JPS59213397A - デオキシウリジン誘導体の製造法 - Google Patents
デオキシウリジン誘導体の製造法Info
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- JPS59213397A JPS59213397A JP8891483A JP8891483A JPS59213397A JP S59213397 A JPS59213397 A JP S59213397A JP 8891483 A JP8891483 A JP 8891483A JP 8891483 A JP8891483 A JP 8891483A JP S59213397 A JPS59213397 A JP S59213397A
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- Japan
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- reaction
- deoxyribose
- compound
- enzyme
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、5−置換−2′−デオキシウリジン誘導体の
酵素的な製造法に関する。さらに具体的には、本発明は
、このヌクレオシドの塩基部分すなわち5−置換ウラシ
ル化合物と糖部分すなわち2−デオキシリボース化合物
と’z%定の属に属する微生物の酵素作用下に結合させ
て、このヌクレオシPを製造する方法に関する。
酵素的な製造法に関する。さらに具体的には、本発明は
、このヌクレオシドの塩基部分すなわち5−置換ウラシ
ル化合物と糖部分すなわち2−デオキシリボース化合物
と’z%定の属に属する微生物の酵素作用下に結合させ
て、このヌクレオシPを製造する方法に関する。
5−置換−2′−デオキシウリ、ノン誘導体は抗腫瘍性
または抗ウィルス注を示すことで知られている一群の化
合−吻であって、それ自身医薬としであるいは医薬原料
として使用しうるM用なものである。具体的には、たと
えば、5−フルオロ−2′−デオキシウリジンは抗腫瘍
活性を、5−トIJフルオロメチルー2′−デオキノウ
リジンは抗ウィルス活性を、持つものとして1ldi瘍
ないしウィルス病の治療の分野での利用が期待されてい
る化合物である。
または抗ウィルス注を示すことで知られている一群の化
合−吻であって、それ自身医薬としであるいは医薬原料
として使用しうるM用なものである。具体的には、たと
えば、5−フルオロ−2′−デオキシウリジンは抗腫瘍
活性を、5−トIJフルオロメチルー2′−デオキノウ
リジンは抗ウィルス活性を、持つものとして1ldi瘍
ないしウィルス病の治療の分野での利用が期待されてい
る化合物である。
先行技術
ピリミジンデオキシリポヌクレオンドを対応塩基化合物
と対応デオキシリボース化合1勿との酵素的反応によっ
てつくることは、特開昭56(02794号公報によっ
て公知である。この公知方法では、酵素は微生物由来の
ものであるところ、この微生物は10種の特定の属に属
するものである。
と対応デオキシリボース化合1勿との酵素的反応によっ
てつくることは、特開昭56(02794号公報によっ
て公知である。この公知方法では、酵素は微生物由来の
ものであるところ、この微生物は10種の特定の属に属
するものである。
また、同様な反応は、特公昭35−16478号(およ
び特公昭42−3497−Q公報)によっても知らtし
ている。
び特公昭42−3497−Q公報)によっても知らtし
ている。
発明の概要
本発明は、特定の属に滅する微生物に由来する酵素の作
用の下に対応塩基化合物と対応デオキシリボース化合物
とを反応させて5−置換2′−デオキシウリジン誘得体
を製造する方法に関する。
用の下に対応塩基化合物と対応デオキシリボース化合物
とを反応させて5−置換2′−デオキシウリジン誘得体
を製造する方法に関する。
従って、本発明によるデオキシウリジン誘導体の製造法
は淋)下式(1)で示されるウラシル化合物と(B)下
記の群から選んだ2−デオキシ1ノボース化合物と金、
(C)下記の群から選んだ桐に属するイ政生物ニ由来す
るヌクレオシドホスホリラーゼ源の存在下に反応させて
下式(II)で示される5−置換−2′−デオキシウリ
ジン誘導体を生成させること、を特徴とするものである
。
は淋)下式(1)で示されるウラシル化合物と(B)下
記の群から選んだ2−デオキシ1ノボース化合物と金、
(C)下記の群から選んだ桐に属するイ政生物ニ由来す
るヌクレオシドホスホリラーゼ源の存在下に反応させて
下式(II)で示される5−置換−2′−デオキシウリ
ジン誘導体を生成させること、を特徴とするものである
。
(ここで、Xはハロゲン、・・ロメチル基、低級アルキ
ル基、低級アルコキシル基、またはニトロ基を、Yは水
素または糖残基を、示す)H (Xは、前記と同意義である) (イ)2′−デオキシリポヌクレオシP1(ロ)2′−
デオキシリボヌクレオシドおよびその塩ならびに (ハ)2−デオキシリボース−1−りん酸およびその塩 微生物 (1)アクロモノマクター(Achromobacte
r )属(2)アルテロモナス(Alteromona
s)属(3)アースロパクター(Arthrobact
er )属(4)ブレビバクテリウム(Breviba
cterium)属(5)セルロモナス(Cellul
omonas)属(6)コリオ、バクテリウム(Cor
ynebacter ium)属(7)フラポノζクテ
リウム(Flavobacterium)M(8)クル
チア(Kurthia)属 (9)ミクロコツカス(Micrococcus)属0
0)プロタミノバクタ−(Protaminobact
er)属圓8ビモナス(Pseudomonas)属0
2)サルシナ(5arcina) KA03)スタフィ
ロコッカス(Staphylococcus )属およ
び Q4)ビズリオ(Vibrio)属 本発明による酵素的製造法の出発原料ないし酵素反応基
質の一つは、前記一般式[1’lで表わされるウラシル
化合−吻である。本発明による反応はこのピリミジン塩
基の1−位の窒素原子に2−デオキシリボース化合物の
β−D−デオキシリポフラノ/ル基を転移させることか
らなるものである。
ル基、低級アルコキシル基、またはニトロ基を、Yは水
素または糖残基を、示す)H (Xは、前記と同意義である) (イ)2′−デオキシリポヌクレオシP1(ロ)2′−
デオキシリボヌクレオシドおよびその塩ならびに (ハ)2−デオキシリボース−1−りん酸およびその塩 微生物 (1)アクロモノマクター(Achromobacte
r )属(2)アルテロモナス(Alteromona
s)属(3)アースロパクター(Arthrobact
er )属(4)ブレビバクテリウム(Breviba
cterium)属(5)セルロモナス(Cellul
omonas)属(6)コリオ、バクテリウム(Cor
ynebacter ium)属(7)フラポノζクテ
リウム(Flavobacterium)M(8)クル
チア(Kurthia)属 (9)ミクロコツカス(Micrococcus)属0
0)プロタミノバクタ−(Protaminobact
er)属圓8ビモナス(Pseudomonas)属0
2)サルシナ(5arcina) KA03)スタフィ
ロコッカス(Staphylococcus )属およ
び Q4)ビズリオ(Vibrio)属 本発明による酵素的製造法の出発原料ないし酵素反応基
質の一つは、前記一般式[1’lで表わされるウラシル
化合−吻である。本発明による反応はこのピリミジン塩
基の1−位の窒素原子に2−デオキシリボース化合物の
β−D−デオキシリポフラノ/ル基を転移させることか
らなるものである。
5−位の置換基は、核酸化学の分野でηり用されうる任
意のものでありうる。具体的には、たとえば、ハロゲン
、ハロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシル基
、ニトロ基、その他かめる。
意のものでありうる。具体的には、たとえば、ハロゲン
、ハロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシル基
、ニトロ基、その他かめる。
これらのうちの代表例は、フルオロ、ヨーP1 ブロ
モ、トリフルオロメチル、メチル、メトキシルおよび二
1・口でちる。
モ、トリフルオロメチル、メチル、メトキシルおよび二
1・口でちる。
1位(の置換基)は、水累または糖残基である。
糖残基は、核酸化学の分野で41」用されうる任意のも
のでありうる。具体的には、たとえば、リボース残基、
アラビノース残基、キシロース残基なとの五炭糖残基、
その他がある。これらのうち代表例Tdリボース残基で
ある。
のでありうる。具体的には、たとえば、リボース残基、
アラビノース残基、キシロース残基なとの五炭糖残基、
その他がある。これらのうち代表例Tdリボース残基で
ある。
従って、本発明で好筐しいウラシル化合物は、下記のl
l11りである。
l11りである。
5−フルオロウラシル(FUra)
5−フルオロウリジン(FUrd)
5−ヨードウラシル(IUra )
5−ブロモウラシル(BrUra )
5−ブロモウリジン(BrUrd )
5−トリフルオロメチルウラシル(TFMTJr a
)チミン(Thy ) リボシルチミン(rThd) 5−メトギシウラシル 5−ニトロウラシル この化合物は、本発明反応においてMi前記ラウシル化
合物の1−位の4素原子に2−デオキシリボース部分を
導入するためのものであるから、2−デオキシリボース
供与体ということができる。
)チミン(Thy ) リボシルチミン(rThd) 5−メトギシウラシル 5−ニトロウラシル この化合物は、本発明反応においてMi前記ラウシル化
合物の1−位の4素原子に2−デオキシリボース部分を
導入するためのものであるから、2−デオキシリボース
供与体ということができる。
この2−デオキシリボース化合物は、下記の(イ)〜(
ハ)の群から選ばれる。
ハ)の群から選ばれる。
(イ)2′−デオキシリボヌクレオシド2′−デオキシ
リボヌクレオシドとしては、具体的には、下記のものが
ある。
リボヌクレオシドとしては、具体的には、下記のものが
ある。
2′−デオキシウリジン(dUrd)
2′−デオキシシチジン(dCyd)
チミ・ノン(Thd)
2′−デオキシアデノシン(dAdo)2′−デオキシ
グアノシン(dGuo)2′−デオキシイノシン(dI
no) (ロ)2′−デオキシリボヌクレオシドおよびその塩2
′−デオキシリボヌクレオチドとしては上記のようなヌ
クレオシドの3′−および(′または)5′−位でのモ
ノ−、ジーまたはトリーりん酸エステルが適当であり、
具体的には下記のものがある。
グアノシン(dGuo)2′−デオキシイノシン(dI
no) (ロ)2′−デオキシリボヌクレオシドおよびその塩2
′−デオキシリボヌクレオチドとしては上記のようなヌ
クレオシドの3′−および(′または)5′−位でのモ
ノ−、ジーまたはトリーりん酸エステルが適当であり、
具体的には下記のものがある。
2′−デオキシウリジン−5′−モノりん酸(dUMP
)2′−デオキシウリジン−5′−ジりん酸(dUDP
)2′−デオキシウリジン−5′−トリりん酸(dUT
P )2′−デオキシシチジン−5′−モノりん酸(d
CMP )2′−デオキシシチジン−5′−ジりん酸
(dCDP)2′−デオキシシチジン−5′−トリりん
酸(dCTP)チミジン−5′−モノりん酸(TMP)
チミジン−5′−ジりん酸(TDP) チミジン−5′−トリりん酸(TTP)2′−デオキシ
アデノノン−5′−モノりん酸(d AMP ’2′−
デオキシアデノシンー5′−ジりん酸(aADP)2′
〜デオキシアデノシン−5′−トリりん酸(dATP)
2′−デオキシグアノシン−5′−モノりん酸(dGM
P)2′−デオキシグアノシン−5′−ジりん酸(dG
