JPS5928664A - トリグリセライド測定用試薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は体液中のトリグリセライドを測定する試薬組成
物に関するものである。

従来から体液中のトリグリセリドを測定する方法として
、リポプロティンリパーゼ、グリセロキナーゼ、グリセ
ロリン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、４−アミノ
アンチピリンおよびアニリン誘導体を使用する方法、リ
ポプロティンリパーゼ１グリセロールオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリンおよびアニリ
ン誘導体を使用する方法が知られている。

アニリン誘導体を用いて比色測定する方法において種々
の体液中共存物質の影響が問題となる。

その中でもビリルビンは血清中に高濃度存在し。

測定値における影響が問題視されている。ビリルビン自
身の可視部吸収による正誤差は、４−アミノアンチピリ
ンとアニリン誘導体の酸化カップリングによる赤紫色生
成物（５４０〜５６０ｎｍ）　　を比色測定することＫ
はり無視できる〔４−アミノアンチピリンとフェノール
誘導体の酸化カップリング赤色生成物（５００ｎｍ　）
の比色測定は正誤差となる。〕。

しかし、ビリルビンの還元力による負誤差は、未だ十分
に影響を回避するに到ってない。トリグリセフィト測定
組成物のｐＨが６．５以下の時、色素系に影響を及ぼす
ビリルビンの還元力は小さく。

無視しつる。ところが構成成分である各酵素の至適１）
　ＩＩ、安定ｐＨは中性領域からアルカリ領域に存在す
る。これらの要因を考慮し、４−アミノアンチピリンと
アニリン誘導体の酸化カップリング体が十分な感度と呈
色の安定性を示すｐ　Ｈ６，５〜ｐ　Ｈ８，０のトリブ
リセラ４）′測定用組成物を用いて定量する場合、ビリ
ルビンの還元力による負誤差は大きくなり、無視しえる
ものでけ々くなる。

本発明者等はこれらの問題を種々鋭意検討したトコろ体
液中のトリグリセフィトを比色定量するに当たり、　　
０．１　／ｊｍｏ　ｌ／Ｊ　〜１．０μｍｏｌ／ｌ　の
フェロシアン化物イオンを含むトリグリセライド測定用
組成物を用いることにより体液中のビリルビンの負影響
を受けることなく測定することに成功し、本発明に到達
した。

すなわち本発明は、（１）リボプロティン中ノ（−ゼ、
（罰）グリセロールキナーゼおよびブリセロリフェナジ
ンおよび（ｖｌ）アニリン誘導体を含むトリグリセフイ
ト９定用試薬組成物において、フェロシアン化物イオン
が０．１　ｐｍｏ　Ｉ　／ｌ　〜１．Ｏｐｍｏ　Ｉ／Ｅ
含有されていることを特徴とするトリグリセフイト９測
定用試薬組成物である。

本発明においてフェロシアン化物イオンの濃度が０．１
μｍ　ｏ　１　／　１未満であるとビリルビンの負影響
を完全に回避することはできない。また、１．０μｊｔ
ｍｏｌ／ｌ　を越える濃度であると試薬ブランクの上昇
の経時変化が大きくなり、正誤差の原因となり試薬性能
を損なう。０．１μｍｏｔ／Ｊ〜１．０μｍ　ｏ　ｌ　
／　Ｊのフェロシアン化物イオン濃度を用いる本発明に
おいて用いるフェロシアン化物イオンはフェロシアン化
ナトリウム、又はフェロシアン化カリウム、並びにＦ　
ｅ　（ＣＮ　）ａ＝イオンを含有するその他の塩が挙げ
られる。

本発明に用いるリポプロティンリパーゼはリボプロティ
ン中のトリグリセライド、ジグリセワイド、モノグリセ
フィトを加水分解し、グリセロールと脂肪酸に分解する
酵素であり１例えばクロモパクテリウムトビスコスム、
シュードモナ７．属等に由来するものがある。

本発明に用いるグリセロキナーゼはマグネシウムイオン
共存下、グリセロールとＡＴＰに作用し。

グリ七ロリン酸とＡＤＰを生成する酵素であり、例ｔ　
ハセルロモナヌ、キャンシダ属に由来するものがある。

本発明に用いるグリセロリン酸メキシダーゼけり１例工
ばベジオコカヌ、アエロコカス属に由来するものがある
。

本発明に用いるグリセロールオキシダーゼは酸素存在下
、グリセロールに作用し、過酸化水素とグリセルアルデ
ヒドを生成する酵素であり、例えばアスペルギルス属、
ニューロスポヲＪｕ１３来スるものがある。

