JPS59204200A - ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 - Google Patents
２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体Info
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- JPS59204200A JPS59204200A JP7587883A JP7587883A JPS59204200A JP S59204200 A JPS59204200 A JP S59204200A JP 7587883 A JP7587883 A JP 7587883A JP 7587883 A JP7587883 A JP 7587883A JP S59204200 A JPS59204200 A JP S59204200A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
発明の背ｆ。
技術分野
本発明は、一般に、２，４−ジニトロフェニルヌクレオ
チド誘導体に関する。さらに具体的には。 本発明は、ヌクレオチＦの塩基以外の部分に２゜４−ジ
ニトロベンゼンを結合させてなる２、４−ジ−４０フエ
ニルヌクレオチ）’ ｒＤｊ ４’； 体に閏スル。 本発明は、また、このような２，４−ジニトロフェニル
ヌクレオチＰ誘導体の製造法にも関する。 先行技術 放射性同位元素を使わず、特殊な抗体や酵素によって検
出することができる、ポリあるいはオリゴヌクレオチド
誘導体は、核酸用アフイニテイーゾローブとして興味が
持たれている。 近年、Ｖｉｎｃｅｎｔらによって、２．４−ノニトロフ
ェニル（以下ＤＮＰと略す）基を核酸に結合させた、Ｄ
ＮＡプローブが開発されている（ Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１
ｄｓＩζｅｓ、 、川、６７８７−６７９６ （１９８
２） ）。彼らは、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）の
ＤＮＰ誘導体”７ ＤＮＡ’１に取り込ませ、相補的塩
基配列を持つＤＮＡにハイブリダイズさせたのち、ＤＮ
Ｐに対するウサギ抗血清および・ぐ−オギシダーゼで標
識したウサギ免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）に対するヒ
ツジ抗血清を順次加えて目的ＤＮＡ ’ｆ検出している
。ここで用いたＤＮＡ鎖は、天然から取り出したフラグ
メントである。 しかし、本発明者らの知るところ罠まれヲ」：、このよ
うにして製造されるＤＮＰ−ヌクレオチド誘導体には下
記のような問題点がある。 （イ）ヌクレオチドの塩基部分にＤＮＰを含有すりため
、使用オリゴヌクレオチド固有の融屏温ムＬ（Ｔｍ値）
に変化を生じる。 （ｃｆｆ）任意でかつ定められた塩基配列をもつＤＮＡ
の合成が固持である。 これらの理由によって、現段階でのＤＮＰ−ヌクレオチ
ド誘導体は、その応用範囲が狭く、有用性が限定されて
いるのが現状である。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えること７目的とし、特定
のオリゴデオキシリゼヌクレオチドのヌクレオチド塩基
以外の特定部位に２，４−ジニトロベンゼン乞結合させ
てなるＤＮＰ−ヌクレオチド誘導体によってこの目的ヲ
４成しようとするものである。 従って、本発明によるＤＮＰ−ヌクレオチｌ−′誘層体
は下式［ｖｎ〕で示されるＤＮＰ−オリゴデオキシリゼ
ヌクレオチドであること、を特徴と１−るものである。 また、本発明によるＤＮＰ−ヌクレオチド１透導体の製
造法は、下式［Ｖｌ ］で示されるオリゴヌクレオチド
誘導体の末端アミン基に２，４−ジニトロベンゼンを結
合させて下式〔■〕で示されるＤＮＰ−オリゴデオキシ
リゼヌクレオチドを得ること、ヲ特徴とするものである
。 〔ただし５ｍおよび＋１はそれぞれ０または任意の自然
数であり、Ｒは２価の直鎖または分岐鎖の炭化氷菓ｔＭ
基であり、Ｂはヌクレオチド誘導体１−る塩基である（
Ｂが複数個存在するときは、それらは同一でも異なって
もよい）。〕 効果 本発明者らの合成したＤＮＰ−オリゴデオギシリン」？
ヌクレオチドは％前記核酸用非放射１Ｊ二Ｔ ７ イ＝
テイフロープの短所を回避することができて、下６己の
ような艮Ｈｉヲもつものである。 （イ） ヌクレオチドの塩基部分にＤＮＰを含有しない
ので、融解温度（Ｔｍ値）に変化を生じることがなくて
安定である。 （ロ）いかなる塩基配列をもつＤＮＰ−オリゴヌクレオ
チドも合成可能である。 （ハ） プローブとして短鎖オリゴマーで十分である。 に）合成が非常に簡単でちって大量合成が可能であり、
また長期保存もｐＪｉ止である。 （ホ）プライマー（鋳型合成の隙のＤＮＡ １１９ｒ片
）としても利用できる。 最近、板金らは、鎖長１９の合成オリゴヌクレオチドを
用いてβ−グロビンの遺伝子病の診ＬｌｉＹ行なってお
り（ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ； ８０．２７８−２８２ （１９８３）
、遺伝子中のわずか一つの塩基配列の違いも検出できる
合成オリゴヌクレオチドが各種遺伝予病解析に有用であ
ること乞示している。 彼らは合成オリゴヌクレオチドの放射性ｌｎＪ位元素（
