JPS59226864A - Method for measuring enzyme immune of transforming gross factor - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To measure easily TGF by bringing the immobilized antibody of the transforming gross factor (TGF) specific to a cancer patient and a liquid to be examined into reaction then bringing an enzyme-marked TGF antibody into reaction and determining quantitatively the amount of the enzyme mark of the solid or liquid phase. CONSTITUTION:TGF being a polypeptide which is created by the cancer cells of man and rodentia and induces the degeneration (character conversion and propagation is sampled from the urine of the human cancer patient and is refined. The refined TGF is injected to a mammal except man to immunize the same. The spleen of this animal is extracted and is made confluent with the cell having antibody generic power and mouse myeloma to obtain a monoclonal antibody generic cell. A human TGF antibody is obtd. from the cultured cell thereof. The antibody which is immobilized to an insoluble carrier and an antibody marked with enzyme are brought into contact with the liquid to be exampled and the liquid is separated to a solid phase and a liquid phase. The amount of the enzyme mark of either solid or liquid phase is quantitatively determined. The decision of the cancer is thus surely made possible.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトランスホーミンググロスファクター（Ｔｒａ
ｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　　Ｇｒｏｗｔｈ　　ｐａｃｔｏｒ
　；以下、ＴＧＦという）の酵素免疫測定法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to transforming growth factor (Tra
nsforming Growth pactor
; hereinafter referred to as TGF).

ＴＧＦは、ヒトおよびけっ歯動物のガン細胞でつくられ
、正常細胞に細胞形態学的に特異な変質（形質転換およ
び増殖）をきせるポリペプチドである。ヒトおよび動物
の正常細胞は、軟寒天培地においてはコロニーを形成し
ないが、これにＴＧＦを加えるとコロニー形成能を有す
るようになる。TGF is a polypeptide that is produced in human and rodent cancer cells and causes specific cytomorphological alterations (transformation and proliferation) in normal cells. Normal human and animal cells do not form colonies in soft agar media, but when TGF is added to them, they become capable of forming colonies.

１９７８年ジ・ゼ・トダロら［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ。1978 Z. Todaro et al. [Proc, Natl, A.
cad.

Ｓｃｉ、、７５．４００１（１９７８）〕により、肉腫
細胞の培養上清から始めてＴＧＦの存在が報告きれて以
来、多数のＴＧＦがヒトおよびけつ歯動物の培養ガン細
胞およびガン患者のガン組織からも発見されている〔ロ
バーツ・工・ビら；　　Ｐｒｏｃ。Sci., 75.4001 (1978)] reported the existence of TGF starting from the culture supernatant of sarcoma cells.Since then, many TGFs have been detected from cultured human and rodent cancer cells and cancer tissues of cancer patients. It has been discovered [Roberts, Eng., Bi et al.; Proc.

Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、　ＵＳＡ、７７　、
３４９４　（１９８０））。最近、ディ・アル・ターシ
ックら〔ＪＮＣＬ、旦ユ、７９３（１９８２）：］およ
びジゼ・トダロら（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、、４３，
４０３（１９８３）〕は、ガン患者の尿から分子量約３
００００〜３５０００の高分子型ＴＧＦを抽出している
が詳しい物性は末だ明らかでない。Natl, Acad, Sci, USA, 77,
3494 (1980)). Recently, Di al-Tashik et al. [JNCL, Danyu, 793 (1982):] and Jise Todaro et al. (Cancer Res, 43,
403 (1983)] has a molecular weight of approximately 3 from the urine of cancer patients.
0,000 to 35,000 polymer type TGF has been extracted, but its detailed physical properties are still unclear.

従ってまた、ＴＧＦと類似している種々のグロスファク
ターとを明瞭に識別する適切な手段が々く、ＴＧＦを判
定するに当って、ＴＧＦの有する正常細胞のコロニー形
成能に基いて行なっていたにすぎず、かつ煩雑な操作を
も必要とするが、定量性に欠けるものであった。さらに
ＴＧＦの体液、例えば血液、尿などにおける存在、含有
量、さらにその消長などに関してあまり報告されていな
いものであった。Therefore, there are many appropriate means for clearly distinguishing between TGF and various similar gross factors. Although it is not too difficult and requires complicated operations, it lacks quantitative properties. Furthermore, there have been few reports regarding the presence and content of TGF in body fluids such as blood and urine, as well as its fate and development.

本発明者らは、先に、高分子型のＴＧＦは正常人尿には
存在せず、ガン患者尿のみ特異的に存在すること、しか
もこのものが正常細胞に対して前述のような生物学的活
性を有するもので極めて主要な物質と考えて研究した結
果、種々のガン患者の尿を透析して無機イオンその他の
低分子物質を除去し、さらに必要に応じてゲル濾過した
後、次いで陽イオン交換体を用いてクロマトグラフィー
または／および吸着クロマトグラフィーを行々い、極め
て高純度に精製されたヒトＴＧＦを得たものである（特
願昭５８−６１１０２号明細書参照）。The present inventors previously discovered that high-molecular-weight TGF does not exist in normal human urine, but only exists specifically in urine of cancer patients. As a result of our research, we found that the urine of various cancer patients was dialyzed to remove inorganic ions and other low-molecular substances, and if necessary gel filtrated. Human TGF purified to extremely high purity was obtained by performing chromatography and/or adsorption chromatography using an ion exchanger (see Japanese Patent Application No. 58-61102).

さらに本発明者らは研究し続けた結果、とのＴＧＦを用
いてヒト以外の哺乳動物に注射して免疫せしめ、その血
液を採取してこのＴＧＦに対するヒ）ＴＧＦ抗体が良好
に得られることを知り、窟らに研究の結果、免疫させた
哺乳動物の牌臓を摘出し、その抗体産生能を有する単細
胞とミエローマ細胞とを融合せしめることによりＴＧＦ
Ｋ対するヒトＴＧＦ抗体としてのモノクロナール抗体産
生細胞を得、その培養物からヒ）ＴＧＦ抗体を良好に得
ることを完成した。さらに本発明者らは、得られたヒ）
ＴＧＦ抗体を不溶性担体に固定化せしめて固定化ヒ）Ｔ
ＧＦ抗体を得、またヒトＴＧＦ抗体と酵素とを結合せし
めて酵素標識ヒ）ＴＧＦ抗体の結合体を得、ＴＧＦを含
有する被検液中のＴＧＦの定量における、上述の固定化
ＴＧＦ抗体および酵素標識ＴＧＦ抗体を用いるサンドイ
ツチ法による酵素免疫測定法（ＥＩＡ）を確立した。Furthermore, as a result of continued research, the present inventors found that human TGF antibodies against this TGF could be successfully obtained by injecting and immunizing non-human mammals with this TGF and collecting their blood. As a result of research, Kutsu et al. discovered that TGF was produced by removing the spleen of immunized mammals and fusing single cells capable of producing antibodies with myeloma cells.
They obtained monoclonal antibody-producing cells as a human TGF antibody against K. and succeeded in obtaining human TGF antibodies from the culture. Furthermore, the present inventors
Immobilization by immobilizing the TGF antibody on an insoluble carrier
A GF antibody is obtained, and a human TGF antibody and an enzyme are combined to obtain an enzyme-labeled TGF antibody conjugate, and the above-mentioned immobilized TGF antibody and enzyme are used in quantifying TGF in a test solution containing TGF. An enzyme-linked immunosorbent assay (EIA) using the Sand-Deutsch method using a labeled TGF antibody was established.

本発明は、上記の知見に基いて完成したもので、固定化
ＴＧＦ抗体と被検液とを反応せしめ、次いで酵素標識Ｔ
ＧＦ抗体を反応せしめた後、固相と液相とを分離し、そ
の分離したいずれか一方の酵素標識の量を定量すること
を特徴とする被検液中（７）ＴＧＦの酵素免疫測定法で
ある。The present invention was completed based on the above findings, and involves reacting an immobilized TGF antibody with a test solution, and then reacting with an enzyme-labeled TGF antibody.
(7) Enzyme immunoassay method for TGF in a test solution, which comprises reacting with a GF antibody, separating a solid phase and a liquid phase, and quantifying the amount of an enzyme label in either of the separated phases. It is.

まず本発明における固定化ヒ）ＴＧＦ抗体および酵素標
識ヒ）ＴＧＦ抗体に用いられるヒ）ＴＧＦ抗体を得るた
めのヒ）ＴＧＦは、例えば肺癌、瓶毛腫腸、胃癌、咽頭
癌、結腸癌、乳癌、黒色肉腫、卵巣癌などのガン患者の
尿を原料として精製、回収することが簡便である。これ
らのガン患者尿からのＴＧＦの精製手段について例示す
ると、集められたガン患者尿は、まず低分子の不純物を
除くため、水を透析外液として透析膜の分子量カット約
１００００以下の膜を用いて透析する。次いで得られた
透析内液は、必要に応じて、凍結、融解を反復して不純
物を析出させ、遠心分離や５ミクロン程度の細孔を有す
るフィルターを通しテ微細な沈澱の粒子を除去してもよ
い。さらに必要に応じて、透析内液は、バイオゲル（Ｂ
ｉｏｇｅｌ　）　ｐ−６０，ｐ−１００（バイオラド社
製）、セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｇ　−
５０（７７／ｌ／−７シア社製）々どのゲル沖過剤にて
ゲル濾過してＴＧＦ活性を示す両分を集めればよい。こ
の際、ＴＧＦ活性を示す両分としては、推定分子量２８
０００〜３５０００の位置に存在し、後述する試験法に
よって識別することができる。次いで、前述の尿の透析
内液−１：たはゲル濾過して集めた活性画分について、
イオン交換クロマトグラフィーや分子篩膜例えば分子量
１００００〜２００００程度の限外濾過膜による分子篩
処理や、吸着クロマトグラフィーの少なくとも１以上の
操作またはこれらの操作を組み合せて精製されたＴＧＦ
活性画分が採取される。イオン交換クロマトグラフィー
は、例えばＣＭ−セファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ　
）　（７７ルマシア召二製）、ＳＰ−セファデックス（
Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）（ファルマシアｔｉ製）、ＣＭ−
５２（ワットマン社製）、バイオ・レックス（Ｂｉｏ　
−Ｒｅｘ　）　７０（バイオ・ラド社製）などの陽イオ
ン交換体を基材としたカラムを用いて、上記のＴＧＦ含
有液を加えて吸着せしめる。次いで逐次濃度を上昇勾配
させた中性塩、好ましくは塩化す）　ＩＪウムの水溶液
を用いて傾斜溶出して、そのＴＧＦ活性画分を回収すれ
ばよい。次いで好ましくは分子量１００００〜２０００
０程度の限外濾過膜を用いて濃縮、脱塩を行なえばよい
。さらに吸着クロマトグラフィーとしては、例えばシン
クロパック（５ｙｎｃｈｒ□ｐａｋ　）　Ｐ　Ｒシリー
ズ（ジンクローム社製）の炭素数３〜２０のアルキル基
のような疎水性基で修飾されたシリカゲルやＭｃＩ　　
Ｇｅｌ　　ＣＨ２０Ｐシリース（三菱化成工業社＠）、
アンバーライ）（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）　Ｘ　Ａ　Ｄシ
リーズ（アンバーライト社製）のようなポリスチレン系
ハイポーラス吸着樹脂などの基材のカラムを用いて、上
記のＴＧＦ含有液を加えて吸着せしめる。次いで逐次濃
度を上昇勾配させた親水性中性有機溶媒、例えばエタノ
ール、プロピルアルコールのような低級脂肪族アルコー
ルマタはアセント、アセトニトリルのような低級脂肪族
ケトンなどの水溶液を用いて傾斜溶出して、そのＴＧＦ
活性画分を回収すればよい。このようにして得られるＴ
ＧＦ活性画分は、必要に応じて凍結乾燥などの乾燥手段
にて乾燥粉末としテ得テもよく、この乾燥粉末は白色で
、ニンヒドリン反応陽性、分子量２８０００〜３５００
０（ゲル濾過法）、５ＤＳ−電気泳動において単一であ
り、酸および熱に対１−て安定で、トリプシンおよびジ
チオスレイトール処理により失活される理化学的性質を
有しており、極めて高度に精製されたヒトＴＧＦである
。First, in the present invention, the immobilized TGF antibody and the enzyme-labeled TGF antibody are used for obtaining the TGF antibody. It is easy to purify and collect urine from cancer patients such as , melanosarcoma, and ovarian cancer as a raw material. To give an example of the method for purifying TGF from the urine of cancer patients, the collected urine of cancer patients is first purified using a dialysis membrane with a molecular weight of about 10,000 or less using water as the external dialysis fluid in order to remove low-molecular impurities. Dialyze. Next, the obtained dialyzed fluid is repeatedly frozen and thawed as necessary to precipitate impurities, and then centrifuged or passed through a filter with pores of about 5 microns to remove fine precipitated particles. Good too. Furthermore, if necessary, the dialysis fluid may be mixed with biogel (B
iogel) p-60, p-100 (manufactured by Bio-Rad), Sephadex (5ephadex) G-
50 (77/l/-7 manufactured by Shea) or any other gel filtration agent, and the two fractions exhibiting TGF activity may be collected. At this time, the estimated molecular weight of the two components showing TGF activity is 28
000 to 35,000, and can be identified by the test method described below. Next, regarding the aforementioned urine dialysis fluid-1: or the active fraction collected by gel filtration,
TGF purified by at least one operation of ion exchange chromatography, molecular sieve treatment using a molecular sieve membrane, such as an ultrafiltration membrane with a molecular weight of about 10,000 to 20,000, or adsorption chromatography, or a combination of these operations.
The active fraction is collected. Ion exchange chromatography is performed using, for example, CM-Sephadex (5ephadex).
) (manufactured by 77 Lemasia Shoji), SP-Sephadex (
S ephadex) (manufactured by Pharmacia Ti), CM-
52 (manufactured by Whatman), Bio Rex (Bio
Using a column based on a cation exchanger such as -Rex) 70 (manufactured by Bio-Rad), the above TGF-containing solution is added and adsorbed. Then, the TGF-active fraction may be collected by gradient elution using an aqueous solution of a neutral salt (preferably a chloride) whose concentration is gradually increased. Next, preferably a molecular weight of 10,000 to 2,000
Concentration and desalting may be carried out using an ultrafiltration membrane of about 0. Furthermore, for adsorption chromatography, for example, silica gel modified with a hydrophobic group such as an alkyl group having 3 to 20 carbon atoms such as SynchroPak PR series (manufactured by Zinchrome Co., Ltd.) or McI
Gel CH20P series (Mitsubishi Chemical Industries, Ltd.),
The above TGF-containing liquid is added and adsorbed using a column having a base material such as a polystyrene-based high-porous adsorption resin such as Amberlite X A D series (manufactured by Amberlite). Next, a hydrophilic neutral organic solvent with an increasing concentration gradient, for example, a lower aliphatic alcohol such as ethanol or propyl alcohol, is gradually eluted using an aqueous solution of a lower aliphatic ketone such as ascent or acetonitrile. That TGF
The active fraction may be collected. T obtained in this way
The GF active fraction can also be obtained as a dry powder by drying means such as freeze-drying, if necessary, and this dry powder is white, positive for ninhydrin reaction, and has a molecular weight of 28,000 to 3,500.
0 (gel filtration method), 5DS-single in electrophoresis, stable against acids and heat, and has physical and chemical properties that are inactivated by trypsin and dithiothreitol treatment, and has extremely high This is human TGF purified to