本発明に用いるペルオキシダーゼはＨ２Ｏ２と色Ｗ、体
に作用し、酸化カップリングをおこし、発色物′にと水
を生成する酵素であり、例えば７＋スースヲデイツシユ
に由来するものがある。

本発明に用いるカプラーとしてけ４−アミノアンチピリ
ン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラジン、ジ
アミノアンチピリン、１−（ｐ−ジエチルアミノ−フェ
ニル）−２，３−ジエチル−４−アミノ−ピラゾン−５
，１−（ｐ−アミノ−フェニル）−２，３−ジメチル−
４−アミノーヒ°ヲソロン−５，１−（ｐ−アセトアミ
ノ−フェニル）−２，３−ジエチル−４−アミノ−ピラ
ゾロン−５などがある。

本発明に用いるアニリン誘導体はアニ１」ン、Ｎ。

Ｎ−ジメチルアニリン、　Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン。

Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ　−トルイジン、　Ｎ、Ｎ−ジメ
チル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチル
フェニル）−Ｎ−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−ト／レイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロ
ヒル−ｍ−））レイジン、Ｎ−エヂールーＮ−スルホプ
ロピル− キシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニシジン等があ
る。

本発明の組成物は系がｐ　Ｈ６，０〜８．０であること
が望ましい。

本発明の組成物はトリグリセライドを測定するに当り、
１液においても、あるい（ｌ′ｉ２液以上の組成におい
ても適用が可能である。２液以上の場合。

発色前液、＠色時液ならいずれの液にフェロシアンイオ
ンを添加してもよい。

本発明の組成物は、フェノールを用いる方法に比べて、
試薬プヲンクの上昇を考慮しフェロシアンイオンの濃度
が少ないことを特徴とする。

本発明の組成物を用いてトリグリセライドをｆｕｌｌ定
するに当り、体液中のビリルビンの影響を受けることな
く、正確に測定することが可能となる。

以下１本発明を実施例により説明する。

実施例１ １、サンプル：血清Ａ：水＝８：２＜容量比）■血清Ａ
：ビリルビン水溶液（１００Ｗ／ｄＪ）＝８：２（容量
比）■ 血清Ｂ：水−８：２（容量比）■ 血清Ｂ：ビリルビン水溶液（１００”Ｆ／ｄｌ）＝８；
２（容量比）　■ ２試　　　薬：　トリス緩衝液（ｐＨ７，５）リボプロ
ティンリパーゼ　　　２ｏｏ単位／Ｍｌグリセロキナー
ゼ　　　　　　　１．０単位／肩ｔグリセロリン酸オキ
シダーゼ　　２６５〃ペルオキシダーゼ　　　　　　　
７．５〃４−アミノアンチピリン　　　　　３〜／ｄｌ
Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−トルイジン ２０′・’ｆ／ｄｌ 上記試薬に下記第１表に示すフェロシアン化カリウム濃
度を含んだ試薬を調製した。

第　　　　１　　　　表 ３、測定法 ■〜■の各サンプル２０μｌに試薬（Ａ、Ｂ。

ａ、ｂ）３ｍｌを加え、３７℃にて１０分間反応させた
後、波長５４５ｎｍで吸光度を測定した。

その結果を第２表に示す。

第　　　　２　　　　表 本発明の試薬はビリルビンの影響を受け々いが。

フェロシアン化カリウム無添加（ａ）やフェロシアン化
カリウム低濃度の場合（ｂ）はビリルビンの影響を受け
た。

実施例２゜ １、サンプル二血清Ａ：水＝８：２Ｃ容量比）■血清Ａ
：ビリルビン水溶液（１００〜／ｄｌ）＝８＝２（容量
比）■ 血清Ｂ：水−８：２（容量比）■ 血清Ｂ：ビリルビン水溶液（１００”Ｖ／ｄＪ）＝８：
２（容量比）　■ ２、試　　　薬　：　トリス緩衝液（ｐＨ７；５）リボ
プロティンリパーゼ　　　２００単位／罰グリセロキナ
ーゼ　　　　　　１．０単位／解ｌグリセロリン酸オキ
シダーセ２．５〃 ペルオキシダーゼ　　　　　　　７．５〃４−アミノア
ンチピリン　　　　　３■／ｄｌＮ−エチル−Ｎ−（３
−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン　　　　　　２０
〜／ｄｌ上記試薬に下記第３表に示すフェロシアン化カ
リウム港度を含んだ試薬を調製した。