３２Ｐ）を使用したが、代わりに本発明者もが開発した
ＤＮＰ−ヌクレオチド誌導体ビ用いることができれば、
非常に有用なことは明白であろう。 このような長所があるところから、本発明のＤＮＰ−ヌ
クレオチド誘導体の利用方法の拡大も考えられろ。 １−なわち、たとえば、 ＤＮＰ−オリゴヌクレオチ１
：′は、非放射性核酸用アフィニティープローブとしで
、あるいはプライマーとして、利用Ｔ０Ｊ能であること
は前記したところであって、その検出力法は抗体による
沈降、酵累免疫活性測定、螢光性染色体による可視化等
々、多様であり、また本発明のＤＮＩ）−ヌクレオチド
誘導体は放射性プローブＣ３２Ｐ）ｖｃ比べて被曝の危
険、コスト、廃棄物の処理および保存性の点でも有利で
ある。 なお、ＤＮＰ基は、市販のウサギ抗血清（たとえばＭｉ
ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｃｏｃｌｅ Ｎ
ｏ、 ６１−００６−１ ） ”？、た（′；ｌ１、Ｄ
ＮＰに対づ−るモノクローナル抗体によってｂ′易に検
出することができる。 本発明によるＤＮＰヌクレオチー躊体は、前記の式〔■
〕で示されるものである。 式中、記号 Ｂは、２′−デオキシリセックレオ上 シトの３′−および５′−水（：ｒ＊ ４を除いたデオ
キシリゾヌクレオシド残卆を示すのに慣用されているも
のであって、具体的には下記の構造のものである。 置換基Ｂはヌクレオチド馨構成するＩ昇基乞下し。 通常はアデニン、チミン、シトシンまたｆ”Ｌグアニン
である。化合物〔■１〕中にＢがを数ＩＩ／！ｌ存在す
るときは、それらは同一でも異なってもよい。 ｍおよびｎは、それぞれ０またば自公会：独を示す。 本発明ＤＮＰオリゴヌクレオチド誘ハ月本の５ｆ合度が
ｍ−１−ｎで表示されているのは、本発明の好ましい製
造法で重合間がそわ、ぞれＩＩＩおよび口のフラクショ
ンを縮合させていることによΦもので・ある（詳にＩ１
１後記）。その場合のＩｎは実用的に＋４二〇−６，特
に１〜４、ｎは実用的に（工０＼４０．特に０〜ム）、
である。 ４１Ｒは、化合物〔■１〕の核酸部分とＤＮＰ部分とを
連結する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である
。これは、特に炭素数２〜２０程度の直鎖または分岐鎖
のアルキレン基が適当である。好ましいＲは、炭素数２
〜６０アルキレン基である。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔■〕、すなわち本発明によるＤＮＰ−ヌクレオ
チド誘導体、は合目的的な任意の方法によって合成する
ことができる。 一つの好ましい方法は、前記の式〔■〕のオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌクレオチドの
５′〜末端リン酸基に基Ｒ’Ｙ介して一般アミノ基が導
入されたもの、のアミノ基にＤＮＰを結合させることか
らなるものである。 一方、式［Ｖｌ］の化合物は、オリゴヌクレオチドの合
成および生成オリｖ％ヌクレオチＰの５′−水酸基延長
上での一般アミン基の導入からなる方法で合成すること
ができる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は。 下記の意味を持つ（その意義ないし詳細は、後「記した
通りである）。 Ｒ０リン酸基乞保護する置換基であって１通常オルトク
ロロフェニル基が用いられる。 Ｒ１二価の炭化水垢残基である。 Ｒ２５′〜末端水酸基の保護基であって、通常ジメトキ
シトリチル基が用いられる。 Ｒ３他のすべその保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステル乞与えることができる置換基であ
って、通常シアノエチル基が用いられる。 Ｒアζノ基の保護基であって、通常トリフルオロアセチ
ル基が用いられる。 ｑｎより小さい任意の自然数。 ｍ Ｏまたは任意の自然数。 ｎＱおよび任意の自然数。 Ｂ 塩基を示す。 Ｂ′ 保護された塩基を示すが、通常はＲ６−ペンゾイ
ルアデニ／、Ｎ−イソブチリルグアニン、Ｒ６−ベンゾ
イルシトシンおよびチミン（すなわち。 保護不要）より選択される。 一〜■ スペーサーを介した担体であって、通常は下記
のものである。 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、トリエステ
ル法、ホスファイト法およびそれぞれの固相法および液
相法がある。本発明者らは既に同相法によるオリゴヌク
レオチド製造技術を確立しており、化合物［Ｖｌ］の合
成には本発明者らの下記の方法が好ましい。 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９７９，
３６３５（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ ８，５４７３（１９８０）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ８，５４９１（
１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｌｘ ８，５５０７（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒ，ｅｓｅａｒｃｂ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
