JPS59210899A - Determination of reduced-type coenzyme and reagent therefor - Google Patents

Abstract

PURPOSE:An electron transporter or a combination thereof with a metal ion is allowed to act on a reduced type coeyzyme and the hydrogen peroxide formed is determined to enable the etermination of reduced type coenzyme in a sample. CONSTITUTION:An electron transporter such as phenazine methosulfate is allowed to act on a reduced type coenzyme such as NADH or NADPH or a reduced type coenzyme which is quantitatively formed by allowing a dehydrogenase to act on a substrate in the presence of a coenzyme. At this time, divalent manganese ion or divalent cobalt ion or another metal ion which has the same action may be allowed to act on, then the hydrogen peroxide formed by the reactions quantitatively can be determined quantitatively by the method which is known per se.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明は、還元型袖１．φ素の定邦一方ｇｔ及び定量用
試薬に関するものである。 さらに詳しくは、被検試料、特に体液成分中の還元型補
酵素又は還元型補酵素を直接又（ｄ連結反応等を介して
間接的に生成するＪ５ｙ分を定量するにあたって、霜、
子伝達体又は霜、子伝達体及び金塊イオンの作用により
、還元祭主］）１酵素を、容易に、かつ定量的に酸化し
、酸化べ’！　？＋ｉ＋酵累及び過酸化水素に導く方法
及び試薬に関するものであり、このようにして定量的に
生成した過酸化水素を、例えは、自体公知の過酸化水素
の定量方法又は／及び定ガ；−用試薬により、典型的に
は被鹸化性呈色試薬を用いて比色定量する方法及Ｏ・試
薬に関するものである。 被検試料が体液成分である生体試料中の酵素活性や物質
（基質）の量又は濃度を測定することは、疾病の診断や
治療効果あるいは疾病の機序を知る上で非常に重要であ
る。 血清又は尿々との体液成分を被検試料とし、これら体液
成分中の脱水素酵素である、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）
、α−ヒドロキン酪酸脱水素酵素（α−ＨＢ　Ｄ　）の
よう々脱水素酵素の活性測定を行なう場合や、これら脱
水素酵素を介在させて被検試泊１中の他の酵素の活性測
定を行なう場合、寸だ、同じく被検試料中のコレステロ
ール、トリクリセライ１〜、クルコース、ホルマリン、
アルテヒト及び胆汁酸なとの物質（基質）に特異的に作
用する脱水素酵素を介在させて、これら被検試料中の物
質（基質）を定量する場合には、脱水素酵素の作用を発
揮させるために補酵素が用いられるのが一般的であシ、
これらの補酵素が、脱水素酵素の作用によって変換され
て生成する還元型補酵素を定量することによって、被検
試料中の酵素活性や基質の量を定量する方法が一般的に
行なわれている。 還元型補酵素とし一７Ｘ（ｒｉ曲’謂Ｎ　Ａ　Ｄ　ＩＩ
又はＮＡＤ１〕Ｉ−１が用いられており、ＩＩｒ来、こ
れら代表的な還元型補酵素であるＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ又（６
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈを定量する場合は、３４０　ｎｍに
おけるこれらの吸光度を７１！１１２ｔするか、あるい
（けテトラン１ノウｌ、塩を、これらＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ又
はＮ　Ａ　ｆ）　Ｐ　１１と反応させてイ１色ホルマサ
／とし、これをＩｊＪ視部で比色定量するＣっが一般的
である。し７かしながら、３／４．　Ｏｎｍにおける吸
光度をイ則定するＪ烏合に（、弓、試料中に共存する：
３４０　ｎｍ伺近に吸収金有する物質によって影’ｉＰ
を受けるため、転石盲検値を仙ｊ定する心裏があり、４
１１］定装置も紫外部扱収を少１ｊ定する／こめの特別
な仕様か必要である。甘た、テ］・ラノリウム塩を使用
する用視的発色法でり１゛、還元型補酵素とテトラツリ
ウム塩との反応に上り生にた有色ホルマザンに問題かあ
る。即ち、生成した有色ホルマザンは、その水にス１す
る溶ｊ竹性が伏く、かつ染色性及び染着性が強いため、
色素が’Ｉｌｌ出沈澱したり、セルやチーーフを染色及
び染着して、測定上の重欠点表なっていた。 そこで、本発明者らは、このような欠点を解消し問題点
を解決する次のような着想を得るに至った。即ち、一般
に、被酸化性呈色試薬には、多種多様の酸化還元′電位
のものがあり、水に対する溶角γ件や色調に対する選択
も比較的自由にでき、しかも染着性かないものも数多く
あり、その使用対象に応じて選択できる特徴がある。そ
の上、被１ν化性呈色試薬は、過酸化水素によって容易
に定量的に罪４色することが知られている。もし、還元
型補酵素を定届、的に過酸化水素に導くことができれば
、この過酸化水素は、容易に定量的に被酸化性呈色試薬
を呈色させるから、これを定量すれは、上記の従来のテ
トラツリウム塩を用いる比色定昂法の欠点及び問題点を
容易に解消し及び解決することができる。 このような着想のもとに、本発明者らは、還元を補酵素
を定量的に過酸化水素に導く方法を鋭意研究の結果、還
元型補酵素に電子伝達体又は電子伝達体及び金属イオン
を作用させると、過酸化水素が定量的に生成することを
見出し、本発明を完成するに至った。 即ち、本発明は、還元型補酵素に電子伝達体又は電子伝
達体及び金属４１２７作用させ、定量的に過酸化水素を
生成させる方法及び試柴並ひにこのようにして定量的に
生成する過酸化水素全定量することにより、還元型軸＋
ｎ素を定量する方法反ひ試薬の発明である。 Ｎ　Ａ　ｌ）　Ｈと電子伝達体であるフエナシノメトサ
ルフエ−１〜Ｉ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　ｉとはｐ」−１８付近で
次式に従って Ｎ　Ａ　　Ｄ　Ｈ＋　Ｐ　〜ｔＳ−−÷ＮＡＤ＋ＰＭＳ
ｉ（２Ｐ　１ｖｌ　Ｓ　ｌ（２＋　２０２　　　　２０
ｗ’　＋　２　ｋ（＋　Ｐ　ＭＳ反応し、スーパ′−オ
キシ１〜イオンリ２？ヲ生成するこ古は公知であり、ス
ーパーオキン！−イオン生成系として利用さイ］てい・
／−０ し力１しなρ）ら、Ｎ　Ａ　Ｄ　１−Ｊ古Ｐ　ｆＡ　Ｓ
の反応により生１ｊ′ｙｌ、たＰ　ＩＶＩ　Ｓ　Ｈ３Ｐ
こよるスーパーオキンドイオン（Ｊ２’の生５ｋが定量
的な生成か否かに関する情報及びそのようにして生成し
たＰ　＋Ｖｉ　Ｓ　ｉ（２が過酸化水素全生成し及びそ
のような過酸化水素の生成が定量的な生成か否かに関す
る情報は、現在までのところ全く開示されておらす、全
く未知の現象であった。 本発明者らは、上記ＮＡＤＩ（とＰＭＳの反応が定量的
に過酸化水素を生成する反応であれば、この反応全利用
してＮ　Ａ　、Ｄ　ＨやＮ　Ａ’ｌ）　Ｐ　Ｒなどの還
元型補酵素を、そのようにして定量的に生成する過酸化
水素全定量することにより、自体公知の過酸化水素の定
量方法によっても、容易に定量的に測定することができ
るのではないか、との着想のもとに、還元型補酵素を定
量的に過酸化水素に導く方法を鋭意研究の結果、ＰＭＳ
のような電子伝達体を還元型補酵素りこ作用させると、
過酸化水素が定量的に生成する、との知見を得た。即ち
、本発明の反応を、代表的な還元型補酵素であるＮ’Ａ
Ｄ　ｌ−１（Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ）について示すと、次
のとおりである。 示″ｆ’席― 上記の反Ｌ１．のようＯこして還元型補酵素から過酸化
水素が生成する反応系に電子伝達体が共存すると、定量
的に過酸化水素が生成する。過酸化水素の生成と同時に
、この過酸化水素は、被酸化性呈色試薬が存在すれは、
こイ′７を自体公知の酸化呈色反応によっても酸化呈色
させることかでき、ＮＡＩ）１１やＮＡｌ）ｐＨなとの
還元型補酵素のｌｌｋ度に比例した吸光度を示す。 従って、本発明１こおいては、電子伝達体が過酸化水素
を定量的に発生させるのに重要な役割を果しているとい
える。 本発明の方法に用いら１１．る電子伝達体は、フエナジ
ンメ１−ザルフェ−１−（Ｌ’　Ｍ　Ｓ　）、１−メト
ギシフェナジンメ１〜ザルフェート（１−メ）−キンＰ
ＩＶＩＳ）、９−シメ千ルアミノベンツパ−α−フェナ
ノキソニτノ１１クロリド（メルトラフルー）、又６ｉ
こ第１らと同等な作用會有する電子伝達体でｆり４”Ｉ
は全て用いることができる、この電子伝達体の濃度（、
ま、％（こ限定されないが、通常０．０１％〜０．００
０１係の濃度が好ましく用いられる。 更に、本発明に於ては、電子伝達体と２価のマンカンイ
オン若しくは２価のコバルトイオン又はこＡ″ｌらと同
等な作用？有する金属イオンを共存させることにより、
過酸化水素の生成反応が促進されることも見出されてい
る。２価のマンガンイオン又は２価のコバ用１〜イオン
は、これらが遷移金）１＋３イオンに分類することがで
きる金属イオンであるこＩｋ考慮に入オ９ると、遷移金
属イオンの有する少なくともｄ軌道・電子が本反応の電
子移動に重要な役割全果たしていると考えることもでき
る。 しかしな力３ら、本発明の金属イオンは、本発明の反応
系ｆこ於て、２価のマンカンイオン若しくは２価のコバ
ルトイオン又はこれらと同等な作用を有する金属イオン
でｆｐＨばいず才９．のものてもよく、遷移金属イオン
には限られない。 次に本発明の実施態様について述べる。 本発明は、還元型補酵素に電子伝達体又は電子伝達体及
び金属イオンを作用させ、定量的ｌこ−Ａｍ化水素を生
成させる以外は、自体公知の方法に従い、容易に実施を
することができる。 本発明は、補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用さ
せ、定量的に生成する還元型補酵素に、電子伝達体又は
電子伝達体及び金属イオンを作用させるこ古によっても
実施をすることができるから、そのような補酵素、基質
及び脱水素酵素又はこれらと連結し得る酵素反応１こ関
与する酵素、補酵素及び基質なとをも、容易に定量する
ことができる。 Ｎ　Ａ　Ｉ）　Ｈ又はＮＡｌ）ｐＪ（ｇま、還元型補酵
素として代表的なものである。 本発明に用いろイする電子伝達木々は、Ｐ＋ｖＬｓ。 １−メＩ・キシＰＭＳ、　メルト′ラフルー又はこれら
と同等な作用を有する′重子伝達体ケいう。 本発明に用いら石る金属イオンとは、２価の−１７　）
ｆ　フイオン若しくは２価のコバルトイオン又はこイ９
らと同等な作用ケ有する金属イオンをいう。 本発明に用いらイア、る遷移金属イオンとは、２価のマ
ンカッイオン若シくは２１曲のコバルトイオン又はこば
つらと同等な作用を有する金属イオンをいう。 本発明に用いられる遷移金属イオンとは、２価ノマンカ
ンイオン若しくは２価のコバルトイオン上回等な作用を
有する遷移金属イオンをいい、これら金属イオンとして
は、種々の遷移金属イオン孕用いることができるが、な
かでも、２価のマンカンイオン、２価のコバルトイオン
が好ましく用いられる。 金属イオンを与える化合物としては、これら金属の無機
酸塩類例えば、塩化物、硫酸（、硝酸塩などが、又有機
酸塩類例えは、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、エチレ
ンジアミンテトラ酢酸塩などが用いら才するが、これら
の化合物に限定されるものではないことは勿論である。 更に用いろねる今風イオンの濃度は、特に限定さＩ］．
ないが、通常０．５　ｍＭ／Ｌ　−　１　０　ｒｎＭ／
Ｌ　の濃度が好ましく用いられる。 本発明に於て、定量的に生成する過酸化水素を定量する
ためには、自体公知の過酸化水素の定量方法及び定量用
試薬でも足りる。そのような自体公知の過酸化水素の定
量方法及び定量用試薬として、過酸化水素（・こよる被
酸化性呈色試薬の呈色を測定する過酸化水素の定量方法
及び定量用試薬かある。 本発明は、補酵素の存在下、基質に脱水素酵素全作用さ
せ、定量的に還元型補酵素を生成する自体公知の酵素反
応にも利用することができるから、そのような酵素反応
に於て、基質（ｉコレステロ−”、胆汁７、り１ｊセリ
ン、り１ｊセ１１ンー３−リン酸、クルコース−６−リ
／１ソ、っ′ルテヒド例えはポルムアルテヒト又はアセ
Ｉ・アルデヒドであり、補酵素はＮＡＩ）又はＮ　Ａ　
Ｄ　Ｌ）であって、補酵素の存在下、基質に作用させる
脱水素酵素は、各々コレステロール脱水素ｌ＃累、胆汁
１救脱水素酵素（３α−ヒトロキノスデロイドテヒ）・
ロケナーセ）、クリセリン脱水素酵素、クリセリン−３
−リン酸説水素酵累、クルコース−６−リン酸脱水素酵
素、ホ／Ｌ／　ｊ−ｚ　７　）ｌ／デヒ１〜脱水累酵素
又はアルテヒト脱水素酵素であるような、自体公知の酵
素反応にも利用することができるし、又、そのような酵
素反応に於て、脱水素酵素が乳酸脱水素酵素又はα−ヒ
ドロキシ酪酸脱水素酵素であり、補酵素がＮＡＤ又はＮ
ＡＤＰてあって、補酵素の存在下、脱水素酵素を作用さ
せる基質が、各々乳酸又はαーヒ１ーロキシ酪酸である
ような、自体公知の酵素反応にも利用するこ古ができる
。 不発明（ｉ、被検試料が体液成分であり、浴液中の反応
により、定量的に過酸化水素を生成させることにより又
はこのようにして定量的に生成する過酸化水素？定量す
ることによっても容易に実施をすることかできる。 本発明は、１溶液中の反応により、定量的に過酸化水素
全生成させることにより又はこのようにして定量的に生
成する過酸化水素を、同溶液中の反応、典型的σこは、
同溶液中に存在する被酸化性呈色試薬の過酸化水素によ
る呈色反応により定量することができる。 本発明は、電子伝達体又は電子伝達体及び金属イオン又
はこイ１らと被酸化性呈色試薬は含むがべルオキシダー
セは含まない液を・第１液とし、ベルオギンダーセ又は
こＩｎと被酸化性呈色試薬は含むが必すしも電子伝達体
又は電子伝達１本及び金属イオンは含まない液を第２液
古して、被検試料に先ず第１液を加えてインキュへ一ト
シ、次いて、これに第２液を加えてイノキュへ−１−シ
、生する呈色を測定する、二液法によっても容易（こ実
施することがてきる。 本発明を二数法で実施する（こは、１夕１」えは、還元
型補酵素ケ含む試料に電子伝達体を加え、数分間室温又
は３７°Ｃ′で反応させ１こ後、ベルオキンターセと被
酸化性呈色試薬を含む試The present invention provides reduced sleeves 1. This article relates to gt and quantitative reagents for φ elements. More specifically, in quantifying the amount of reduced coenzyme or reduced coenzyme in a test sample, especially body fluid components, directly or indirectly (through d-linkage reaction, etc.), frost,
By the action of child carriers or frost, child carriers and gold nugget ions, the reduction priest ]) 1 oxidizes the enzyme easily and quantitatively, and oxidizes! ? +i+ This relates to a method and a reagent for leading to fermentation and hydrogen peroxide, and the hydrogen peroxide thus quantitatively produced can be used, for example, in a known method for quantifying hydrogen peroxide or/and in a constant state; The present invention relates to a method for colorimetric determination using a saponifiable coloring reagent, and an oxygen reagent. BACKGROUND ART Measuring the enzyme activity and the amount or concentration of substances (substrates) in biological samples, where the test sample is a body fluid component, is very important for diagnosing diseases, understanding therapeutic effects, and understanding the mechanisms of diseases. The test sample is body fluid components such as serum or urine, and the dehydrogenase in these body fluid components is lactate dehydrogenase (LDH).
, when measuring the activity of dehydrogenases such as α-hydroquine butyrate dehydrogenase (α-HBD), or when measuring the activity of other enzymes in test sample 1 by intervening these dehydrogenases. In the same case, the test sample also contains cholesterol, trichrysalium 1~, crucose, formalin,