またヒ）ＴＧＦ抗体を得るに当っては、上述のヒ）ＴＧ
Ｆを抗原として、ヒト以外の哺乳動物、例えばモルモッ
ト、ウサギ、ラット、マウスやヤギなどの抗体産生能の
ある動物を用い、通常の方法に従って免疫した後採血し
て抗血清を得、さらに抗体を分離する。この際抗原とし
て用いるＴＧＦは、上述の如くまで高度に精製した単一
の蛋白標品であることが望ましいが、必ずしもこれに限
定されるものではない。また抗体を得るに当って、例え
ば上述のヒ）’ｒＧＦ粉末０．１〜１■を生理食塩水０
．１〜５ｒｎｌに溶解し、これに同量のコンプリート・
フロイント・アジュバント（ＣｏｍｐｌｅｔｅＦｒｅｕ
ｎｄ’ｓ　　ａｄｊｕｖａｎｔ　　）を加え、充分乳化
した援用いる哺乳動物、例えばウサギやマウスなどの皮
下、皮内に注射し、１〜３週間毎に数回注射して免疫せ
しめる。その後、最終免疫の日より一定期間後採血し、
これを放置し、凝固せしめて遠心分離し、ヒ）ＴＧＦ抗
体を含有する抗血清を得る。In addition, in obtaining h) TGF antibodies, the above-mentioned h) TG
Using F as an antigen, immunize non-human mammals such as guinea pigs, rabbits, rats, mice, and goats with the ability to produce antibodies according to the usual method, collect blood to obtain antiserum, and then generate antibodies. To separate. The TGF used as the antigen at this time is preferably a single protein preparation highly purified as described above, but is not necessarily limited to this. In addition, in order to obtain antibodies, for example, 0.1 to 1 μg of the above-mentioned H)'rGF powder was added to 0.0% of physiological saline.
．． Dissolve in 1 to 5 rnl and add the same amount of Complete.
Freund's adjuvant (CompleteFreu)
nd's adjuvant) is added and sufficiently emulsified and injected subcutaneously or intradermally into a mammal to be used, such as a rabbit or mouse, for immunization by several injections every 1 to 3 weeks. After that, blood was collected after a certain period of time from the day of final immunization.
This is left to solidify and centrifuged to obtain antiserum containing TGF antibody.

またこの場合に用いる動物としては抗体産生能のある動
物であれば何れを用いてもよく、大量の抗体を得るには
大型動物を用いるのが好ましく、通常はウサギ、マウス
やヤギを用いるか、何んら限定されるものではない。さ
らにこれらの動物から得られたヒ）ＴＧＦ抗体を含有す
る抗血清からヒ）ＴＧＦ抗体を得るには、通常用いられ
る抗体の精製手段の方法によって行なえるもので、例え
ば抗血清を硫安分画し、次いでイオン交換クロマトグラ
フィーあるいはゲル濾過によって精製、採取すればよい
。さらに高純度に精製するにはヒトＴＧＦを固定化した
不溶性担体を基材として用いるアフィニティークロマト
グラフィーにて吸着し、次いで溶出を行なって得ればよ
い。さらにヒトＴＧＦ抗体を得る別法としては、ヒ）Ｔ
ＧＦを抗原として免疫させたヒト以外の哺乳動物の牌細
胞とミエローマ細胞とを用いて融合せしめ、この融合細
胞からヒトＴＧＦに対するモノクロナール抗体産生細胞
を分離し、この融合細胞を用いるヒトＴＧＦモノクロナ
ール抗体を製造する方法で、特に哺乳動物としてマウス
を用いる方法がよく利用されている［Ｎａｔｕｒｅ、　
　２５６　、４９５〜４９７　（１９７５）、Ｎａｔｕ
ｒｅ　、　２７６　、３９７〜３９９（］９７８）、Ｃ
ｅ１ｌ、ｌ　４　、９〜２０　（１９７８）、Ｎａｔｕ
ｒｅ　、　２６６　、５５０〜５５２　（１９７７）、
Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　６，５１１〜５１９
（１９７６）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｅｎｇ
ｉｎｅｅｒｉｎｇＮｅｗｓ、Ｊａｎ、　１　、１９７９
　、１．５〜．１７：ｉｏ例えばＢａ１ｂ／Ｃマウスの
皮下に、ＴＧＦ含有生理食塩水とコンプリート・フロイ
ント・アジュバントの乳化液を注射し、１〜３週間後複
数回追加免疫を行ない、最終免疫後３〜５日後にマウス
の牌臓を摘出し、適当な媒体中で牌細胞の単−細胞化し
た懸濁液を調製する。次いでこの牌細胞３〜１０量に対
して、マウス由来のミエローマ細胞、例えばＰＳ−ＮＳ
Ｉ／ｌ−Ａｇ４−１のＩＭを用いて、３７℃、４０〜５
０％ポリエチレングリコール１０００〜１５００の存在
下適当な培地、例えばＲＰＭＩ培地［Ｊ、Ａ、Ｍ、Ａ、
、　　１９９　、５１９　（１９６７）、Ｊ、Ｎａｔ、
Ｃａｎｃｅｒ　　Ｉｎ５ｔ、、　３６　＋　４０５（１
９６６）、Ｉｎ　　Ｖｉｔｒｏ、　６　、８９　（１９
７０）〕で融合せしめ、次いで洗浄後分離し、ウシ胎児
血清含有ＲＰＭＩ培地に加え、さらにこの細り懸ｍｍの
微量づつ、ヒボキサンチン、アミノプテリジン、チミジ
ン、ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地
）にて選択培養し、各培養液の上清を採取し、その抗体
価の高い培養細胞を選択し、さらに用いたマウスＢａ１
ｂ／ｃの胸腺細胞をフィダーセルとして用いる限界希釈
法法によりクローニングを行ない、ヒトＴＧＦモノクロ
ナール抗体産生ｍ胞を分取する。ざらにこの細胞を、ウ
シ胎児血清含有ＲＰＭＩ培地やダルベツコ変法イーグル
培地にて培養し、その上清を取得し、これを硫安分画、
イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過やアフィニテ
ィークロマトグラフィーを行なって精製されたヒ）ＴＧ
Ｆモ／クロナール抗体を得る。または、ヒ）ＴＧＦモノ
クロナール抗体産生細胞を、組織適合動物や無胸腺のヌ
ードマウスの体内で腫瘍として生育せしめ、これから採
取、精製してもよい。さらにこのヒトＴＧＦモノクロナ
ール抗体産生細胞は、ジメチルスルホキサイドやグリセ
ロールなどの凍結保護剤を用いて血清含有増殖培地にて
液体窒素的−１９６℃で凍結保存すればよい。In this case, any animal can be used as long as it has the ability to produce antibodies, and in order to obtain a large amount of antibodies, it is preferable to use large animals, and usually rabbits, mice, goats, or It is not limited in any way. Furthermore, human TGF antibodies can be obtained from antiserum containing human TGF antibodies obtained from these animals by a commonly used antibody purification method, such as ammonium sulfate fractionation of the antiserum. Then, it may be purified and collected by ion exchange chromatography or gel filtration. For further purification, it may be obtained by adsorption by affinity chromatography using an insoluble carrier on which human TGF is immobilized as a base material, followed by elution. Furthermore, as an alternative method for obtaining human TGF antibodies, human
The tile cells of a non-human mammal immunized with GF as an antigen are fused with myeloma cells, the monoclonal antibody-producing cells against human TGF are separated from the fused cells, and the fused cells are used to produce human TGF monoclonal antibodies. Among the methods for producing antibodies, methods using mice as mammals are often used [Nature,
256, 495-497 (1975), Natu
re, 276, 397-399(]978), C
e1l, l4, 9-20 (1978), Natu
re, 266, 550-552 (1977),
Eur, J. Immunol, 6,511-519
(1976), Chemical and Eng.
ineeringNews, Jan. 1, 1979
, 1.5~. 17:io For example, subcutaneously inject a Ba1b/C mouse with an emulsion of TGF-containing physiological saline and complete Freund's adjuvant, perform multiple booster immunizations 1 to 3 weeks later, and 3 to 5 days after the final immunization. The spleen of the mouse is removed, and a monocellular suspension of spleen cells is prepared in an appropriate medium. Next, 3 to 10 amounts of these tile cells are injected with mouse-derived myeloma cells, such as PS-NS.
Using IM of I/l-Ag4-1, 37°C, 40-5
A suitable medium, such as RPMI medium [J, A, M, A,
, 199, 519 (1967), J. Nat.
Cancer In5t,, 36 + 405 (1
966), In Vitro, 6, 89 (19
70)], then washed and separated, added to RPMI medium containing fetal bovine serum, and further added to RPMI medium containing hyboxanthin, aminopteridine, thymidine, and fetal bovine serum (HAT medium) in minute amounts of this thin suspension (HAT medium). The supernatant of each culture was collected, cultured cells with high antibody titers were selected, and the mouse Ba1
Cloning is performed by the limiting dilution method using b/c thymocytes as feeder cells, and human TGF monoclonal antibody-producing m cells are fractionated. These cells were cultured in RPMI medium containing fetal bovine serum or Dulbecco's modified Eagle's medium, and the supernatant was obtained, which was fractionated with ammonium sulfate.
TG purified by ion exchange chromatography, gel filtration or affinity chromatography
Obtain F mono/clonal antibodies. Alternatively, human TGF monoclonal antibody-producing cells may be grown as tumors in the bodies of histocompatible animals or athymic nude mice, and then collected and purified. Furthermore, the human TGF monoclonal antibody-producing cells may be cryopreserved at -196° C. in liquid nitrogen in a serum-containing growth medium using a cryoprotectant such as dimethyl sulfoxide or glycerol.