５ｅｒｉｅｓ７．２８１（１９８０） また、上記で合成したオリザックレオチドリ５′−水酸
基にリン酸基を介して一敵アミノ基を尋人する方法、す
なわち化合物［ＶＪ）の合成法としては。 たとえば本発明者らの特願昭５７−１３８１３６号明細
書記載の方法がある。 化合物［ＶＪ］の合成法をその一実施態様について示せ
ば、下記の通りである。すなわち、第１図に示したよう
に、化合物［１）の保護基Ｒ３Ｙ除去したものと化合物
［］Ｔ］の保踵基Ｒ’＆除去したものとを縮合させ、こ
れらの操作乞くり返づ−ことによって、化合物〔■〕を
合成する。オリゴヌクレオチド化合物〔■〕の合成法は
、上記の通り公知である。 一方、本発明者らの方法（特願昭５７−１３８１３６号
明細書参照）に従って、式〔１ｖ〕の化合物を合成する
。すなわち、化合物［１］のＲ２を除去して５′−水酸
基化合物とし、これにリン酸化１１Ｊ （たとえば、ホ
スホジトリアゾリド、ホスホジクロリｒまたはホスホジ
ペンゾトリアゾリド等）を作用させてリン酸化し、つい
でアミン基が保護、されているアミノアルコール化合物
Ｒ２−Ｎｆ（−Ｒ１−ＯＨ［この化合４勿ハオメｉ −
７ミ／ フルコール（ＮＨ２−Ｒ’−０Ｈ）ノアミノ基
をＲで保護することにより得ることができる〕を縮合さ
せることにより、化合！吻［ＩＶ］を得ることができる
（詳細は該明細書参照）。 この化合物［ＩＶ］の保護基Ｒ３を除去し、化合物〔１
■〕の保護基Ｒ２ｗ除去したものと縮合させて。 化合物［Ｖ］を合成する。縮合は、化合物［１１１］の
合成の際の縮合と本質的には変らない方法で行なうこと
ができる。 このようにして合成された化合物〔ル〕の保詠苓をすべ
て除去すれば、化合物［Ｖｌ］が得られる。保％ 基Ｃ
ｏ−Ａ−■、リン酸トリエステル中のオルト−クロロフ
ェニル基および塩基部分のアシル基は。 ０．５Ｍのテトラメチルグ゛アニジンービリジン−２−
カルゼアルドキシムのジオキサン−水（９：１゜（ｖ／
ｖ））ｉ液で処理後、アルカリ処理（濃アンモニア水）
を行なうことより除去される。Ｒ４がトリフルオロアセ
チル基の場合は、アンモニア処理により充分脱離される
が、オルトニトロフェニルスルフェニル基である場合は
メルカプトエタノール処理が必要である。Ｒとして他の
保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチＰ部分が簀定
な条件で、さらに別の処理？加えることも可能である。 なお、デオキシオリゴリセヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基の種類およびその導
入ないし除去ならびに縮合その他について上記以外の詳
細は核酸の化学合成に関する放置や総説たとえば「ヌク
レオシド・ヌクレオチドの合成」 「丸首１９７７年）
、「核敗有機化学」（化学同人１９７９年）、「核ν」
（朝食書店１９７９年） 、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
、：（４，３１４３（１９７８） 、有合化、ヱ、７
２３ （１９７８）および化学の領域、盃、５６６（１
９７９）等を参照することができる。 化合物〔■〕の合成 りＮＰ−オリビデオキシリゼヌクレオチ）４（化合物〔
■〕）は、上記化合物〔ｖ１〕の５′−末端延長上の一
般アミノ基に２，４−ジニトロベンゼンを結合させるこ
とによって得ることができる。 両者の結合は、２，４−ジニトロベンゼンの１−位と化
合物〔■〕のアミノ基との間のＣ−Ｎ結合の形成を実現
することのできる任意の方法によって行なうことができ
る。 両者の結合は、一般に、前者の誘導体、すなわちＤＮＰ
−Ｘ （Ｘは１−置換基）とアミン基との間の脱Ｈ−
Ｘ縮合によることがふつうである。Ｘと゛しては、ハロ
ゲンが好ましい。Ｘがハロゲンである誘導体、すなわち
Ｉ−ハロゲノ−２，４−ｕニトロベンゼンが好ましいの
は、一般に、オリコヌクレオチｒの塩基部分のアミノ基
とは反応しないで５′−水酸基末端延長上の一般アミノ
基とのみ選択的に反応し、しかも反応操作が簡便だから
である。とりわけ、■−フルオロー２．４−ジニトロベ
ンゼンは市販され容易に入手でき、穂かな反応条件で化
合物［ＶＩ］のアミノ基との反応が進行する。 ■−ハロゲノー２，４−ジニトロベンゼンと化合物［Ｖ
Ｘ］との反応は、両者の均一溶液中（溶媒は、たとえば
含水アルコール）あるいは不拘−済液中（溶媒は、たと
えば水）、ノ・ロゲン化水素捕捉剤（たとえば、炭酸氷
菓ナトリウム、トリエチルアミン、水酸化カリウム等）
の存在下に、【０〜５０℃程度の温度で実施することが
できる。目的生成物は、たとえば抽出によって回収すれ
ばよい。なおりＮＰ化に関しては、適当な総説、たとえ
ば［実験化学講座１．蛋白質の化学ｉＩ、第１１８頁」
（１９７６年（丸首（Ｖ発行）等を参照することができ
る。 実施例 １）フローチャート 第２図のフローチャートに従って、本発明化合物（同図
の化合物０）を製造した。 第２図で、記号は次の意味７持つ。 Ｂ′ ベンゾイル化アデニン Ｂ アデニン ＤＭＴ ｒ ジメトキシトリチル ＲＯオルトクロロフェニル Ｆ２ｔ エチル ＣＦ］ −シアノエチル ｎ ２ Ｌ ２ １２ ２）化合物〔■〕（第２図の■）の合成実験１−１ ノメトキシトリチルアデノシン／・１五１月旨〔■〕（
樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目的化合物
は外観的ＶＣは樹脂そのものと変らないので、樹脂に相
持された当該化合物を以下にｌｉｉいて単ニ樹脂と呼ぶ
ことにする） ３００ｍｇ（０，０３３ｍｍｏｌ）をイ
ソプロノミノール−塩化メチレン（１５： ）ｉ５、Ｖ
／Ｖ）ｉ液１０ ｍ ｌで３回洗浄後、臭化亜鉛の１．
０Ｍのイソプロ・ξノールー塩化メチレン溶ｇ ３ ｒ
ｎｌで５外間ずつ４回反応（脱トリチル化）させて厨脂
〔■〕を得る。耐詣〔■〕をイノプロ・ξノールシー塩
化メチレン溶液１０ｍ１ で３回洗浄し、これにジヌク
レオチド［■］ １５０ｍｇ （０、１ｍｍｏｌ）のピ
リジン溶液を添加後、共沸させて糸乞領水とし、メシチ
レンスルホニルニトロトリアゾリド（以下ＭＳＮＴと記
す） １５０ｍｇ （０，５ｍｍｏｌ ）と無水ピリジ
ン２ｍｌ とを添加して９０分間反応（縮合）させる
。 反応後、ピリジン１０ｍ１ で３回洗浄し、触媒量（約
１０ｍｇ）のジメチルアミノピリジン（以下ＤＭＡＰ）
を含む無水酢酸〜ピリジン（１：９．（Ｖ／Ｖ））溶液
１０ｍ、１７添加し１０分間反尾、させて未反応５′−
水ｒａ基ケアセチル化して保原し、これをピリジンで洗
浄して、化合物〔■’］（ｎ＝２）を得る。 以上のような操作乞６回くり返して、化合物〔■〕（ｎ
＝１２）ケ得る。 一方、 ５’−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕８
００ｍｇＣ帆７１ｍｍｏｆ）とオルトクロロフェニルホ
スホジトリアゾリドと２後者のジオギサン浴液（１，０
ｍｍｏｌ、 ６ｍ１）中で２時間反応させ、−ｔ’ｊｃ
いてトリフルオロアセチル−６−アミンヘキサノール３
００ ｍｇ （１、４ｍ ｍｏｌ ）および１−メチル
−イミダゾール１１５ｍｇ（１，４ｍｍｏｌ ） ｆ加
えてさらに２時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去
し、残液をクロロホルムに溶解した後、水、０．５Ｍリ
ン酸二水素す） ＩＪウム水溶液、飽和炭酸水素す）
ｉＪウム水溶液および５％の塩化ナトリウム水浴液でそ
れぞれ洗浄し、無水硫酸す） リウムで乾燥￥る。 クロロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製（溶
出液として０〜４％のメタノール含有クロロホルムを使
用）シ、溶出液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の化
合物〔■〕を得る。 上記で合成した化合物〔■］（ｎ＝１２） １１５ｍｇ
。 （３，４５μｍｏｆ） を前述と同様の方法で脱トリチ
ル化したもの〔■〕に、化合物〔０３６０ｍｇ （０，
０４ｍｍｏｌ ）をトリエチルアミン−ピリジン−水（
１：３：１、Ｖ／Ｖ）溶液３ｍｌ で処理（脱シアノ
エチル化）した化合物〔■〕を加え、無水にしたのち。 ＭＳＮＴ５０ｍｇ （０、２ｍｍｏｌ ）およびビリジ
７１ ｒｎｌ ’ａ？加え□□□分間反応（縮合）させ
、反応終了後ピリジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥
して、完全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体〔■
〕ビ得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔０３１５ｍｇ Ｙ ｏ、！
５ Ｍテトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルゼ
アルドギシメイトのジオキサン−水（９：１゜ＣＶ／Ｖ
）溶液２００μｍを加え、遠沈管中、室温で胴時間反応
させる。反応後、濃アンモニア水（２，５ｍ１）を加え
て密閉し、５０℃で一枢反応させる。反応終了後、Ｐフ
のし、流液を濃縮後、水に居解させてからエーテルで抽
出を行なう。水層を濃縮後。 セファデック、ｘ、 Ｇ −５０（φ］ 、５ Ｘ １
２０ ｃｍ、 ＠出液は０．０５Ｍの重炭俊トリエチル
アンモニウム緩衝液ｐＨ７，５）で脱塩精製しペンタデ
カアデニル酸誘縛体〔Ｑ′３を得た。 また同様の方法で実験１−２．１−３および１−４のよ
うなオリゴヌクレオチド鋳心体を得た。 以上で合成した化合物ｆ；ｒ：第１表に示す。 第１表 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグア
ニン、Ｃはシトシンを示す。 これら４種の化合物の高速液体クロマトグラフィーの結
果を第３図に示す。Ａ〜Ｄは、それぞれ実験１．−１〜
１−４の化合物についての図である。 ３）２．４−ジニトロフェニル−ペンタデカアデニル酸
チド誘導体に関する。さらに具体的には。 本発明は、ヌクレオチＦの塩基以外の部分に２゜４−ジ
ニトロベンゼンを結合させてなる２、４−ジ−４０フエ
ニルヌクレオチ）’ ｒＤｊ ４’； 体に閏スル。 本発明は、また、このような２，４−ジニトロフェニル
ヌクレオチＰ誘導体の製造法にも関する。 先行技術 放射性同位元素を使わず、特殊な抗体や酵素によって検
出することができる、ポリあるいはオリゴヌクレオチド
誘導体は、核酸用アフイニテイーゾローブとして興味が
持たれている。 近年、Ｖｉｎｃｅｎｔらによって、２．４−ノニトロフ
ェニル（以下ＤＮＰと略す）基を核酸に結合させた、Ｄ