When quantifying substances (substrates) in test samples by intervening dehydrogenases that act specifically on substances (substrates) such as artehyde and bile acids, the action of dehydrogenases is exerted. Generally, coenzymes are used for
A commonly used method is to quantify the enzyme activity and substrate amount in a test sample by quantifying the reduced coenzyme that is produced when these coenzymes are converted by the action of dehydrogenase. . Reduced coenzyme Toshiichi 7X (ri song'N A D II
or NAD1] I-1, and since IIr, these representative reduced coenzymes NAD H or (6
To quantify N A D P H, either measure their absorbance at 340 nm, or react the (tetrane 1, 1, salt) with these N A D H or N A D P 11. This is generally used as a one-color formasa/C, which is colorimetrically determined using the IjJ viewing section. However, 3/4. To determine the absorbance at 10 nm, the following values coexist in the sample:
340 nm is shadowed by a material with absorption near the iP.
There was a ulterior motive to determine the rolling stone blind test value in order to receive the results, and 4
11] A special specification device is also required for determining the amount of ultraviolet radiation handled. In the visual coloring method using lanolium salt, there is a problem with the raw colored formazan resulting from the reaction between the reduced coenzyme and the tetrathulium salt. That is, the produced colored formazan has low soluble properties when soaked in water, and has strong dyeing and staining properties.
The dye precipitated and stained the cells and chiefs, resulting in major defects in measurement. Therefore, the present inventors came up with the following idea to eliminate such drawbacks and solve the problems. In other words, in general, oxidizable coloring reagents have a wide variety of oxidation-reduction potentials, and the solubility angle to water and color tone can be selected relatively freely, and there are also many that do not have dyeing properties. There are some features that can be selected depending on the intended use. Furthermore, it is known that the chromatable coloring reagent is easily and quantitatively colored by hydrogen peroxide. If the reduced coenzyme can be converted into hydrogen peroxide in a controlled manner, this hydrogen peroxide will easily and quantitatively color the oxidizable coloring reagent. The above drawbacks and problems of the conventional colorimetric fixation method using tetrathulium salt can be easily overcome and solved. Based on this idea, the present inventors conducted extensive research into a method for quantitatively reducing coenzymes to hydrogen peroxide. It was discovered that hydrogen peroxide is quantitatively produced by the action of hydrogen peroxide, leading to the completion of the present invention. That is, the present invention provides a method for quantitatively producing hydrogen peroxide by causing a reduced coenzyme to act on an electron carrier or an electron carrier and metal 4127, a test sample, and a method for quantitatively producing hydrogen peroxide in this way. By measuring the total amount of hydrogen oxide, the reduced axis +
This is an invention of a method and a reagent for quantifying n-element. NA D H+ P ~tS--÷NAD+PMS near p''-18 according to the following formula.
i(2P 1vl S l(2+ 202 20
w' + 2 k (+ P MS reaction to produce super'-oxy 1 to ion 2? is well known and can be used as a super oxygen!-ion production system)
/-0 Shiriki 1 Shina ρ) et al., N A D 1-J Old P fA S
By the reaction of 1j′yl, P IVI S H3P
Information on whether or not the raw 5k of superoquindo ion (J2') is produced quantitatively and the thus produced P + Vi Si (2 is the total production of hydrogen peroxide and Information regarding whether or not the formation is quantitative has not been disclosed until now, which is a completely unknown phenomenon.The present inventors have determined that the reaction between NADI (and PMS) is quantitatively If the reaction produces hydrogen oxide, all of this reaction is used to produce reduced coenzymes such as N A , DH and N A'l) P Based on the idea that hydrogen peroxide could be easily measured quantitatively using the well-known method for quantifying hydrogen peroxide, we determined that the reduced coenzyme could be quantitatively peroxidized. As a result of intensive research on how to lead to hydrogen, PMS
When an electron carrier such as is used as a reduced coenzyme,
It was found that hydrogen peroxide is produced quantitatively. That is, the reaction of the present invention is carried out using N'A, a typical reduced coenzyme.
D l-1 (N A D P H) is as follows. If an electron carrier coexists in the reaction system in which hydrogen peroxide is produced from the reduced coenzyme as shown in anti-L1 above, hydrogen peroxide is produced quantitatively.Hydrogen peroxide Simultaneously with the formation of hydrogen peroxide, in the presence of an oxidizable coloring reagent,
The coenzyme '7 can also be oxidized and colored by a known oxidative coloring reaction, and exhibits an absorbance proportional to the degree of reduced coenzyme such as NAI) 11 and NAI) pH. Therefore, in the present invention 1, it can be said that the electron carrier plays an important role in quantitatively generating hydrogen peroxide. 11. Used in the method of the present invention. The electron carriers are phenazine meth-1-zulfate-1-(L' M S ), 1-methoxyphenazine meth-sulfate(1-meth)-kin P
6i
This is an electron carrier with an action equivalent to that of the first one.
can all be used, and the concentration of this electron carrier (,
Well, % (although not limited, usually 0.01% to 0.00
A concentration in the range 01 is preferably used. Furthermore, in the present invention, by coexisting an electron carrier with a divalent mankanion ion, a divalent cobalt ion, or a metal ion having the same effect as these A''l,
It has also been found that the hydrogen peroxide production reaction is accelerated. Divalent manganese ions or divalent edge ions are metal ions that can be classified as transition gold (1+3) ions.Taking into consideration Ik, at least the d orbital of the transition metal ion・It can be considered that electrons play an important role in electron transfer in this reaction. However, in the reaction system f of the present invention, the metal ion of the present invention is a divalent mankanion ion, a divalent cobalt ion, or a metal ion having an action equivalent to these. ．． It is not limited to transition metal ions. Next, embodiments of the present invention will be described. The present invention can be easily carried out according to a method known per se, except for reacting an electron carrier or an electron carrier and a metal ion with a reduced coenzyme to produce quantitative l-aminohydride. can. The present invention can also be carried out by allowing a dehydrogenase to act on a substrate in the presence of a coenzyme, and then acting on the quantitatively produced reduced coenzyme with an electron carrier or an electron carrier and a metal ion. Therefore, it is possible to easily quantify such coenzymes, substrates, and dehydrogenases, or enzymes, coenzymes, and substrates involved in enzymatic reactions that can be linked to them. N A I) H or NAl) pJ (g) is a typical reduced coenzyme. The electron transfer trees used in the present invention are P+vLs. or a deuteron carrier having an action equivalent to these. The metal ions used in the present invention are divalent -17)
f ion or divalent cobalt ion or cobalt 9
A metal ion that has an effect equivalent to that of a metal ion. The transition metal ion used in the present invention refers to a metal ion having an effect equivalent to a divalent manka ion, a cobalt ion, or a divalent cobalt ion. The transition metal ion used in the present invention refers to a transition metal ion that has an effect equivalent to that of a divalent nomankane ion or a divalent cobalt ion, and various transition metal ions can be used as these metal ions. Among these, divalent mankan ions and divalent cobalt ions are preferably used. Compounds that provide metal ions include inorganic acid salts of these metals, such as chloride, sulfuric acid (and nitrate), and organic acid salts, such as acetate, citrate, tartrate, and ethylenediaminetetraacetate. Although it is frustrating, it is of course not limited to these compounds.Furthermore, the concentration of the modern ions used is not particularly limited.