さらにこのヒトＴＧＦ抗体またはヒトＴＧＦモノクロナ
ール抗体は、不溶性担体に固定化した固定化ＴＧＦ抗体
や標識である酵素との結合体としての酵素標識ＴＧＦ抗
体として用いられる。まずこのよう々固定化ＴＧＦ抗体
に用いられる不溶性担体としては、免疫反応器に対して
自由に移動できる移動相不溶性担体の場合と、免疫反応
器壁例えば内容量５０〜５００μβ用のマイクロプレー
トの反応壁面を不溶化担体とする連続相不溶性担体との
場合が挙げられる。また移動相不溶性担体としては、通
常少なくとも濾過などの手段により容易に単離できる粒
径のものがよく、例えば径１朋以」二、好ましくは５ｍ
ｍ以上のものがよく、ビーズ状のものが繁用される。ま
たビーズ状の代りに、免疫反応器の底部の形状と相似し
た紡錘形や半円形の形状のものとして用いてもよく、こ
のような形状の不溶性担体としては特開昭５８−５６５
７号公報に記載のものが例示される。さらにとのような
不溶性担体としては、例えばアルブミンやゼラチンなど
の蛋白質の不溶化したもの、アガロ−１ス、セルロース
やデキストリンなどの多糖類のエヒリロルヒドリン処理
による不溶化したものや臭化シアン処理やその他のアミ
７基導入試薬、チオール基導入試薬やカルボキシル基導
入試薬にテ処理した不溶化したものなどの不溶性半合成
高分子系担体、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリ
ル酸エステル、メタアクリル酸、メタアクリル酸エステ
ル、ビニルアルコール、酢酸ビニル、スチレン、アミノ
スチレン、クロルスチレン、スルホスチレン、マレイン
酸、フマル酸などの重合体または共重合体やそれらのハ
イポーラスなものなどの不溶性合成高分子系担体やケイ
素やアルミニウムなどの無機化合物またはそのハイポー
ラス無機化合物の不溶性無機系担体が挙げられる。また
連続相不溶性担体としては、主に上記の不溶性合成高分
子系担体や不溶性無機系担体が挙げられる。Furthermore, this human TGF antibody or human TGF monoclonal antibody is used as an immobilized TGF antibody immobilized on an insoluble carrier or an enzyme-labeled TGF antibody as a conjugate with an enzyme as a label. First, as insoluble carriers used for immobilized TGF antibodies, there are two types of insoluble carriers: mobile phase insoluble carriers that can move freely relative to the immunoreactor, and microplates with an internal capacity of 50 to 500 μβ on the immunoreactor wall. An example is a case with a continuous phase insoluble carrier in which the wall surface is an insolubilizing carrier. The mobile phase-insoluble carrier usually has a particle size that can be easily isolated by means such as filtration, for example, a particle size of 1" or more, preferably 5 m
It is best to use m or more, and bead-shaped ones are often used. Moreover, instead of bead-shaped, it may be used in a spindle-shaped or semicircular shape similar to the shape of the bottom of an immunoreactor.
The one described in Publication No. 7 is exemplified. Examples of insoluble carriers include, for example, insolubilized proteins such as albumin and gelatin, agarose, insolubilized polysaccharides such as cellulose and dextrin treated with echylolhydrin, and cyanogen bromide treatment. Other ami7 group-introducing reagents, insoluble semi-synthetic polymer carriers such as insolubilized ones treated with thiol group-introducing reagents and carboxyl group-introducing reagents, acrylonitrile, acrylic acid, acrylic esters, methacrylic acid, methacrylic acid Insoluble synthetic polymer carriers such as polymers or copolymers of esters, vinyl alcohol, vinyl acetate, styrene, aminostyrene, chlorstyrene, sulfostyrene, maleic acid, fumaric acid, and highly porous versions thereof; Examples include inorganic carriers in which inorganic compounds such as aluminum or highly porous inorganic compounds are insoluble. The continuous phase insoluble carrier mainly includes the above-mentioned insoluble synthetic polymer carriers and insoluble inorganic carriers.

次いでこれらの不溶性担体を用いて前記のＴＧＦ抗体を
固定化せしめるに当っては、不活性媒体、例えばリン酸
緩衝液やベロナール緩衝液などのＰＨ６〜８．５の緩衝
液などの媒体中で不溶性担体のノ・イボ−ラス吸着能に
基＜ＴＧＦ抗体の吸着固定化を行なってもよく、または
不溶性担体の有する官能基またはそれに導入した官能基
とＴＧＦ抗体の有する官能基またはそれに導入した官能
基とに基いて、必要に応じて架橋剤を用いて、共有結合
せしめて固定化せしめてもよい。また官能基を導入する
場合にはスペーサー導入のための試薬がよく用いられ、
例えばスクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジ
ボアルデヒドなどのジアルデヒド化合物、Ｗ−アミノ酪
酸、Ｗ−アミングルタミン酸などのアミノ酸化合物また
はその酸クロライド、スクシンイミドエステル、ｐ−ニ
トロフェニルエステルなどの反応性誘導体、マロン酸、
コハク酸、グルタル酸、アジピン酸などのジカルボン酸
化合物またはその反応性誘導体、ヘキサメチレンジアミ
ン、デカメチレンジアミンなどのジアミン化合物、３−
（２−ピリジル−ジチオ）プロピオ酸、３−（２′−ベ
ンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオン酸などのチオカル
ボン酸化合物またはそノ反応性誘導体、Ｓ−アセチルメ
ルカプトサクシニック・アンハイドライド、２−アミン
エタンチオール、γ−ア・ミノプロピルエトキシシラン
などの試薬の１種または２種以上を用いてアルデヒド基
、カルボキシル基、アミ７基、チオール基などの官能基
を導入してもよい。さらにこのような不溶性担体および
ＴＧＦ抗体を用いて固定化ＴＧＦ抗体の共有結合体を得
るに当っては、この不溶性担体、ＴＧＦ抗体の有するア
ミ７基、水酸基、カルボキシル基、チオール基などの官
能基またはその反応性誘導体やさらに導入された官能基
またはその反応性誘導体に基いて、必要に応じて両者を
結合し得る架橋試薬を用いて得られる。また架橋試薬と
しては、アミン基、水酸基、カルボキシル基、チオール
基などの官能基と反応し得る基を二以上有する多官能性
試薬であればよく、例えばスクシンアルデヒド、グルタ
ルアルデヒド、アジボアルデヒドなどのジアルデヒド化
合物、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸な
どのジカルボン酸またはその反応性誘導体、ヘキサメチ
レンジイソシアナー）、２．４−）ルエンジイソシアナ
−１・などのジイソシアナート化合物、マレイミド安息
香酸、マレイミドフェニル酢酸などのマレイミドカルボ
ン酸化合物またはその反応性誘導体、Ｎ、Ｎ−エチレン
ビスマレイミド、Ｎ、Ｎ−０−フェニレンジマレイミド
などのシマレイミド化合物、ビスジアゾベンジジン、ジ
エチルマロンイミデー１−、ジメチルアジビンイミデー
）、Ｎ、Ｎ−ポリメチレンビスヨードアセトアミドや３
−（２’−ベンゾデアゾリル−ジチオ）プロピオン酸、
３−（２′−ビリジルージチオ）プロピオン酸などのチ
オカルボン酸化合物またはその反応性誘導体、Ｎ−〔２
−（２′−ピリジル−ジチオ）エチル〕−３−＜２′−
ベンゾチアゾリル−ジチオ）プロピオンアミド、１−（
２−ベンゾチアゾリル−ジチオ）　−２−（２！’−ビ
リジルージチオ）エタンなどのジチオ化合物などが挙げ
られ、これらの試薬は、用いる不溶性担体とＴＧＦ抗体
の結合に関与するアミ７基、カルボキシル基、アルデヒ
ド基、水酸基、チオール基などの官能基を考慮して選択
使用すればよい。さらに不溶性担体ＫＴＧＦ抗体を共有
結合して固定化ＴＧＦを得るに当っては、例えばＰＨ６
〜８．５の緩衝液、メタノーノペエタノール、アセトン
、ジオキサン、ジメチルスルホキサイド、テトラヒドロ
フランなどの有機溶媒またはこれらの混合溶媒を用いて
、０℃〜４０℃にてＴＧＦ抗体と架橋試薬とを反応せし
める。この際使用する割合としてはＴＧＦ抗体に対して
架橋試薬等モル化以上使用すればよい。次いで反応後、
必要に応じて精製し、これと不溶性担体とを反応せしめ
ればよい。また不溶性担体とＴＧＦ抗体との使用割合と
しては特に限定されるものではなく、測定すべき被検液
中のＴＧＦの含有量に比べて過剰量のＴＧＦ抗体の量を
固定化したものであればよい。さらに別の固定化手段と
しては、このＴＧＦ抗体に対する特異的抗体、即ちこの
ＴＧＦ抗体産生の哺乳動物の免疫グロブリン分画を用い
て他種の哺乳動物、特に大型動物に免疫せしめて得られ
たいわゆる第２抗体を用い、この第２抗体を不溶性担体
に固定化せしめ、欧いでこれにこのＴＧＦ抗体を免疫的
手段にて結合せしめることによるＴＧＦ抗体の活性をほ
とんど失活せしめることのない固定化手段によって固定
化ＴＧＦ抗体を得てもよい。Next, when immobilizing the above-mentioned TGF antibody using these insoluble carriers, the TGF antibody is insoluble in an inert medium, for example, a buffer with a pH of 6 to 8.5 such as a phosphate buffer or a veronal buffer. The TGF antibody may be adsorbed and immobilized based on the no-bolus adsorption capacity of the carrier, or the functional group possessed by the insoluble carrier or the functional group introduced therein and the functional group possessed by the TGF antibody or the functional group introduced therein. Based on this, if necessary, a crosslinking agent may be used to form a covalent bond and immobilize it. In addition, when introducing a functional group, a reagent for introducing a spacer is often used.
For example, dialdehyde compounds such as succinaldehyde, glutaraldehyde, and adibaldehyde; amino acid compounds such as W-aminobutyric acid and W-amine glutamic acid; or reactive derivatives thereof such as acid chlorides, succinimide esters, and p-nitrophenyl esters; acid,
Dicarboxylic acid compounds such as succinic acid, glutaric acid, adipic acid or their reactive derivatives, diamine compounds such as hexamethylene diamine, decamethylene diamine, 3-
(2-pyridyl-dithio)propionic acid, 3-(2'-benzothiazolyl-dithio)propionic acid and other thiocarboxylic acid compounds or their reactive derivatives, S-acetylmercaptosuccinic anhydride, 2-amineethanethiol, Functional groups such as aldehyde groups, carboxyl groups, amide groups, and thiol groups may be introduced using one or more reagents such as γ-aminopropylethoxysilane. Furthermore, when obtaining a covalent conjugate of immobilized TGF antibody using such an insoluble carrier and TGF antibody, functional groups such as amine 7 group, hydroxyl group, carboxyl group, and thiol group, which this insoluble carrier and TGF antibody have, Alternatively, it can be obtained based on a reactive derivative thereof, a further introduced functional group, or a reactive derivative thereof, and if necessary, using a crosslinking reagent capable of bonding both. The crosslinking reagent may be a polyfunctional reagent having two or more groups capable of reacting with functional groups such as amine groups, hydroxyl groups, carboxyl groups, and thiol groups, such as succinaldehyde, glutaraldehyde, and azibaldehyde. dialdehyde compounds, dicarboxylic acids such as malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid or their reactive derivatives, diisocyanates such as hexamethylene diisocyanate, 2.4-) luene diisocyanate-1. Compounds, maleimidocarboxylic acid compounds or reactive derivatives thereof such as maleimidobenzoic acid, maleimidophenylacetic acid, cimaleimide compounds such as N,N-ethylene bismaleimide, N,N-0-phenylene dimaleimide, bisdiazobenzidine, diethylmalonimide 1-, dimethylazibinimide), N,N-polymethylene bis iodoacetamide and 3
-(2'-benzodeazolyl-dithio)propionic acid,
Thiocarboxylic acid compounds such as 3-(2′-pyridyldithio)propionic acid or reactive derivatives thereof, N-[2
-(2'-pyridyl-dithio)ethyl]-3-<2'-
Benzothiazolyl-dithio)propionamide, 1-(
Examples include dithio compounds such as 2-benzothiazolyl-dithio)-2-(2!'-pyridyl-dithio)ethane, and these reagents contain amine 7 groups, carboxyl groups, and aldehyde groups involved in the binding of the TGF antibody to the insoluble carrier used. They may be selected and used in consideration of functional groups such as hydroxyl group, hydroxyl group, and thiol group. Furthermore, when obtaining immobilized TGF by covalently bonding an insoluble carrier KTGF antibody, for example, PH6
The TGF antibody and the cross-linking reagent were mixed at 0°C to 40°C using a buffer solution of ~8.5, an organic solvent such as methanol, acetone, dioxane, dimethyl sulfoxide, and tetrahydrofuran, or a mixed solvent thereof. Make it react. In this case, the ratio of the crosslinking reagent to the TGF antibody may be equal to or more than equimole. Then, after the reaction,
If necessary, it may be purified and reacted with an insoluble carrier. Furthermore, the ratio of the insoluble carrier and TGF antibody used is not particularly limited, as long as the amount of TGF antibody immobilized is in excess compared to the TGF content in the sample solution to be measured. good. Another immobilization method is to use a specific antibody against this TGF antibody, that is, a so-called so-called antibody obtained by immunizing other species of mammals, especially large animals, using an immunoglobulin fraction of a mammal that produces this TGF antibody. An immobilization method that hardly deactivates the activity of the TGF antibody by using a second antibody, immobilizing the second antibody on an insoluble carrier, and binding the TGF antibody thereto by immunological means. An immobilized TGF antibody may be obtained by.