I)P)2′−ジオキングアノシン−5′−トリりん酸
(dGTP)2′−デオキシイノシン−5′−モノりん
酸(dIMP)2′−デオキソイノシン−5′−ジりん
酸(dIDI))2′−デオキソイノノン−5′−トリ
りん敵(dITP)(ハ)2′−デオキシリボース=1
−りん酸およびその塩 上6己の2′−デオキシリボヌクレオシド葦たは2′−
デオキシリボース−1−りん酸の塩としては、具体的に
は、アルカリ金属塩たとえばナトリウム塩、リチウム塩
およびカリウム塩、アルカリ土類金属塩たとえばカルシ
ウム塩およびマグネシウム塩、アンモニウム塩、アミン
塩たとえばトリエチルアンモニウム塩等がある。本発明
酵素反応は水性系で行なわれるから、上記のりん酸エス
テルの塩は水溶性のものであるべきである。
)2′−デオキシウリジン−5′−ジりん酸(dUDP
)2′−デオキシウリジン−5′−トリりん酸(dUT
P )2′−デオキシシチジン−5′−モノりん酸(d
CMP )2′−デオキシシチジン−5′−ジりん酸
(dCDP)2′−デオキシシチジン−5′−トリりん
酸(dCTP)チミジン−5′−モノりん酸(TMP)
チミジン−5′−ジりん酸(TDP) チミジン−5′−トリりん酸(TTP)2′−デオキシ
アデノノン−5′−モノりん酸(d AMP ’2′−
デオキシアデノシンー5′−ジりん酸(aADP)2′
〜デオキシアデノシン−5′−トリりん酸(dATP)
2′−デオキシグアノシン−5′−モノりん酸(dGM
P)2′−デオキシグアノシン−5′−ジりん酸(dG
I)P)2′−ジオキングアノシン−5′−トリりん酸
(dGTP)2′−デオキシイノシン−5′−モノりん
酸(dIMP)2′−デオキソイノシン−5′−ジりん
酸(dIDI))2′−デオキソイノノン−5′−トリ
りん敵(dITP)(ハ)2′−デオキシリボース=1
−りん酸およびその塩 上6己の2′−デオキシリボヌクレオシド葦たは2′−
デオキシリボース−1−りん酸の塩としては、具体的に
は、アルカリ金属塩たとえばナトリウム塩、リチウム塩
およびカリウム塩、アルカリ土類金属塩たとえばカルシ
ウム塩およびマグネシウム塩、アンモニウム塩、アミン
塩たとえばトリエチルアンモニウム塩等がある。本発明
酵素反応は水性系で行なわれるから、上記のりん酸エス
テルの塩は水溶性のものであるべきである。
〔リヌクレオンPホスホリラーゼ源
1)定義
不発明において「ヌクレオシドホスホリラーゼ」とは、
2′−デオキシリボヌクレオシドをりん酸イオン供与体
の存在下、加りん酸分解して2−デオキシリース−1−
りんばと核酸塩基とを与える作用および(または)2−
デオキシリボース−1−りん酸と核酸塩基とから2′−
デオキシリボヌクレオシドを会成する1乍用命担う酵素
をいう。この場合に必要なりん敵は基質またはヌクレオ
シドホ、スホリラーゼ源である微生物一体から供給する
ことができるが、基質またすよヌクレオシドホスホリラ
ーゼ源がりん酸を含゛まないものである揚台には外部か
らりん酸を供給することが必要である。
2′−デオキシリボヌクレオシドをりん酸イオン供与体
の存在下、加りん酸分解して2−デオキシリース−1−
りんばと核酸塩基とを与える作用および(または)2−
デオキシリボース−1−りん酸と核酸塩基とから2′−
デオキシリボヌクレオシドを会成する1乍用命担う酵素
をいう。この場合に必要なりん敵は基質またはヌクレオ
シドホ、スホリラーゼ源である微生物一体から供給する
ことができるが、基質またすよヌクレオシドホスホリラ
ーゼ源がりん酸を含゛まないものである揚台には外部か
らりん酸を供給することが必要である。
1−ヌクレオシドホスホリラーゼ源」とは、ウラシル化
付物(A)と2−デオキシリボース化合+1(B)との
反応系にヌクレオシドホスホリラーゼの酵素作用を及ぼ
しうるヌクレオシドホスホリラーゼ含有物質を、斂味す
る。これは、具体的には、使用微生物の培養物、生菌体
または菌体処理物(詳細後記)からなるものである。ま
た、ヌクレオシドホスホリラーゼ源は、ヌクレオ7Fホ
スホリラーゼ源外の酵素を含んでいてもよく、これが微
生物の培養物、生菌体−!たは菌体処理物の形態である
場合はこのような他種酵素をも含んでいることがむしろ
ふつうである。この場合の・他種酵素は、本発明の反応
に際して、たとえば原料化合物に作用してヌクレオシド
ホスホリラーゼの基質を生成する等の点で不発明の反応
に、両極的に塊与する酵素であるか、あるいは本発明の
反応を阻一群しないe素でありうる。反応に積極的に関
与する酵素としては、2−デオキシリポース化合物とし
て2−デオキシリボヌクレオチ) e jL用した場合
のホスファターゼを例示することができる。
付物(A)と2−デオキシリボース化合+1(B)との
反応系にヌクレオシドホスホリラーゼの酵素作用を及ぼ
しうるヌクレオシドホスホリラーゼ含有物質を、斂味す
る。これは、具体的には、使用微生物の培養物、生菌体
または菌体処理物(詳細後記)からなるものである。ま
た、ヌクレオシドホスホリラーゼ源は、ヌクレオ7Fホ
スホリラーゼ源外の酵素を含んでいてもよく、これが微
生物の培養物、生菌体−!たは菌体処理物の形態である
場合はこのような他種酵素をも含んでいることがむしろ
ふつうである。この場合の・他種酵素は、本発明の反応
に際して、たとえば原料化合物に作用してヌクレオシド
ホスホリラーゼの基質を生成する等の点で不発明の反応
に、両極的に塊与する酵素であるか、あるいは本発明の
反応を阻一群しないe素でありうる。反応に積極的に関
与する酵素としては、2−デオキシリポース化合物とし
て2−デオキシリボヌクレオチ) e jL用した場合
のホスファターゼを例示することができる。
本発明で使用する「ヌクレオシド、ホスホリラーゼ源」
は、特定の属に属する微生物に由来するものである。こ
のようなところから、本発明で好ましいヌクレオ7Fホ
スホリラーゼ源は、微生物の培養物、生菌体または菌体
処理物(詳細後記)からなるものである。
は、特定の属に属する微生物に由来するものである。こ
のようなところから、本発明で好ましいヌクレオ7Fホ
スホリラーゼ源は、微生物の培養物、生菌体または菌体
処理物(詳細後記)からなるものである。
2)微生物
前記のようなヌクレオシドホスホリラーゼ源を与える微
生物は、下記の14iの属に属するものである。
生物は、下記の14iの属に属するものである。
(1)アクロモバクタ−(Achromobacter
)属(2)アルテロモナス(Alteromonas)
属(3)アースロパクタ−(Arthrobac te
r)属(4)プレピノZクテリウム(Brevibac
terium)属(5)セルロモナス(Cellulo
monas)属(6)コリネバクテリウム(Coryn
ebacterium)属(カフラボノ々クテリウム(
Flavobacterium)属(8)クルチア(K
urthia)属 (9)ミクロコツカス(Micrococcus)属(
10)プロタミノdクター(Protaminobac
ter)属・(11)シュウ−モナス(Pseudom
onas)属(121サルシナ(Sarcina)属(
13)スタフィロコッカス(Staphylococc
us)属(I4)ビブリオ(Vibrio)属 これらの属に属する菌株の具体例を皐げれば、下d己の
通りである。
)属(2)アルテロモナス(Alteromonas)
属(3)アースロパクタ−(Arthrobac te
r)属(4)プレピノZクテリウム(Brevibac
terium)属(5)セルロモナス(Cellulo
monas)属(6)コリネバクテリウム(Coryn
ebacterium)属(カフラボノ々クテリウム(
Flavobacterium)属(8)クルチア(K
urthia)属 (9)ミクロコツカス(Micrococcus)属(
10)プロタミノdクター(Protaminobac
ter)属・(11)シュウ−モナス(Pseudom
onas)属(121サルシナ(Sarcina)属(
13)スタフィロコッカス(Staphylococc
us)属(I4)ビブリオ(Vibrio)属 これらの属に属する菌株の具体例を皐げれば、下d己の
通りである。
(1−1)アクロモバクタ−・ユウリデイセ BE−3
−3微工研菌寄第6304号 (Ac 、e u ryd i ce )(2−1)ア
ルテロモナス・ゾトレファシエンスATCC8071 (AI 、put、refaciens)(2−2)同
上 ATCC8072(2−3)同上 ATC
C8073(3−1)アースロパクター・シトレウス
IFO2957 (Ar、citreus) (3−21アースロパクター・グロビフオルミスIFO
121,37 (Ar、globiformis) (3−:3)7−スロハクター・シンプレックスIFO
12069 (Ar 、 s imp l ex) (4−1)ブレビバクテリウム・インペリアレATCC
8365 (B、 jmperjale) (4−2)ブレビバクテリウム・アセチリカムAT−6
−7微工研萌を第6305号 (B、acetyl icum) (4−3)同上 ATCC954 (5−1)+#oモナスー 7ラビゲナIFO3747
、ATCC486 (Ce 、f lavigena) (5−2)同上 IFO12680(6−1)コリ
ネバクテリウム・エクイ IAM 1038(Co、e
qui) (7−1)フンポパクテリウム・アルボレセンスIFO
3750,ATCC4358 (F、arborescens) (7−2)フラホハクテリウム・ニステロアロマティク
ムIFO3751 (F、e++teroaromaticum)(8−1
)クルチア−シフイー IFO12083(K、zop
fii) (8−2)同上 IFO12084(9−1)ミク
ロコツカス・ロゼウス IFO3768、ATCC18
6 (M、roseus) (9−2)ミクロコツカス・ヴアリアンスIFO376
5、ATCC399 (M、varians) (9−3)ミクロコツカス・ルテウス IAM 105
6、IFO3333、ATCC4698 (M、1uteus) (9−4)同上 IAM 1157(10−1)グ
ロタミノパクター・アルボフラバスIFO:3707+ (Pr、alboflavus) (11,−1)シュウトモナス・デスモリチカ J−4
−2微工研菌寄第6307号 (Ps、desmolytica) (11,−2)シュウトモナス・シューリキリエンシス
IAM 、1051 (Ps、5huylkilltensis)(11−3
’lシユウトモナス・オパリス IAM 1002(P
s、ovalis) (12−1)サルシナ・マルギナータ IAM 113
0微工研菌寄第6539号 (Sa、marginata) (13−1)スタフィロコッカス・アウレウス IAM
011 (St 、aureus) (13−2)同上 IFO3060(]、4−1
>ビブリオ・アンギララムIFO13266(V、an
guillarum) 苦本菌株は、TFMUraとdUr dとから対応TF
WUrdを生成させる能力は不元分であった。
−3微工研菌寄第6304号 (Ac 、e u ryd i ce )(2−1)ア
ルテロモナス・ゾトレファシエンスATCC8071 (AI 、put、refaciens)(2−2)同
上 ATCC8072(2−3)同上 ATC
C8073(3−1)アースロパクター・シトレウス
IFO2957 (Ar、citreus) (3−21アースロパクター・グロビフオルミスIFO
121,37 (Ar、globiformis) (3−:3)7−スロハクター・シンプレックスIFO
12069 (Ar 、 s imp l ex) (4−1)ブレビバクテリウム・インペリアレATCC
8365 (B、 jmperjale) (4−2)ブレビバクテリウム・アセチリカムAT−6
−7微工研萌を第6305号 (B、acetyl icum) (4−3)同上 ATCC954 (5−1)+#oモナスー 7ラビゲナIFO3747