No, but usually 0.5mM/L - 10rnM/
A concentration of L is preferably used. In the present invention, in order to quantitatively determine the amount of hydrogen peroxide produced, a method for quantifying hydrogen peroxide and a quantitative reagent that are known per se are sufficient. As such per se known methods and reagents for quantifying hydrogen peroxide, there are methods and reagents for quantifying hydrogen peroxide that measure the coloration of an oxidizable coloring reagent caused by hydrogen peroxide. The present invention can also be used for enzymatic reactions known per se in which a dehydrogenase acts fully on a substrate in the presence of a coenzyme to quantitatively produce a reduced coenzyme. The substrate (cholesterol), bile 7, lyserine, lysine-3-phosphate, lucose-6-ly/1so, ruthehyde, for example porumartehyde or aceI aldehyde, The enzyme is NAI) or NA
D L), and the dehydrogenases that act on the substrate in the presence of coenzymes are cholesterol dehydrogenase 1, bile 1 rescue dehydrogenase (3α-human quinosedeloid), and
rochenase), chrycerin dehydrogenase, chrycerin-3
- Enzymes known per se, such as phosphate theory hydrogenase, crucose-6-phosphate dehydrogenase, H/L/j-z7)l/dehi1-dehydrogenase or artehyde dehydrogenase It can also be used for reactions, and in such enzymatic reactions, the dehydrogenase is lactate dehydrogenase or α-hydroxybutyrate dehydrogenase, and the coenzyme is NAD or N
ADP can also be used in enzymatic reactions known per se, where the substrate on which dehydrogenase acts in the presence of a coenzyme is lactic acid or α-hyroxybutyric acid, respectively. Non-invention (i. The test sample is a body fluid component, and hydrogen peroxide is quantitatively produced by a reaction in the bath fluid, or hydrogen peroxide is quantitatively produced in this way? By quantitatively determining The present invention can be carried out by quantitatively producing hydrogen peroxide in its entirety through a reaction in one solution, or by reacting the hydrogen peroxide quantitatively produced in this way in the same solution. The reaction, typical σ, is
It can be determined by a coloring reaction of an oxidizable coloring reagent present in the same solution with hydrogen peroxide. In the present invention, the first liquid is a liquid containing an electron carrier, an electron carrier, a metal ion or the like, and an oxidizable coloring reagent, but does not contain peroxidase. Add a second solution containing a coloring reagent but not necessarily an electron carrier or one electron carrier and metal ions, add the first solution to the test sample, and incubate it. The present invention can also be easily carried out by a two-liquid method (this can also be carried out by adding a second liquid to the inoculum and measuring the resulting coloration). Add the electron carrier to the sample containing the reduced coenzyme and allow it to react for several minutes at room temperature or 37°C.

【イゲを加えて、室幌又はニー
３７’″Ｃで反１．殴発色させ、試薬画倹を対照おして
吸蓋度を測定する。この際、電子伝達体に金属イオン、
例えは２価のフンカッイオンを共存させると、過酸化水
素の生成反応が促進サイ９、次のベルオキンクーセさ被
酸化性呈色試薬を加えるまでの時間を短縮することがで
きる。金属イオンとしては種々の金属イオンを用いるこ
とができるが、中でも２価のマノカッイオン又は２価の
コバルトイオンが好ましく用いられる。 本発明の方法及び試薬に使用さ第１る被酸化性呈色試薬
は、通常、Ｊ７Ｉ２０□−ＰＯＤ（ベルオキシダーセ）
系で用いられている自体公知のものが使用できるこ古は
いうまでもない。例えば、４−アミノアンチピリン・フ
ェノール系を被酸化性呈色試薬として用いた場合は、５
０５ｎｍの吸光度を測定ずれはよいし、４−アミノアン
チピリン・３−メチル−Ｎ＝エチル−Ｎ’　−（β−ヒ
ドロキシエチル）アニリン系を被酸化性呈色試薬として
用い１こ場合・ｊよ、５５　（１ｎ　ＩＴＩの吸光度を
測定すれはよいし、ロイコマラカイトクリーンを被酸化
性呈色試薬として用いた場合は、６２５　ｎｍの吸光度
を測定す２１はよいし、３−メチル−２−ペンゾチアソ
リノンヒドラヅン・クロモトロープ酸系を被酸化性呈色
試薬として用いた場合は、５７０ｎｍの吸光度をが１１
定す４１はよいし、２，２′−アジノービス−（３−エ
チルヘンフチアゾ１１ンー６−スルホン酸）を被酸化ｉ
生呈色試薬として用いた場合は、６６　［）　ｎ　ｍの
吸光度を測定すれはよい。 反応の液性は、ｐＨ４〜］０の範囲であれは、通常特に
問題はないか、中てもｐｉ−Ｉ６〜９の範囲が好ましく
用いらイすることか多い。この場合、２価のマンカンイ
オン、２１曲のコノ・ｌしトイオンなとの金７匡イオ／
は、ｐＨ７，５り上になると水酸化物又は塩基性化合物
の沈ｊ般を生ずることがあるが、このような場合は、Ｅ
　１）　Ｕ″Ａや、・四石鹸塩、クエン酸塩會添加して
町俗化すイ］、はよい。 溶液反応中、目的に適うｐＨを維持する１こめ１こは・
自体公知の緩衝液を用いるこ古ても足りる。このようｆ
Ｓ緩衝液の１９１１としては、’ｌ　７　（俊：抜働液
、１゛リス緩衝液、ホウ酸１．俊衝／（２などがある。 尚、リン酸緩衝液を用いる曜、　＠（、′ｉ、２仙１の
マンカンイオンが有−在すると、リフ１控マンカンとじ
て析出するのを防１にする目的で、Ｅ　Ｉ）　’ｒ　Ａ
　冑のキレ−１〜剤を冷力［ｌず；（１，はよい。 本発明は、還ｊじ型補スー１４素ケ容易に定量すること
かてきる方法及び試薬全提供するものであるにもかかＡ
つらず、従求、固定的といっても過言ではない程その定
量に用いら杓てき１こテ１−ラゾリワム塩愛用いる比色
定量法とは全く無関係且つ対照的な、過酸化水素の定量
的生成反応を利用する還元型補酵素の定敞方去を提供す
る発明である点に於て特に画期的な発明であり、無論、
テトラゾリウム塩を用いる比色定量法の欠点及Ｏ・問題
点なとおば全く関係かなく、還元型補酵素から定量的に
過酸化水素全生成させる方法及び試薬並ひにそれら還元
型補酵素から定量的に生成した過酸化水素を定量するこ
とにより還元型補酵素を定量する方法及び試薬を提供す
る発明である点に於て重要な意義をイ１する発明であり
、斯界に貢献する所極めて犬なるものがある。 また、以下の実施例に示されるように、本発明は、血清
や尿などの体液成分、例えば、コレステ■コール、１−
１１クリセライト、クルコース、ホルマリン、アルテヒ
１−及び胆汁酸などを酵素反応を利用して定量する場合
に、何の支障もなく用いらイすると共に、各々の物質（
基質）に特異的に作用する脱水素酵素によって還元型補
酵素が生成する場合の脱水素酵素の活性や、そのように
酵素反応と連結し得ろ自体公知の酵素反応に関与する物
質（基質）、酵素、補酵素の量や活性などを、容易に定
量することがてきる方法及び試薬を提供するものであり
、この点に於ても斯業に貢献する所、極めて犬なるもの
かある。 実施例　１．ＷＡＩ）Ｈの定量 １−ノトキシフェナ７ノノトサルフエ−１−０，０（ｌ
　１％ケ含む（１，０５ＬＶＩ　１１７醸塩緩価液（ｐ
Ｈ７，５’）’ｔＨ’Ｎ＜　１試液とし、４−アミノア
ンチピリン１１．０１係、フェノール　０．１％、ペル
オキシクーセロ　００　ｕｌｄｅ　をＳ（ｊ’　ｉ）、
１　ｒＶｉ　ｌンｆａｉ＞塩緩衝液（ｐＨ７，５）′（
１１−第２試液とする。 Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｉ−Ｉを各々１００．２００．３００．４
００．５００．６００　ｍ９　／ｄ１２ｋ　＠むｔｌｌ
　ＩＶＩ　ＩＩ　７酸塩緩ｔｉｊ液（ｐｌ４７．５　）
　（ル下、末票＄敵とする。）５０　ｔｉｌ　をおり、
第１試液１ｍｌ！’ｅ力１」え、室ｆｌｌＦｌで３分間
放置１カ・、直ち（こ第２試液Ｂ　ｔｒｔを加えて、３
７℃・同温槽中５分回加。・晶後、試桑冒倹ケ対照とし
て波長５　（１５ｒｏηの吸ｙＣ度ケ測定する。 各ＮＡ１）Ｈ濃度（ｍｊｉ／ｄｐ、）に対してブロソト
シた吸光度を結ぶ検量線は、第１図に示されるよう０こ
、原点を通る直線となり、検量線は良好な定量性を示し
ている。 実施例　２、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの定量 １−メトキンフェナジンメトザルフェート０．００１係
を含む０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐｌ−ｆ７．５　）
を第１試液とし、ロイコマラカイトクリーン（１，０１
７％、ベルオキ７ダーゼ６００ｕ／ｄｅ、　　トリトン
ｘｌｏ０　０．７係、エタノール　２容量／（≠附：饅
を含む０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐｆ（７，５）を第
２試液とする。 実施例　１　で用いたＮＡＤＨ標準液（１００，２００
，３００，４００ｍｇ／ｄｌ　）　ｋ　５　（ＪμＬ　
　とり、第１試液１．　ｍ！、を加え、室温で３分間放
１惺後、直ちに第２試液ケ加えて、室温で５分間放置後
、直も（・こ試薬冒険を対照として波長６２５　’ｎｍ
に於ける吸光度を測定する。 各ＮＡＤＨ濃度Ｃｄ／ｄｅ　）に対してブＩコツトしｆ
こ吸光度ケ結ぶ検量線は、第２図に示すように、Ｎ　Ａ
　１）　Ｈ３０Ｏｙｎ９７ｄｌまでは原点を通る直線と
なり、検量線は良好な定量性を示している。 実施例　３、Ｎ　Ａ　ｌ）　１−１の定量メルトラフル
ー　（１，００１係、塩化マンカン（４水和物）　　５
　ｍ１Ｖ１／　Ｌ　’ｆ含むＯ，［１５Ｍ　ｈ　’Ｉス
ーｊ篇醇緩便Ｊ１夜（ｐｌ−１７，０）を第１試液とじ
、４−アミノアンチピリン　０．（ｌ　］、　％　、フ
ェノール　（）】係、ベルオキ：＞　り”　−セ’　　
６０　（Ｉ　ｕｌｄｅ　ｋ含む０．０５１Ｖ１１・リス
−塩酸緩衝液（ｐ、ｌ−１７，０）を第２試散とする。 Ｎ　Ａ　Ｉ）　Ｈケ各１００．２００．３００．４００
．５　０　０　　ｍ、、９／ｄｅ　ｋ　’ａ−む　［１
，（１５１Ｖｊ　　ト　リ　ス　−　塩ＤＪ　緩’９Ｍ
　７＆（１）、１（７４〕）ケ５０μＬとり、第１試液
１ゴを加え、３７　＝Ｃ恒温１４１ｈて５分間卯仏抜、
第２試液２７艷を加えて、史に３７°Ｃ・１０７晶槽で
５分：…加湿した後、試薬商）欠をご対照として波長５
（＋５ｎｍの吸光１．Ｆｌ　ｋ　ｌ１ｌｌ定する、 各Ｎ　Ａ　１）　ｉｌ娘度（ｍｊＪ／ｌ／β）に７１シ
てブロンｌ−Ｌｌこ吸光度を結ぶ検量勝１．ま、第３図
に示すように、原点を通る１α勝と′ｆ、Ｃす、倹市線
は良好な定量性を示している。 実施例　４、血清遊離コレステロールの定量ｌ−メ１−
キシフェナジンメトサルフェート０．００１％、Ｎ　Ａ
　Ｄ　　１　（ｌ　Ｏｍ９／ｄｅ、、　コレステロール
テヒトロゲナーセ　２００　ｕｌｄｅ、トｌ１１−７　
Ｘ１００か０．２係になるようにそ石ら全０．０５１Ｖ
ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し第１試液とす
る。 ４−アミノアンチピリン　０．０１％、フェノール０．
１係、ペルオキシダーゼ　６００　ｕｌｄｌ　ｋ含む０
、（１５ｘＶＩ　’Ｉ）鈑塩緩価液（ｐＨ７，５）　　
ケ第２試液とする。 血ｉ’ｔ￥　５０　μＡ　ｆｆ：とり、第１試液１ｍ１
ｋ加え、３７°Ｃ恒温槽中］０分間加温後、第２試販２
−ケ加えて、１５分間３７°Ｃ加温後、試薬盲検を対照
として彼３％　５０５　ｎｍの吸光度を測定する。別に
、コレステロール標準液（コレステロール１００ｍｇ／
ｄｅ）を用いて、１（ＩＬ屑と同様に操作して得１こ吸
光度から、血清中の遊離コレステロール濃度を算出する
。 参考例　１、薄情遊離コレステロールの定量フェノール
　０．１　％、４−アミノアンチピリン０．０１％、コ
レステロールオキシクーセｌＯｕ／ｄｅ。 ベルオキシダーセ　３００　ｕ／ｄｇ、　トリトンＸ１
０００．１５％の濃度になるように、０．１ＭＩＪン酸
塩緩衝液（ｐ）ｌ　７．０　）に溶解し発色試液とする
。 血清５０μｔをとり、発色試液３−を加えて、３７°Ｃ
恒温槽中１５分間加温後、試薬直換全対照として波長５
０５ｎｍの吸光度を測定する。別にコレステロール標準
ｇ１．（コレステロール　１００　ｍ＆／ｄｅ　）　ｋ
用いて、血清と同様（こ操作して得１こ吸光度から血清
中の遊離コレステロール濃度を算出する。 第１表に示されるように、実施例　４の１直と、本参考
例の［直はよく一致し、その間に有意差は認められない
。 アス二Ｆ　赤白 第１表 ｒ＝ｏ、’９９４ Ｙ＝　１．０１　Ｘ＋、０．０６ 実施例　５、血に＆離コレステロールの定量メルｉ・ラ
フルー　０．００１％、塩化マンノノン５　ｍＭ／Ｌ、
　ＮＡ　Ｉ）　　１００　ｍ（ワ／ｃｊｅ、　Ｄレステ
ロールテヒトロケナーセ’　　２００　ｕ／ｄｅ、　　
ｌ・ｉ　ｌ・７　Ｘ］　ＯＯカ０．２％６コするように
、と、１１ら／７０．０５１Ｖ１１・リスー塩酸緩Ｓ液
（ｐＨ７，０）に溶解し第１試ｉｒ＆とする。４−アミ
ンアンチビ］１ン　０．０１％、フェノール　０．１％
、ベルオギンターセ　６ｏＯｕ　／ｄＩ！、’ｆｒ：　
’９−む０．０５１’Ｖ１　ｌ−リスー塩絃緩匍■液（
ｐＨ７，０）を第２試液とする。 血清５０μｔをとり、実施１夕１］４　　と同−炊こ作
により］吸光度全測定し、コレステロール娘度孕永める
。 第２表（こ示さイ９．るように、実施例　５のＩＩσと
本参考例の１直おはよく一致し、その間Ｃと有意差は認
めら１１ない。 以下＃自 第　　２　　表 ζ＝　０．９９５ Ｙ　＝　０．９８　Ｘ＋　０．６０[Add a burr, and punch it with a chamber hood or knee 37'''C to develop color, and measure the occlusion degree by comparing the reagent color.At this time, metal ions are added to the electron carrier,
For example, the coexistence of divalent ions can accelerate the hydrogen peroxide production reaction and shorten the time until the next addition of the oxidizable coloring reagent. Various metal ions can be used as the metal ion, and among them, divalent manokat ion or divalent cobalt ion is preferably used. The first oxidizable coloring reagent used in the methods and reagents of the present invention is usually J7I20□-POD (peroxidase).