第　　　　３　　　　表 ３、測定法 ω〜■の各サンプル２０μＩＫ試薬（Ａ、　Ｂ、ａ、ｂ
）３肩ｔを加え、３７℃にて１０分間反応させた後、波
長５４０ｎｍで吸光度を測定した。

その結果を第４表に示す。

第　　　　４　　　　表 本発明の試薬はビリルビンの影響を受けないが、フェロ
シアン化カリウム無添加（ａ）やフェロシアン化カリウ
ム低濃度の場合（ｂ）はビリルビンの影響を受けた。

実施例３゜ 試薬：　トリス緩衝液（ｐＨ７，５） リポプロティンリパーゼ　　　　　　２００単位／鹸グ
リセロキナーゼ　　　　　　　　　１・０　　“グリセ
ロリン酸オキシダーゼ　　　　　２．５〃ペルオキシダ
ーゼ　　　　　　　　　７，５〃４−アミノアンチピリ
ン　　　　　　　　３Ｆｌｖ／ｄ　ｌＮ、Ｎ−ジエチル
−ｍ−）ルイジン　　　２０〜／ｄｉ上記試薬に下記第
５表に示すフェロシアン化カリウム濃度を含んだ試薬を
調製し、試薬ブランクの経日変化を測定した。その結果
を第１図に示す。

第５表 本発明は試薬ブランクの軒日変化が小さく、無添加と比
較して差が小さい。フェロシアン化カリウムの添加量が
多いと試薬ブランクの経口変化が大きく、無添加と比較
し差が大きい。

実施例４゜ 試薬Ａ：実施例３の試薬組成と同じ。

試薬　Ｂ：実施例３の試薬組成のＮ、Ｎ−ジエチル−ｍ
−）ルイジンにかえてフェノ ール１２ｍ９／ｄｌ　。

サンプル：実施例２と同じ。

測定法： ■〜■の各サンプル２０μｌ　Ｋ試薬（Ａ、　Ｂ）３　
ｔｔｔｌを加え、３７℃に゛て１ｏ分間反応させた後、
波長５４０ｎｍで吸光度を測定した。その結果を第６表
忙示す。

第６表 また、試薬ブランクの経口変化を第２図に示す。

第２図中、ａはフェロシアン化カリウムｏ、２μｍｏｌ
／ｌ含むｌ試薬Ｂ、ｂはフェロシアン化カリウム０．２
μｍｏｌ／Ｊ含む／Ａ％　Ｃはフェロシアン化カリウム
２０．０μｍｏＩ／ｌ含むｌ試薬Ｂ、ｄけフェロシアン
化カリウム２０．０μｍｏＩ／ｌ含ｔｒｌ　Ｒ薬への場
合を示す。

／′ｌ）は試薬ブランクの経日変化が小さいフェロ／　
ｌ シアン化イオン濃度でビリルビンの影響を回避できるが
、試薬Ｂけフェロシアン化イオンを高濃度必要どし試薬
ブランクの経口変化が大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の試薬および比較のための
試薬の吸光度における経日変化を示す・ 特許出願人　東洋紡績株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）リポプロティンリパーゼ、（Ｉ）グリセロールキ
   ナーゼおよびグリセロリン酸オキシダーゼ−または（Ｉ
   ｌ＋　）グリセロールオキシダーゼ、　（ｌｖ）ペルオ
   キシダーゼ、（Ｖ）カプラーおよび（ｖｌ）アニリン誘
   導体を含むトリグリセフィト測定用試薬組成物において
   、フェロシアン化物イオンが０．１μｍｏｌ／１〜１．
   ０　ｔｌｍｏ　Ｉ／ｌ含有されていることを特徴とする
   トリグリセワイド測定用試薬組成物。