きらに酵素標識ＴＧＦ抗体を得るに当って、用いられる
酵素としては、酸化還元酵素、加水分解酵素、転位酵素
、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼが適宜選択使用さ
れるもので、例示すればラクテートデヒド四ゲナーゼ、
マレイドデヒドロゲナーゼ、マルトースデヒドロゲナー
ゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、
アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタメイトデヒドロゲ
ナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、
ラクテートオキシダーゼ、マレイドオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コリン
オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキ
シダーゼ、アミンオキシダーゼ、ザルコシンオキシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、ＮＡＤオキシダー
ゼ、α−アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リゾチー
ム、リパーゼ、アルカリホスファターゼ、アミノペプチ
ダーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセロキナーゼ・ピルベー
トキナーゼなどが挙げられる。さらにこれらの酵素は、
あらかじめ任意のスペーサーや官能基の導入を行なって
もよく、前記の不溶性担体に官能基を導入する場合と同
様の試薬、例えばジアルデヒド化合物、アミノ酸化合物
またはその反応性誘導体、ジカルボン酸化合物またはそ
の反応性誘導体、ジアミン化合物、チオカルボン酸化合
物またはその反応性誘導体、その他Ｓ−アセチルメルカ
プトサクシニック・アンハイドライド、２−アミノエタ
ンチオールなどの一種または二種以上が用いられ、新た
にアルデヒド基、カルボキシル基、アミノ酸、チオール
基などの官能基をスペーサーを介して導入してもよい。In order to obtain an enzyme-labeled TGF antibody, the enzymes used are appropriately selected from oxidoreductases, hydrolases, transposases, lyases, isomerases, and ligases, such as lactate dehyde tetragenase. ,
maleide dehydrogenase, maltose dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
Alcohol dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, α-glycerophosphate dehydrogenase,
Lactate oxidase, maleide oxidase, glucose oxidase, alcohol oxidase, choline oxidase, xanthine oxidase, amino acid oxidase, amine oxidase, sarcosine oxidase, peroxidase, catalase, NAD oxidase, α-amylase, β-galactosidase, lysozyme, lipase, alkaline phosphatase , aminopeptidase, hexokinase, glycerokinase/pyruvate kinase, etc. Furthermore, these enzymes
Any spacer or functional group may be introduced in advance, and the same reagent as used for introducing a functional group into the insoluble carrier, such as a dialdehyde compound, an amino acid compound or a reactive derivative thereof, a dicarboxylic acid compound or a reaction thereof, may be used. One or more types of derivatives, diamine compounds, thiocarboxylic acid compounds or their reactive derivatives, S-acetylmercaptosuccinic anhydride, 2-aminoethanethiol, etc. are used, and new aldehyde groups, carboxyl groups, Functional groups such as amino acids and thiol groups may be introduced via spacers.

また同様に、酵素に導入する代りに、用いるＴＧＦ抗体
に上記の試薬を用いて官能基を導入してもよい。さらに
このような試薬を用いて官能基を導入するに当っては、
通常酵素やＴ　Ｇ、　Ｆ抗体を失活せしめないｐＨ６〜
８．５の緩衝液、メタノール、エタノール、アセトン、
ジオキサン、ジメチルスルホキサイド、ジメチルアセト
アミド、テトラヒドロフランなどの有機溶媒、またはこ
れらの混合溶媒である不活性媒体中、０〜４０℃にて酵
素またはＴＧＦ抗体と試薬とを反応せしめ、必要に応じ
て精製する。Similarly, instead of introducing the functional group into the enzyme, the functional group may be introduced into the TGF antibody to be used using the above-mentioned reagent. Furthermore, when introducing a functional group using such a reagent,
pH 6~, which does not normally inactivate enzymes, TG, and F antibodies.
8.5 buffer solution, methanol, ethanol, acetone,
React the enzyme or TGF antibody with the reagent at 0 to 40°C in an inert medium such as an organic solvent such as dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethylacetamide, or tetrahydrofuran, or a mixed solvent thereof, and purify as necessary. do.

さらにこのような酵素およびＴＧＦ抗体を用いて酵素標
識ＴＧＦ抗体を得るに当ってはくこの酵素、ＴＧＦ抗体
の有するアミノ基、水酸基、カルボキシル基、チオール
基や、さらに導入された官能基に基いて、両者を結合し
得る架橋試薬を用いて得られる。また用いられる架橋試
薬としては、前記の不溶性担体とＴＧＦ抗体とを結合せ
しめるに際して用いられたものと同様の多官能性試薬が
よく用いられる。例えばジアルデヒド化合物、ジカルボ
ン酸化合物またはその反応性誘導体、ジイソシアナート
化合物、マレイミドカルボン酸化合物またはその反応性
誘導体、シマレイミド化合物、チオカルボン酸化合物″
！！たはその反応性誘導体などが挙げられ、これらの多
官能性試薬は、用いる酵素とＴＧＦ抗体との結合に関与
するアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、水酸基
、チオール基などの官能基を考慮して選択使用すればよ
い。Furthermore, when obtaining an enzyme-labeled TGF antibody using such an enzyme and TGF antibody, it is necessary to obtain an enzyme-labeled TGF antibody based on the amino group, hydroxyl group, carboxyl group, thiol group, and further introduced functional groups of the enzyme and TGF antibody. , can be obtained using a cross-linking reagent that can bind the two. As the crosslinking reagent used, a polyfunctional reagent similar to that used for binding the above-mentioned insoluble carrier and TGF antibody is often used. For example, dialdehyde compounds, dicarboxylic acid compounds or their reactive derivatives, diisocyanate compounds, maleimidocarboxylic acid compounds or their reactive derivatives, simaleimide compounds, thiocarboxylic acid compounds.
! ! or its reactive derivatives, etc., and these multifunctional reagents take into account functional groups such as amino groups, carboxyl groups, aldehyde groups, hydroxyl groups, and thiol groups that are involved in the binding between the enzyme used and the TGF antibody. You can use it selectively.

さらに酵素標識ＴＧＦ抗体を製造するに当って、例えば
前記と同様の不活性媒体中、０℃〜４０℃にてＴＧＦ抗
体と多官能性試薬を反応せしめる。Further, in producing an enzyme-labeled TGF antibody, the TGF antibody and a polyfunctional reagent are reacted, for example, in the same inert medium as described above at 0°C to 40°C.

この際使用する割合としては、ＴＧＦ抗体に対して多官
能性試薬を等モル比以上使用すればよい。In this case, the polyfunctional reagent may be used in an equimolar ratio or more to the TGF antibody.

次いでこの反応終了後、必要に応じて精製し、これに酵
素を加え、好ましくは酵素の安定ＰＨを有する緩衝液中
にて反応せしめればよく、ざらに使用される酵素量とし
てはＴＧＦ抗体と等モル比以上を用いればよい。次いで
このようにして得られた酵素標識ＴＧＦ抗体は、吸着ク
ロマトグラフィーやゲル濾過などの精製手段により精製
採取すればよい。After this reaction is completed, the enzyme is purified if necessary, and the enzyme is added thereto, and the reaction is preferably carried out in a buffer having a stable pH for the enzyme. An equimolar ratio or more may be used. The enzyme-labeled TGF antibody thus obtained may then be purified and collected by a purification means such as adsorption chromatography or gel filtration.