ＮＡプローブが開発されている（ Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１
ｄｓＩζｅｓ、 、川、６７８７−６７９６ （１９８
２） ）。彼らは、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）の
ＤＮＰ誘導体”７ ＤＮＡ’１に取り込ませ、相補的塩
基配列を持つＤＮＡにハイブリダイズさせたのち、ＤＮ
Ｐに対するウサギ抗血清および・ぐ−オギシダーゼで標
識したウサギ免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）に対するヒ
ツジ抗血清を順次加えて目的ＤＮＡ ’ｆ検出している
。ここで用いたＤＮＡ鎖は、天然から取り出したフラグ
メントである。 しかし、本発明者らの知るところ罠まれヲ」：、このよ
うにして製造されるＤＮＰ−ヌクレオチド誘導体には下
記のような問題点がある。 （イ）ヌクレオチドの塩基部分にＤＮＰを含有すりため
、使用オリゴヌクレオチド固有の融屏温ムＬ（Ｔｍ値）
に変化を生じる。 （ｃｆｆ）任意でかつ定められた塩基配列をもつＤＮＡ
の合成が固持である。 これらの理由によって、現段階でのＤＮＰ−ヌクレオチ
ド誘導体は、その応用範囲が狭く、有用性が限定されて
いるのが現状である。 発明の概要 要旨 本発明は上記の点に解決を与えること７目的とし、特定
のオリゴデオキシリゼヌクレオチドのヌクレオチド塩基
以外の特定部位に２，４−ジニトロベンゼン乞結合させ
てなるＤＮＰ−ヌクレオチド誘導体によってこの目的ヲ
４成しようとするものである。 従って、本発明によるＤＮＰ−ヌクレオチｌ−′誘層体
は下式［ｖｎ〕で示されるＤＮＰ−オリゴデオキシリゼ
ヌクレオチドであること、を特徴と１−るものである。 また、本発明によるＤＮＰ−ヌクレオチド１透導体の製
造法は、下式［Ｖｌ ］で示されるオリゴヌクレオチド
誘導体の末端アミン基に２，４−ジニトロベンゼンを結
合させて下式〔■〕で示されるＤＮＰ−オリゴデオキシ
リゼヌクレオチドを得ること、ヲ特徴とするものである
。 〔ただし５ｍおよび＋１はそれぞれ０または任意の自然
数であり、Ｒは２価の直鎖または分岐鎖の炭化氷菓ｔＭ
基であり、Ｂはヌクレオチド誘導体１−る塩基である（
Ｂが複数個存在するときは、それらは同一でも異なって
もよい）。〕 効果 本発明者らの合成したＤＮＰ−オリゴデオギシリン」？
ヌクレオチドは％前記核酸用非放射１Ｊ二Ｔ ７ イ＝
テイフロープの短所を回避することができて、下６己の
ような艮Ｈｉヲもつものである。 （イ） ヌクレオチドの塩基部分にＤＮＰを含有しない
ので、融解温度（Ｔｍ値）に変化を生じることがなくて
安定である。 （ロ）いかなる塩基配列をもつＤＮＰ−オリゴヌクレオ
チドも合成可能である。 （ハ） プローブとして短鎖オリゴマーで十分である。 に）合成が非常に簡単でちって大量合成が可能であり、
また長期保存もｐＪｉ止である。 （ホ）プライマー（鋳型合成の隙のＤＮＡ １１９ｒ片
）としても利用できる。 最近、板金らは、鎖長１９の合成オリゴヌクレオチドを
用いてβ−グロビンの遺伝子病の診ＬｌｉＹ行なってお
り（ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ 、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ ； ８０．２７８−２８２ （１９８３）
、遺伝子中のわずか一つの塩基配列の違いも検出できる
合成オリゴヌクレオチドが各種遺伝予病解析に有用であ
ること乞示している。 彼らは合成オリゴヌクレオチドの放射性ｌｎＪ位元素（
３２Ｐ）を使用したが、代わりに本発明者もが開発した
ＤＮＰ−ヌクレオチド誌導体ビ用いることができれば、
非常に有用なことは明白であろう。 このような長所があるところから、本発明のＤＮＰ−ヌ
クレオチド誘導体の利用方法の拡大も考えられろ。 １−なわち、たとえば、 ＤＮＰ−オリゴヌクレオチ１
：′は、非放射性核酸用アフィニティープローブとしで
、あるいはプライマーとして、利用Ｔ０Ｊ能であること
は前記したところであって、その検出力法は抗体による
沈降、酵累免疫活性測定、螢光性染色体による可視化等
々、多様であり、また本発明のＤＮＩ）−ヌクレオチド
誘導体は放射性プローブＣ３２Ｐ）ｖｃ比べて被曝の危
険、コスト、廃棄物の処理および保存性の点でも有利で
ある。 なお、ＤＮＰ基は、市販のウサギ抗血清（たとえばＭｉ
ｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｃｏｃｌｅ Ｎ
ｏ、 ６１−００６−１ ） ”？、た（′；ｌ１、Ｄ
ＮＰに対づ−るモノクローナル抗体によってｂ′易に検
出することができる。 本発明によるＤＮＰヌクレオチー躊体は、前記の式〔■
〕で示されるものである。 式中、記号 Ｂは、２′−デオキシリセックレオ上 シトの３′−および５′−水（：ｒ＊ ４を除いたデオ
キシリゾヌクレオシド残卆を示すのに慣用されているも
のであって、具体的には下記の構造のものである。 置換基Ｂはヌクレオチド馨構成するＩ昇基乞下し。 通常はアデニン、チミン、シトシンまたｆ”Ｌグアニン
である。化合物〔■１〕中にＢがを数ＩＩ／！ｌ存在す
るときは、それらは同一でも異なってもよい。 ｍおよびｎは、それぞれ０またば自公会：独を示す。 本発明ＤＮＰオリゴヌクレオチド誘ハ月本の５ｆ合度が