、ATCC486 (Ce 、f lavigena) (5−2)同上 IFO12680(6−1)コリ
ネバクテリウム・エクイ IAM 1038(Co、e
qui) (7−1)フンポパクテリウム・アルボレセンスIFO
3750,ATCC4358 (F、arborescens) (7−2)フラホハクテリウム・ニステロアロマティク
ムIFO3751 (F、e++teroaromaticum)(8−1
)クルチア−シフイー IFO12083(K、zop
fii) (8−2)同上 IFO12084(9−1)ミク
ロコツカス・ロゼウス IFO3768、ATCC18
6 (M、roseus) (9−2)ミクロコツカス・ヴアリアンスIFO376
5、ATCC399 (M、varians) (9−3)ミクロコツカス・ルテウス IAM 105
6、IFO3333、ATCC4698 (M、1uteus) (9−4)同上 IAM 1157(10−1)グ
ロタミノパクター・アルボフラバスIFO:3707+ (Pr、alboflavus) (11,−1)シュウトモナス・デスモリチカ J−4
−2微工研菌寄第6307号 (Ps、desmolytica) (11,−2)シュウトモナス・シューリキリエンシス
IAM 、1051 (Ps、5huylkilltensis)(11−3
’lシユウトモナス・オパリス IAM 1002(P
s、ovalis) (12−1)サルシナ・マルギナータ IAM 113
0微工研菌寄第6539号 (Sa、marginata) (13−1)スタフィロコッカス・アウレウス IAM
011 (St 、aureus) (13−2)同上 IFO3060(]、4−1
>ビブリオ・アンギララムIFO13266(V、an
guillarum) 苦本菌株は、TFMUraとdUr dとから対応TF
WUrdを生成させる能力は不元分であった。
なお、本発明の特定の属に属する菌株、時に上記の代表
的劇株、から紫外線、X紛、γ線等の照射による物理的
処理もしくはニトロソグアニジンなどによる薬剤処理な
どの一般的変異誘導法による誘発突然変異または、自然
の原因に起因する自然突然変異によって誘導された変異
株も、ヌクレオシトホスホリラーゼ源としての酵素活性
を失シー)ない限り、本発明で定義したヌクレオシド4
てプント1ノラーゼ源に包含されるものとする。また、
qi[己のような好適な菌株から得られたヌクレオシド
ホスホリラーゼ源としての酵素の遺伝子力;前自己特定
の属以外の微生物に取り込まれてそのような形質力S発
現するに至った場合は、このような微生ζ勿は前記!h
定の属に域する微生物と均等とみなされるべきであって
、そのような微生物の培養9勿、生菌体または菌体処理
物を本発明の目的に使用する方法は本発明(特許請求の
範囲を解釈する場合を含む)の技術的範囲に含まれるも
のである。
的劇株、から紫外線、X紛、γ線等の照射による物理的
処理もしくはニトロソグアニジンなどによる薬剤処理な
どの一般的変異誘導法による誘発突然変異または、自然
の原因に起因する自然突然変異によって誘導された変異
株も、ヌクレオシトホスホリラーゼ源としての酵素活性
を失シー)ない限り、本発明で定義したヌクレオシド4
てプント1ノラーゼ源に包含されるものとする。また、
qi[己のような好適な菌株から得られたヌクレオシド
ホスホリラーゼ源としての酵素の遺伝子力;前自己特定
の属以外の微生物に取り込まれてそのような形質力S発
現するに至った場合は、このような微生ζ勿は前記!h
定の属に域する微生物と均等とみなされるべきであって
、そのような微生物の培養9勿、生菌体または菌体処理
物を本発明の目的に使用する方法は本発明(特許請求の
範囲を解釈する場合を含む)の技術的範囲に含まれるも
のである。
3)ヌクレオシドホスホリラーぜ源の調製ヌクレオシド
ホスホリラーゼ源の調製は、少なくとも微生物の培養か
らなる。
ホスホリラーゼ源の調製は、少なくとも微生物の培養か
らなる。
(3−1,)f@養
培養のための培地および培養法は、所与の微生物が生育
する限り、時に限定されない。
する限り、時に限定されない。
培地としては、これらの微生物75ユ貸イヒ可官旨な炭
素源および窒素源を適当量含有し、必要に応じて無機塩
、微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用
される。具体的には、炭素源としては、グルコース、フ
ラクトース、マルトース、リボース、サッカロース、澱
粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類もしくは
その脂肪酸エステルなどの誘導体、麦、飯、米などの天
然炭水化4勿、マンニトール、メタノール、エタノール
ナトのアルコール類、グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、
クエン酸などの脂肪酸類、ノルマル・ξラフイン、ケロ
シンなどの炭化水素類、グリシン、クルタミン敵、グル
タミン、アラニン、アスノξラギンなどのアミノ酸類な
ど、一般的な炭素源より使用微生物の貸化性全考慮して
一種または二種以上全適宜に選択して使用すtばよい。
素源および窒素源を適当量含有し、必要に応じて無機塩
、微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用
される。具体的には、炭素源としては、グルコース、フ
ラクトース、マルトース、リボース、サッカロース、澱
粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類もしくは
その脂肪酸エステルなどの誘導体、麦、飯、米などの天
然炭水化4勿、マンニトール、メタノール、エタノール
ナトのアルコール類、グルコン酸、ピルビン酸、酢酸、
クエン酸などの脂肪酸類、ノルマル・ξラフイン、ケロ
シンなどの炭化水素類、グリシン、クルタミン敵、グル
タミン、アラニン、アスノξラギンなどのアミノ酸類な
ど、一般的な炭素源より使用微生物の貸化性全考慮して
一種または二種以上全適宜に選択して使用すtばよい。
窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾
燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カ
ザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステイープリカー、コ
ツトンシードミールないしその加水分解物、フィツシュ
ミールないしその加水分解物、その他の動物、植物、微
生物の加水分解物などの有機窒素物質、アンモニア、(
lt’l WJtアンモニウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、すん酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝1iセ
ナトリウムなどの硝酸塩、尿素など無機窒素化合・:勿
上り団用微生物の貧化性を考慮して一種または二種以上
を適宜に選択して使用すればよい。さらに、無機塩とし
て微量のマグネンウム、マンガン、鉄、亜鉛、り同、ナ
トリウム、カル7ウム、カリウムなどのりん酸塩、塩酸
塩、硫酸塩、炭1伎塩、硝酸塩、1作液塩などの一種ま
たは二他以上を適宜添加し、必辰に応じて植物油、界面
后匪剤などの消泡剤、ビタミンB0、B2、ニコチン酸
、パントテン酸、ビオチン、p−アミン安息香1文など
の微−計元育促進物質を添加してもよい。栄誉要求を同
時に示す微生物を使用する場合は、当然その生育を満足
させる物質を培地に添加しなければならない。
燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カ
ザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステイープリカー、コ
ツトンシードミールないしその加水分解物、フィツシュ
ミールないしその加水分解物、その他の動物、植物、微
生物の加水分解物などの有機窒素物質、アンモニア、(
lt’l WJtアンモニウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、すん酸アンモニウム、炭酸アンモニウ
ム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝1iセ
ナトリウムなどの硝酸塩、尿素など無機窒素化合・:勿
上り団用微生物の貧化性を考慮して一種または二種以上
を適宜に選択して使用すればよい。さらに、無機塩とし
て微量のマグネンウム、マンガン、鉄、亜鉛、り同、ナ
トリウム、カル7ウム、カリウムなどのりん酸塩、塩酸
塩、硫酸塩、炭1伎塩、硝酸塩、1作液塩などの一種ま
たは二他以上を適宜添加し、必辰に応じて植物油、界面
后匪剤などの消泡剤、ビタミンB0、B2、ニコチン酸
、パントテン酸、ビオチン、p−アミン安息香1文など
の微−計元育促進物質を添加してもよい。栄誉要求を同
時に示す微生物を使用する場合は、当然その生育を満足
させる物質を培地に添加しなければならない。
培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で振盪」音
養、通気撹拌培養、静置増養、連成培養などの通常の培
養法より使用微生物に適した培養法を選択して行なう。
養、通気撹拌培養、静置増養、連成培養などの通常の培
養法より使用微生物に適した培養法を選択して行なう。
培養条件は、使用微生物および培地の柚頓により適宜選
択すればよいが、通常は培養開始のpHを約6〜8に調
整し、約5〜35℃の温度条件下で培養を行なう。培#
期間は使用微生物の生育に十分な時間であればよく、通
常1〜3日間である。
択すればよいが、通常は培養開始のpHを約6〜8に調
整し、約5〜35℃の温度条件下で培養を行なう。培#
期間は使用微生物の生育に十分な時間であればよく、通
常1〜3日間である。
(3−2)酵累源の調製
以上のように微生イ勿を培養したのち、得られた培養物
、あるいは培養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離な
どの通常の方法によって果閑した生菌体、あるいは生菌
体に適宜な処理を施して得られる菌体処理物、全本発明
におけるヌクレオシドホスホリラーゼ源として1史用す
ることができる。ここで、「培養物」とは培養後の培地
と培養歯体が未分離の状態のものをいう。「生菌体」と
は、培養物から分離されたのち未だ下記のような処理を
受けていない菌体をいう。−!た、「菌体処4!物」と
は、乾燥菌体、細胞膜および(または)細胞壁変性菌体
、破砕菌体、固定化固体、菌体抽出物、本発明の目的と
するヌクレオシドホスホリラーゼ源としての酵素活性を
有する菌体抽出物の蛋白質画分もしくはそのイn製物、
蛋白質画分もしくはその4製吻の固定化物などを相称す
る。
、あるいは培養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離な
どの通常の方法によって果閑した生菌体、あるいは生菌
体に適宜な処理を施して得られる菌体処理物、全本発明
におけるヌクレオシドホスホリラーゼ源として1史用す
ることができる。ここで、「培養物」とは培養後の培地
と培養歯体が未分離の状態のものをいう。「生菌体」と
は、培養物から分離されたのち未だ下記のような処理を
受けていない菌体をいう。−!た、「菌体処4!物」と
は、乾燥菌体、細胞膜および(または)細胞壁変性菌体
、破砕菌体、固定化固体、菌体抽出物、本発明の目的と
するヌクレオシドホスホリラーゼ源としての酵素活性を
有する菌体抽出物の蛋白質画分もしくはそのイn製物、
蛋白質画分もしくはその4製吻の固定化物などを相称す
る。
菌体処理物を得るための方法のいくつかを例示すれば下
記の洩りである。すなわち、(イ)生菌体に対して、物