次いで本発明を実施するに当って、まずＴＧＦの含有量
を測定しようとする被検液、例えばヒトの尿または血清
の５０ｄ〜１．ｎｌと被検液中のＴＧＦ含有量に比べて
過剰量のＴＧＦ抗体を固定化している固定化ＴＧＦ抗体
とを免疫反応媒体、例えばリン酸緩衝液やベロナール緩
衝液５０μｌ〜５ｍｌ中にて４〜４０℃、好ましくは３
７℃にて１〜５時間反応せしめ、その後これに、被検液
中のＴＧＦ含有量に比べて過剰量のＴＧＦ抗体量を含む
量の酵素標識ＴＧＦ抗体を加えて、好捷しくは３７℃、
１〜５時間反応せしめる。次いで固定化ＴＧＦ抗体の形
成する固定化ＴＧＦ抗体−被検液中ＴＧＦ−酵素標識Ｔ
ＧＦ抗体の固相と、未反応の酵素標識ＴＧＦ抗体を含む
液相とを分離し、さらに同相は必要に応じて洗浄し、そ
の後固相または液相のいずれか一方、または両方の酵素
活性値を測定する。特に固定化ＴＧＦ抗体の不溶性担体
が、ビーズ状などの移動相不溶性担体である場合には、
この移動相不溶性担体を濾過々どの手段にて回収すれば
よく、捷たマイクロプレー１・などの連続相不溶性担体
である場合には反応終了液を洗浄区別してマイクロプレ
ートを回収すればよい。Next, in carrying out the present invention, first, 50 to 1. nl and the immobilized TGF antibody, in which an excess amount of TGF antibody is immobilized compared to the TGF content in the test solution, in an immunoreaction medium such as 50 μl to 5 ml of phosphate buffer or veronal buffer for 4 to 4 hours. 40℃, preferably 3
The reaction is carried out at 7°C for 1 to 5 hours, and then an enzyme-labeled TGF antibody is added thereto in an amount containing an excess amount of TGF antibody compared to the TGF content in the test solution, preferably at 37°C. ,
Allow to react for 1 to 5 hours. Next, the immobilized TGF antibody formed by the immobilized TGF antibody-TGF in the test solution-enzyme-labeled T
The solid phase of the GF antibody and the liquid phase containing the unreacted enzyme-labeled TGF antibody are separated, the same phase is washed as necessary, and then the enzyme activity value of either the solid phase, the liquid phase, or both is determined. Measure. In particular, when the insoluble carrier of the immobilized TGF antibody is a mobile phase insoluble carrier such as beads,
This mobile phase-insoluble carrier may be recovered by any means such as filtration, and in the case of a continuous phase-insoluble carrier such as crushed Microplate 1, the microplate may be recovered after washing the reaction-completed solution.

さらに免疫反応後、固相または液相の酵素活性を測定す
るのであるが、同相に免疫的に保持きれている酵素標識
ＴＧＦ抗体における酵素または液相に残在する酵素標識
ＴＧＦ抗体における酵素をその酵素の性質に基く公知の
種々の活性測定法によって行なえばよい。例えば酵素と
して酸化還元酵素、特に酸化酵素を用いた場合には、そ
の酵素の基質と溶存酸素とを利用する酵素の触媒反応を
行なわせしめて、基質酸化物および過酸化水素、さらに
場合によりアンモニアや炭素ガスを生成せしめ、その酵
素反応によって消費される成分、例えば酸素の量や、生
成される成分、例えば過酸化水素、アンモニアや炭酸ガ
スの量を定量することによって測定される。さらに酸素
、過酸化水素、アンモニアや炭素ガスの量は、酸素電極
、過酸化水素電極、イオン電極やガス電極などの電極に
よる電気化学的変化の量として定量すればよい。さらに
また過酸化水素の量はペルオキシダーゼおよびグアヤフ
ール、４−アミノアンチピリンとフェノール、４−アミ
ノアンチピリンとジメチルアニリン、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノンとジメチルアニリンなどの過酸化水
素呈色試薬やホモバニリン酸やｐ−ヒドロキシフェニル
酢！９１どの螢光試薬を用いて呈色または螢光せしめて
、その量を常法に従って定量してもよい。さらに酸化還
元酵素でニコチン・アデニン・ジヌクレオチドまたはニ
コチン・アデニン・ジヌクレオチド［ＮＡｐ（ｐ））４
たはその還元型を基質とするデヒドロゲナーゼを用いて
、用いた基質に作用してＮＡＤ（Ｐ）ｔたは還元型ＮＡ
Ｄ（Ｐ）を消費または生成せしめる反応により、その還
元型ＮＡＤ（Ｐ）の量をその吸収波長である３　４０ｎ
ｍにて吸光度測定するか、テトラゾリウム塩とジアホラ
ーゼまたはメナジンフエトサルフエートとによるホルマ
ザン呈色のサイクリング反応を行なわせて比色定量して
もよい。さらに捷た加水分解酵素の場合には、加水分解
によって用いる基質から検出できる低分子物質を分解、
遊離する合成基質を用いることが好ましく、例えば加水
分解酵素がβ−ガラクトシダーゼの場合には、０−ニト
ロフェニル−β−り一ガラクトピラノシドを基質とし、
その酵素反応によって低分子物質としてのＯ−ニトロフ
ェニルを遊離し、とのＯ−ニトロフェニルの量を波長４
２０ｎｍにおける吸光度として測定すればよい。さらに
遊離される低分子物質に応して種々の定量手段が採用で
きるもので、例えば低分子物質がアミノ酸化合物やアミ
ン化合物の場合にはアミノ酸オキシダーゼやアミンオキ
シダーゼを用いて酸化反応における前述の消費成分′＝
！たは生成成分の定量手段にて測定でき、またフェノー
ル化合物やアニリン化合物が低分子物質の場合にはフェ
ノールオキシダーゼ、ラッカーゼなどを用いて呈色酸化
反応せしめて比色定量することもできる。Furthermore, after the immune reaction, the enzyme activity in the solid phase or liquid phase is measured. This may be carried out by various known activity measurement methods based on the properties of the enzyme. For example, when an oxidoreductase, especially an oxidase, is used as an enzyme, the enzyme's catalytic reaction using the enzyme's substrate and dissolved oxygen is carried out to produce the substrate oxide and hydrogen peroxide, and in some cases, ammonia, etc. It is measured by producing carbon gas and quantifying the amount of components consumed by the enzymatic reaction, such as oxygen, and the amount of produced components, such as hydrogen peroxide, ammonia, and carbon dioxide gas. Further, the amount of oxygen, hydrogen peroxide, ammonia, or carbon gas may be quantified as the amount of electrochemical change caused by an electrode such as an oxygen electrode, a hydrogen peroxide electrode, an ion electrode, or a gas electrode. Furthermore, the amount of hydrogen peroxide is peroxidase and guayafur, 4-aminoantipyrine and phenol, 4-aminoantipyrine and dimethylaniline, 3-methyl-2-
Hydrogen peroxide color reagents such as benzothiazolinone and dimethylaniline, homovanillic acid and p-hydroxyphenyl vinegar! Any fluorescent reagent may be used to cause coloration or fluorescence, and the amount thereof may be determined by a conventional method. Furthermore, nicotine adenine dinucleotide or nicotine adenine dinucleotide [NAp(p))4
Using a dehydrogenase that uses NAD(P)t or its reduced form as a substrate, it acts on the used substrate to produce NAD(P)t or its reduced form.
By the reaction that consumes or produces D(P), the amount of reduced NAD(P) can be adjusted to its absorption wavelength of 340n.
The absorbance may be measured at m, or colorimetric determination may be performed by carrying out a cycling reaction of formazan coloration with a tetrazolium salt and diaphorase or menazine phethosulfate. Furthermore, in the case of a cleaved hydrolase, it decomposes low-molecular substances that can be detected from the substrate used by hydrolysis.
It is preferable to use a liberated synthetic substrate, for example, when the hydrolase is β-galactosidase, 0-nitrophenyl-β-ri-galactopyranoside is used as the substrate,
The enzymatic reaction liberates O-nitrophenyl as a low-molecular substance, and the amount of O-nitrophenyl with wavelength 4
It may be measured as absorbance at 20 nm. Furthermore, various quantitative methods can be adopted depending on the low-molecular substance to be liberated. For example, when the low-molecular substance is an amino acid compound or an amine compound, amino acid oxidase or amine oxidase is used to quantify the above-mentioned consumed components in the oxidation reaction. ′＝
! Alternatively, when the phenol compound or aniline compound is a low-molecular substance, it can be measured by colorimetric oxidation reaction using phenol oxidase, laccase, etc.

このように、ヒ）ＴＧＦを用いて得られる固定化ヒ）Ｔ
ＧＦ抗体および酵素標識ヒ）ＴＧＦ抗体を用いることに
より、極めて正確かつ簡便に被検液中のＴＧＦの定量を
なし得るもので、さらに固定化ヒ）ＴＧＦ抗体の抗体が
哺乳動物の血清から得られた抗体またはモノクロナール
抗体であわ、かつ酵素標識ヒ）ＴＧＦ抗体の抗体がモノ
クロナール抗体である場合においては、前述の逐次反応
のみならず、これらの必要な試薬を同時に用いて反応せ
しめる一段反応にてなし得るものである。In this way, immobilized TGF can be obtained using TGF.
By using a GF antibody and an enzyme-labeled human TGF antibody, it is possible to quantify TGF in a test solution extremely accurately and easily, and furthermore, the immobilized human TGF antibody can be obtained from mammalian serum. If the antibody is a monoclonal antibody or an enzyme-labeled TGF antibody, it is possible to perform not only the above-mentioned sequential reaction but also a one-step reaction using these necessary reagents at the same time. It is something that can be done.

さらにこれらの抗体は免疫グロブリンのままの使用に限
られず、これらの抗体をパパイン処理して得られるその
Ｆ　（ａｂ’）２やさらにこれを還元処理して得られる
そのＦａｂ′や、抗体をペプシン処理して得られるその
Ｆ　（ａ　ｂ　）　２などの７ラグメントをその抗体の
代りに用いてもよいものである。Furthermore, these antibodies are not limited to use as immunoglobulins, but can be used as F(ab')2 obtained by treating these antibodies with papain, Fab' obtained by further reduction treatment, or using antibodies with pepsin. 7 fragments such as F (ab) 2 obtained by the treatment may be used in place of the antibody.

以」二の通り、本発明は被検液中のＴＧＦの測定におけ
る新規な定量法を提供するもので、ガンの判定に有用に
利用されるものであり、次いで本発明の実施例および参
考例を挙げて具体的に述べるが、本発明は何んらこれに
よって限定されるものではない。As described in Section 2 below, the present invention provides a novel quantitative method for measuring TGF in a test fluid, and is useful for cancer diagnosis. will be specifically described, but the present invention is not limited thereto in any way.

実施例　１ （１）　　ヒトＴＧＦ抗血清の作製 ＴＧＦ（後述参考例１によって製造したＴＧＦ）０．５
”Ｉｉ’を生理食塩水０．５−に溶解し、これに同量の
コンプリート・フロイント・アジュバントを加え、充分
に乳化混合した後、家ウサギの四肢指の戊申、および背
中の数ケ所に注射した。２週問おきに同量の乳剤を６回
皮下注射し、最終の免疫より１０日後にその全血を採血
し、６０分間室温に放置し凝固せしめた後、３０００ｒ
ｐｍで１０分間遠心分離を行ないヒ）ＴＧＦ抗体（ポリ
クロナール抗体）含有抗血清を得た。Example 1 (1) Preparation of human TGF antiserum TGF (TGF produced according to Reference Example 1 described below) 0.5
"Ii' was dissolved in 0.5% of physiological saline, and the same amount of Complete Freund's Adjuvant was added to it. After thoroughly emulsifying and mixing, it was applied to the four toes and several places on the back of a domestic rabbit. The same amount of emulsion was subcutaneously injected 6 times every two weeks, and whole blood was collected 10 days after the final immunization, left at room temperature for 60 minutes to coagulate, and then injected at 3000 ml.
Centrifugation was performed at pm for 10 minutes to obtain antiserum containing human TGF antibody (polyclonal antibody).

（２）　　ヒ）ＴＧＦモノクロナール抗体の作製ＴＧＦ
Ｉ■を生理食塩水１ｒｎｌに溶解し、これに同量のコン
プリート・フロイント・アジュバントを加え、充分に乳
化混合はせた。乳化剤０，２ｄをＢａ１ｂ／ｃマウスの
背中皮下数ケ所に注射した。１０日間隔に同様の方法で
２回追加免疫を行ない、さらに２週間後ＴＧＦ　１００
μｇを溶解させた生理食塩水０．２ｍｌを静脈内投与し
た。(2) H) Preparation of TGF monoclonal antibody TGF
I■ was dissolved in 1 rnl of physiological saline, the same amount of Complete Freund's Adjuvant was added thereto, and the mixture was thoroughly emulsified and mixed. Emulsifier 0.2d was injected subcutaneously at several points on the back of Balb/c mice. Booster immunization was performed twice in the same manner at 10-day intervals, and two weeks later, TGF 100
0.2 ml of physiological saline in which μg was dissolved was administered intravenously.