ｍ−１−ｎで表示されているのは、本発明の好ましい製
造法で重合間がそわ、ぞれＩＩＩおよび口のフラクショ
ンを縮合させていることによΦもので・ある（詳にＩ１
１後記）。その場合のＩｎは実用的に＋４二〇−６，特
に１〜４、ｎは実用的に（工０＼４０．特に０〜ム）、
である。 ４１Ｒは、化合物〔■１〕の核酸部分とＤＮＰ部分とを
連結する二価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基である
。これは、特に炭素数２〜２０程度の直鎖または分岐鎖
のアルキレン基が適当である。好ましいＲは、炭素数２
〜６０アルキレン基である。 化合物〔■〕の合成 一般的説明 化合物〔■〕、すなわち本発明によるＤＮＰ−ヌクレオ
チド誘導体、は合目的的な任意の方法によって合成する
ことができる。 一つの好ましい方法は、前記の式〔■〕のオリゴヌクレ
オチド誘導体、すなわちオリゴデオキシヌクレオチドの
５′〜末端リン酸基に基Ｒ’Ｙ介して一般アミノ基が導
入されたもの、のアミノ基にＤＮＰを結合させることか
らなるものである。 一方、式［Ｖｌ］の化合物は、オリゴヌクレオチドの合
成および生成オリｖ％ヌクレオチＰの５′−水酸基延長
上での一般アミン基の導入からなる方法で合成すること
ができる。 第１図は、この好ましい合成法の一例を示すフローチャ
ートである。フローチャート中の記号は。 下記の意味を持つ（その意義ないし詳細は、後「記した
通りである）。 Ｒ０リン酸基乞保護する置換基であって１通常オルトク
ロロフェニル基が用いられる。 Ｒ１二価の炭化水垢残基である。 Ｒ２５′〜末端水酸基の保護基であって、通常ジメトキ
シトリチル基が用いられる。 Ｒ３他のすべその保護基が安定な条件で容易に脱離され
て、リン酸ジエステル乞与えることができる置換基であ
って、通常シアノエチル基が用いられる。 Ｒアζノ基の保護基であって、通常トリフルオロアセチ
ル基が用いられる。 ｑｎより小さい任意の自然数。 ｍ Ｏまたは任意の自然数。 ｎＱおよび任意の自然数。 Ｂ 塩基を示す。 Ｂ′ 保護された塩基を示すが、通常はＲ６−ペンゾイ
ルアデニ／、Ｎ−イソブチリルグアニン、Ｒ６−ベンゾ
イルシトシンおよびチミン（すなわち。 保護不要）より選択される。 一〜■ スペーサーを介した担体であって、通常は下記
のものである。 一般にオリゴヌクレオチド合成法としては、トリエステ
ル法、ホスファイト法およびそれぞれの固相法および液
相法がある。本発明者らは既に同相法によるオリゴヌク
レオチド製造技術を確立しており、化合物［Ｖｌ］の合
成には本発明者らの下記の方法が好ましい。 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９７９，
３６３５（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ ８，５４７３（１９８０）Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ８，５４９１（
１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒ
ｃｌｘ ８，５５０７（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃ１ｄｓ Ｒ，ｅｓｅａｒｃｂ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
５ｅｒｉｅｓ７．２８１（１９８０） また、上記で合成したオリザックレオチドリ５′−水酸
基にリン酸基を介して一敵アミノ基を尋人する方法、す
なわち化合物［ＶＪ）の合成法としては。 たとえば本発明者らの特願昭５７−１３８１３６号明細
書記載の方法がある。 化合物［ＶＪ］の合成法をその一実施態様について示せ
ば、下記の通りである。すなわち、第１図に示したよう
に、化合物［１）の保護基Ｒ３Ｙ除去したものと化合物
［］Ｔ］の保踵基Ｒ’＆除去したものとを縮合させ、こ
れらの操作乞くり返づ−ことによって、化合物〔■〕を
合成する。オリゴヌクレオチド化合物〔■〕の合成法は
、上記の通り公知である。 一方、本発明者らの方法（特願昭５７−１３８１３６号
明細書参照）に従って、式〔１ｖ〕の化合物を合成する
。すなわち、化合物［１］のＲ２を除去して５′−水酸
基化合物とし、これにリン酸化１１Ｊ （たとえば、ホ
スホジトリアゾリド、ホスホジクロリｒまたはホスホジ
ペンゾトリアゾリド等）を作用させてリン酸化し、つい
でアミン基が保護、されているアミノアルコール化合物
Ｒ２−Ｎｆ（−Ｒ１−ＯＨ［この化合４勿ハオメｉ −
７ミ／ フルコール（ＮＨ２−Ｒ’−０Ｈ）ノアミノ基
をＲで保護することにより得ることができる〕を縮合さ
せることにより、化合！吻［ＩＶ］を得ることができる
（詳細は該明細書参照）。 この化合物［ＩＶ］の保護基Ｒ３を除去し、化合物〔１
■〕の保護基Ｒ２ｗ除去したものと縮合させて。 化合物［Ｖ］を合成する。縮合は、化合物［１１１］の
合成の際の縮合と本質的には変らない方法で行なうこと
ができる。 このようにして合成された化合物〔ル〕の保詠苓をすべ
て除去すれば、化合物［Ｖｌ］が得られる。保％ 基Ｃ
ｏ−Ａ−■、リン酸トリエステル中のオルト−クロロフ
ェニル基および塩基部分のアシル基は。 ０．５Ｍのテトラメチルグ゛アニジンービリジン−２−
カルゼアルドキシムのジオキサン−水（９：１゜（ｖ／
