JPS594117B2 - バシルス属アミラ−ゼｇ６によるオリゴ糖の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はハシルス属の生産するアミラーゼを使用し、で
ん粉からマルトヘキサオースを含有する糖化物を製造す
る方法に関するものである。

従来、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、−アミラ
ーゼ、グルコアミラーゼなど、でん粉に対する分解様式
を異にする種々のアミラーゼが知られ、グルコースやマ
ルトースの製造に使用されてきた。

そして、最近は、より分子量の太きい、例えば、マルト
トリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マ
ルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６
）などのオリゴ糖製造技術の開発が要望されている。

これらの糖は食品の甘味料、増量剤、賦形剤、包接剤と
して食品及び薬品工業に広く使用できるものと考えられ
ている。

そして、現在までに、例えば、マルｌ−１−ＩＪオース
についてはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｃｅｎｓ
の生産するＮ−Ａ４６８酵素（％開昭５１−９７３９号
及び特開昭５１−１１００４９号）が知られ、マルトテ
トラオースについてＰｓｅｎｄｏｍｏｎａｓＳ ｔｕｚ
ｅｒ ｉのアミラーゼ（Ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ Ｂｉｏ
−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｅｓｉｃ
ｓ第１４５巻、１０５〜１１４頁（１９７１年月が知ら
れている。

そしてマルトヘキサオースについては、Ａｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓの生産する細胞壁に結合す
るアミラーゼが、でん粉をその非還元性末端からマルト
ヘキサオース単位で加水分解すると云われている（特開
昭４８−３９６８８号、特開昭４８−３９６４９号及び
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａ
ｃｔａ、 第４１０巻、３３３〜３４６頁（１９７５
年月。

本発明者らはオリゴ糖生産能の強い微生物を求めて、土
壌中より微生物の検索を行ってきた結果、バシルス・サ
ーキュランスと同定した微生物がでん粉をマルトヘキサ
オースを主成分とする糖化物に分解するアミラーゼを菌
体外に著量に生産することを認め本発明を完成した。

すなわち、本発明はでん粉又はその部分分解物からマル
トヘキサオースを生成するバシルス・サーキュランスの
生産するアミラーゼＧ６を、でん粉、アミロース、アミ
ロペクチン又はその部分分解物に作用させることを特徴
とするバシルス属アミラーゼＧ６によるマルトヘキサオ
ーズ含有糖液の製造法に関するものである。

以下に本発明の内容をより具体的に説明する。

バシルス属細菌の生産する酵素によるオリゴ糖の生産に
ついては、例えば、α−アミラーゼがでん粉分解物の構
成糖の少量成分としてマルトヘキサオースを生成したり
、又、シクロデキストリン・クリコシルトランスフエラ
ーゼにより、グルコース６個が結合した環状デキスｌ−
ＩＪンを生成することは知られているが、本発明に示す
ようなマルトヘキサオースを主成分とするでん粉糖化物
を生成するバシルス属アミラーゼは知られていない。

しかも、本発明のアミラーゼはＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ・
ａｅｒｏｇｅｎｅｓの生産する酵素とは違い、菌体外に
生産されるため、生産量が多く、且つ酵素的性質におい
ても、以下に記載するように、差異が多く新規な酵素と
認められるものであり、本酵素をアミラーゼＧ６と命名
した。

アミラーゼＧ６の酵素的性質 （１）作用；でん粉、アミロース、アミロペ’７ｆン、
デキスｌ−ＩＪンなどからマルトヘキサオースを主成分
とする糖分解物を生成する。

マルトヘキサオースの収量は基質の液化度に依存するが
通常、２５〜３５％である。

可溶性でん粉に対するｋｍは約０．０６５％。

可溶性でん粉を基質としたときの典型的な糖化物の組成
を第１図に示す。

（２）作用ｐＨ範囲及び最適作用ｐＨ； ｐＨ４〜１１
の範囲に作用し、最適ｐＨは８付近（１％可溶性でん粉
、０．０５Ｍ１−リス緩衝液の下で、４０℃で１時間反
応（第２図月。

（３）作用温度範囲及び最適作用温度；約７０℃まで作
用し、最適作用温度は約６０℃（１％可溶性でん粉、０
．０５ＭＩ−ＩＪス緩衝液の下で、各温度で３０分間反
応（第３図月。