Needless to say, any known material used in the system can be used. For example, when 4-aminoantipyrine/phenol is used as an oxidizable color reagent, 5
In this case, 4-aminoantipyrine/3-methyl-N=ethyl-N'-(β-hydroxyethyl)aniline is used as the oxidizable coloring reagent. 55 (It is good to measure the absorbance of 1n ITI, and when Leucomalachite Clean is used as the oxidizable coloring reagent, it is good to measure the absorbance of 625 nm.21 When linone hydrazine chromotropic acid system is used as an oxidizable coloring reagent, the absorbance at 570 nm is 11
41 is good, and oxidized i
When used as a raw coloring reagent, it is sufficient to measure the absorbance at 66 [) nm. As long as the pH of the reaction is within the range of 4 to 0, there is usually no particular problem, and a pi-I range of 6 to 9 is often preferred. In this case, the divalent mankan ion, the 21 song kono lshito ion, and the gold 7 ka io /
When the pH exceeds 7.5, precipitation of hydroxides or basic compounds may occur; in such cases, E
1) Adding U''A, tetrasoap salt, and citrate to make it popular] is good. During the solution reaction, it is important to maintain the desired pH.
It is also sufficient to use a buffer solution known per se. Like this f
Examples of 1911 S buffer include 'l7 (shun: extraction solution, 1゛Lis buffer, boric acid 1.shunshoku/(2). 'i, If there is a mankan ion of 2 sen 1, E I) 'r A
The present invention provides a method and reagents that allow easy quantitative determination of the cooling power of the helmet. Monika A
Quantification of hydrogen peroxide is completely unrelated to and in contrast to the commonly used colorimetric method, which is used for its quantification. It is a particularly ground-breaking invention in that it provides constant removal of reduced coenzymes using a chemical production reaction, and of course,
Regardless of the shortcomings and problems of the colorimetric method using tetrazolium salts, the method and reagent for quantitatively producing all hydrogen peroxide from reduced coenzymes, as well as quantitative determination from these reduced coenzymes. This invention is of great significance in that it provides a method and reagent for quantifying reduced coenzymes by quantifying hydrogen peroxide produced in a vacuum, and is an extremely valuable invention that contributes to this field. There is something. Furthermore, as shown in the following Examples, the present invention can be applied to body fluid components such as serum and urine, such as cholesterol, 1-
It can be used without any problem when quantifying 11 chrycerite, glucose, formalin, artehyl-1-, bile acids, etc. using an enzymatic reaction, and each substance (
The activity of dehydrogenase when a reduced coenzyme is produced by a dehydrogenase that acts specifically on a substrate), and the substance (substrate) that is known to be involved in an enzymatic reaction that can be linked to such an enzymatic reaction. The present invention provides methods and reagents that can easily quantify the amount and activity of enzymes and coenzymes, and in this respect, it is an extremely valuable contribution to this industry. Example 1. Determination of 1-notoxyphena-7-notosulfate-1-0,0 (l
Contains 1% (1,05LVI 117 mild salt solution (p
H7,5')'tH'N < 1 test solution, 4-aminoantipyrine 11.01%, phenol 0.1%, peroxycusero 00 ulde as S(j' i),
1 rVi lnfai > salt buffer (pH 7,5)' (
11- Use as second test solution. N A D I-I each 100.200.300.4
00.500.600 m9 /d12k @mutll
IVI II hepta-acid salt mild tij solution (pl47.5)
(The last vote is $ enemy.) 50 til,
1ml of first test solution! 'E force 1', then leave it for 3 minutes in the chamber 1. Immediately (add the 2nd reagent solution B trt,
5 minutes at 7℃ in the same temperature bath.・After crystallization, the absorbance at wavelength 5 (15 roη) is measured as a reference for sample mulberry exposure.A calibration curve connecting the absorbance at wavelength 5 (15roη) with respect to each NA1)H concentration (mji/dp, ) is shown in Figure 1. As shown, a straight line passes through the origin and the calibration curve shows good quantitative properties. Example 2, Determination of N ADH 0.05 M phosphate buffer containing 0.001 part of 1-methquinphenazine methosulfate (pl-f7.5)
was used as the first test solution, and Leucomalachite Clean (1,01
7%, Veroxidase 600 u/de, Triton xlo0 0.7, ethanol 2 volumes/(≠ Attachment: 0.05M phosphate buffer (pf (7, 5) containing rice) is used as the second test solution. NADH standard solution used in Example 1 (100, 200
,300,400mg/dl) k5 (JμL
Take the first test solution 1. m! , and leave it at room temperature for 3 minutes. Immediately add the second reagent solution and leave it at room temperature for 5 minutes.
Measure the absorbance at For each NADH concentration Cd/de),
As shown in Figure 2, the calibration curve connecting this absorbance is N A
1) Up to H30Oyn97dl, a straight line passes through the origin, and the calibration curve shows good quantitative performance. Example 3, N A l) 1-1 quantitative melt flow (1,001 section, mankan chloride (tetrahydrate) 5
m1V1/L'f containing O, [15M h'I Sooj version loose stool J1 night (pl-17,0), the first test solution, 4-aminoantipyrine 0. (l], %, phenol ()), Beloki:>ri"-se'
60 (Use 0.051V11 Lis-HCl buffer (p, l-17,0) containing Iulde k as the second sample. N A I) H ke each 100.200.300.400
．． 500 m,,9/de k'a-m [1
,(151Vj Tris-Salt DJ Yuru'9M
Take 50 μL of 7 & (1), 1 (74), add 1 g of the first test solution, keep the temperature constant at 37 = C for 141 hours, and remove the Ubutsu for 5 minutes.
Add 27 liters of the second reagent solution and heat it for 5 minutes at 37°C in a 107 crystal bath. After humidifying, the wavelength 5
(+5 nm absorbance 1.Fl k l1ll is determined, each N A 1) Calibration result 1. Connecting the absorbance of Bron l-Ll by 71 to the il daughter degree (mjJ/l/β). Well, as shown in Figure 3, the 1α line passing through the origin and the 'f, C, and Shukuichi lines show good quantitative properties. Example 4, Quantification of serum free cholesterol l-Me1-
Xifenazine methosulfate 0.001%, NA
D 1 (l Om9/de,, cholesteroltehydrogenase 200ulde, tol11-7
Soseki and others are all 0.051V to be in charge of X100 or 0.2
Dissolve it in 1 phosphate buffer (pH 7.5) and use it as the first test solution. 4-aminoantipyrine 0.01%, phenol 0.
Section 1, peroxidase 600 uldl k included 0
, (15xVI 'I) Mild plate salt solution (pH 7,5)
K Use this as the second test solution. Blood i't￥ 50 μA ff: Take the first test solution 1ml
Add k, in 37°C constant temperature bath] After heating for 0 minutes, 2nd trial sale 2
In addition, after heating at 37°C for 15 minutes, the absorbance at 3% 505 nm is measured using the reagent blind as a control. Separately, cholesterol standard solution (cholesterol 100mg/
The concentration of free cholesterol in the serum is calculated from the absorbance of 1 (obtained in the same manner as with IL scrap). Reference Example 1. Determination of Free Cholesterol Phenol 0.1%, 4-amino Antipyrine 0.01%, cholesterol oxidase lOu/de. peroxidase 300 u/dg, triton X1
The solution was dissolved in 0.1 MIJ phosphate buffer (p)l 7.0 to a concentration of 0.000.15%, and used as a coloring reagent. Take 50 μt of serum, add color reagent 3-, and incubate at 37°C.
After heating in a constant temperature bath for 15 minutes, wavelength 5 was used as a control for direct reagent replacement.