ｖ））ｉ液で処理後、アルカリ処理（濃アンモニア水）
を行なうことより除去される。Ｒ４がトリフルオロアセ
チル基の場合は、アンモニア処理により充分脱離される
が、オルトニトロフェニルスルフェニル基である場合は
メルカプトエタノール処理が必要である。Ｒとして他の
保護基を用いた場合は、オリゴヌクレオチＰ部分が簀定
な条件で、さらに別の処理？加えることも可能である。 なお、デオキシオリゴリセヌクレオチドの合成法は既に
各種のものが公知であって、保護基の種類およびその導
入ないし除去ならびに縮合その他について上記以外の詳
細は核酸の化学合成に関する放置や総説たとえば「ヌク
レオシド・ヌクレオチドの合成」 「丸首１９７７年）
、「核敗有機化学」（化学同人１９７９年）、「核ν」
（朝食書店１９７９年） 、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
、：（４，３１４３（１９７８） 、有合化、ヱ、７
２３ （１９７８）および化学の領域、盃、５６６（１
９７９）等を参照することができる。 化合物〔■〕の合成 りＮＰ−オリビデオキシリゼヌクレオチ）４（化合物〔
■〕）は、上記化合物〔ｖ１〕の５′−末端延長上の一
般アミノ基に２，４−ジニトロベンゼンを結合させるこ
とによって得ることができる。 両者の結合は、２，４−ジニトロベンゼンの１−位と化
合物〔■〕のアミノ基との間のＣ−Ｎ結合の形成を実現
することのできる任意の方法によって行なうことができ
る。 両者の結合は、一般に、前者の誘導体、すなわちＤＮＰ
−Ｘ （Ｘは１−置換基）とアミン基との間の脱Ｈ−
Ｘ縮合によることがふつうである。Ｘと゛しては、ハロ
ゲンが好ましい。Ｘがハロゲンである誘導体、すなわち
Ｉ−ハロゲノ−２，４−ｕニトロベンゼンが好ましいの
は、一般に、オリコヌクレオチｒの塩基部分のアミノ基
とは反応しないで５′−水酸基末端延長上の一般アミノ
基とのみ選択的に反応し、しかも反応操作が簡便だから
である。とりわけ、■−フルオロー２．４−ジニトロベ
ンゼンは市販され容易に入手でき、穂かな反応条件で化
合物［ＶＩ］のアミノ基との反応が進行する。 ■−ハロゲノー２，４−ジニトロベンゼンと化合物［Ｖ
Ｘ］との反応は、両者の均一溶液中（溶媒は、たとえば
含水アルコール）あるいは不拘−済液中（溶媒は、たと
えば水）、ノ・ロゲン化水素捕捉剤（たとえば、炭酸氷
菓ナトリウム、トリエチルアミン、水酸化カリウム等）
の存在下に、【０〜５０℃程度の温度で実施することが
できる。目的生成物は、たとえば抽出によって回収すれ
ばよい。なおりＮＰ化に関しては、適当な総説、たとえ
ば［実験化学講座１．蛋白質の化学ｉＩ、第１１８頁」
（１９７６年（丸首（Ｖ発行）等を参照することができ
る。 実施例 １）フローチャート 第２図のフローチャートに従って、本発明化合物（同図
の化合物０）を製造した。 第２図で、記号は次の意味７持つ。 Ｂ′ ベンゾイル化アデニン Ｂ アデニン ＤＭＴ ｒ ジメトキシトリチル ＲＯオルトクロロフェニル Ｆ２ｔ エチル ＣＦ］ −シアノエチル ｎ ２ Ｌ ２ １２ ２）化合物〔■〕（第２図の■）の合成実験１−１ ノメトキシトリチルアデノシン／・１五１月旨〔■〕（
樹脂は担体に過ぎないが、樹脂に担持された目的化合物
は外観的ＶＣは樹脂そのものと変らないので、樹脂に相
持された当該化合物を以下にｌｉｉいて単ニ樹脂と呼ぶ
ことにする） ３００ｍｇ（０，０３３ｍｍｏｌ）をイ
ソプロノミノール−塩化メチレン（１５： ）ｉ５、Ｖ
／Ｖ）ｉ液１０ ｍ ｌで３回洗浄後、臭化亜鉛の１．
０Ｍのイソプロ・ξノールー塩化メチレン溶ｇ ３ ｒ
ｎｌで５外間ずつ４回反応（脱トリチル化）させて厨脂
〔■〕を得る。耐詣〔■〕をイノプロ・ξノールシー塩
化メチレン溶液１０ｍ１ で３回洗浄し、これにジヌク
レオチド［■］ １５０ｍｇ （０、１ｍｍｏｌ）のピ
リジン溶液を添加後、共沸させて糸乞領水とし、メシチ
レンスルホニルニトロトリアゾリド（以下ＭＳＮＴと記
す） １５０ｍｇ （０，５ｍｍｏｌ ）と無水ピリジ
ン２ｍｌ とを添加して９０分間反応（縮合）させる
。 反応後、ピリジン１０ｍ１ で３回洗浄し、触媒量（約
１０ｍｇ）のジメチルアミノピリジン（以下ＤＭＡＰ）
を含む無水酢酸〜ピリジン（１：９．（Ｖ／Ｖ））溶液
１０ｍ、１７添加し１０分間反尾、させて未反応５′−
水ｒａ基ケアセチル化して保原し、これをピリジンで洗
浄して、化合物〔■’］（ｎ＝２）を得る。 以上のような操作乞６回くり返して、化合物〔■〕（ｎ
＝１２）ケ得る。 一方、 ５’−ヒドロキシ−ジヌクレオチド〔■〕８
００ｍｇＣ帆７１ｍｍｏｆ）とオルトクロロフェニルホ
スホジトリアゾリドと２後者のジオギサン浴液（１，０
ｍｍｏｌ、 ６ｍ１）中で２時間反応させ、−ｔ’ｊｃ
いてトリフルオロアセチル−６−アミンヘキサノール３
００ ｍｇ （１、４ｍ ｍｏｌ ）および１−メチル
−イミダゾール１１５ｍｇ（１，４ｍｍｏｌ ） ｆ加
えてさらに２時間反応させる。反応終了後、溶媒を留去
し、残液をクロロホルムに溶解した後、水、０．５Ｍリ
ン酸二水素す） ＩＪウム水溶液、飽和炭酸水素す）
ｉＪウム水溶液および５％の塩化ナトリウム水浴液でそ
れぞれ洗浄し、無水硫酸す） リウムで乾燥￥る。 クロロホルム層を濃縮後、シリカゲルカラムで精製（溶
出液として０〜４％のメタノール含有クロロホルムを使
用）シ、溶出液を濃縮後ペンタン中に滴下し粉末状の化
合物〔■〕を得る。 上記で合成した化合物〔■］（ｎ＝１２） １１５ｍｇ