理的処理手段たとえば凍結融解処理、凍結乾燥処理、通
風乾燥処理、アセトン乾燥処理、r俊性ないしアルカリ
性下における加温処理、磨砕処理、超音波処理、浸透圧
差処理など、あるいは化学的ないし生物化学的処理手段
たとえはリゾチーム、IIIIil胞壁溶解酵素などの
酵素処理、トルエン、キシレン、ブチルアルコール(フ
タノール)などの浴媒もしくは界面活性剤との接触処理
など、を単独もしくは組み台せて施す方法、(ロ)菌体
抽出物に対して、酵素分離梢製+段たとえば塩析処理、
専一点沈澱処理、M機浴媒沈澱処理、各錘クロマトグラ
フ処理、透析処理などを単独もしくは組み付せで施す方
法、および(ハ)生菌体、菌体抽出物もしくはその精製
物に酵素1mlm比定段たとえば包括処理、架倫処理、
担体への吸着処理などを施す方法、である。
記の洩りである。すなわち、(イ)生菌体に対して、物
理的処理手段たとえば凍結融解処理、凍結乾燥処理、通
風乾燥処理、アセトン乾燥処理、r俊性ないしアルカリ
性下における加温処理、磨砕処理、超音波処理、浸透圧
差処理など、あるいは化学的ないし生物化学的処理手段
たとえはリゾチーム、IIIIil胞壁溶解酵素などの
酵素処理、トルエン、キシレン、ブチルアルコール(フ
タノール)などの浴媒もしくは界面活性剤との接触処理
など、を単独もしくは組み台せて施す方法、(ロ)菌体
抽出物に対して、酵素分離梢製+段たとえば塩析処理、
専一点沈澱処理、M機浴媒沈澱処理、各錘クロマトグラ
フ処理、透析処理などを単独もしくは組み付せで施す方
法、および(ハ)生菌体、菌体抽出物もしくはその精製
物に酵素1mlm比定段たとえば包括処理、架倫処理、
担体への吸着処理などを施す方法、である。
〔D〕本発明による酵素反応
本発明による酵素反応は、前記のウランル化合*(A)
と2−デオキソリボース化合物(B)と葡ヌクレオシP
ホスホリラーゼu% (C)の存在下に反応させること
からなる。
と2−デオキソリボース化合物(B)と葡ヌクレオシP
ホスホリラーゼu% (C)の存在下に反応させること
からなる。
酵素源(C)は微生物の培養物でありうるから、酵素源
(C)の存在下ということはこの微生物の培養中に出発
原料(A)および(B)を共存させておいてこの酵素反
応全行なわせること矛も包含するのであるが、好ましい
反応方式は微生物培養工程が実質的に終了してから培養
物(または生菌体もしくは菌体処理物)を出発原料囚お
−よび(B)の反応系に存在させることからなるもので
ある。
(C)の存在下ということはこの微生物の培養中に出発
原料(A)および(B)を共存させておいてこの酵素反
応全行なわせること矛も包含するのであるが、好ましい
反応方式は微生物培養工程が実質的に終了してから培養
物(または生菌体もしくは菌体処理物)を出発原料囚お
−よび(B)の反応系に存在させることからなるもので
ある。
1)反応基質溶液
本発明の酵素反応に使用される/I¥質溶媒は、基本的
には反応示質、すなわち前記の出発原料(A)および(
B八が水性媒体に溶解もしくは懸濁した水性液である。
には反応示質、すなわち前記の出発原料(A)および(
B八が水性媒体に溶解もしくは懸濁した水性液である。
この水性液中には少なくともウラシル化合物(A)およ
び2−デオキシリボース化合!吻(B)の−棟捷たは二
伸1以上が存在するが、この水性液はこれらの反応基質
のほかに、心安に応じてりん酸イオン供与系、南イ幾溶
媒、界面活性剤、金属塩類、補酵素類、酸、塩基、糖類
など酵素反応を促進する物質、妨著酵素活性を阻害する
物質、反応基質の溶解性を同上させる吻ケ4、酵素と反
応基質の接触を向上させる4勿質等全含有していてもよ
い。また、1更用微生物か貢化しつるrjtJ記のよう
な培地成分を含有していてもよい。
び2−デオキシリボース化合!吻(B)の−棟捷たは二
伸1以上が存在するが、この水性液はこれらの反応基質
のほかに、心安に応じてりん酸イオン供与系、南イ幾溶
媒、界面活性剤、金属塩類、補酵素類、酸、塩基、糖類
など酵素反応を促進する物質、妨著酵素活性を阻害する
物質、反応基質の溶解性を同上させる吻ケ4、酵素と反
応基質の接触を向上させる4勿質等全含有していてもよ
い。また、1更用微生物か貢化しつるrjtJ記のよう
な培地成分を含有していてもよい。
水性媒陣としては、水l/ヒc;L酵素反応に好適な各
柿緩1而液(りん酸緩1碩液、イミダゾール−塙酸猛刷
7i′Jj、、べT7ナールー塩酸緩衝液、トリス−塩
酸緩l11Ij液など)を用いることができる。
柿緩1而液(りん酸緩1碩液、イミダゾール−塙酸猛刷
7i′Jj、、べT7ナールー塩酸緩衝液、トリス−塩
酸緩l11Ij液など)を用いることができる。
りん虚イオンttC与系としては、水性媒体中でりん;
−レイ万ンに解離しつるもののいずれを用いてもよく、
/ヒとえは遊離型りん酸そのもの、無機りん酸」も た
とえばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金1.・為
、カルシラノ・、マグネノウムなどのアルカリ土4Ji
釜属、アンモニウムとの塩が好適に使用される。才だ
、りん酸イオン供鳥系としては、酵素反応の基質溶液中
でりん竣イオンを遊離しうる系、たとえば各種りん酸エ
ステル誘導体とホスファターゼの組み合せ、ヌクレオチ
ドとヌクレオチダーゼの組み合せ、もしくは核酸塩基お
よびリボース−1−りん酸などを利用することができる
。
−レイ万ンに解離しつるもののいずれを用いてもよく、
/ヒとえは遊離型りん酸そのもの、無機りん酸」も た
とえばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金1.・為
、カルシラノ・、マグネノウムなどのアルカリ土4Ji
釜属、アンモニウムとの塩が好適に使用される。才だ
、りん酸イオン供鳥系としては、酵素反応の基質溶液中
でりん竣イオンを遊離しうる系、たとえば各種りん酸エ
ステル誘導体とホスファターゼの組み合せ、ヌクレオチ
ドとヌクレオチダーゼの組み合せ、もしくは核酸塩基お
よびリボース−1−りん酸などを利用することができる
。
以上のようなりん酸供与系は酵素反応に際して糸外から
添加されたものであってもよく、使用微生物の成分とし
て含有されているものであってもよい。すなわち、酵素
反応に利用しうる形態である限り、上記の物質の単独も
しくは二種以上全組み合せた系を、または上記の物質を
含有する微生′ω菌体もしくはその菌体処理物を本党明
の茸素反応に際して反応液に別途添加してもよく、ヌク
レオシドホスホリラーゼ源に含有さ几てぃりこれらの吻
買をそのま1利用してもよい。
添加されたものであってもよく、使用微生物の成分とし
て含有されているものであってもよい。すなわち、酵素
反応に利用しうる形態である限り、上記の物質の単独も
しくは二種以上全組み合せた系を、または上記の物質を
含有する微生′ω菌体もしくはその菌体処理物を本党明
の茸素反応に際して反応液に別途添加してもよく、ヌク
レオシドホスホリラーゼ源に含有さ几てぃりこれらの吻
買をそのま1利用してもよい。
4!−機溶媒としては、たとえばメタノール、エタノー
ル、フロノぐノール、フタノール、アセトン、メチルエ
チルケトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒドロフラ
ン、ノオキサン、ジメチルスルホキシP1 ジメチルア
セトアミド、ジメチルホルムアミド、2−エトキシエタ
ノールなどが例示される。
ル、フロノぐノール、フタノール、アセトン、メチルエ
チルケトン、酢酸エチル、トルエン、テトラヒドロフラ
ン、ノオキサン、ジメチルスルホキシP1 ジメチルア
セトアミド、ジメチルホルムアミド、2−エトキシエタ
ノールなどが例示される。
2)反応方法
本発明の反応は、11J記の酵素源(すなわちヌクレオ
ンドホスホリラーゼ源)と反応基質とを水性媒体中で接
触させることにより達成される。
ンドホスホリラーゼ源)と反応基質とを水性媒体中で接
触させることにより達成される。
接触方法は、酵素源の形態に応じて適fに選択すればよ
いが、通常はイ)酵素源を反応基質溶液に2茜l蜀もし
くは浴解し、好寸しくは刀IJ温しなから↑・覚拌もし
くは帳盪するパッチ方式、または口)酵素源を心安に応
じて適当な担体、助剤または吸着剤と7昆4[」するか
これらに4旦持させて充填カラム、流動層タンク、多段
タンク、フィルム装填タンク、攪拌タンク、その他に入
れ、反応泰質冶欣全通液するバイオリアクタ一方式(連
続フロ一方式)などが通用される。なお、パッチ方式の
場合には反応後、酵素源を濾過(加圧(I、々過、真空
濾過などを含む)、遠心分離、沈降分離、凝集分離など
通菖の方法によって回収ないし來菌し、これを再度反応
基・濱溶液と接触させることによって礫り返し使用する
ことができる。固定化ヌクレオシドホスホリラーゼ源に
よるバイオリアクタ一方式の場合は酵素源の分離操作は
不要であり、リアクターは昧り返しであるいは連続的に
酵素反応に使用することができる。
いが、通常はイ)酵素源を反応基質溶液に2茜l蜀もし
くは浴解し、好寸しくは刀IJ温しなから↑・覚拌もし
くは帳盪するパッチ方式、または口)酵素源を心安に応
じて適当な担体、助剤または吸着剤と7昆4[」するか
これらに4旦持させて充填カラム、流動層タンク、多段
タンク、フィルム装填タンク、攪拌タンク、その他に入
れ、反応泰質冶欣全通液するバイオリアクタ一方式(連
続フロ一方式)などが通用される。なお、パッチ方式の
場合には反応後、酵素源を濾過(加圧(I、々過、真空
濾過などを含む)、遠心分離、沈降分離、凝集分離など
通菖の方法によって回収ないし來菌し、これを再度反応
基・濱溶液と接触させることによって礫り返し使用する
ことができる。固定化ヌクレオシドホスホリラーゼ源に
よるバイオリアクタ一方式の場合は酵素源の分離操作は
不要であり、リアクターは昧り返しであるいは連続的に
酵素反応に使用することができる。
3)反応基質および酵素源の濃1t′もしくは添加故一
般に、反応基質溶液の基買磯兆は時に制限されるもので
はなく、反応温度における使用水性媒体に対する各基質
の飽オU濃度以下の偽当な濃度がJI■冨採用される。
般に、反応基質溶液の基買磯兆は時に制限されるもので
はなく、反応温度における使用水性媒体に対する各基質
の飽オU濃度以下の偽当な濃度がJI■冨採用される。
しかし、反応恭賀溶液に冷〃口された前記のM機溶媒な
どによ+7基質濃j史を瑠太さぜることも、反応基質浴
液中に飽和濃11j以上の各基質を懸濁状態で存在させ
て反応の進行に従って各基質を溶解させることも、可能
である。捷だ、各基質を反応中に逐次添加して遍当仏縫
度を維持することもでさる。
どによ+7基質濃j史を瑠太さぜることも、反応基質浴
液中に飽和濃11j以上の各基質を懸濁状態で存在させ
て反応の進行に従って各基質を溶解させることも、可能
である。捷だ、各基質を反応中に逐次添加して遍当仏縫
度を維持することもでさる。
具体的には、5−フルオロウシシル2よび5−トリフル
オロメチルウラシルについてl−j反応恭賀溶液中のそ
の濃度は1〜200 mM程鍵、好ましくは5〜100
mM程度であり、2−デオキシリボース化合物について
は1〜300 mM 8 問、好捷しくは5〜150m
M程度である。
オロメチルウラシルについてl−j反応恭賀溶液中のそ
の濃度は1〜200 mM程鍵、好ましくは5〜100
mM程度であり、2−デオキシリボース化合物について
は1〜300 mM 8 問、好捷しくは5〜150m
M程度である。
なお、酵素源の使用量は微生物の種部、その使用形態、
反応効率、経済性などを考慮し、当業者が予備実験前に
よって容易に決定できるものである。
反応効率、経済性などを考慮し、当業者が予備実験前に
よって容易に決定できるものである。
4)反応中性
本発明の反応の条件は、反応基質が酵素源の作用によっ
て反応して効率よく目的ヌクレオシドが生成1−る条件
であれば1史用lNi1’:素源做生物の非増焔条′1