（４，） ｐＨ安定性；ｐＨ約５〜約１１安定（０，
０５Ｍ緩衝液の下で、３０℃で３時間放置後、残存活性
を測定（第４図月。

（５）熱安定性；０．０５ＭトＩＪス緩衝液の下で、各
温度で１０分間加熱後、残存活性を測定した。

その結果、５０℃、１０分間の加熱で約１０％失活し、
５５℃、１０分間の加熱で約５０％失活し、６０℃、１
０分間の加熱で約８０％失活した。

（６）阻害剤；本酵素は５Ｘ１０−５ＭのＨｇＣ１□。

Ｆｅ５０．ｉ 、 ＣＯＣｌ２ 、 ＺｎＳＯ４、ＣＬ
ＩＳＯ４により、それぞれ約９９％、約８９％、約７９
％、約７６％、約６６％阻害された。

又、５Ｘ１０−５ ＭＣａＣ１２によっても約４０％阻
害された。

（７）安定化：カルシウムによる熱安定性の増加は認め
られなかった。

（８）精製方法；本酵素は培養沢液から硫安４０〜７０
％飽和で沈澱物として回収され、次いで、ＤＥＡＥ−セ
ファローズ・カラムクロマトグラフィー（０，０２５Ｍ
ＩＪン酸緩衝液に溶解した塩化カリウム０．２〜０．６
Ｍでグラジェント溶出）、同カラムによる再クロマトグ
ラフィー、セファデックスＧ −２００がラム・クロマ
トグラフィーにより、クロマト的に単一アミラーゼに精
製することができる。

（９）分子量；セファデックスＧ−２００カラム・クロ
マトグラフィーによる分子量は約７６０・００であった
。

（１０）力価測定法；本酵素の活性測定は、０．１Ｍト
リス緩衝液に溶解させた１％可溶性でん粉液０．５１１
１１に適量の酵素を加え、水で全量１ ｍｌとし、４０
℃で反応させる。

この条件で１時間に１■のグルコースに相当する還元力
を生成する酵素量を１単位とした。

以上の酵素的性質について、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓの酵素と比較した結果を第１表に示す。

第１表から明らかなように、本発明のアミラーゼＧ６に
よるでん粉糖化物は、主成分であるマルトヘキサオース
の他に、反応初期よりマルトース、マルトトリオース、
マルトテトラオース及びマルトペンタオースを生成刃る
ことから、でん粉性基質の非還元性末端からマルトヘキ
サオース単位で分解する酵素と断定できない。

本発明のアミラーゼＧ６はＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅ
ｒｏｇｅｎｅｓの酵素に比ベアルカリ性側に安定であり
、作用ｐＨもアルカリ性側にある０又、Ａｅｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓのアミラーゼＧ６はカルシ
ウムイオンにより熱失活から保護されるのに比べ、本発
明のアミラーゼＧ６にはこのような効果は認められない
。

本発明のアミラーゼＧ６は菌体外に生産される酵素であ
るが、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓの酵
素は細胞壁に結合した酵素である。

なお、本発明において使用される微生物の菌学的性質は
下記に示す通りであり、本菌株は微工研菌寄第５８５３
号として、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され
ている。

（１）形態；単桿菌、大きさ０．７〜１．ＯＸ２．４〜
４．０μ、非運動性、ダラム陰性 （２）胞子；胞子前細胞はふくらみ、球形〜楕円形の胞
子を形成する。

（３）ゼラチン；殆んど液化しない。

（４）肉汁寒天；生育中程度、表面平滑で薄く、半透明
乳白色。

（５）グルコース肉汁寒天；肉汁寒天培地よりも生育不
良。

（６）クエン酸寒天；わずかに生育。

（７）グルコース硝酸塩寒天；わずかに生育。

（８）肉汁；わずかに混濁、沈澱する。

（９）食塩肉汁；１〜８％食塩濃度でも生育、１０％食
塩濃度では生育しないが、わずかに生育。

００）ミルク；ゆっくり凝固、その後ペプトン化。

ａυ ポテト；生育微弱。

０２）チロシン寒天；生育中程度、チロシナーセ陰性。

（１３）グルコース−アスパラギン寒天；生育微弱。

０４）インドール；生成しない。

（１５） アセチルメチル力ルビソール；生成する。

（Ｌ６）硫化水素；生成する。

（Ｌ７）硝酸塩の這元；陰性 ０８） ウレアーゼ；生成しない。

（Ｌ９）カタラーゼ；生成しない。

（２０）グルコース肉汁培地のｐＨ；約５（２１）でん
粉の加水分解：陽性 （２２）炭水化物の利用；グルコース、フラクトース、
マンノース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、シュ
ークロース、ラクトース、マルトース、ラフィノース、
マンニトール、イヌリン、でん粉、Ｌ−ソルボース、ソ
ルビトールを利用中酸するが、カスの発生なし。

（２３）生育温度；最適生育温度は３５〜４５℃、最高
生育温度は５０〜５５℃。

（２４）死滅温度；１００℃で１０分間加熱しても死滅
しない。

（２５）最適生育ｐＨ；８〜９ 以上の菌学的性質について、Ｂｅｒｇｅｙｓ Ｍａｎ−
ｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌｏｇｙの第７版及び第８版（ＴｈｅＷｉ
ｌ ｌ ｉａｍｓ ＆Ｗｉ １ｋｉｎｓ Ｃｏ−ｍｐａ
ｎｙ １９５７年及び１９７４年）を参照し、本微生
物はバシルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｎｓｃｉ
ｒｃｎｌａｎｓ ）に近縁の微生物であると同定し、Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＧ６と命名した。

本発明による酵素生産のための培養は、通常用いられる
固体培地または液体培地が使用され、液体培養のための
培地の炭素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキ
ス、カゼイン、コーン・ステイープ・リカーなどのいず
れかと、炭素源としてでん粉、デキストリン、マルトー
ス、グルコース、シュークロースなどのいずれか、及び
これを補足する無機窒素源、リン酸塩、マグネシウム塩
及び少量の金属塩を含む培地が使用される。