最終免疫後３日目にマウスの牌臓を無菌的に取り出し、
単細胞化し、混入した赤血球細胞は、０．８３％塩化ア
ンモニウム液で融解させな。牌細胞は、冷却したハンク
ス液で数回洗滌後、別に培養調製したマウスミエローマ
細ａ（Ｐ３−ｘ−６３−Ａｇ８−Ｕｌ）と３対１の量比
で混合した。遠心分離を行ない得られた牌細胞トミエロ
ーマ細胞のペレットに予め３７℃に加湿した３０％ポリ
エチレングリコール（シグマ社）含むＲＰＮＭＩ６４０
培地１ｒｎｌを遠心管を回転させながら約３０秒かけて
ゆっくり加えた。室温で６０秒間放置後、１１０００ｒ
ｐで４分間遠心分離を行ない、上清をアスピレータ−で
除いた後、°５−のＲＰＭＩ培地を加え、室温で２分間
放置後、再び１０００　ｒｐｍで５分間遠心分離を行な
った。得られたペレットをＲＰＭ■培地で洗滌後、ペレ
ットに３４ｒｎｌのＨＡＴ培地〔１００μＭヒボキサン
チン、０．４μＭアミノプテリン、　１６　ｐＭチミジ
ン、１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭ１１６４
０培地〕を加え、細胞を懸濁させた。懸濁液１００μｌ
を９６ウエルプレート（ムンク社）３枚に分注し、炭酸
ガス培養装置（９５％空気、５％ＣＯ２；温度３７℃、
湿度１００％）で培養を開始した。その後、１〜３日ご
とに培地の半分量をＨＡＴ培地で交換し、７〜１４日後
にハイブリドーマの生育してきたウェルの培養上清を採
取し、その抗体価をβ−ガラクトシダーゼ標識ＴＧＦを
用いたＥＩＡ法で測定し、抗体価の高いハイブリドーマ
を５コ選択した。限界希釈法でクローニングを行ない、
得られた８コのハイブリドーマから最も高い抗体価を示
したＮ０９３のハイブリドーマをヒトＴＧＦモノクロナ
ール抗体産生細胞として取得した。ＮＯ，３のハイブリ
ドーマを１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ　１６４０培地で
培養を行ない、得られた２、５Ｘ１０７コの細胞をプリ
スタン０．５ｍｌを１週間前に腹腔内注射したＢａ１ｂ
／ｃマウスの腹腔内に投与し、腹水腫瘍を作らせ１０日
後に用水を採取し、同様な方法で腹水５０ｍ１を調製し
、ヒ）ＴＧＦモノクロナール抗体液として使用した。On the third day after the final immunization, the spleen of the mouse was removed aseptically.
Do not lyse the single-celled and contaminated red blood cells with 0.83% ammonium chloride solution. After washing the tile cells several times with chilled Hank's solution, they were mixed with mouse myeloma cells (P3-x-63-Ag8-Ul), which had been cultured separately, at a ratio of 3:1. RPNMI640 containing 30% polyethylene glycol (Sigma) pre-humidified at 37°C was added to the pellet of tile tomyeloma cells obtained by centrifugation.
One rnl of the medium was slowly added over about 30 seconds while rotating the centrifuge tube. After leaving at room temperature for 60 seconds, 11000r
After centrifuging at 1000 rpm for 4 minutes and removing the supernatant using an aspirator, 5°C RPMI medium was added, and after being left at room temperature for 2 minutes, centrifugation was performed again at 1000 rpm for 5 minutes. After washing the obtained pellet with RPM medium, the pellet was mixed with 34rnl of HAT medium [RPM1164 containing 100 μM hypoxanthine, 0.4 μM aminopterin, 16 pM thymidine, and 10% tallow serum (Fe2).
0 medium] was added to suspend the cells. 100 μl suspension
was dispensed into three 96-well plates (Munk) and placed in a carbon dioxide incubator (95% air, 5% CO2; temperature 37°C,
Culture was started at a humidity of 100%. Thereafter, half of the medium was replaced with HAT medium every 1 to 3 days, and after 7 to 14 days, culture supernatants from wells in which hybridomas had grown were collected, and the antibody titer was measured using β-galactosidase-labeled TGF. Five hybridomas with high antibody titers were selected by EIA method. Cloning is performed using the limiting dilution method,
Hybridoma N093, which showed the highest antibody titer from the eight hybridomas obtained, was obtained as a human TGF monoclonal antibody producing cell. No. 3 hybridoma was cultured in RPMI 1640 medium containing 10% FCS, and the resulting 2.5 x 107 cells were treated with Ba1b, which had been intraperitoneally injected with 0.5 ml of pristane one week earlier.
/c mice were intraperitoneally administered to produce ascites tumors, and 10 days later, the water was collected, and 50 ml of ascites was prepared in the same manner and used as a TGF monoclonal antibody solution.

（３）不溶性担体としてビーズを用いたサンドイッチＥ
ＩＡＫよるＴＧＦの測定 １）抗体固定化ビーズの調製 （１）で得られた抗血清を常法に従い硫安分画を行ない
γ−グロブリン分画を回収し、次いでＴＧＦをセファロ
ース４Ｂに固定化したカラムに、脱塩したヒ）ＴＧＦ抗
体を含むγ−グロブリン液を添加し、生理食塩水で充分
洗滌後、０．１５ＭＮａＣβを含有する０、１Ｍグリシ
ン−塩酸緩衝液（、Ｈ２，３）で抗体を溶出せしめ、１
００ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液（、Ｈ８，Ｏ）Ｋ対して透析
を行々い、精製ヒ）ＴＧＦ抗体を得た。精製抗体１ｍＬ
ｉを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）２
０ｍｌに、ポリスチレンビーズ（種水化学社製、粒径６
．３５朋）１００粒を加え、５℃で１６時間、３７℃で
１時間反応させ、抗体をビーズに固定化せしめた。ビー
ズは生理食塩水で充分洗滌後、免疫反応用緩衝液（０，
２５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、５ｍＭＥＤＴＡ、
０．１％アジ化ナトリウム、０．９％Ｎａ　Ｃ（ｌを含
有する１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，４）　）に浸漬
し、５°Ｃで保存し、固定化ＴＧＦ抗体としての抗体固
定化ビーズを得た。(3) Sandwich E using beads as an insoluble carrier
Measurement of TGF by IAK 1) Preparation of antibody-immobilized beads The antiserum obtained in (1) was subjected to ammonium sulfate fractionation according to a conventional method to recover the γ-globulin fraction, and then TGF was immobilized on a Sepharose 4B column. γ-globulin solution containing desalted human TGF antibody was added to the solution, and after thorough washing with physiological saline, the antibody was removed with 0, 1M glycine-HCl buffer (H2, 3) containing 0.15M NaCβ. Elute, 1
Dialysis was performed against 00mM IJ acid buffer (H8,O)K to obtain purified TGF antibody. Purified antibody 1mL
100mM phosphate buffer (pH 8,0) containing i
Add polystyrene beads (manufactured by Tanesui Kagaku Co., Ltd., particle size 6) to 0 ml.
．． 35) 100 beads were added and reacted at 5°C for 16 hours and at 37°C for 1 hour to immobilize the antibody on the beads. After thoroughly washing the beads with physiological saline, add immunoreaction buffer (0,
25% bovine serum albumin (BSA), 5mM EDTA,
Antibody immobilization as immobilized TGF antibody by immersing in 10 mM phosphate buffer (PH7,4) containing 0.1% sodium azide and 0.9% NaC (l) and storing at 5 °C. Got beads.

２）β−ガラクトシダーゼ−ヒトＴＧＦモノクロナール
抗体結合物の調製 （２）で得られたヒ）ＴＧＦモノクロナール抗体を含有
する腹水より、常法に従い硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロ
ースクロマトグラフィーヲ行すいＴＧＦモノクロナール
抗体を精製した。精製抗体４■を１００ｍＭリン酸緩衝
液（、、Ｈ８，０）１．８ｍＪに溶解し、これに３−　
（２’−ベンゾヂ了ゾリルージチオ）プロピオン酸スク
シンイミドエステル１４．８８μｇを含有するジメチル
ホルムアミド液２００　ｐ（１、および１００ｍＭＥＤ
ＴＡ水溶液２０μｌを加えて５℃で１時間反応せしめた
。反応液をセファデックスＧ−１５（１，５Ｘ　４０　
ｃｍ　）のカラムに添加し、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ＰＨ
５，０’）で溶出を行ない、その素通り画分を回収し、
ＴＧＦモノクロナール抗体のアミ７基に３−（２−ベン
ゾチアゾリル−ジチオ）プロピオニル基を導入した誘導
体を得た。次いでこの誘導体１．５ｍＰを含有する１０
０ｍＭ！Ｊン酸緩衝液（、Ｈ７，０）　２ｍｌにβ−ガ
ラクトシダーゼ（ヘーリンガー社製）３．３３７ｎ９を
含有する１０ｕｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，０）０．６
６６−を加え５℃で１６時間反応せしめた。反応液をセ
ファデックスＧ−１５０（１，５Ｘ９５Ｇ）のカラムに
添加し、生理食塩水で溶出を行ない、その素通り両分を
回収して、β−カラクトシダーゼーヒ）ＴＧＦモ／クロ
ナール結合体を得た。2) Preparation of β-galactosidase-human TGF monoclonal antibody conjugate From the ascites containing the human TGF monoclonal antibody obtained in (2), ammonium sulfate fractionation and DEAE-cellulose chromatography were performed according to conventional methods. Monoclonal antibodies were purified. Purified antibody 4■ was dissolved in 1.8 mJ of 100 mM phosphate buffer (H8,0), and 3-
200 p of dimethylformamide solution containing 14.88 μg of (2'-benzodizolyludithio)propionic acid succinimide ester (1, and 100 mM ED)
20 μl of TA aqueous solution was added and reacted at 5° C. for 1 hour. The reaction solution was transferred to Sephadex G-15 (1,5X 40
cm ) and added to the column in 50 mM acetate buffer (PH
5,0') and collect the flow-through fraction,
A derivative in which a 3-(2-benzothiazolyl-dithio)propionyl group was introduced into the amine 7 group of a TGF monoclonal antibody was obtained. 10 containing 1.5 mP of this derivative.
0mM! 10 umM phosphate buffer (PH7,0) 0.6 containing β-galactosidase (manufactured by Herringer) 3.337n9 in 2 ml of J phosphate buffer (PH7,0)
66- was added to the mixture, and the mixture was reacted at 5°C for 16 hours. The reaction solution was added to a column of Sephadex G-150 (1,5X95G), elution was performed with physiological saline, and both the flow-through fractions were collected to obtain β-caractosidasehi) TGF mo/clonal conjugate. I got it.