−1−下であれ満“舶昶1′1:下であれ特に1沢疋さ
れない。
て反応して効率よく目的ヌクレオシドが生成1−る条件
であれば1史用lNi1’:素源做生物の非増焔条′1
−1−下であれ満“舶昶1′1:下であれ特に1沢疋さ
れない。
しかしながら、使用微生物の非増殖未件下における反応
が的に効率が良い。
が的に効率が良い。
微生物の−Il−珀殖乗件下でこれ全反応に供する方法
としてQ、↓、(イ珀う、素)又応温呟紫・1史用微生
物が瑠焔でさない偏置範囲(たたし、本発明の反応に関
与するtfl素が失活しないイ16(度範囲)に設雉す
る方法、(ロ)裸用倣生吻蘭体をあらかじめ前記のとお
り物理的、化学的ないし生物化学的に処理することKよ
って微生物を増殖できない状態にしたのち、反応に供す
る方法、(ハ)反応に際して、たとえばトルエンなどの
使用微生物の増殖を阻害する物質を反応基質溶液に添加
する方法など、を単独にあるいは組み合せて採用すれば
よい。これらのうちでは、反応温度を操作する方法が最
も効果的で闇便である。
としてQ、↓、(イ珀う、素)又応温呟紫・1史用微生
物が瑠焔でさない偏置範囲(たたし、本発明の反応に関
与するtfl素が失活しないイ16(度範囲)に設雉す
る方法、(ロ)裸用倣生吻蘭体をあらかじめ前記のとお
り物理的、化学的ないし生物化学的に処理することKよ
って微生物を増殖できない状態にしたのち、反応に供す
る方法、(ハ)反応に際して、たとえばトルエンなどの
使用微生物の増殖を阻害する物質を反応基質溶液に添加
する方法など、を単独にあるいは組み合せて採用すれば
よい。これらのうちでは、反応温度を操作する方法が最
も効果的で闇便である。
本発明の反応は一般に28〜80℃の範囲において進行
するが、実用性金考感すれば37〜70℃の範囲が好ま
しく、時に40〜65゛Cが最〕j通である。
するが、実用性金考感すれば37〜70℃の範囲が好ま
しく、時に40〜65゛Cが最〕j通である。
なお、反応基質(B)がデオキ7ビリミジンヌクレオシ
ドの場合は、45℃前後の温度が吾に適当である。
ドの場合は、45℃前後の温度が吾に適当である。
反応基質溶液の液性は、通常pH4〜10.好筐しくは
pH6〜8、の範囲に保たれればよい。反応中にpHが
変動するときは、塩1竣、鎖酸、りん酸などの酸または
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、ア
ンモニアガスなどのアルカリを用いて好せしいpH範囲
に補正すれはよい。
pH6〜8、の範囲に保たれればよい。反応中にpHが
変動するときは、塩1竣、鎖酸、りん酸などの酸または
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、ア
ンモニアガスなどのアルカリを用いて好せしいpH範囲
に補正すれはよい。
反応時間は、反応基質の目的吻への賀侯率を確認しなが
ら決定すればよいが、2ル常バッチ方式でtよ2〜45
時間程1α、好ましくは24〜36時間程度反応させれ
ばよい。バイオリアクタ一方式では、パッチ方式に準じ
て適当な条件を設定して反応させればよい。
ら決定すればよいが、2ル常バッチ方式でtよ2〜45
時間程1α、好ましくは24〜36時間程度反応させれ
ばよい。バイオリアクタ一方式では、パッチ方式に準じ
て適当な条件を設定して反応させればよい。
5)分離#製
反応後、心安に応じて酵素源を濾過、遠ル分離、沈降分
離または凝集分離などの常法によって分離除去して、生
成デオキシウリジン誘専体の分離植装工程に供する。
離または凝集分離などの常法によって分離除去して、生
成デオキシウリジン誘専体の分離植装工程に供する。
デオキシウリジン誘4す体の分離植装は、公9旧の方法
育たばこれを応用した方法によって行えばよい。たとえ
ば、イオン文例クシマドグラフィー、吸涜クロマトグラ
フィー、分配クロマトゲランイー、ゲル薊過法など各種
のクロマトグラフィー、向流分配、向i!+tc j+
Ij出など二液イ山lJの分配を41」用する方法、濃
縮、冷却、有機溶媒添加など溶解層の差を利用する方法
などの一般的な分離謂装法fc単独で、あるいは適亘に
組み合せて行えばよい。
育たばこれを応用した方法によって行えばよい。たとえ
ば、イオン文例クシマドグラフィー、吸涜クロマトグラ
フィー、分配クロマトゲランイー、ゲル薊過法など各種
のクロマトグラフィー、向流分配、向i!+tc j+
Ij出など二液イ山lJの分配を41」用する方法、濃
縮、冷却、有機溶媒添加など溶解層の差を利用する方法
などの一般的な分離謂装法fc単独で、あるいは適亘に
組み合せて行えばよい。
CEI代衣代表的生物の説明
前記の例示倣生物のうち、工F04号、IAIVi番号
およびATCC番号を付された菌株はいずれも公知菌株
であり、当業者であれば当該寄託機関よりこねらの菌株
を容易に入手することができる。
およびATCC番号を付された菌株はいずれも公知菌株
であり、当業者であれば当該寄託機関よりこねらの菌株
を容易に入手することができる。
微工研寄託番号(微工研萌d)だけ全村された菌株は、
本発明者らによって自然界から分離、同定された菌株で
あり、工業技術院微生物工業技術研死所(微工研)に寄
託されている。当業者は一足の条件の下にこれらの寄託
菌株を人手することができる。
本発明者らによって自然界から分離、同定された菌株で
あり、工業技術院微生物工業技術研死所(微工研)に寄
託されている。当業者は一足の条件の下にこれらの寄託
菌株を人手することができる。
上記の分離菌株とは千葉県誂子市西ζ苺鹿島町の土壌よ
り分離されたJ −4,−2株、兵庫県西−′市の甲子
−球場の砂より分1碓ぜれたAT−6−7株および千葉
県銚子市新生町の土壌より分離さnたBE−3−3株で
ある。これらの菌株のし肴学的性質等は、下記の通りで
ある。
り分離されたJ −4,−2株、兵庫県西−′市の甲子
−球場の砂より分1碓ぜれたAT−6−7株および千葉
県銚子市新生町の土壌より分離さnたBE−3−3株で
ある。これらの菌株のし肴学的性質等は、下記の通りで
ある。
1’1J−4−’2株
(a)形態
([)細施の形態および太ぎさ:#秋、0.7〜0.8
×2.0〜3.0μm (2)運動性、鞭毛の青虫状態:運動性あり、極1史毛 1(3)胞子の形成:なし く/1)ダラム染色性:陰性 (b)各種培地における生育状態 (1)肉汁91−大平板培養(28’C,48?ijg
i )■集落の形状:円形(C4rcular)■集落
表面の***:***状(Raised)ないし中心凸状(
Umbonate) (り大きさ:2〜4 mm I、り色調:湿γ閏で灰色ないし鈍黄色(2)肉汁寒天
斜面培養(zb’c、 48時lii’j )(L)
庄H:良好 (2)生付の形:糸状(1’i l i f o rm
)でゃや拡布状(Spreading) (3)色糸の生成:不ψJ (3)肉汁成体培養(あ”G、 72時1樹)生育:
膜のル成なく、余液混濁し、やや沈澱を生じる。
×2.0〜3.0μm (2)運動性、鞭毛の青虫状態:運動性あり、極1史毛 1(3)胞子の形成:なし く/1)ダラム染色性:陰性 (b)各種培地における生育状態 (1)肉汁91−大平板培養(28’C,48?ijg
i )■集落の形状:円形(C4rcular)■集落
表面の***:***状(Raised)ないし中心凸状(
Umbonate) (り大きさ:2〜4 mm I、り色調:湿γ閏で灰色ないし鈍黄色(2)肉汁寒天
斜面培養(zb’c、 48時lii’j )(L)
庄H:良好 (2)生付の形:糸状(1’i l i f o rm
)でゃや拡布状(Spreading) (3)色糸の生成:不ψJ (3)肉汁成体培養(あ”G、 72時1樹)生育:
膜のル成なく、余液混濁し、やや沈澱を生じる。
(4)肉汁ゼラチン芽刺培誉(2t)℃、6日間):液
化しない。
化しない。
(5)リドマスミルク培地(28℃、4日1司):変化
しない。
しない。
(c)生理的性質
(1)硝酸塩の還元(28°C15日間):還元1生あ
り。
り。
(2)硫化水素の生成(28℃、5日間):生成する。
(3)#粉の加水分解二分解カなし。
(4)カタラーゼ:陽性
(5)インドールの生成=1嬉性
(6)ヘプトンおよびアルギニンがらのアンモニアの生
成:陰性 (7)メチルレッドテスト:陰性 (8) V −、Pテスト:陽性 (9)酸素に対する態度:好気的 (10)O−Fテスト(Hugh Lejfson法に
よる)二〇型(0xidat 1on) (lυ糖類から酸の生成 陽性ニゲルコース、マンノース、フジクトース、マルト
ース、サッカロース、 トレハロース、マンニット 陰性:アラビノース、キシロース、ガラクトース、ラク
トース、ノルビット、 イノジット、グリセリン (12J生育pH範囲: pal 6.C)−9,0(
13)生育最適温度二5〜35°C 2)AT−,6−7株 (a)形態 (1)rMl胞の形態および大きさ:短稈状、0.8〜
1.0X1.Q〜1.2μm (2)胞子の形成:なし く3)ダラム染色性:陽性 Cb)各捜培地における生育状態 (1)肉汁寒天平板培養(28℃、48時間)■集落の
形状:円形(Circular)(2)集落狭量の***
二扁平状(Flat)、平滑(Smooth) ■大きさ:2〜4 mrn ■色調:黄色ないし桃黄色 (2)肉汁寒天斜Tl1I培養(28℃、48時−j)
■生育:良好 ■生育の形:症状(Echinulate)(3)肉汁
液体培養(28°c148時田」)生育:表面に菌環(
Ring) f形成し、やや沈渣(Sediment
) f生じる。
成:陰性 (7)メチルレッドテスト:陰性 (8) V −、Pテスト:陽性 (9)酸素に対する態度:好気的 (10)O−Fテスト(Hugh Lejfson法に
よる)二〇型(0xidat 1on) (lυ糖類から酸の生成 陽性ニゲルコース、マンノース、フジクトース、マルト
ース、サッカロース、 トレハロース、マンニット 陰性:アラビノース、キシロース、ガラクトース、ラク
トース、ノルビット、 イノジット、グリセリン (12J生育pH範囲: pal 6.C)−9,0(
13)生育最適温度二5〜35°C 2)AT−,6−7株 (a)形態 (1)rMl胞の形態および大きさ:短稈状、0.8〜
1.0X1.Q〜1.2μm (2)胞子の形成:なし く3)ダラム染色性:陽性 Cb)各捜培地における生育状態 (1)肉汁寒天平板培養(28℃、48時間)■集落の
形状:円形(Circular)(2)集落狭量の***
二扁平状(Flat)、平滑(Smooth) ■大きさ:2〜4 mrn ■色調:黄色ないし桃黄色 (2)肉汁寒天斜Tl1I培養(28℃、48時−j)
■生育:良好 ■生育の形:症状(Echinulate)(3)肉汁
液体培養(28°c148時田」)生育:表面に菌環(
Ring) f形成し、やや沈渣(Sediment
) f生じる。
(4)肉汁ゼラチン穿刺培養(20℃、6日間):層状
(Straitiform)に液化する。
(Straitiform)に液化する。
(5)リドマスミルク培地(28℃、4B+1t1):
わずかに凝固し、ペゾトン化も見られる。
わずかに凝固し、ペゾトン化も見られる。
(c)生理的性質
(1)硝酸塩の還元(28℃、5日間):還元性なし。
(2)硫化水木(D 生X (28°C,5B181
) : 生tJXシない。
) : 生tJXシない。
(別殿粉の加水分解:分解性あり。
(4)カタラーゼ:陽性
(5)インドールの生成:生成しない。
(6)ペゾトン寂よびアルギニンがらのアンモニアの生
成:陰性 (7)メチルレッドテスト:陰性 (81V−pテスト:陽性 (9)酸素に対する態度:好気的 (l[I) O−FテストfHugh Leifson
法による): F型(Ferrnentaj 1on)
01)糖類からの酸の生成 陽性ニゲルコース、マンノース、フラクトース、マルI
・−ス、サッカロース、 トレハロース 陰性:アラビノース、キシロース、ガラクトース、ラク