Measure the absorbance at 0.05 nm. Separately, cholesterol standard g1. (Cholesterol 100 m&/de) k
As shown in Table 1, the free cholesterol concentration in the serum is calculated from the absorbance obtained in the same manner as in serum. They match well and no significant difference is observed between them.Asuni F Red and White Table 1 r=o, '994 Y= 1.01・Lafleur 0.001%, mannonone chloride 5 mM/L,
NA I) 100 m (wa/cje, D-steroltehythrochemase' 200 u/de,
l・i l・7 4-amine antibi]1 0.01%, phenol 0.1%
, Bel Ogintase 6oOu /dI! ,'fr:
'9-mu0.051'V1 l-lisu salt-salt liquid (
pH 7.0) is used as the second test solution. Take 50 μt of serum, and measure the total absorbance by boiling in the same manner as in Example 1 and 1, and determine the cholesterol level. As shown in Table 2 (A9.), IIσ of Example 5 and 1st axis of this reference example agree well, and there is no significant difference between them and C. 0.995 Y = 0.98 X+ 0.60

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図、第２図及び第３図は、各々、実施例１１実施例
２及び実施例：３にｂ５て得ら第１た検量扉を表わし、
横軸の各Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ濃度（ｍｊＪ／ｄｅ　）につい
て得らイ１．た吸光度を殿軸に活ってプロットした点を
結んだ、ＮＡＩ）Ｈの検量ＩＷＱ　’Ｌ衣わす。 特許出ｊ畑人　和元純薬工業株式会社 醒　１　図 ＮＡＤＴＴｔｔＡＩｆ）ｌ　（ｌｎｇ乙＋ｇ嬉　２図 ＮＡＤＨ講吸（ｌｌＩ≠′ｉ） 第３図 ＮＡＤＨ濃Ｕ（ｍｙ／ｄｔ） 手続補正書 昭和り７年　　と月　　８日 特許庁長官　殿 １　事件の表示 ２　発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡装置　０３−２７０−８５７１ ５、　補正の対象 願書、明細書の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄、
及び発明の詳細な説明の欄。 ６、　補正の内容 （１）願書の特許請求の範囲に記載された発明の数の欄
に記載の「６発明」を「２発明」と補正する。 （２）発明の名称の欄に記載の「還元型補酵素の定量法
及び定量用試薬」を「還元型補酵素の定量法」と補正す
る。 （３）特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （４）明細書１７頁１１行目に記載のｒ３４０ｎｍイマ
ｊ近に吸収を有する物質によって」をｒ３４０ｎｍ刊近
に吸収を有する物質、例えばビリルビン、ヘモグロビン
等によって」と補正する。 （５）明細１．２３頁１９行目から２４頁９行目にかけ
て記載の「本発明に用いられる金属イオンとは、・・・
・　２価のコバルトイオンが好寸しぐ用いられる。」を
「２価のマンガンイオン若しくは２価のコバルトイオン
と同等な作用を有する金属イオンとしては、例えば、遷
移金属イオンが挙げられる。」と補正する。 以上 別　　　　紙 ２、特許請求の範囲 （１）還元型補酵素に電子伝達体を作用させ、定量的に
生成する過酸化水素を定量することを特徴とする、還元
型補酵素の定量方法。 （２）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ、
定量的に生成する還元型補酵素に、電子伝達体を作用さ
せる、特許請求の範囲第１項記載の定量方法。 （３）還元型補酵素が、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ（還元型ニコチ
ンアミトアテニンジヌク１７オチト）又はＮ　Ａ　Ｄ　
Ｐ　ｉ−■（還元型ニコチンアミトアデニンジヌク１７
オチド記載の定量方法。 （４）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（Ｐ
ＭＳ）、１−メトキシフェナジンメトザルフェート（１
−メトキシＰＭＳ　）、９−ジメチルアミノベンゾ−α
−フエナゾキソニウムクロリト（メルトラブル−）又は
これらと同等な作用を有する電子伝達体である、特許請
求の範囲第１項、＠２項又は第３項記載の定量方法。 （５）過酸化水素を定量する方法が、自体公知の過酸化
水素の定量方法である、特許請求の範囲第１（６）過酸
化水素を定量する方法が、過酸化水素による被酸化性呈
色試薬の呈色を測定する自体公知の過酸化水素の定量方
法である、特許請求の範囲第５項記載の定量方法。 （７）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ、
定量的に還元型補酵素を生成する反応が自体公知の酵素
反応である、特許請求の範囲第２項、法。 （８）　基質がコ１／ステロール、胆汁酸、グリセリン
、クリセリン−３−リン酸、グルコース−６−リン酸、
ホルムアルデヒド又はアセトアルデヒド、補酵素がＮＡ
Ｄにコチンアミトアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤ
Ｐにコチンアミトアデニンジヌク１／オチドリン酸）で
あって、補酵素の存在下、基質に作用させる脱水素酵素
が各々コ１／ステロール脱水素酵素、胆汁酸脱水素酵素
（３α−ヒドロキシステロイドデヒトロゲナーゼ）、グ
リセリン脱水素酵素、グリセリン−３−リン酸脱水素酵
素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホル素である
、特許請求の範囲第７項記載の定量方法。 （９）脱水素酵素が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、又はα
−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−ＨＢ　Ｄ　）であり
、補酵素がＮＡＤにコチンアミトアデニンジヌクレオチ
ド）又はＮＡＤＰにコチンアミトアテニンジヌク１／オ
チドリン酸）であって、補酵素の存在下、脱水素酵素を
作用させる基質が各々乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸であ
る、特許請求の範囲第７項記載の定量方法。 （１０）被検試料が体液成分であり、溶液中の反応によ
り定量的に生成する過酸化水素を定量する特の定量方法
。 （１１）　１溶液中の反応により、定量的に生成する過
酸化水素を同溶液中の反応により定量する、特許請求の
範囲第１０項記載の定量方法。 （１２）過酸化水素を定量する方法が、過酸化水素によ
る被酸化性呈色試薬の呈色を測定する自体公知の過酸化
水素の定量方法である、特許請求の範囲第１１項記載の
定量方法。 （１３）電子伝達体又はこれと被酸化性呈色試薬は含ｔ
ｒ　カベルオキシダーゼは含まない液を第１液とし、ペ
ルオキシダーゼ又はこれと被酸化性呈色試薬は含むが必
ずしも電子伝達体は含まない液を第２液として、被検試
料に先ず第１液を加えてインキュベートし、次いで、こ
れに第２液を加えてインキュベートし、生ずる呈色を特
徴する特許請求の範囲第１２項記載の定量方法。 （１４）還元型補酵素に電子伝達体及び金属イオンを作
用させ、定量的に生成する過酸化水素を定量することを
特、徴とする、還元型補酵素の定量方法。 （１５）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ
、定量的に生成する還元型補酵素に、電子伝達体及び金
属イオンを作用させる、特許請求の範間第１４項記載の
定量方法。 （１６）還元型補酵素が、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド項記載の定量方
法。 （１７）電子伝達体が、フエナジンメトザルフエー）（
ＰＭＳ）、Ｉ−メトキシフェナジンメトサルフェート（
１−メトキシＰＭＳ　）、９−ジメチルアミノベンゾ−
α−フエナゾキンニウムクロリド（メルトラブル−）又
はこれらと同等な作用を有する電子伝達体である、特許
請求の範囲第１４項、（１８）　金属イオンが２価のマ
ンガンイオン若しくは２価のコバルトイオン又はこれら
と同等な作用を有する金属イオンである特許請求の範囲
第１４方法。 （１９）２価のマンガンイオン若しぐは２価のコバルト
イオンと同等な作用を有する金属イオンが遷移金属イオ
ンである特許請求の範囲第１８項記載の定量方法。 （２０）過酸化水素を定量する方法が、自体公知の過酸
化水素の定量方法である、特許請求の範囲第（２１）過
酸化水素を定量する方法が、過酸化水素による被酸化性
呈色試薬の呈色を測定する自体公知の過酸化水素の定量
方法である、特許請求の範囲第２０項記載の定量方法。 （２２）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ
、定量的に還元型補酵素を生成する反応が自体公知の酵
素反応である、特許請求の範囲第１５（２３）基質がコ
レステロール、胆汁酸、グリセリン、クリセリン−３−
リン酸、グルコース−６−リン酸、ホルムアルデヒド又
はアセトアルデヒド、補酵素がＮＡＤにコチンアミドア
デニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ　にコチンアミド
アデニンジヌク１／オチドリン酸）であって、補酵素の
存在下、基質に作用させる脱水素酵素が各々コ１／ステ
ロール脱水素酵素、胆汁酸脱水素酵素（３α−ヒドロキ
システロイドデヒドロゲナーゼ）、グリセリン脱水素酵
素、グリセリン−３−リン酸脱水素酵素、グルコース−
６−リン酸脱水素酵素、ホ方法。 （２４）脱水素酵素が乳酸脱水素酵素（ＬＤｎ）、又は
α−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（α−ＨＢＤ）であり、
補酵素がＮＡＤにコチンアミトアデニンジヌク１／オチ
ド）又はＮＡＤＰにコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸）であって、補酵素の存在下、脱水素酵素を作
用させる基質が各々乳酸又はσ−ヒドロキシ酪酸である
、特許請求の範囲第２２項記載の定量方法。 （５）被検試料が体液成分であり、溶液中の反応により
定量的に生成する過酸化水素を定量する特許請求の範囲
第１４項、第１５項、第１６項、第１７項、第１８項、
第１９項、第２０項、第２１量方法。 （２６）　１溶液中の反応により、定量的に生成する過
酸化水素を同溶液中の反応により定量する、特許請求の
範囲第２５項記載の定量方法。 （２７）過酸化水素を定量する方法が、過酸化水素によ
る被酸化性呈色試薬の呈色を測定する自体公知の過酸化
水素の定量方法である、特許請求の範囲第２６項記載の
定量方法。 （２８）電子伝達体及び金属イオン又はこれらと被酸化
性呈色試薬は含むが、ベルオキシダーゼは含まない液を
第１液とし、ペルオキシダーゼ又はこれと被酸化性呈色
試薬は含むが必ずしも電子伝達体又は電子伝達体及び金
属イオンは含まない液を第２液として、被検試料に先ず
第１液を加えてインキュベートし、次いで、これに第２
液を加えてインキュベートし、生ずる呈色を特徴する特
許請求の範囲第２７項記載の定量方法。 以上1, 2 and 3 respectively represent the first calibration door obtained by b5 in Example 11, Example 2 and Example 3,
1. Obtained for each N A DH concentration (mjJ/de) on the horizontal axis. The calibration IWQ'L of NAI)H is calculated by connecting the points plotted using the measured absorbance on the axis. Patent issued by Hatato Wamoto Pure Chemical Industries, Ltd. 1 Figure NADTTttAIf)l (lng Otsu + g happy 2 Figure NADH lecture (llI ≠'i) Figure 3 NADH no U (my/dt) Procedural amendments Showa era 7th year and month 8th Director General of the Patent Office 1 Indication of the case 2 Name of the invention 3 Relationship to the case of the person making the amendment Postal code of the patent applicant 541 Communication device 03-270-8571 5. Application to be amended, description of the specification Title of invention column, Claims column,
and a column for detailed description of the invention. 6. Contents of the amendment (1) The "6 inventions" stated in the column of the number of inventions stated in the scope of claims of the application will be amended to "2 inventions." (2) "Method for quantifying reduced coenzyme and reagent for quantifying" stated in the column of title of the invention is corrected to "method for quantifying reduced coenzyme." (3) Amend the scope of claims as shown in the attached sheet. (4) "By a substance having absorption near r340nm imma j" as stated in page 17, line 11 of the specification is corrected to "by substance having absorption near r340nm, such as bilirubin, hemoglobin, etc." (5) Specification 1. From page 23, line 19 to page 24, line 9, “The metal ions used in the present invention are...
- Divalent cobalt ions are often used. " is corrected to "Metal ions that have the same effect as divalent manganese ions or divalent cobalt ions include, for example, transition metal ions." Attachment 2, Claims (1) A method for quantifying a reduced coenzyme, which comprises causing an electron carrier to act on a reduced coenzyme and quantitatively quantifying hydrogen peroxide produced. (2) In the presence of a coenzyme, let a dehydrogenase act on the substrate,
2. The quantitative method according to claim 1, wherein an electron carrier is caused to act on the reduced coenzyme that is quantitatively produced. (3) The reduced coenzyme is N A D H (reduced nicotine amitoatenin dinucu 17 otito) or N A D
P i-■ (reduced nicotine amide adenine dinucu 17
Quantification method described in Otide. (4) The electron carrier is phenazine methosulfate (P
MS), 1-methoxyphenazine methosulfate (1
-methoxyPMS), 9-dimethylaminobenzo-α
- Phenazoxonium chlorite (melt trouble) or an electron carrier having an action equivalent to these, the quantitative method according to claim 1, @2, or 3. (5) The method for quantifying hydrogen peroxide is a per se known method for quantifying hydrogen peroxide. Claim 1 (6) The method for quantifying hydrogen peroxide is characterized by the oxidizability caused by hydrogen peroxide. 6. The method for quantifying hydrogen peroxide according to claim 5, which is a known method for quantifying hydrogen peroxide by measuring the color development of a color reagent. (7) Allowing dehydrogenase to act on the substrate in the presence of a coenzyme,
The method according to claim 2, wherein the reaction for quantitatively producing the reduced coenzyme is an enzymatic reaction known per se. (8) The substrate is co-1/sterol, bile acid, glycerin, chrycerin-3-phosphate, glucose-6-phosphate,
Formaldehyde or acetaldehyde, coenzyme is NA
D is cotinamitoadenine dinucleotide) or NAD
In the presence of coenzymes, the dehydrogenases that act on the substrate are cotinamide dehydrogenase, bile acid dehydrogenase (3α-hydroxysteroid dehydrogenase), and cotinamide dehydrogenase (3α-hydroxysteroid dehydrogenase). 8. The quantitative method according to claim 7, wherein the quantification method is performed using the following enzymes. (9) Dehydrogenase is lactate dehydrogenase (LDH) or α
-Hydroxybutyrate dehydrogenase (α-HBD), in which the coenzyme is NAD (cotinamitoadenine dinucleotide) or NADP (cotinamitoatenine dinucleo1/otidophosphate), and in the presence of the coenzyme, dehydration occurs. 8. The quantitative method according to claim 7, wherein the substrate on which the enzyme acts is lactic acid or α-hydroxybutyric acid. (10) A specific quantitative method in which the test sample is a body fluid component and hydrogen peroxide quantitatively produced by a reaction in a solution is determined. (11) The quantitative method according to claim 10, wherein hydrogen peroxide produced quantitatively by a reaction in one solution is quantitatively determined by a reaction in the same solution. (12) Quantification according to claim 11, wherein the method for quantifying hydrogen peroxide is a per se known method for quantifying hydrogen peroxide, which measures the coloration of an oxidizable color reagent caused by hydrogen peroxide. Method. (13) Electron carriers or oxidizable coloring reagents are not included.