培養温度は２５〜５５℃、ｐＨ７〜９で行なう。

アミラーゼＧ６は菌体外に生産される酵素であるので、
培養終了後、沢過又は遠心分離して除菌し、上澄液を回
収する。

そして、必要に応じて濃縮し、硫安、硫酸ナトリウムな
どによる塩析、又はアセトン、エタノール、メタノール
、イソプロパツールなどの有機溶剤を加え、酵素を沈澱
物として取得する。

次に、本酵素を用いて、でん粉、アミロース、アミロペ
クチン及びこれらの派生物に作用させてマルトヘキサオ
ースを生成するためには、通常、基質濃度５〜４０％で
行なわれるが、望ましくは５〜２０％である。

反応のｐＨは、第２図に示す通り、ｐＨ４〜１１の広い
範囲にあるが、中性及び中性以下のｐＨでは生成したマ
ルトヘキサオースがマルトテトラオースとマルトースに
分解する度合が大きくなるため、通常、ｐＨ８〜９の範
囲で行なうのが望ましい。

反応温度は、通常、４０〜６０℃である。

でん粉、アミロース及びアミロペクチンの液化（部分分
解）度はマルトヘキサオースの収量に関係する。

第２表は種々の液化度のでん粉を使用したときの糖化物
の糖組成を示している。

表から明らかなように、液化でん粉のＤＥはある程度高
い方がよく、ＤＥ約４以上の液化でん粉を使用したとき
３０〜３５％の収量でマルトヘキサオースが得られた。

そして、例えば、ＤＥ約４の液化でん粉を使用したとき
の御粘化物の糖組成ハ、クルコース２．１％、マルトー
ス５．７％、マルトトリオース２．６％、マルトテトラ
オース６．７％、マルトペンタオース４．８％、マルト
ヘキサオース３１％、そしてその他のオリゴ糖４７．１
％でめった。

次に実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例 １ ２ｔの三角フラスコに、カツオ肉エキス５％、Ｋ２ＨＰ
Ｏ４０，３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，１爪可溶性で
ん粉１％からなる培地４００ ｍｌを入れ、常法により
殺菌後、バシルス・サーキュランスＧ６（微工研菌寄第
５８５３号）を接種し、３０℃で４８時間振盪培養した
。

培養後、得られた上澄液について生産されたアミラーゼ
Ｇ６を測定した結果、培地ｍｌ当り４１，１単位であっ
た。

この上澄液２．２ｔから硫安４０〜７０％飽和沈澱区分
を集め、蒸溜水で透析した（２５０ｍｌ）。

このもののアミラーゼＧ６活性は２５３単位／ｍｌであ
った。

ＤＥ７．７の液化でん粉５１に、該酵素剤８０単位添加
し、全量を水で１００ ｍｌとし、５０℃で４８時間反
応させた。

そして得られたでん粉糖化物中のマルトヘキサオースを
液体クロマトグラフ（カラム 昭和電工■製ＮＨｐａｋ
Ｊ ４１１、溶出液アセトニトリル６５％：水３５％
）で、分離、分取し、乾燥後、蒸溜水に溶解し、フェノ
ール−硫酸法により定量した結果、収量は２９．７％で
あった。

実施例 ２ 実施例１で得られたアミラーゼＧ６を、ＤＥ８の液化で
ん粉１当り１５単位使用し、第３表に示すでん初濃度で
、ｐＨ８〜８．５ （０，０２Ｍ トリス緩衝液を使用
）、５０℃で１０〜２４時間反応させた。

反応後、生成したマルトヘキサオースを実施例１と同様
に定量した。

結果は第３表に示す通りであった。

アミロース（トウモロコシ製）、アミロペクチン（トウ
モロコシ製）、ポテトスターチ及びコーンスターチ各約
１０７７２！ｉ＋に、０．２Ｍトリス緩衝液（ｐ）１８
．０ ） ０．１ ｍｌ、アミラーセＧ６０．６単位を
加え、水で全量２７１１１にし、５０℃で２時間反応さ
せた。

反応後、実施例１と同様にして生成したマルトトリオー
スを定量した。

結果は第３表に示す通りであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はアミラーゼＧ６によるでん粉糖化物の液体クロ
マトグラムを示す。 １はグルコース、２はマルトース、３はマルトトリオー
ス、４はマルトテトラオース、５はマルトペンタオース
、６はマルトヘキサオースを示す。 第２図、第３図と第４図は、それぞれアミラーゼＧ６反
応の最適作用ｐＨ１最適作用温度とｐＨ安定性を示して
いる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ でん粉又はその部分分解物からマルトヘキサオース
   を生成するバシルス・サーキュランスの生産するアミラ
   ーゼＧ６を、でん粉、アミロース、アミロペクチン又は
   その部分分解物に作用させることを特徴とするバシルス
   属アミラーゼＧ６によるマルトヘキサ７１−−ス含有糖
   液の製造法。