トース、ソルビット、 イノジット、グリセリン (I2)生育prI範囲: p)(6,0〜9.0(1
3+生付最適温度=25〜37℃ (a)形態 (1)細胞の形態および大きさ:桿状、0.8〜0.9
×1.4〜1.8μm (2)胞子の形成:なし く3)ダラム染色性:l裟註 (b)各抽培地に抄ける生育状態 (1)肉汁寒天平板培養(28°C148時間)■集落
の形状:仮恨状CRh1zoid)で切裂状(Lace
rate) ■集落表向の***:扁平状(F’1at)で平滑(Sm
ooth) ■大きさ:5〜9 mm ■色調:淡灰出色ないし青灰色 (2)肉汁寒天斜面培養(あ°C148時間)■生育:
良好 ■生育の形:糸状(Filiform)(3)肉汁液体
培養(28°C148時間)生育:余液混濁し、沈渣(
Sediment) f生しる。
成:陰性 (7)メチルレッドテスト:陰性 (81V−pテスト:陽性 (9)酸素に対する態度:好気的 (l[I) O−FテストfHugh Leifson
法による): F型(Ferrnentaj 1on)
01)糖類からの酸の生成 陽性ニゲルコース、マンノース、フラクトース、マルI
・−ス、サッカロース、 トレハロース 陰性:アラビノース、キシロース、ガラクトース、ラク
トース、ソルビット、 イノジット、グリセリン (I2)生育prI範囲: p)(6,0〜9.0(1
3+生付最適温度=25〜37℃ (a)形態 (1)細胞の形態および大きさ:桿状、0.8〜0.9
×1.4〜1.8μm (2)胞子の形成:なし く3)ダラム染色性:l裟註 (b)各抽培地に抄ける生育状態 (1)肉汁寒天平板培養(28°C148時間)■集落
の形状:仮恨状CRh1zoid)で切裂状(Lace
rate) ■集落表向の***:扁平状(F’1at)で平滑(Sm
ooth) ■大きさ:5〜9 mm ■色調:淡灰出色ないし青灰色 (2)肉汁寒天斜面培養(あ°C148時間)■生育:
良好 ■生育の形:糸状(Filiform)(3)肉汁液体
培養(28°C148時間)生育:余液混濁し、沈渣(
Sediment) f生しる。
(4)肉汁ゼラチン穿刺培養(20℃、6日間):液化
しない。
しない。
(5)!lマスミルク培地(28℃、4日間):はとん
と変化しない。
と変化しない。
<c)生理的性質
(1)硝酸塩の還元(28℃、5出司):還元性なし
(2)イ(Ifc化水素の生成(28℃、5日+d1)
:生成する。
:生成する。
(3)澱粉の加水分解性:なし
く4)カタラーゼ:陽性
(5)インドールの生成:生成しない。
(6)ペゾトンおよびアルギニンがらのアンモニアの生
成:陰性 (7)メチルレッドテスト:陰性 t81V−Pテスト:陰性 (9)酸素に対する態度:好気的 (10)O−Fテスト(Hugh Leifson法に
よる):0鴎リ (OxidaNon) 圓糖用からの酸の生成 陽性ニゲルコース、マンノース、フラクトース、トレハ
ロース 陰性:アラビノース、キシロース、ガラクトース、ラク
トース、マルトース、 ザツカロース、ノルビット、イノジ ット、グリセリン (12)生付pH範囲: 6.0〜9.003)最適生
育範囲=25〜37℃ 以上の蘭学的性質を、バーシーズ・マニュアル・オズ・
ディタミネーディズ・バクテリオロジー(Bergey
’s Mannal of Determinativ
eBacteriology)第7版(1957年)の
分類基準により検索した。その剣来、J−4−2味は直
短桿爾で、ダラム陰性であり、極鞭毛全有し、胞子形成
化がなく、グルコースf:酸化するなどの諸性質よりシ
ュウトモナス(Pseudomonas )属に属する
菌株と同定し、シュウトモナス・デスモリチ力(Pse
udomonaadesmolytica) J −
4−2と命名した。AT−6〜7株はelとんど球菌に
近い短桿菌で、ダラム陽註であり、フィラメントを形成
せず、炭水化物より酸を生成することよりブレビバクテ
リウム(Brevibacterium)属に属する菌
株と同足し、ブレビバクテリウム・アセチリカム(Br
evibacjeriumacetylicum) A
T −6−7と命名した。BE−3−3株は、ダラム
陰性であり、ヘキソースより戚を生成し、硫化水素を生
成し、細ノ荊が桿状であることによりアクロモバクタ−
(Achromobacter )j川に叫する菌株と
同定し、アクロモバクタ−・ユウリデイセ(Achro
mobacter eurydice) B E −3
−3と命名した。
成:陰性 (7)メチルレッドテスト:陰性 t81V−Pテスト:陰性 (9)酸素に対する態度:好気的 (10)O−Fテスト(Hugh Leifson法に
よる):0鴎リ (OxidaNon) 圓糖用からの酸の生成 陽性ニゲルコース、マンノース、フラクトース、トレハ
ロース 陰性:アラビノース、キシロース、ガラクトース、ラク
トース、マルトース、 ザツカロース、ノルビット、イノジ ット、グリセリン (12)生付pH範囲: 6.0〜9.003)最適生
育範囲=25〜37℃ 以上の蘭学的性質を、バーシーズ・マニュアル・オズ・
ディタミネーディズ・バクテリオロジー(Bergey
’s Mannal of Determinativ
eBacteriology)第7版(1957年)の
分類基準により検索した。その剣来、J−4−2味は直
短桿爾で、ダラム陰性であり、極鞭毛全有し、胞子形成
化がなく、グルコースf:酸化するなどの諸性質よりシ
ュウトモナス(Pseudomonas )属に属する
菌株と同定し、シュウトモナス・デスモリチ力(Pse
udomonaadesmolytica) J −
4−2と命名した。AT−6〜7株はelとんど球菌に
近い短桿菌で、ダラム陽註であり、フィラメントを形成
せず、炭水化物より酸を生成することよりブレビバクテ
リウム(Brevibacterium)属に属する菌
株と同足し、ブレビバクテリウム・アセチリカム(Br
evibacjeriumacetylicum) A
T −6−7と命名した。BE−3−3株は、ダラム
陰性であり、ヘキソースより戚を生成し、硫化水素を生
成し、細ノ荊が桿状であることによりアクロモバクタ−
(Achromobacter )j川に叫する菌株と
同定し、アクロモバクタ−・ユウリデイセ(Achro
mobacter eurydice) B E −3
−3と命名した。
なお、以上の三菌株の同定帰属はパーシーズ・マニュア
ル・オプ・デイタミネーテイブ・バクテリオクジ−4フ
版によるものであり、分類基準の変更などにより、!+
4なる分類基準によってとizらの菌株の同定帰・萬が
行われた場合には、他イ虫あるいは他属に4rJ4する
こともあり得るが、本発明において上記のように命名さ
′1tた做生書勿は、少なくとも本発明の目的に合致す
るヌクレオンドホスホリラーゼを生Pfzシ、かつ前1
己の菌学的性質もしくはこれと均等の菌学的性智、全有
する微生物を包ざし、時短され得るものである。
ル・オプ・デイタミネーテイブ・バクテリオクジ−4フ
版によるものであり、分類基準の変更などにより、!+
4なる分類基準によってとizらの菌株の同定帰・萬が
行われた場合には、他イ虫あるいは他属に4rJ4する
こともあり得るが、本発明において上記のように命名さ
′1tた做生書勿は、少なくとも本発明の目的に合致す
るヌクレオンドホスホリラーゼを生Pfzシ、かつ前1
己の菌学的性質もしくはこれと均等の菌学的性智、全有
する微生物を包ざし、時短され得るものである。
これら三閑株は昭;1us6年泄商並栗省舌示第178
号Vこ健って工業技術院做生物工業技術研究所に昭和5
7年1月13日付けで受託されて、次のとおり受比企号
が何カされている。
号Vこ健って工業技術院做生物工業技術研究所に昭和5
7年1月13日付けで受託されて、次のとおり受比企号
が何カされている。
(1)シュウトモナス・デスモリチカJ−4−2微工研
函寄第6307号(FEM P−6307)(2)ブレ
ビバクテリウム・アセチリカムAT−6−7微工研菌寄
、A 6305号(FEBM P−6305)(3)ア
クロモバクタ−・ユウリティセBE−3−3彼工研菌寄
第6304号(FERM P−6:304 )実施例 以下の実験例において、反応液中の5−フルオロ−27
−デオ千ノウリジン(FdUrd)および5−トリフル
オロメチル−2′−デオギシウリジン(TFMdUrd
)は、1%速液体クロマトグラフィーによって分析した
。
函寄第6307号(FEM P−6307)(2)ブレ
ビバクテリウム・アセチリカムAT−6−7微工研菌寄
、A 6305号(FEBM P−6305)(3)ア
クロモバクタ−・ユウリティセBE−3−3彼工研菌寄
第6304号(FERM P−6:304 )実施例 以下の実験例において、反応液中の5−フルオロ−27
−デオ千ノウリジン(FdUrd)および5−トリフル
オロメチル−2′−デオギシウリジン(TFMdUrd
)は、1%速液体クロマトグラフィーによって分析した
。
装置:島津筒速液体りロマトグラフLC−3A型力ラム
二マイクロ・ボンダノミツク0j3ONDAI)AK
)C18,4,6mmX250mm(日本ウォーターズ
リミテッド社製) 流4 : l ml/m1n FdUrd反応液 を合出剤:0.5Mりん戚−カリウム溶液測足波長:2
60nm 保持時間: FUra 3.91分Fd□Urd
、i 20.28分 TFMd U r d反応液 溶出剤:5チアセトニトリルを含む20mMトリス−塩
酸緩衝液 (pH7,5) 測定波長: 260nm 保持時1fs’l : TFMUra 8.49分
子FMdUrd 13.49分 実施例1 1.5チ酵母エキス培地(pH7,0) 4 mlに下
表に示す各閣法を植菌し、あ°Cで調時間培養した。培
養液より遠心分離によって4萌した。
二マイクロ・ボンダノミツク0j3ONDAI)AK
)C18,4,6mmX250mm(日本ウォーターズ
リミテッド社製) 流4 : l ml/m1n FdUrd反応液 を合出剤:0.5Mりん戚−カリウム溶液測足波長:2
60nm 保持時間: FUra 3.91分Fd□Urd
、i 20.28分 TFMd U r d反応液 溶出剤:5チアセトニトリルを含む20mMトリス−塩
酸緩衝液 (pH7,5) 測定波長: 260nm 保持時1fs’l : TFMUra 8.49分
子FMdUrd 13.49分 実施例1 1.5チ酵母エキス培地(pH7,0) 4 mlに下
表に示す各閣法を植菌し、あ°Cで調時間培養した。培
養液より遠心分離によって4萌した。
20 mM FUraもしく i’120 mM TF
MUr a 、 30 mMdUrdおよび31J m
Mりん1浚−カリウムヲ言有する浴液(phi 7.0
) 2 ml K前記菌体を加え、45℃で一晩反応
させた。
MUr a 、 30 mMdUrdおよび31J m
Mりん1浚−カリウムヲ言有する浴液(phi 7.0
) 2 ml K前記菌体を加え、45℃で一晩反応
させた。
反応波、遠心分離によって菌体を尿去し、反応生成物を
尚速液体クロマトグラフィーによって分析したところ、
下表に示す辿りであった。なお、表中1生成率」とある
のは原料の5−置換ウラシルVこ対する生成した5−置
換デオキシウリジン全意味のモル百分率である。−!た
、1−FdUrdJおよび[TFMdUrdjは、それ
ぞれ5−フルオロ−2′−デオキシウリ・ジンおよび5
−トリフルオロメチル−2′−デオキシウリジン全意味
する!アク・モパクター・−ウリデイセ 39.33
48.68BE−3−3微工研菌寄第6304号 アルテロモナス・プトレファシエンス 27.97
0ATCC8071 同上ATCC807239,3233,21同上ATC
C807336,3420,99アースロパクター・ゾ
トレウス 47.90 42.811FO12957 アースロパクター・グロビクオルミス 51.23
0IFO12137 アースロハクター・シンプレックス 51゜66 2
3.29IFO12069 ブレビバクテリウム・インペリアレ36.55 9.