r The first solution is a solution that does not contain cabel oxidase, and the second solution is a solution that contains peroxidase or an oxidizable coloring reagent but does not necessarily contain an electron carrier. First, add the first solution to the test sample. 13. The quantitative method according to claim 12, wherein the second liquid is added to the second liquid and incubated, and the resulting color is characterized. (14) A method for quantifying a reduced coenzyme, which is characterized by acting on the reduced coenzyme with an electron carrier and a metal ion, and quantitatively quantifying the produced hydrogen peroxide. (15) Quantification according to claim 14, wherein a dehydrogenase is allowed to act on a substrate in the presence of a coenzyme, and an electron carrier and a metal ion are made to act on the quantitatively produced reduced coenzyme. Method. (16) The reduced coenzyme is NADH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide) or NADPH (the quantitative method described in the reduced nicotinamide adenine dinucleotide section). (17) The electron carrier is phenazine methosulfate. (
PMS), I-methoxyphenazine methosulfate (
1-methoxyPMS), 9-dimethylaminobenzo-
Claim 14, (18) The metal ion is a divalent manganese ion or a divalent cobalt, which is α-phenazoquinium chloride (melt trouble) or an electron carrier having an action equivalent to these. 14. The method according to claim 14, wherein the method is an ion or a metal ion having an action equivalent to these. (19) The quantitative method according to claim 18, wherein the metal ion having the same effect as a divalent manganese ion or a divalent cobalt ion is a transition metal ion. (20) The method for quantifying hydrogen peroxide is a per se known method for quantifying hydrogen peroxide. Claim No. (21) The method for quantifying hydrogen peroxide is the oxidizable coloration caused by hydrogen peroxide. 21. The method for quantifying hydrogen peroxide according to claim 20, which is a known method for quantifying hydrogen peroxide by measuring the coloration of a reagent. (22) The reaction of causing a dehydrogenase to act on a substrate in the presence of a coenzyme to quantitatively produce a reduced coenzyme is an enzymatic reaction known per se. Claim 15 (23) The substrate is cholesterol. , bile acids, glycerin, chrycerin-3-
Phosphoric acid, glucose-6-phosphate, formaldehyde or acetaldehyde, the coenzyme is NAD (cotinamide adenine dinucleotide) or NADP (cotinamide adenine dinucleotide 1/otide phosphate), which acts on the substrate in the presence of the coenzyme. The dehydrogenases are co-1/sterol dehydrogenase, bile acid dehydrogenase (3α-hydroxysteroid dehydrogenase), glycerin dehydrogenase, glycerin-3-phosphate dehydrogenase, and glucose-
6-phosphate dehydrogenase, method e. (24) the dehydrogenase is lactate dehydrogenase (LDn) or α-hydroxybutyrate dehydrogenase (α-HBD),
The coenzyme is NAD (cotinamide adenine dinucleotide 1/otide) or NADP (cotinamide adenine dinucleotide phosphate), and in the presence of the coenzyme, the substrate that acts on dehydrogenase is lactic acid or σ-hydroxybutyric acid, respectively. A quantitative method according to claim 22. (5) Claims 14, 15, 16, 17, and 18, in which the test sample is a body fluid component and hydrogen peroxide is quantitatively generated by a reaction in a solution. section,
Items 19, 20, and 21 Amount Methods. (26) The quantitative method according to claim 25, wherein hydrogen peroxide produced quantitatively by a reaction in one solution is quantitatively determined by a reaction in the same solution. (27) Quantification according to claim 26, wherein the method for quantifying hydrogen peroxide is a per se known method for quantifying hydrogen peroxide, which measures the coloration of an oxidizable color reagent caused by hydrogen peroxide. Method. (28) The first solution is a liquid that contains an electron carrier and a metal ion, or these and an oxidizable coloring reagent, but does not contain peroxidase, and a liquid that contains peroxidase or this and an oxidizable coloring reagent but does not necessarily transfer electrons. A second solution containing no body or electron carrier and metal ions is first added to the test sample and incubated, and then the second solution is added to the test sample.
28. The quantitative method according to claim 27, characterized by the color development that occurs when a liquid is added and incubated. that's all

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （］）崩１元型袖酵索に電子伝達体を作用させ、定量的
に生成する過酸化水素を定量することを特徴とする、還
ノｃ抛補Ｃリソ素の定量方法。 （２）還元型補酵素に電子伝達体及び金属イオンを作用
ブせ、定量的に生成する過ｒ糞化水素を定量１すること
を和徴とする、還元型補酵素の定量方法。 （３）袖耐−素の存在下、基質に脱水素Ｙ・・２素を作
月］させ、定（都市に生成する還元型；ｉｌｉ　ｆ’＋
：ｊ素に、電子伝達体を作用させる、特許請求の範囲第
１項記載の定量方法。 （４）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ、
定量１的に生成する還元型補酵素に、電子伝達体及び金
に℃イオンを作月１さぜる、特許請求の範囲第２項記載
の定量方法。 （５）還元型補酵素が、ＮＡＤＪ−１（還元型ニコチン
アミトアテニン／ヌクレオチド）又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　
Ｈ（Ｍ　元Ｍニコチンアミトアテニンンヌクレオチドリ
ン酸）である特許請求の範囲第１項、第２項、第３項又
は第４項記載の定量方法。 （６）電子伝達体が、フェナジンメトサルフェート（Ｐ
ＭＳ）、１−メトキンフェナジンメトザルフェート　（
１−メトキ７ＰＭＳ）、９−７メチルアミノヘノノーα
−フエナンキンニウムクロリト（メルトラブル−）又は
これらと同等な作用を有する′ｉｉイ伝達体である、特
許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４項又は第５
項記載の定量方法。 （７）金属イオンが２価のマンガンイオン若しくは２仙
１のコバルトイオン又はこれらと同等な作用を有する金
属イオンである特許請求の範囲第２項・第４項、第５項
又は第６項記載の定量方法。 （８）２価のマンガンイオン若しくは２価のコハルｉ・
イオンと同等な作用を有する金属イオンが遷移金属１イ
オンである特許請求の範囲第７項記載の定量方法。 （９）過酸化水素を定量する方法が、自体公知の過酸化
水素の定量方法である、特許請求の範囲第１項、第２項
、第３ｇ１、第４項、第５項、第６項、第７項、又１ｄ
第８項記載の定量方法。 （］０）過酸化水素を定量する方法が、過酸化水素によ
る被酸化性呈色試薬の呈色を測定する自体公知の過酸化
水素の定量方法である、特許請求の範囲第９項記載の定
量方法。 旧）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ、定
量的に還元型補酵素を生成する反応が自体公知の酵素反
応である、特許請求の１・［Ｊ間第３項、第４項、第５
項、第６項、狽）、７項、第８項、第９項又は第１０項
記載の定量方法。 （１２１基質がコレ７テロール、胆汁酸、クリセリ／・
クリセリ／−３−リ／酸、クルコース−６−リン酸、ア
ルテヒト例えばホルムアルデヒド又はアセトアルテヒト
であり、補酵素がＮＡＤにコナノアミトアテニンノヌク
レオチト）又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐにコチンアミトアテニン
ノヌクレオチ１〜リン酸）であって、補酵素の存在下、
基質に作用させる脱水素酵素が各々コレステロール脱水
素酵素、胆′／＋酸脱水素Ｎ’Ｐ　素（３α−ヒトロキ
／ステロイ］・テヒトロケナーセ）、クリセリン脱水素
酵素、クリセリノー３−リン酸脱水素酵素、クルコース
−６−リン酸脱水素ｎ＋２素、アルテヒド脱水素酵素又
はホルムアルデヒド脱水素酵素である、特許請求の範囲
第１１項記載の定量方法。 住３）脱水素酵素が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ＞　、又は
α−ヒＩ・ロキシ酪酸脱水素酵素（α−ＨＢＤ）であり
、補酵素がＮＡＤ　にコチンアミトアデニンノヌクレオ
チト）又はＮＡＤＰ　にコチンアミトアデニンンヌクレ
オチドリン酸）であって、補酵素の存在下、脱水素酵素
を作用させる基質が各々乳酸又はα−ヒドロキシ酪酸で
ある、特許請求の範囲第１１項記載の定量方法。 （圓被検試料が体液成分であり、溶液中の反応により定
量的に生成する過酸化水素を定量する特許請求の範囲第
１項、第２項、第３項、第４項、第５項、第６項、第７
項、第８項、第９項、自ＺｌＯ項、第１１項、第１２項
又は第１３項記載の定量方法。 ０９１溶液中の反応により、定量的に生成する過酸化水
素を同溶液中の反応により定量する、特許請求の範囲第
１４項記載のπ：量方法。 （１６ｊ過酸化水素を定置する方法が、過酸化水素によ
る被酸化性呈色ん（薬の呈色を測定する自体公知の過酸
化水素の定拓力法である、特許請求の範囲第１５項記載
の定量ツノ法。 （１１電子伝達体又はこノ１と被酸化性呈色試薬は含む
