−オキシム・Ｈｂ
感作血球浮遊液０．４ｍ１を加え、室温で２時間インキ
ユベートした。インキユベート終了後遠心して固相を分
取し、０．００５％ツイーン２０を含む生理食塩水で洗
滌し、３ｍ１の基質溶液（５−アミノサリチル酸６０ｍ
９／ＤｌｌＯ．３％過酸化水素水１ｍ１／ｄｌ）を加え
、室温で６０分間反応した。アジ化ナトリウムで反応を
停止させた後、軽く遠心して上清の吸光度を測定した。
結果の１例を第２図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２の測定結果のグラフ、第２図は実施例
３の測定結果のグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 酵素を標識剤として使用する酵素免疫測定法用不溶
   化抗体及び不溶化抗原において、血球に存在する酵素の
   うち少なくとも前記標識剤の酵素と同種類の反応を触媒
   する酵素又は基質を共通にする酵素の活性を除去した後
   、該血球を結合剤で処理して該血球に抗体又は抗原を結
   合せしめてなる酵素免疫測定法用不溶化抗体及び不溶化
   抗原。