３）ＴＧＦの測定 精製ＴＧＦを免疫反応用緩衝液を用いて、１ｄあたり５
．１０．２０．４０．８０．１６０．３２０ｎＷの各濃
度に溶解したものを標準ＴＧＦ液とした。反応用試験管
（ジオツギチューブ）に、免疫反応用緩衝液３００μｌ
と各標準ＴＧＦ１００μ４を加え、これに抗体固定化ビ
ーズを１粒加え、３７℃で３時間反応せしめた。次いで
酵素標識抗体液５０μｌを加え、さらに３７℃で２時間
反応せしめ、反応終了後生理食塩水２ｍＡ’を加え攪拌
洗滌後、洗液をアスピレータ−で吸引除却した。この操
作を２回くり返し行なった後、β−ガラクトシダーゼ活
性測定用基質液（０，５％Ｏ−ニトロフェニールーβ−
Ｄ−ガラクトピラノシド、０，１％ＢＳＡ　、０．１％
アジ化ナトリウム、　３　ｍ’Ｍ　Ｍｇ　Ｃ１２，０，
９％Ｎａ　Ｃ１を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液（、Ｈ
６，７）　０．５ｍｌ。3) Measurement of TGF Purified TGF was added at 5 ml per 1 d using an immunoreaction buffer.
．． A standard TGF solution was prepared by dissolving the solution at each concentration of 10, 20, 40, 80, 160, and 320 nW. Add 300 μl of immune reaction buffer to a reaction test tube (Jiotsugi tube)
and 100 μ4 of each standard TGF were added, one antibody-immobilized bead was added thereto, and the mixture was reacted at 37° C. for 3 hours. Next, 50 μl of the enzyme-labeled antibody solution was added, and the mixture was further reacted at 37° C. for 2 hours. After the reaction was completed, 2 mA' of physiological saline was added and washed with stirring, and the washing solution was removed by suction using an aspirator. After repeating this operation twice, the substrate solution for β-galactosidase activity measurement (0.5% O-nitrophenyl-β-
D-galactopyranoside, 0.1% BSA, 0.1%
Sodium azide, 3 m'M Mg C12,0,
10 mM phosphate buffer containing 9% NaCl (,H
6,7) 0.5ml.

を加え、３７℃で６０分間反応せしめた。反応停止液（
１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ＰＨ１
１，０）　）　２献を加え反応を停止させた後、その呈
色を波長４２０ｎｍにて測定した０ 結果は第１図に示す通りであり、本測定系はきわめて良
好な定量曲線を示すものであった。was added and allowed to react at 37°C for 60 minutes. Reaction stop solution (
100mM glycine-sodium hydroxide buffer (PH1
1,0)) After adding 2 chloride and stopping the reaction, the color development was measured at a wavelength of 420 nm. The results are shown in Figure 1, and this measurement system shows an extremely good quantitative curve. Met.

なお被検液（血清、尿等）中のＴＧＦ量を測定する場合
は、標準ＴＧＦ液の代りに、被検液］００μｌを加え、
前記と同様の操作を行ない、定量曲線と対照することに
より被検液中のＴＧＦ濃度を求めることができる。When measuring the amount of TGF in the test solution (serum, urine, etc.), add 00 μl of the test solution instead of the standard TGF solution.
The TGF concentration in the test liquid can be determined by performing the same operation as described above and comparing it with the quantitative curve.

実施例　２ （１）　　ヒトＴＧＦ抗血清の作製 実施例ＩＫ順じて行なった。Example 2 (1) Preparation of human TGF antiserum The procedure of Example IK was followed.

（２）　　ヒトＴＧＦモノクロナール抗体の作製実施例
１に順して行なった。(2) Preparation of human TGF monoclonal antibody The procedure of Example 1 was followed.

（３）不溶性担体としてマイクロプレート壁を用いたサ
ンドイッチＥＩＡによるＴＧＦの測定１）抗体固定化マ
イクロプレートの調製（１）で得られたヒ）ＴＧＦ抗体
含有血清を常法に従い硫安分画を行ないγ−グロブリン
分画を回収し、次いでＴＧＦをセファロース４ＢＩＣ固
定化したカラムに脱塩したヒｌ−Ｔ　Ｃ，Ｆ抗体を含む
γ−グロブリン液を添加し、生理食塩水で充分洗滌後、
０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含有する０、１Ｍグリシン−塩
酸緩衝液（、、Ｈ２，３）で抗体をカラムより溶出せし
め、１００ｍＭ’Ｊン酸緩衝液にり・Ｊして透析を行な
い、精製ヒトＴＧＦ抗体を得た。精製抗体を１−あたり
５μｇの濃度に溶解させた１００ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ
Ｈ８，０）を、９６ウエルプレート（ムンク社、ＥＩＡ
用）の１ウエルに１５０μｅづつ分注し、５℃で１６時
間、３７℃で１時間反応させ、抗体をプレートに固定化
せしめた。プレートは生理食塩水で充分洗滌後、Ｑ、５
％ＢＳＡを含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ８，
０）を１ウェル１５０１ｔｌづつ加え３７℃で２時間反
応せしめた。プレートトは再び生理食塩水に洗滌後、免
疫反応用緩衝液をｌウェル１５０μβづつ加え、５℃で
保存し、ヒ）ＴＧＦ抗体固定化プレートとして用いた。(3) Measurement of TGF by sandwich EIA using a microplate wall as an insoluble carrier 1) Preparation of antibody-immobilized microplate The human TGF antibody-containing serum obtained in (1) was subjected to ammonium sulfate fractionation according to a conventional method. - Collect the globulin fraction, then add the γ-globulin solution containing the desalted Hi-TC,F antibody to the column on which TGF was immobilized on Sepharose 4BIC, and after washing thoroughly with physiological saline,
The antibody was eluted from the column with 0.1M glycine-HCl buffer (H2,3) containing 0.15M NaC1, and dialyzed against 100mM'J acid buffer to obtain purified human TGF. Obtained antibodies. The purified antibody was dissolved at a concentration of 5 μg per 100 mM phosphate buffer (P
H8,0) in a 96-well plate (Munk, EIA
150 .mu.e each was dispensed into each well of a plate (for use in commercial use) and reacted at 5.degree. C. for 16 hours and at 37.degree. C. for 1 hour to immobilize the antibody on the plate. After washing the plate thoroughly with physiological saline, Q, 5
100mM phosphate buffer (PH8,
0) was added in an amount of 1,501 tl per well and reacted at 37°C for 2 hours. After washing the plate again with physiological saline, 150 μβ of immunoreaction buffer was added to each well, stored at 5° C., and used as a TGF antibody immobilization plate.

２）β−ガラクトシダーゼ−ヒトＴＧＦモ／クロナール
抗体結合物の調製 実施例１に順じて行なった。2) Preparation of β-galactosidase-human TGF monoclonal antibody conjugate The procedure of Example 1 was followed.

３）ＴＧＦの測定 精製ＴＧＦを免疫反応用緩衝液を用いて、】−あたり２
．５．５．１０．２０．４０．８０．１６０７１Ｊｉの
各濃度に溶解したものを標準ＴＧＦ液とした。ヒ）ＴＧ
Ｆ抗体固定化マイクロプレートの１ウエルに各標準ＴＧ
Ｆ液１００μｌを加え３７℃で２時間反応せしめた。０
．１％ツイーン２０を含む生理食塩水で各ウェルを３回
洗滌した後、β−ガラクトシダーゼ標識ＴＧＦ液１００
１１（ｌを各ウェルに加え３７℃で２時間反応せしめた
。再び０．１％ツイーン２０を含む生理食塩水で各ウェ
ルを４回洗滌した後、β−ガラクトシダーゼ活性測定用
基質液（前述）１５０μｌを加え３７℃で１時間反応せ
しめた。終了後、５００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（、、Ｈｌｌ、Ｏ）を５０μｌ加え、その呈色
をコロナ２波長マイクロプレート光度ｉ−１−（ＭＴｌ
−１−（を用い波長４０５ｎｍにて測定した。3) Measurement of TGF Purified TGF was purified using immunoreaction buffer,
．． 5.5.10.20.40.80.16071Ji dissolved in each concentration was used as a standard TGF solution. h) TG
Add each standard TG to one well of F antibody-immobilized microplate.
100 μl of solution F was added and reacted at 37° C. for 2 hours. 0
．． After washing each well three times with physiological saline containing 1% Tween 20, β-galactosidase-labeled TGF solution 100
11 (l) was added to each well and allowed to react at 37°C for 2 hours. After washing each well four times again with physiological saline containing 0.1% Tween 20, the substrate solution for β-galactosidase activity measurement (described above) was added. 150 μl was added and reacted for 1 hour at 37°C. After completion, 50 μl of 500 mM glycine-sodium hydroxide buffer (Hll, O) was added, and the color development was measured using Corona two-wavelength microplate luminosity i-1-(MTl).
-1-( was measured at a wavelength of 405 nm.

結果は第２図に示す通りであり、本測定系はきわめて良
好な定量曲線を示すものであった。The results are shown in FIG. 2, and this measurement system showed an extremely good quantitative curve.

なお被検液（血清、尿等）中のＴＧＦ量を測定する場合
は、標準ＴＧＦ液の代りに、被検液を免疫反応用緩衝液
で５〜１０倍に希釈した液１００μｌを加え、前記と同
様の操作を行ない、定量曲線と対照することにより被検
液中のＴＧＦ濃度を求めることができる。When measuring the amount of TGF in a test solution (serum, urine, etc.), instead of the standard TGF solution, add 100 μl of a 5- to 10-fold dilution of the test solution with an immune reaction buffer, and add The TGF concentration in the test liquid can be determined by performing the same operation as above and comparing it with the quantitative curve.

また以下にＴＧＦの製造例を挙げるが、これに限定され
るものではなく、例えば特願昭５８−６１１０２号明細
書に記載の方法によってＴＧＦを製造し、これを用いて
もよい。Further, an example of producing TGF will be given below, but the present invention is not limited thereto. For example, TGF may be produced by the method described in Japanese Patent Application No. 58-61102 and used.

参考例　１ 肺癌患者法１１００−を０．０１ＭＩＪン酸緩衝液（、
Ｈ８゜０）に対し分子量カット１０．０００の透析膜（
三光純薬社製）を用いて４℃で２昼夜透析を行なった。Reference example 1 Lung cancer patient method 1100- was mixed with 0.01MIJ acid buffer (,
Dialysis membrane with a molecular weight cut of 10.000 against H8゜0) (
Dialysis was performed at 4° C. for 2 days and nights using Sanko Pure Chemical Industries, Ltd.).

透析内液は１２．０００ｇにて６０分間遠心分離し、沈
澱を除く。ｓｐ−セファデックス（７アルマシヤ社製）
をカラム（４，５Ｆ　Ｘ　３３９ｍ　）に詰め、０．０
１　Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ８，０）で平衡化した後、上
記透析内液を流下し、有効成分を吸着させた後、同緩衝
液で充分洗浄し、ついで同緩衝液中、塩化ナトリウム０
゜０１Ｍ〜１．５Ｍの傾斜溶出を行なった。（流速２２
．５ｍｌ／時、温度４℃、塩化ナトリウム傾斜濃度緩衝
液４．８１使用）ＴＧＦは同緩衝液中、塩化ナトリウム
濃度０．６〜１．０Ｍの位置に溶出され、活性分画６２
．Ｃ１ｍ１を得た。本活性分画は後記のＴＧＦ活性試験
法において、５μｌで正常細胞は変質されコロニーを形
成した。本活性分画全量をダイヤフロー分子篩膜ＰＭ−
１０（７ミコン、ファーイースト、リミツテツド社製（
日本））を用いて脱塩、濃縮をくり返し、１．２−とし
、これにトリフロロ酢酸を加えて０．０５％トリフロロ
酢酸溶液とした。The dialyzed fluid was centrifuged at 12,000 g for 60 minutes to remove the precipitate. sp-Sephadex (manufactured by 7 Almasya)
packed in a column (4,5F x 339m) and packed with 0.0
After equilibrating with 1 M phosphate buffer (PH8, 0), the above dialysis solution was allowed to flow down to adsorb the active ingredient, and then thoroughly washed with the same buffer.
A gradient elution from 0.01M to 1.5M was performed. (Flow rate 22
．． (5 ml/hour, temperature 4°C, sodium chloride gradient concentration buffer 4.81) TGF was eluted in the same buffer at a position with a sodium chloride concentration of 0.6 to 1.0 M, and the active fraction was 62.
．． C1ml was obtained. In the TGF activity test method described below, normal cells were transformed and colonies were formed in 5 μl of this active fraction. The entire amount of this active fraction was added to Diaflow Molecular Sieve Membrane PM-
10 (manufactured by 7 Mikon, Far East, Limited Company)
Desalting and concentration were repeated using (Japan)) to obtain 1.2-, and trifluoroacetic acid was added thereto to obtain a 0.05% trifluoroacetic acid solution.