がベルオキンクーセは含捷ない液を第１液とし、ベルオ
キシターセ又はこれと被酸化性呈色試薬は含むか必ずし
も電子伝達体は含まない敵を第２液として、被検試料に
先ず第１液を加えてイノキュ・＼−１・し、次いで、こ
れに第２液を加えてイノギー・＼−トシ、生ずる呈色を
特徴する特許請求の範囲第１６項記載の定量方ｆ去。 （ｌｓｌ　４ｉＬ子伝辻休及び金属イオ／又はこれらと
被酸化性呈色試薬は含むか、ベルオキ／ターセ（ｄ含ま
ない液を第１液とし、ベルオキンクーセ又はこれと被酸
化性呈色試薬は含むが必ずしも電子伝達体又は′７［Ｌ
子伝送体及び金１・北イオンは含まない液を第２液と１
２で、被検試料に先ず第１液を加えてインキー−一＜−
トし、次いで、これに第２液を加えてインキーヘ−トシ
、生ずる呈色を特徴する特許請求の範囲第１６項記載の
定量方法。 旺還元型補酵素に電子伝達体を作゛用させ、定量的に過
酸化水素を生成させる、還元型補酵素の定量用試薬。 （２０１還元型袖酵素に電子伝達体及び金属イオンを作
用させ、定量的に過酸化水素を生成させる、還元型補酵
素の定量用試薬。 （２１）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ
、定量的に生成する還元型補酵素に、電子伝達体を作用
させる、特許請求の範囲第１９項記載の、定量的に逆酸
化水素を生成させる、還元型補酵素の定量用試薬。 （２２ｊ補醇素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ
、定量的に生成する還元型補酵素に、電子伝達体及び金
属イオンを作用させる、特許請求の範囲第２０項記載の
、定量的に過酸化水素を生成させる、還元型補酵素の定
量用試薬。 （２３）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ
、定量的に還元型補酵素を生成する反応が自体公知の酵
素反応である、特許請求の簡」間第２１項又は第２２項
記載の、定−（１・的に過噌化水素を生成させる、；Ｍ
ｉｉ元型袖醇素の定量用試薬。 Ｃ！１）還元型補酵素が、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンア
ミ［・アテニンノヌクレオチト）又はＮＡＤＰＨ（還元
型ニコチンアミトアテニノノヌクレオチトリン酸）であ
る特許請求の範囲第１９項、第２０項、第２１項、第２
２項又は第２３項記載の、定量的に過酸化水素を生成さ
せる、還元型補酵素の定量用試薬。 Ｃ！５）電子伝達体が、フエナノノメトサルフエート（
ＰＭＳ）　、１−メトキンフエナ／ノメトサルフェート
　（１−メトキシＰＭＳ）、９−ジメチルアミノヘンノ
ーα−フエナノキソニウムクロリｌ−（メルトラブル−
）又はこれらと同等な作用を有する電子伝達体である、
特許請求の範囲第１９項、第２０項、第２１項、第２２
項、第２３項又は第２４項記載の、定ｈ；的に過自々□
化水素を生成させる、還７０型袖酵素の定年用試薬。 （２＋＋＋　金）ＢＳイオンが２価のマンカンイオン若
しくは２価のコバルトイオン又はこれらと同等な作用を
有する金属イオンである特許請求の範囲第２０項、第２
２項、第２３項、第２４項又は第２５項記載の、定量的
に過酸化水素を生成させる、還元型補酵素の定量用試薬
。 （２力２価のマンカンイオン若しくは２価のコバルトイ
オンと同等な作用を有する金属イオンが遷移金属イオン
である特許請求の範囲第２６項記載の、定量的に過酸化
水素を生成させる、還元型補酵素の定量用試薬。 θ８）基質がコレステロール、胆汁酸、クリセリン、ク
リセリン−３−リン酸、グルコース−６−リン酸、アル
テヒト例えばホルムアルデヒド又はアセトアルテヒトで
あり、補酵素がＮＡＤ　にコチンアミ１−アテニンンヌ
クレオチト）又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐにコチンアミドアテニ
ンジヌクレオチトリン酸）であって、補ｒｌシ素の存在
下、基質に作用させる脱水素酵素が各々コレステロール
脱水素酵素、胆汁酸ｒ＋ａ　水素酵素（３α−ヒトロキ
システロイトテヒトロケナーセ）、クリセリン脱水素酵
素、グリセリン−３−リン酸脱水素酵素、グルコース−
６−リン酸脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素又はホル
ムアルテヒ１−説水素酵素である、特許請求の範囲第２
１項、第２２項、第２３項、第２４項、第２５項、第２
６項又は第２７項記載の、定量的に過酸化水素を生成さ
せる、還元型補酵素の定量用試薬。 （２９）脱水素酵素が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）　、又
はα−ヒトロキ／酪酸脱水素醇累（α−ＨＢＤ）であり
、補酵素がＮＡＤ　にコチンアミトアテニンノヌクレオ
チト）又はＮＡＤＰ　にコチンアミＩ・アテニンンヌク
レオチ）・リン酸）であって、補酵素の存在下、脱水素
酵素を作ＪＩ］さぜる基質が各々乳酸又はα−ヒドロキ
ン酪酸である、特許請求の範囲第２１項、第２２項、第
２３項、第２４項、第２５項、第２６項又は第２７項記
載の、定量的に過酸化水素を生成さぜる、還元型補酵素
の定年用試薬。 （３［］）被検試料が体液成分てあり、溶液中の反応に
より定量的に過酸化水素を生成させる、特許請求の範囲
第１９項、第２０項、第２１項、第２２項、第２３項、
第２４項、第２５項、第２６項、第２７項、第２８項又
は第２９項記載の、定量的にオ・）酸化水素を生成させ
る、還元型補酵素の定量用試薬。 （３＋）　ｌ溶液中の反応により定量的に過酸化水素を
生成させる、特許請求の範囲第３０項記載の、定量的に
過酸化水素を生成させる、還元型補酵素の定量用試薬。 （３→還元型袖酵素に電子伝達体を作用させ、定量的に
生成する過１峻化水素を定量することにより還元型補酵
素を定量する、還元型補酵素の定量用試薬。 （３３）還元Ｂす補酵素に電子伝達体及び金属イオンを
作用させ、定量的に生成する過酸化水素を定量すること
により還元型補酵素を定量する、還元型補酵素の定量用
試薬。 （３４）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ
、定か一的に生成する還元型補酵素に、電子伝達体を作
用さぜる、特許請求の範囲第３２項記載の定Ｂ＜用試薬
。 （，３５）補酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用さ
せ、定量的に生成する還元型補酵素に、電子伝達体及び
金属イオンを作用させる、特許請求の範囲第３３項記載
の定量用試薬。 （３６）還元型補酵素が、ＮＡＬ）Ｉ−１（還元型ニコ
チンアミトアテニンノヌクレオチト）又はＮ　Ａ　Ｉ）
　Ｐ　１７Ｉ（還元型ニコチノアミトアテ二ノンヌクレ
男チ］・リン酸）である特許請求のｆｉｔｉｊ囲第３２
項第３２項項、第３４項又は第３５項記載の定量用試薬
。 （３η電子伝達体が、フェナノンメトサルフェ−１・（
ＰＭＳ）、ｌ−メトキ７ノエナノンメトザルフェ−１・
（１−メ［・キンＰＭＳ）、９−ツメデル°フ′ミノヘ
ンソーα−フェナノキノニウムクロリト（ノル］・ラブ
ル−）又はこれらと１ｍ１笠な作用を有する電子伝達体
である、特許請求の範囲第３２０（、第３３項、第３４
項、第３５項又は第３６項記載の定量用試薬。 （３８）金属イオンが、２価のマノカンイオン若しく（
は２価のコバルトイオン又はこれらと同等な作用を有す
る金属イオンである特許請求の範囲第３３項、ＷＪ３５
項、第３６項又は第３７項記載の定量用試薬。 （３９１２価のマンカンイオン若しくは２価のコバルト
イオンと同等な作用を有する金属イオンか遷移金属イオ
ンである特許請求の範囲第３８項記載の定量用試薬。 （４０）過酸化水素を定量する方法が、自体公知の過酸
化水素の定量方法である、特許請求の範囲第３２項、第
３３項、第３４項、第３５項、第３６項、第３７項、第
３８項又は第３９項記載の定量用試薬。 （４１）過酸化水素を定量する方法が、過酸化水素によ
る被酸化性呈色試薬の呈色を測定する自体公知の過酸化
水素の定量方法である、特許請求の範囲第４０項記載の
定量用試薬。 （州都酵素の存在下、基質に脱水素酵素を作用させ、定
量的に還元型補酵素を生成する反応が自体公知の酵素反
応である、特許請求の範囲第３４項、第３５項、第３６
項、第３７項、第３８項、第３９項、第４０項又は第４
１項記載の定量用試薬。 （痢基質かコレステロール、胆汁酸、クリセリン、クリ
セリン−３−リン酸、グルコース−６−リン酸、アルデ
ヒド例えはホルムアルデヒド又はアセ）・アルデヒドで
あり、補酵素がＮＡＤ　にコチンアミドアデニンンヌク
レオチト）又はＮ　Ａ　Ｄ　Ｐにコチンアミ［・アテニ
ンノヌクレオチトリン酸）であって、補ＷＷ素の存在下
、基質に作用させる脱水素酵素が各々コレステロール脱
水素酵素、胆汁酸脱水Ｘ　酵素（３α−ヒドロキンステ
ロイ］・テヒ］−ロケナーセ）、クリセリン脱水素酵素
、クリセリン−３−リン酸脱水索酵素、クルコース−６
−リン酸脱水素酵素、アルテヒト脱水素酵素又はホルム
アルテヒト脱水素酵素である、特許請求の範囲第４２項
記載の定量用試薬。 （４・り脱水）く酵素か乳畝脱水素酵素（ＬＤＩ−Ｉ）
、又はα−ヒ１−ロキ／酪酸脱水素酵累（α−Ｉ−１１
３　Ｄ　）であり、補酵素がＮＡＩ）にコチンアミトア
デ二／ノヌクレオチ］・）又１ＮＡＤＰ　にコチンアミ
）・アデニンノヌクレオチ１−リン酸）であって、袖耐
素の存在斗、脱水素酵素を作用させる基質が各々乳酸又
員α−ヒ１−ロキン酪酸である、特許請求のＲｔｉｊ囲
第４２項記載の定量用試薬。 （４５）被検試料か体液成分であり、浴液中の反応によ
り定量的に生成する過酸イ］′水素を定量する特許請求
の範囲第３２項、第３３項、第３４項、第３５項、第３
６項、第３７項、第３８項、第３９項、第４０項、第４
１項第４２項、第４３項又は第４４項記載の定量用試薬
。 （４（ｉ）　ｌ溶液中の反応によシ、定量的に生成する
過酸化水素を同溶液中の反応により定量する、特許請求
の範囲第４５項記載の定量用試薬。 （４７）過酸化水素を定量する方法が、過酸化水素によ
る被酸化性呈色試薬の呈色を測定する自体公知の過酸化
水素の定量方法である、特許請求の範囲第４６項記載の
定量用試薬。 （４８１電子伝達体又はこれと被酸化性呈色試薬は含む
かベルオキ７ターセは含まない液を第１液とし、ベルオ
キ７ターセ又はこれと被酸化性呈色試薬は含むか必ずし
も電子伝達体は含捷々い液を第２液として、被検試料に
先ず第１液を加えてインキーヘートし、次いで、これに
第２液を加えてインキュへ−１・し、生ずる呈色を特徴
する特許請求の範囲第４７項記載の定量用試薬。 （−＋９＋電子伝達体及び金属イオン又はこれらと被酸
化性呈色試薬は含むが、ベルオキ７ターセは含まない液
を第１液とし、ベルオキ７ターセ又はこれと′＃１酸化
性呈色試薬は含むが必ずしも電子伝達体又は電子伝達体
及び金属イオンは含まない液を第２液として、被検試料
に先ず第１液を加えてインキ・へ−１・し、次いで、こ
れに第２液を加えてインキ−＝＜−トし、生ずる呈色を
特徴する特許請求の範囲第４７項記載の定量用試薬。[Scope of Claims] (]) A method of reducing hydrogen peroxide, which is characterized in that hydrogen peroxide produced is quantitatively determined by applying an electron carrier to a decomposition monomer-type sodomestic acid. Quantification method. (2) A method for quantifying a reduced coenzyme, which is characterized by acting on the reduced coenzyme with an electron carrier and a metal ion and quantitatively quantifying the produced hydrogen peroxide. (3) In the presence of Sode-tai-element, dehydrogenated Y...2 element is produced on the substrate, and the reduced form produced in the city; ili f'+
The quantitative method according to claim 1, wherein the quantification method is made to act on the element j with an electron carrier. (4) in the presence of a coenzyme, allowing a dehydrogenase to act on the substrate;
2. The quantitative method according to claim 2, wherein C ions are added to the electron carrier and gold to the reduced coenzyme that is produced during the quantitative determination. (5) The reduced coenzyme is NADJ-1 (reduced nicotine amitoatenine/nucleotide) or NAD P
The quantitative method according to claim 1, 2, 3, or 4, which is H (M ex-M nicotine amitoatenin nucleotide phosphate). (6) The electron carrier is phenazine methosulfate (P
MS), 1-methquinphenazine methosulfate (
1-methoxy7PMS), 9-7methylaminohenono α
Claims 1, 2, 3, 4, or 5, which are phenanquinium chloride (melt trouble) or a transmitter having an action equivalent to these.
Quantification method described in section. (7) Claims 2, 4, 5, or 6, wherein the metal ion is a divalent manganese ion, a divalent cobalt ion, or a metal ion having an action equivalent to these. Quantification method. (8) Divalent manganese ion or divalent Kohar i.