02ATCC8365 ブレビバクテリウム・アセチリカム 13.51 36
.77AT−6−7微工研函寄第6:う05号同上AT
CC95403,76 セルロモナス・フラビゲナ 29.01 6.5
2IFO3747 同上IFO1268041,025,94コリネバクテ
リウム・エクイ35.83 3.83IAM 103
8 フラボバクテリウム・アルボレセンス44.82 8
.96IFO3750 フラボバクテリウム・ニステロアロマティクム34.9
5 6.39IP’0 3751 クルチア・シフイー 57.19 47゜88
IFO12083 ミクロコツカス・ロゼウス 24.73 13.5
5IFO3768 ミクロコツカス・ヴアリアンス32.83 35.54
IF’03765 ミクロコツカス・ルテウス 30゜12 14.8
0IAM 1.056 同上IAM 1157 39.15−−−−一プロ
タミノバクター・アルボイラパス 11.60 0
IFO3707 シュウドモナス・デスモリチカ 34.06 0J−4
−2微工研函寄第6307号 シュウトモナス・シューリキリエンシス34.88 1
0.36I入M 1051 シュウドモナス・オパリス 36.57 18.8
01AM 1002 サルシナ・マルギナータ 39.34 12゜9
2TAM 1130 微工研菌寄第6539号 スタフィロコッカス・アウレウス 14.97
10.48IAMIOII スタフィロコッカス・エビデノベデス 18.41 2
1.76IFO3060 ビブリオ・アンギララム 45.67 12.1
0IFO13266 実施例2 クルチア・シフイー IFo 12084を1.。5%
酵母エキス培地で28℃で22時間培養した。培4液か
mlから遠心分離によって湿菌体を得た。この湿菌体に
’arnM FUra、 30mMの下表に示す各2−
デオキシリボース化合物および30 mM F)ん酸−
カリウムを含む基質溶液(pH7,0)10 mlを加
え、45℃で20時間反応させた。反応液より菌体を除
去後、高速液体クロマトグラフィーで〜FdUrdの生
成率を測定し、下表に示した。
尚速液体クロマトグラフィーによって分析したところ、
下表に示す辿りであった。なお、表中1生成率」とある
のは原料の5−置換ウラシルVこ対する生成した5−置
換デオキシウリジン全意味のモル百分率である。−!た
、1−FdUrdJおよび[TFMdUrdjは、それ
ぞれ5−フルオロ−2′−デオキシウリ・ジンおよび5
−トリフルオロメチル−2′−デオキシウリジン全意味
する!アク・モパクター・−ウリデイセ 39.33
48.68BE−3−3微工研菌寄第6304号 アルテロモナス・プトレファシエンス 27.97
0ATCC8071 同上ATCC807239,3233,21同上ATC
C807336,3420,99アースロパクター・ゾ
トレウス 47.90 42.811FO12957 アースロパクター・グロビクオルミス 51.23
0IFO12137 アースロハクター・シンプレックス 51゜66 2
3.29IFO12069 ブレビバクテリウム・インペリアレ36.55 9.
02ATCC8365 ブレビバクテリウム・アセチリカム 13.51 36
.77AT−6−7微工研函寄第6:う05号同上AT
CC95403,76 セルロモナス・フラビゲナ 29.01 6.5
2IFO3747 同上IFO1268041,025,94コリネバクテ
リウム・エクイ35.83 3.83IAM 103
8 フラボバクテリウム・アルボレセンス44.82 8
.96IFO3750 フラボバクテリウム・ニステロアロマティクム34.9
5 6.39IP’0 3751 クルチア・シフイー 57.19 47゜88
IFO12083 ミクロコツカス・ロゼウス 24.73 13.5
5IFO3768 ミクロコツカス・ヴアリアンス32.83 35.54
IF’03765 ミクロコツカス・ルテウス 30゜12 14.8
0IAM 1.056 同上IAM 1157 39.15−−−−一プロ
タミノバクター・アルボイラパス 11.60 0
IFO3707 シュウドモナス・デスモリチカ 34.06 0J−4
−2微工研函寄第6307号 シュウトモナス・シューリキリエンシス34.88 1
0.36I入M 1051 シュウドモナス・オパリス 36.57 18.8
01AM 1002 サルシナ・マルギナータ 39.34 12゜9
2TAM 1130 微工研菌寄第6539号 スタフィロコッカス・アウレウス 14.97
10.48IAMIOII スタフィロコッカス・エビデノベデス 18.41 2
1.76IFO3060 ビブリオ・アンギララム 45.67 12.1
0IFO13266 実施例2 クルチア・シフイー IFo 12084を1.。5%
酵母エキス培地で28℃で22時間培養した。培4液か
mlから遠心分離によって湿菌体を得た。この湿菌体に
’arnM FUra、 30mMの下表に示す各2−
デオキシリボース化合物および30 mM F)ん酸−
カリウムを含む基質溶液(pH7,0)10 mlを加
え、45℃で20時間反応させた。反応液より菌体を除
去後、高速液体クロマトグラフィーで〜FdUrdの生
成率を測定し、下表に示した。
dUrd 61.60dUMP
49’、8.1acya
65.22dcMI) 60・28
Thd 74.85TMP
18 、44dAdo
1.83dAMP O,78dG
u o 2 、18dGMP
2.06dIno’
3.60dIMP
2.75実施例3 クルチア・シフイーIF012083に実施例2と同様
の方法で培養し、培養液2リツトルがら湿菌体を遠心分
離した。
49’、8.1acya
65.22dcMI) 60・28
Thd 74.85TMP
18 、44dAdo
1.83dAMP O,78dG
u o 2 、18dGMP
2.06dIno’
3.60dIMP
2.75実施例3 クルチア・シフイーIF012083に実施例2と同様
の方法で培養し、培養液2リツトルがら湿菌体を遠心分
離した。
FUra 5.2 gXdUrd 13.7gおよびり
ん酸−カリウム8.2gを水に溶解し、pF■7.oに
調整した基質溶液に前記の閑体業加え、きらに水を肌え
て2リツトルとして、反応に供した。反応は、45°C
で2日間行なうた。反応液を分析したところ、FdUr
dの生成率は75.389bであった。
ん酸−カリウム8.2gを水に溶解し、pF■7.oに
調整した基質溶液に前記の閑体業加え、きらに水を肌え
て2リツトルとして、反応に供した。反応は、45°C
で2日間行なうた。反応液を分析したところ、FdUr
dの生成率は75.389bであった。
反応液からi体を除去し、I)H2,Oに調整後、5リ
ツトルに希釈した。この浴液全活性炭1リツトルカラム
に吸着させ、水洗液、0−INアンモニア浴液で溶出さ
せた。溶出液を濃縮し、pH9,0に調整後、アニオン
父換明脂「ダウエックス1×2」 (商品名。ダウ・ケ
ミカル社製;蟻酸型)500mlカラムへ吸着させた。
ツトルに希釈した。この浴液全活性炭1リツトルカラム
に吸着させ、水洗液、0−INアンモニア浴液で溶出さ
せた。溶出液を濃縮し、pH9,0に調整後、アニオン
父換明脂「ダウエックス1×2」 (商品名。ダウ・ケ
ミカル社製;蟻酸型)500mlカラムへ吸着させた。
各区分を高速頭体クロマトグラフィーで分析し、FdU
rd区分を合せて(与び500 mlの活性炭カラムに
吸着させた。水洗後、0゜INアンモニア溶液で溶出さ
せ、濃縮乾固した。こルに酢f1!2エチルを力0え、
結晶を析出させたのち、酢酸エチルから再結晶させて、
FdUrd5.81g をイ尋た。
rd区分を合せて(与び500 mlの活性炭カラムに
吸着させた。水洗後、0゜INアンモニア溶液で溶出さ
せ、濃縮乾固した。こルに酢f1!2エチルを力0え、
結晶を析出させたのち、酢酸エチルから再結晶させて、
FdUrd5.81g をイ尋た。
実施例4
クルチア・シフイーIFO12084’c実施例2と同
様の方法で培養し、培う2液4リツトルがら湿菌体を辿
心分離した。
様の方法で培養し、培う2液4リツトルがら湿菌体を辿
心分離した。
TFMUra 3.6 g XdUrd 6.9gおよ
びりん酸−カリウム4.1gを水に浴解し、pH7,0
,、に調11にした杓(簀浴l夜にりIJN己の[屑イ
本を刀■え、さらに水をカ[1えて1リツトルとして、
反応に供した。反応は、45℃で2011信司行1つ/
こ。反応液を分析したところ、TFMdUrdの生成率
は5o。12%であった。
びりん酸−カリウム4.1gを水に浴解し、pH7,0
,、に調11にした杓(簀浴l夜にりIJN己の[屑イ
本を刀■え、さらに水をカ[1えて1リツトルとして、
反応に供した。反応は、45℃で2011信司行1つ/
こ。反応液を分析したところ、TFMdUrdの生成率
は5o。12%であった。
反応液から菌体を除去し、pH2゜0に調整後、活性炭
600m1 カラムに吸着させ、水洗後、0.01Nア
ンモニア−10%エタノール浴液12リツトルで浴出さ
せた。溶出液を濃縮後、逆相クロマトグラフィー(装置
:ウォーターズ、プレツブLC/システム500A0カ
ラム:プレツブ500/C18゜移動相:水および10
%メタノール)を行なった。
600m1 カラムに吸着させ、水洗後、0.01Nア
ンモニア−10%エタノール浴液12リツトルで浴出さ
せた。溶出液を濃縮後、逆相クロマトグラフィー(装置
:ウォーターズ、プレツブLC/システム500A0カ
ラム:プレツブ500/C18゜移動相:水および10
%メタノール)を行なった。
TFMdUrd区分を濃縮乾固し、エーテルをカロえて
攪拌したのち、P取した。これにエタノールを加えて浴
解し、濃縮後、エーテルを加えて再結晶させて、TFM
dUrd 2.8gを得た。
攪拌したのち、P取した。これにエタノールを加えて浴
解し、濃縮後、エーテルを加えて再結晶させて、TFM
dUrd 2.8gを得た。
実施例5
クルチア・シフイーIF012083を1.5%酵母エ
キス培地(pH7,0)4 mlに植菌後、28”Cで
一晩培養した。
キス培地(pH7,0)4 mlに植菌後、28”Cで
一晩培養した。
遠心分離して得た菌体に、下表に示す10 mMのウラ
シル化合物、15mMの2′−デオキシウリジンおよび
15 mMのりん酸−カリウム金含む基質を1ml加え
て、45℃で224間反応させた。
シル化合物、15mMの2′−デオキシウリジンおよび
15 mMのりん酸−カリウム金含む基質を1ml加え
て、45℃で224間反応させた。
反応c液をHPLCによって分析した精米は、下表に示
した通りであった。
した通りであった。
基質 反応生成物 拠随城率(幅5−)ごロウ
ラシル 5−フロロデオキシ 57.56 %ウリジン 5−クロロウラシル 5−クロロデオキシ 58.96
%ウリジン チミン チミジン 76.51%リボ
シルチミン チミジン 33.03%出
願人代理人 猪 股 漕手 続 宥n j
F 閣) 昭和59年8月20日 特許庁長官 志賀 学 殿 1 事件の表示 昭和58年 待訂願 第8891 /1号2 発明の名
称 デオキシウリジン誘導体の製造法 3 補止をづる者 事件との関係 υIFf出願人 (677) A7マザ暫浦株式会社 4 代 理 人 東京都千代口]区丸の内三丁]」2番3号宙詰東京(2
N)2321大代表 g 補正の内容 /)特許請求の範囲の記載を別紙のとおり訂正する。
ラシル 5−フロロデオキシ 57.56 %ウリジン 5−クロロウラシル 5−クロロデオキシ 58.96
%ウリジン チミン チミジン 76.51%リボ
シルチミン チミジン 33.03%出
願人代理人 猪 股 漕手 続 宥n j
F 閣) 昭和59年8月20日 特許庁長官 志賀 学 殿 1 事件の表示 昭和58年 待訂願 第8891 /1号2 発明の名
称 デオキシウリジン誘導体の製造法 3 補止をづる者 事件との関係 υIFf出願人 (677) A7マザ暫浦株式会社 4 代 理 人 東京都千代口]区丸の内三丁]」2番3号宙詰東京(2
N)2321大代表 g 補正の内容 /)特許請求の範囲の記載を別紙のとおり訂正する。
コ)明細書第グ頁第9〜70行目の「抗腫瘍性」を「抗
腫瘍活性」と訂正する。
腫瘍活性」と訂正する。
3)明細書箱グ頁第1O行目の「抗ウイルス性」を「抗
ウィルス活性」と訂正する。
ウィルス活性」と訂正する。
リ 明細書第5頁第一行目の「ラウシル化合物」を「ウ
ラシル化合物」と訂正する。
ラシル化合物」と訂正する。
S)明細書簡9負第g行目と同第9行目との間に行を改
めて「S−クロロウラシル(CIUra)Jを加入する
。
めて「S−クロロウラシル(CIUra)Jを加入する
。
6)8A細誓書第1/第13行目のr、2’Jを1.2
」と訂正する。
」と訂正する。
7)明細書第1/頁第1S〜/乙行目の1a′−デオキ
シリボース−7−りん酸Jを「コープオキシリボース−
/−りん酸」と訂正する。
シリボース−7−りん酸Jを「コープオキシリボース−
/−りん酸」と訂正する。
ざ)明細書箱13負第is〜/6行目の「−一デオキシ
リボヌクレオチド」を「−′−デオキシリボヌクレオチ
ド」と訂正する。
リボヌクレオチド」を「−′−デオキシリボヌクレオチ
ド」と訂正する。
?)明細書簡、2グ頁第16行目の「基質溶媒」を「基
質溶液」と訂正する。
質溶液」と訂正する。
10)明細書簡、26頁第に−A行目の「もしくは核酸
塩基およびリポース−/−りん酸」を削除する。
塩基およびリポース−/−りん酸」を削除する。
//)明細書第侵頁第q行目の1MannalJを[M