アルキル基（Ｃ１８）を結合させたシリカゲルを担体と
するシンクロパックＲＰ−Ｐ（ジンクローム社製）をカ
ラム（’４．１　ｃｍＸ　２５０　ｃｍ　）に詰め０．
０５％トリフロロ酢酸で平衡化し、とのカラム１本に上
記ＴＧＦ、）ＩＪフロロ酢酸溶液の１／３を流し吸着後
０．０５％トリフロロ酢酸水で洗浄した後、同液中０〜
９０％アセトニトリル（７）　傾斜溶出を行ないアセト
ニトリル濃度５５〜７５％位置に溶出される活性分画を
とる。以上の操作を３回行ない前記の分子篩膜による濃
縮調整液全量を処理しＴＧＦ活性分画？、９ｙｎｌを分
取した。本分画を凍結乾燥後、再び３．０ｍ１．の生理
食塩水に溶解し、この溶液をＴＧＦ試験法にかけ０．４
　ｐｌで正常細胞は変質宴れコロニー形成能を示した。A column ('4.1 cm x 250 cm) was packed with Synchropack RP-P (manufactured by Zinchrome Co., Ltd.), which uses silica gel to which an alkyl group (C18) is bonded as a carrier.
After equilibration with 0.05% trifluoroacetic acid, 1/3 of the above TGF, )IJ fluoroacetic acid solution was poured into one column and adsorbed, and after washing with 0.05% trifluoroacetic acid water, 0 to
90% acetonitrile (7) Perform gradient elution and collect the active fraction eluted at the acetonitrile concentration position of 55-75%. The above operation was performed three times, and the entire amount of the concentrated preparation solution was processed using the molecular sieve membrane, and the TGF active fraction was obtained. , 9ynl was collected. After freeze-drying this fraction, 3.0 ml. of physiological saline and this solution was subjected to TGF test method with 0.4
In pl, normal cells showed altered colony-forming ability.

第　　１　表 ＴＧＦ活性試験法 （ＴＧＦの軟寒天培地培養試験法） 材料 ＋１）ＮＲＫ−細胞（株４９Ｆ） （２）５％牛脂児血清および１％非不可欠アミノ酸添加
ダルベツコ変法イーグル培地 （３）精製寒天（］）ｉｆｃｏ　　社製　Ｎｏｂｌｅ　
　ＳｐｅｃｉａｌＡｇａｒ　） （４）直径６０πｍのペトリー皿 操作 ０．５％寒天含有の（１）の培地をペトリー皿一枚に５
ｍｌずつ注加して下層培地とする。この上にＮＨＫ細胞
Ｉ　Ｘ　１０”個／ｍＡ’を含む０．３％寒天含有培地
をペトリー皿一枚に２ｍｌずつ層積し上層培地とし、こ
の上０．５ｒｎｌの生理食塩水に溶解した試料を加え、
炭酸ガスインキュベーター中に３７℃で培養する、１４
日後に培養器から取り出し、４０倍のケンビ鏡でペトリ
ー皿上の２朋視野を１０ケ所を無作為（てえらび、細胞
数１０個以上よりなるコロニーの数をかぞえその総数を
成績とする。Table 1 TGF activity test method (TGF culture test method on soft agar medium) Materials + 1) NRK-cells (49F stock) (2) Dulbecco's modified Eagle medium supplemented with 5% tallow serum and 1% non-essential amino acids (3) Purified agar (]) Manufactured by ifco Noble
Special Agar) (4) Petri dish operation with a diameter of 60 m
Pour each ml to form a lower layer medium. On top of this, 2 ml of a 0.3% agar-containing medium containing I x 10" NHK cells/mA' was layered in each Petri dish to form an upper layer medium, and on top of this, a sample dissolved in 0.5 rnl of physiological saline. Add
Incubate at 37°C in a carbon dioxide incubator, 14
After a day, remove the cells from the incubator, use a 40x magnification microscope to randomly select 10 fields in 2 fields on the Petri dish, count the number of colonies consisting of 10 or more cells, and use the total number as the score.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は実施例１における不溶性担体としてビーズを用
いたサンドイッチＥＩＡによるＴＧＦの定量曲線を示し
、第２図は実施例２における不溶性担体としてマイクロ
プレート壁を用いたサンドイッチＥＩＡによるＴＧＦの
定量曲線を示す。 特許出願人　東洋醸造株式会社 特許出願人　日本ケミカルリサーヂ株式会社手続祁ｊ正
書（自発） １．事件の表示　昭和５８年特Ｆｌ’願第１０２３９４
号、　　２１発明の名称 トランスホーミンググロスファクター の酵素免疫測定法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福 ６３２番地の１ 名称　東洋１ｌＩｌ造株式会社 代表者　　　高　１）哲　夫 ４、代理人 欄 ７、補正の内容　別紙の通り 補正の内容 １、明細書の第６頁、第４行の「絨毛腫腸」を「絨毛腫
瘍」と訂正する。 ２、同、第３頁、第１８行〜１９行「グロスファクター
とをｊを「グロスファクターを」と訂正する。 ３、同、第８頁、第１３行の「アセン１−」を１アセト
ン」と訂正する。 ４、同、第１１頁、第１４行の１最終免疫後」を「最終
免疫の」と訂正する。 ５、同、第１１頁、第１８行のｒＰＳ−ＮＳ−１／１−
Ａ（１４−１ＪをｒＰｓ−Ｘ−６３−Ａ。 ８−１ＪＩＪと訂正する。 ６、同、第１２頁、第６行〜７行の「アミノプテリジン
」を「アミノプテリン」と訂正づる。 ７、同、第１４頁、第１０行〜Ｍ１１行の１′処理した
」を「処理し」と訂正する。 ８、同、第１６頁、第３行〜４行のｒ３−（２＝−ビリ
ジル−ジチオンプロビオ酸、」をｒ３−（２−−ビリジ
ルージチオ）プロピオン酸、ｊと訂正する。 ９、同、第３０頁、第１３行の［細胞をブリスタンＪを
「細胞を、あらかじめプリスタン」と訂正する。 １０、同、第３３頁、第８行の［モノクロナール結合体
コをＵモノクロナール抗体結合体ｊと訂正する。 １１、同、第３８頁、第２行のＮｏ、０ＯＯＪをｒｌ　
０ＯＯＯＪと訂正する。 １２、同、第３８頁、第４行のＩＩ　２．０ＯＯＪをｒ
ｌ　２０００Ｊと訂正する。 １３、同、第３９頁、第５行の１カラム（４，１ｃｍｘ
　２５０ｃｍ）　ｊをｒ　（４，１ｍｍｘ２５Ｑ＋＋＋
＋ｎ）　Ｊと訂正づる。 １４、同、第４０頁、材料の（４）、同、第４１頁、第
１行、第４行、第８行の「ベトリー皿」を「ペトリ皿」
と訂正する。 以上FIG. 1 shows a TGF quantification curve by sandwich EIA using beads as an insoluble carrier in Example 1, and FIG. 2 shows a TGF quantification curve by sandwich EIA using a microplate wall as an insoluble carrier in Example 2. show. Patent Applicant: Toyo Jozo Co., Ltd. Patent Applicant: Nippon Chemical Research Co., Ltd. Procedural Report (spontaneous) 1. Display of incident 1981 Special Fl' Application No. 102394
No. 21 Name of the invention Enzyme immunoassay method for transforming growth factor 3, Relationship with the case of the person making the amendment Patent applicant address 632-1 Mifuku, Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka Prefecture Name Toyo IlIlzo Co., Ltd. Representative Takashi 1) Tetsuo 4, agent column 7, content of amendment As shown in the attached document, content of amendment 1, "choriomatous intestine" on page 6, line 4 of the specification is corrected to "choriomatous tumor." 2. Same, page 3, lines 18 to 19, ``Correct j to ``gross factor.'' 3. Same, page 8, line 13, ``acene 1-'' is corrected to ``1 acetone.'' 4. Same, page 11, line 14, ``after the final immunization'' is corrected to ``after the final immunization''. 5, same page 11, line 18 rPS-NS-1/1-
A (Correct 14-1J to rPs-X-63-A. 8-1JIJ. 6. Correct "aminopteridine" in lines 6 to 7 of page 12 of the same page to "aminopterin". 7 , same, p. 14, lines 10 to M11, 1'processed'' is corrected to ``processed''. 8, same, p. 16, lines 3 to 4, r3-(2=-viridyl -dithione probioic acid," is corrected to r3-(2--pyridyldithio)propionic acid, j. 10, Ibid., page 33, line 8, [monoclonal conjugate ko] is corrected to U monoclonal antibody conjugate j. 11. Ibid., page 38, line 2, No, 0OOJ is changed to rl.
Correct it to 0OOOJ. 12, ibid., page 38, line 4 II 2.0OOJ r
l Corrected to 2000J. 13, same, page 39, 1st column of 5th line (4.1 cm x
250cm) j to r (4.1mm x 25Q+++
+n) J and correction zuru. 14, same, page 40, materials (4), same, page 41, lines 1, 4, and 8, "Betri dish" is replaced with "Petri dish"
I am corrected. that's all

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１）固定化トランスホーミンググロスファクター抗体
と被検液とを反応せしめ、次いで酵素標識トランスホー
ミンググロスファクター抗体を反応せしめた後、固相と
液相とを分離し、その分離したいずれか一方の酵素標識
の量を定量することを特徴とする被検液中のトランスホ
ーミンググロスファクターの酵素免疫測定法。 （２）トランスホーミンググロスファクターが、ヒトト
ランスホーミンググロスファクターである特許請求の範
囲第１項記載の測定法。 （３）固定化トランスホーミンググロスファクター抗体
が、移動相不溶化担体に結合したトランスホーミンググ
ロスファクター抗体である特許請求の範囲第１項記載の
測定法。 ＋４１　１１ｑ−走化トランスホーミンググロスファク
ター抗体が、連続相不溶化担体に結合したトランスホー
ミンググロスファクター抗体である特許請求の範囲第１
項記載の測定法。 （５）トランスホーミンググロスファクタ−１九体が、
モノクロナーノヒ抗体である特許請求の範囲第１項記載
の測定法。 （６）酵素が、酸化還元酵素である特許請求の範囲第１
項記載の測定法。 （７）酵素が、加水分解酵素である特許請求の範囲第１
項記載の測定法。 （８）加水分解酵素が、β−ガラクトシダーゼである特
許請求の範囲第７項記載の測定法。[Scope of Claims] (1) After reacting the immobilized transforming gross factor antibody with the test liquid and then reacting with the enzyme-labeled transforming gross factor antibody, the solid phase and the liquid phase are separated; An enzyme immunoassay method for a transforming growth factor in a test solution, which is characterized by quantifying the amount of either one of the separated enzyme labels. (2) The measuring method according to claim 1, wherein the transforming gross factor is a human transforming gross factor. (3) The measuring method according to claim 1, wherein the immobilized transforming gross factor antibody is a transforming gross factor antibody bound to a mobile phase insolubilizing carrier. Claim 1, wherein the +41 11q-chemotactic transforming growth factor antibody is a transforming growth factor antibody bound to a continuous phase insolubilizing carrier.
Measurement method described in section. (5) Transforming gross factor-1 nine bodies,
The measuring method according to claim 1, which is a monoclonal antibody. (6) Claim 1 in which the enzyme is an oxidoreductase
Measurement method described in section. (7) Claim 1 in which the enzyme is a hydrolase
Measurement method described in section. (8) The measuring method according to claim 7, wherein the hydrolase is β-galactosidase.