8. The quantitative determination method according to claim 7, wherein the metal ion having the same effect as the ion is a transition metal 1 ion. (9) Claims 1, 2, 3g1, 4, 5, and 6, wherein the method for quantifying hydrogen peroxide is a per se known method for quantifying hydrogen peroxide. , Section 7, and 1d
The quantitative method described in Section 8. (]0) The method for quantifying hydrogen peroxide is a method for quantifying hydrogen peroxide known per se that measures the coloration of an oxidizable coloring reagent caused by hydrogen peroxide, according to claim 9. Quantification method. (Old) Claims 1 and [J, Paragraphs 3 and 3, in which the reaction of causing a dehydrogenase to act on a substrate in the presence of a coenzyme and quantitatively producing a reduced coenzyme is a known enzymatic reaction. Section 4, Section 5
6, 7), 7, 8, 9, or 10. (121 substrates are chole7terol, bile acids, chryseri/・
chryseri/-3-ly/acid, crucose-6-phosphate, artehyde, such as formaldehyde or acetaltehyde, and the coenzyme is NAD (conanoamitoatenin nonnucleotide) or NAD P (cotinamitoatenin). nucleotide 1 to phosphate) in the presence of a coenzyme,
The dehydrogenases that act on the substrate are cholesterol dehydrogenase, bile'/+ acid dehydrogenase N'P (3α-hydrogenase), chrycerin dehydrogenase, chryselin 3-phosphate dehydrogenase, 12. The quantitative method according to claim 11, which is n+2 phosphate dehydrogenase, altehyde dehydrogenase, or formaldehyde dehydrogenase. 3) The dehydrogenase is lactate dehydrogenase (LDH) or α-hyperoxybutyrate dehydrogenase (α-HBD), and the coenzyme is NAD (cotinamitoadenine nonnucleotide) or NADP (cotine). 12. The quantitative method according to claim 11, wherein the substrate on which the dehydrogenase acts in the presence of a coenzyme is lactic acid or α-hydroxybutyric acid. (Claims 1, 2, 3, 4, and 5) in which the sample to be tested is a body fluid component, and hydrogen peroxide is quantitatively generated by a reaction in a solution. , Section 6, Section 7
The quantitative method according to item 8, item 9, auto-ZlO term, item 11, item 12, or item 13. 15. The π: amount method according to claim 14, wherein hydrogen peroxide produced quantitatively by a reaction in a 091 solution is quantitatively determined by a reaction in the same solution. (16j Claim 15, in which the method of fixing hydrogen peroxide is the per se known hydrogen peroxide fixing force method for measuring oxidizable color development (color development of drugs) by hydrogen peroxide. Quantitative method as described. (The first solution is a solution that contains 11 electron carriers or this 1 and an oxidizable coloring reagent but does not contain beluoxitase, and does not contain beluoxitase or this and an oxidizable coloring reagent.) The enemy, which does not necessarily contain an electron carrier, is used as the second liquid, and the first liquid is first added to the test sample to produce Inogy ＼-1. Then, the second liquid is added to this to produce Inogy ＼-toshi. The quantitative method described in claim 16, which is characterized by coloration (lsl 4iL). The liquid is the first liquid, and contains Beloquincouse or this and an oxidizable coloring reagent, but does not necessarily contain an electron carrier or '7[L
The liquid that does not contain the child transmitter and gold 1/northern ions is the second liquid and 1.
2, first add the first liquid to the test sample and ink
17. The quantitative determination method according to claim 16, wherein the second liquid is added to the ink, and the resulting coloration is characterized by the color development. A reagent for the quantitative determination of reduced coenzymes that acts as an electron carrier on reduced coenzymes to quantitatively produce hydrogen peroxide. (201 A reagent for quantitative determination of reduced coenzyme that allows electron carriers and metal ions to act on reduced coenzyme to quantitatively produce hydrogen peroxide. (21) In the presence of coenzyme, dehydrogenase is added to the substrate. A reagent for quantifying a reduced coenzyme, which quantitatively produces hydrogen reverse oxide, as claimed in claim 19, wherein the reduced coenzyme is reacted with an electron carrier to quantitatively produce reduced coenzyme. (22j In the presence of a coenzyme, a dehydrogenase is made to act on a substrate, and an electron carrier and a metal ion are made to act on a quantitatively produced reduced coenzyme, according to claim 20, A reagent for quantifying reduced coenzyme that quantitatively produces hydrogen peroxide. (23) The reaction itself involves the action of dehydrogenase on a substrate in the presence of a coenzyme to quantitatively produce reduced coenzyme. 21 or 22 of the patent claim, which is a known enzymatic reaction;
ii Reagent for quantifying archetype Sodejimoto. C! 1) Claims 19, 20, and 20, wherein the reduced coenzyme is NADH (reduced nicotinamide [atenine nonnucleotide) or NADPH (reduced nicotinamide ateninononucleotitolic acid). Section 21, No. 2
24. A reagent for quantifying a reduced coenzyme, which quantitatively produces hydrogen peroxide, according to item 2 or 23. C! 5) The electron carrier is phenanonomethosulfate (
PMS), 1-methoxyphena/nomethosulfate (1-methoxyPMS), 9-dimethylaminohenno α-phenanoxonium chloride l-(meltlab-
) or an electron carrier with an effect equivalent to these,
Claims 19, 20, 21, and 22
23 or 24, the constant h;
Retirement reagent for the 70-type enzyme that produces hydrogen chloride. Claims 20 and 2, wherein the (2+++ gold) BS ion is a divalent mankan ion, a divalent cobalt ion, or a metal ion having an action equivalent to these.
A reagent for quantifying a reduced coenzyme, which quantitatively produces hydrogen peroxide, as described in Item 2, 23, 24, or 25. (Reduced type that quantitatively produces hydrogen peroxide according to claim 26, wherein the metal ion having the same effect as a divalent mankane ion or a divalent cobalt ion is a transition metal ion. Reagent for quantitative determination of coenzyme. θ8) The substrate is cholesterol, bile acid, chrycerin, chrycerin-3-phosphate, glucose-6-phosphate, artehyde, for example formaldehyde or acetaltehyde, and the coenzyme is NAD, cotinami-1- atenine nucleotide) or cotinamide atenine dinucleotide nucleotide), and the dehydrogenases that act on the substrate in the presence of complement cysine are cholesterol dehydrogenase and bile acid r+a hydrogenase, respectively. (3α-hydroxysteroid tetrochemase), chrycerin dehydrogenase, glycerin-3-phosphate dehydrogenase, glucose-
Claim 2, which is a 6-phosphate dehydrogenase, an aldehyde dehydrogenase, or a formaldehyde 1-hydrogenase.
Section 1, Section 22, Section 23, Section 24, Section 25, Section 2
A reagent for quantifying a reduced coenzyme, which quantitatively produces hydrogen peroxide, according to item 6 or 27. (29) The dehydrogenase is lactate dehydrogenase (LDH) or α-hydroxybutyrate dehydrogenase (α-HBD), and the coenzyme is NAD (cotinamide atenine nonnucleotide) or NADP (cotinamide). Claim 21, wherein the substrate for producing dehydrogenase in the presence of a coenzyme is lactic acid or α-hydroquinbutyric acid, respectively. A reagent for retirement of a reduced coenzyme, which quantitatively produces hydrogen peroxide, according to item 22, 23, 24, 25, 26, or 27. (3[]) Claims 19, 20, 21, 22, and 22, wherein the test sample contains body fluid components, and hydrogen peroxide is quantitatively produced by reaction in the solution. Section 23,
24. A reagent for quantifying a reduced coenzyme, which quantitatively produces o. (3+) The reagent for quantifying a reduced coenzyme, which quantitatively generates hydrogen peroxide by reaction in a (3+) l solution, according to claim 30. (3->A reagent for quantifying reduced coenzymes, which is used to quantitatively quantify reduced coenzymes by acting on the reduced sleeve enzyme with an electron carrier and quantitatively quantifying the hydrogen peroxide produced. (33) A reagent for quantifying a reduced coenzyme, which quantifies the reduced coenzyme by acting on the reduced B coenzyme with an electron carrier and a metal ion and quantitatively measuring the hydrogen peroxide produced. (34) 33. The reagent for constant B< according to claim 32, wherein a dehydrogenase is allowed to act on a substrate in the presence of an enzyme, and an electron carrier is allowed to act on a reduced coenzyme that is consistently produced. (, 35) The quantitative determination according to claim 33, wherein a dehydrogenase is allowed to act on a substrate in the presence of a coenzyme, and an electron carrier and a metal ion are made to act on the quantitatively produced reduced coenzyme. (36) The reduced coenzyme is NAL) I-1 (reduced nicotine amitoatenin nonnucleotide) or NA I)
P 17I (reduced nicotinoamitoatedinone nucleotide) phosphate)
Quantitative reagent according to item 32, item 34, or item 35. (The 3η electron carrier is phenanonemethosulfate-1・(
PMS), l-methoxy7noenanone methosulfe-1.
(1-me[・kin PMS), 9-phenanoquinonium chloride (nor) ruble-), or an electron carrier having a similar effect to these. Range No. 320 (, Section 33, Section 34
35. The quantitative reagent according to item 35 or 36. (38) The metal ion is a divalent manocane ion or (
is a divalent cobalt ion or a metal ion having an action equivalent to these ions, Claim 33, WJ35
36. The quantitative reagent according to item 36 or 37. (The quantitative reagent according to claim 38, which is a metal ion or transition metal ion having an effect equivalent to a divalent mankanion ion or a divalent cobalt ion. (40) A method for quantifying hydrogen peroxide , which is a per se known method for quantifying hydrogen peroxide, according to claim 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, or 39. Quantitative reagent. (41) Claim 40, wherein the method for quantifying hydrogen peroxide is a known method for quantifying hydrogen peroxide, which measures the coloration of an oxidizable color reagent caused by hydrogen peroxide. (Claim 34, in which the reaction of causing a dehydrogenase to act on a substrate in the presence of a capital enzyme to quantitatively produce a reduced coenzyme is an enzymatic reaction known per se.) , Section 35, Section 36
Section 37, Section 38, Section 39, Section 40 or Section 4
Quantitative reagent according to item 1. (enteric substrates, cholesterol, bile acids, chrycerin, chrycerin-3-phosphate, glucose-6-phosphate, aldehydes such as formaldehyde or acetate), coenzymes include NAD, cotinamide adenine nucleotides) or The dehydrogenases that act on the substrate in the presence of co-WW complexes are cholesterol dehydrogenase and bile acid dehydrogenase (3α-hydroquine dehydrogenase), respectively. Steroid]・Tehi]-Lochenase), chrycerin dehydrogenase, chrycerin-3-phosphate dehydrogenase, crucose-6
- The quantitative reagent according to claim 42, which is phosphate dehydrogenase, artehyde dehydrogenase or formalehyde dehydrogenase. (4. Dehydration) enzyme or milk ridge dehydrogenase (LDI-I)
, or α-hi-1-loki/butyric acid dehydrogenation (α-I-11
3D), and the coenzyme is NAI), cotinamide adenyl/nonnucleotide],) and 1NADP, cotinamide), adenine nonnucleotide 1-phosphate), and in the presence of a resistant element, dehydrogenase acts. 42. The quantitative reagent according to claim 42, wherein the substrates are lactic acid and α-hyroquine butyric acid, respectively. (45) Claims 32, 33, 34, and 35 of the claims 32, 33, 34, and 35 which quantify hydrogen peroxide, which is a component of a body fluid in a test sample and is quantitatively produced by a reaction in a bath fluid. Section, 3rd
Section 6, Section 37, Section 38, Section 39, Section 40, Section 4
1. The quantitative reagent according to Section 42, Section 43, or Section 44. (4(i) The quantitative reagent according to claim 45, which quantitatively determines hydrogen peroxide produced by a reaction in a solution. (47) Peroxide The quantitative reagent according to claim 46, wherein the method for quantifying hydrogen is a per se known method for quantifying hydrogen peroxide, which measures the coloration of an oxidizable coloring reagent caused by hydrogen peroxide. (481 The first solution is a liquid that contains an electron carrier or an oxidizable coloring reagent or does not contain a beluoxitase, and does not necessarily contain an electron carrier or an oxidizable coloring reagent. The claim is characterized by the color development that occurs when the first liquid is first added to the test sample to incubate it, and then the second liquid is added to it and incubated. The quantitative reagent according to item 47. (-+9+ A solution containing an electron carrier and a metal ion or these and an oxidizable coloring reagent but not containing beluoxitase is used as the first liquid. '#1 A liquid that contains the oxidative coloring reagent but does not necessarily contain the electron carrier or electron carrier and metal ions is used as the second liquid, and the first liquid is added to the test sample to ink. 48. The quantitative reagent according to claim 47, wherein a second liquid is added thereto and inked, and the resulting coloration is characterized.