anualJ と訂正する。
anualJ と訂正する。
/:1)明細書箱11.コ頁第7行目の「および」を「
、」と訂正する。
、」と訂正する。
/3)明細書第グコ頁第9行目のr (TFMd Ur
d) Jの後に「、タークロロー−′−デオキシウリジ
ン(CIdUrd)およびチミジン(Ty)Jを加入す
る。
d) Jの後に「、タークロロー−′−デオキシウリジ
ン(CIdUrd)およびチミジン(Ty)Jを加入す
る。
/り明細書第1Ig頁末行に「・・・・・・吸着させた
。」とあるのを[・・・・・・吸着させ、水洗後、o
、orM蟻酸ナトリウム溶液で溶出させた。」と訂する
。
。」とあるのを[・・・・・・吸着させ、水洗後、o
、orM蟻酸ナトリウム溶液で溶出させた。」と訂する
。
基 質 反応生成物 反応生泌壱札5−フル
オロウラ 5−フルオロ−2’−57,56シル(F
Ura) デオキシウリジン(FdUrd ) 5−クロロウラシ 5−クロロ−2’−58,96ル
(CIUra ) デオキシウリジン(cldU
rd ) チミン(Thy ) チミ・ジン(Thd )
76.51すメシルチミン チミジン(Th
d ) 33.03(rThd ) 2 特許請求の範囲 1(A)下式(I)で示されるウラシル化合物と(B)
下記の群から選んだコープオキシリボース化合物とを、
(C)下記の群から選んだ属に属する微生物に由来する
ヌクレオシドホスホリラーゼ源の存在下に反応させて下
式(It)で示されるよ一置換一一′−デオキシウリジ
ン銹導体を生成させることを特徴とする、デオキシウリ
ジン誘導体の製造法。
オロウラ 5−フルオロ−2’−57,56シル(F
Ura) デオキシウリジン(FdUrd ) 5−クロロウラシ 5−クロロ−2’−58,96ル
(CIUra ) デオキシウリジン(cldU
rd ) チミン(Thy ) チミ・ジン(Thd )
76.51すメシルチミン チミジン(Th
d ) 33.03(rThd ) 2 特許請求の範囲 1(A)下式(I)で示されるウラシル化合物と(B)
下記の群から選んだコープオキシリボース化合物とを、
(C)下記の群から選んだ属に属する微生物に由来する
ヌクレオシドホスホリラーゼ源の存在下に反応させて下
式(It)で示されるよ一置換一一′−デオキシウリジ
ン銹導体を生成させることを特徴とする、デオキシウリ
ジン誘導体の製造法。
ウラシル化合物
(ここで、又はハロゲン、ハロメチル基、低級アルキル
基、低級アルコキシル基、またはニトロ基を、Yは水素
または糖残基を、示す) S−置換−a′−デオキシウリジン誘導体(Xは、前記
と同意義である) (() 2’−デオキ7リボヌクレオシド、(ロ)2
′−デオキ7リボヌクレオチドおよびその塩ならびに (ハ) −一デオキシリボース−l−りん酸およびその
塩 微生物 (1)アクロモバクタ−(Achromobacter
)属(2)アルテロモナス(AI’teromonas
)属(3)アースロバフタ−(Arthrobacte
r)属(4)ブレビバクテリウム(Brevibaet
erlum)属(5)セルロモナス(Ca 11u l
omonas )属(6)コリネバクテリウム(Co
rynebaeterlum)属(7)フラボバクテリ
ウム(Flavobaet@rium)属(8)クルチ
ア(Kurthia)属 (9)ミクロコツカス(Ml crocoeeus)属
aIIIプロタjツノくフタ−(Protamlnob
aet@r)属uシュウトモナス(P、ieudomo
nag )属0サルシナ(Sarelna)属 0スタフイロコツカス(Stmphylococcua
)属および a4ビブリオ(Vibrlo)属 ユヌクレオシドホスホリラーゼ源力1、当該微生物の培
養物、生菌体また&ま菌体処理物力・らなる、特許請求
の範囲第1項記載のデオキシウリジン誘導体の製造法。
基、低級アルコキシル基、またはニトロ基を、Yは水素
または糖残基を、示す) S−置換−a′−デオキシウリジン誘導体(Xは、前記
と同意義である) (() 2’−デオキ7リボヌクレオシド、(ロ)2
′−デオキ7リボヌクレオチドおよびその塩ならびに (ハ) −一デオキシリボース−l−りん酸およびその
塩 微生物 (1)アクロモバクタ−(Achromobacter
)属(2)アルテロモナス(AI’teromonas
)属(3)アースロバフタ−(Arthrobacte
r)属(4)ブレビバクテリウム(Brevibaet
erlum)属(5)セルロモナス(Ca 11u l
omonas )属(6)コリネバクテリウム(Co
rynebaeterlum)属(7)フラボバクテリ
ウム(Flavobaet@rium)属(8)クルチ
ア(Kurthia)属 (9)ミクロコツカス(Ml crocoeeus)属
aIIIプロタjツノくフタ−(Protamlnob
aet@r)属uシュウトモナス(P、ieudomo
nag )属0サルシナ(Sarelna)属 0スタフイロコツカス(Stmphylococcua
)属および a4ビブリオ(Vibrlo)属 ユヌクレオシドホスホリラーゼ源力1、当該微生物の培
養物、生菌体また&ま菌体処理物力・らなる、特許請求
の範囲第1項記載のデオキシウリジン誘導体の製造法。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、(A)下式(I)で示されるウラシル化合物と(B
)下記の群から選んだ2−デオキシリボース化合物とを
、(C)下記の群から選んだ属に属する微生物に由来す
るヌクレオシドホスホリラーゼ源の存在下に反応させて
下式(If)で示される5−置換−2′一デオキシウリ
ジン誘導体を生成させることを特徴とする、デオキシウ
リジン誘導体の製造法。 (ここで、Xはハロゲン、ハロメチル基、低級アルキル
基、低級アルコキシル基、またはニトロ基を、Yは水素
または糖残基を、示す)(Xは、前記と同意義である) 2−デオキシリボース化合物 (イ)2′−デオキシリボヌクレオシド、(ロ)2′−
デオキシリボヌクレオチドおよびその塩ならびに (ハ)2−デオキシリボース−1−りん酸およびその塩 微生物 (1)アクロモパ六りター(Achromobacte
r)属 / 宇11!IWp(2)アルテロモナス(A
lteromonas)属(3)アースロパクク−(A
rthrobacter)属(4)ブレビバクテリウム
(Brevibacterium)属(5)セルロモナ
ス(Ce l lu lomonas )属(6)コリ
ネバクテリウム(Corynebacterium)属
(カフラボ、にクテリウム(Flavobacteri
um)属(8)クルチア(Kurthia )属(9)
ミクロコックス(Micrococcus )属00)
プロタミノバクタ−(Protaminobacter
)属0υシュウトモナス(Pseudomonas)
属(121ザルシナ(5arcina)属(13)スタ
フィロコッカス(Staphylococcus)属お
よび 04)ビズリオ(Vibrio)属 2、ヌクレオシドホスホリラーゼ源が、当該微生物の培
養物、生菌体または菌体処理物からなる、特許請求の範
囲第1項記載のデオキシウリジン誘導体の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8891483A JPS59213397A (ja) | 1983-05-20 | 1983-05-20 | デオキシウリジン誘導体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8891483A JPS59213397A (ja) | 1983-05-20 | 1983-05-20 | デオキシウリジン誘導体の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59213397A true JPS59213397A (ja) | 1984-12-03 |
JPS6111598B2 JPS6111598B2 (ja) | 1986-04-03 |
Family
ID=13956197
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8891483A Granted JPS59213397A (ja) | 1983-05-20 | 1983-05-20 | デオキシウリジン誘導体の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59213397A (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4835104A (en) * | 1987-06-16 | 1989-05-30 | Ajinomoto Co., Inc., Patent & Licensing Department | Process for producing and purifying 2',3'-dideoxynucleosides, and process for producing 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydronucleosides |
WO2000070074A1 (fr) * | 1999-05-13 | 2000-11-23 | Mitsui Chemicals, Incorporated | Procede de production de compose nucleosidique |
WO2002036800A1 (fr) * | 2000-11-06 | 2002-05-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | Procede de production de compose nucleoside |
JP2008029358A (ja) * | 2000-11-06 | 2008-02-14 | Mitsui Chemicals Inc | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
CN104761603A (zh) * | 2014-12-06 | 2015-07-08 | 山东诚创医药技术开发有限公司 | 曲氟尿苷新晶型b及其制备方法 |
JP2016506725A (ja) * | 2013-01-25 | 2016-03-07 | シーエスアイアール | アワビの水産養殖において用いるためのプロバイオティクスの製造 |
CN108299518A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-07-20 | 王成宇 | 一种2`-脱氧-β-尿苷的合成方法 |
-
1983
- 1983-05-20 JP JP8891483A patent/JPS59213397A/ja active Granted
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4835104A (en) * | 1987-06-16 | 1989-05-30 | Ajinomoto Co., Inc., Patent & Licensing Department | Process for producing and purifying 2',3'-dideoxynucleosides, and process for producing 2',3'-dideoxy-2',3'-didehydronucleosides |
WO2000070074A1 (fr) * | 1999-05-13 | 2000-11-23 | Mitsui Chemicals, Incorporated | Procede de production de compose nucleosidique |
WO2002036800A1 (fr) * | 2000-11-06 | 2002-05-10 | Mitsui Chemicals, Inc. | Procede de production de compose nucleoside |
JP2008029358A (ja) * | 2000-11-06 | 2008-02-14 | Mitsui Chemicals Inc | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
JP4593608B2 (ja) * | 2000-11-06 | 2010-12-08 | 三井化学株式会社 | ヌクレオシド化合物の製造方法 |
JP2016506725A (ja) * | 2013-01-25 | 2016-03-07 | シーエスアイアール | アワビの水産養殖において用いるためのプロバイオティクスの製造 |
CN104761603A (zh) * | 2014-12-06 | 2015-07-08 | 山东诚创医药技术开发有限公司 | 曲氟尿苷新晶型b及其制备方法 |
CN108299518A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-07-20 | 王成宇 | 一种2`-脱氧-β-尿苷的合成方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6111598B2 (ja) | 1986-04-03 |
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