。 （３，４５μｍｏｆ） を前述と同様の方法で脱トリチ
ル化したもの〔■〕に、化合物〔０３６０ｍｇ （０，
０４ｍｍｏｌ ）をトリエチルアミン−ピリジン−水（
１：３：１、Ｖ／Ｖ）溶液３ｍｌ で処理（脱シアノ
エチル化）した化合物〔■〕を加え、無水にしたのち。 ＭＳＮＴ５０ｍｇ （０、２ｍｍｏｌ ）およびビリジ
７１ ｒｎｌ ’ａ？加え□□□分間反応（縮合）させ
、反応終了後ピリジンおよびメタノールで洗浄し、乾燥
して、完全に保護されたオリゴヌクレオチド誘導体〔■
〕ビ得る。 オリゴヌクレオチド誘導体〔０３１５ｍｇ Ｙ ｏ、！
５ Ｍテトラメチルグアニジン−ピリジン−２−カルゼ
アルドギシメイトのジオキサン−水（９：１゜ＣＶ／Ｖ
）溶液２００μｍを加え、遠沈管中、室温で胴時間反応
させる。反応後、濃アンモニア水（２，５ｍ１）を加え
て密閉し、５０℃で一枢反応させる。反応終了後、Ｐフ
のし、流液を濃縮後、水に居解させてからエーテルで抽
出を行なう。水層を濃縮後。 セファデック、ｘ、 Ｇ −５０（φ］ 、５ Ｘ １
２０ ｃｍ、 ＠出液は０．０５Ｍの重炭俊トリエチル
アンモニウム緩衝液ｐＨ７，５）で脱塩精製しペンタデ
カアデニル酸誘縛体〔Ｑ′３を得た。 また同様の方法で実験１−２．１−３および１−４のよ
うなオリゴヌクレオチド鋳心体を得た。 以上で合成した化合物ｆ；ｒ：第１表に示す。 第１表 ただし、この表でＡはアデニン、Ｔはチミン、Ｇはグア
ニン、Ｃはシトシンを示す。 これら４種の化合物の高速液体クロマトグラフィーの結
果を第３図に示す。Ａ〜Ｄは、それぞれ実験１．−１〜
１−４の化合物についての図である。 ３）２．４−ジニトロフェニル−ペンタデカアデニル酸
〔０〕の製造
実験２−１
上記実験１−１で合成したペンタデカアデニル酸誘導体
〔■〕約１．ＯＯＤを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶
液（ｐＨ８，３）１０μｌｖｃ溶解し、ｌ−フルオロ−
２，４−ジニトロベンゼンのエタノール浴液（５０ｍｇ
／ｍｌ ） ５μｌ （大過剰）ヲ加えて３７℃で２時
間反応させた後、水加μｌ を加えエーテル１５０μｌ
で４回抽出を行ない、２，４−ジニトロフェニル−ペ
ンタデカアデニル酸［Ｑ］ｗ得る。反応の確認は、高速
液体クロマトグラフィーにより行なった。 またその際、反応性の比較のため上記で合成しタオリゴ
ヌクレオチド［■〕な脱係１うｏして得た５′−水酸基
をもつ化＠物［ＩＱ］も同様に１−フルオロ−２，４−
ジニトロベンゼンと反応サセル。 上記実Ｂ１−２．１−３および１−４で合成した化合物
し■〕についても実戯２−１と同様な操作を行なって各
々について化合物し０〕乞製造する。 また、反応の比較のため５′−水酸基をもつ化合物〔◎
〕をも製造し、化合物〔◎〕と１−フルオロ−２，４−
ジニトロ−ベンゼンとを谷々反比、させる。このときの
実験す谷々実１Ｑ２−２．２−３および２−４とした。 実験２で製造した化合物ｆ？ｒ：第２表に示す。 ただし、この表でＡｌ’ｌアデニン、Ｔはチミン％Ｇは
グアニン、Ｃはシトシンを示す。 以上の結果を第４図（高速液体クロマトグラフィーの結
果）に示す。 第４図は高速液体クロマトグラフィーの浴出・ξターン
を示すものである。図中、■は倒れも反応前の化合物そ
のもの、２は何れも化合物と１−フルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼンとを反応させたもの、のクロマトグラム
である。イは実験２−１で式〔◎〕である化合物、口は
実Ｊｉｌ−１で式［ｅ）である化合物、ハは実験２−２
で式〔◎〕である化合物、二は実験１−２で式〔■〕で
ある化合物、ホは実験２−３で式〔◎〕である化合物、
へは実験１−３で式［ｅ〕である化合物、トは実験２−
４で式〔◎〕である化合物、チは実験１−４で式〔［株
］〕である化合物について上記のような操作を行なった
際のクロマトグラムを示す。なおピーク上の数値は保持
時間を示す。 これらの結果からみれば、式◎で示される５′−水酸基
乞もつ化合物（第４図のイーエ、）１−１１ホー１．お
よびトー１）は１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼ
ンと反応していないことがわかる（第４図イー２．）・
−２，ホー２、およびトー２）。 それに対してオリゴヌ、クレオチＰ誘樽体〔Ｑ〕は１−
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンと反応させると、
高速液体クロマトグラフィーの溶出・ξターンに変化が
生じ、て、原料のピーク（第４図ロー１、ニー１、へ−
１およびチー１）はなくなっており、１−フルオロ−２
，４−ジニトロベンゼンと反応して新しい化合物（第４
図ロー２、ニー２．へ−２およびチー２）ができて（・
ることかわかる。 すなわち、−級アミノ基を有する化合物〔■〕は１−フ
ルオロ−２，４−ジニトロベンセ゛ント選択的に反応し
、５′−水酸基をもつ化合物［Ｑ］とは全く反応しない
ことがわかる。 なお、第４図の保持時間５分程度で各々溶出されるピー
クは、２，４−ジ丁゛トロフェノールと考えられる。 上記において、高速液体クロマトグラフィーは日本分光
ＨＰＬＣＳｙｓｔｅｍ Ｔｒｉ−Ｒｏｔｅｒｌｍ ？：
用い、次の条件により測定を行なった。 カラム ： ｔｔ −Ｂｏｎｄａｐａｋ ０１８ （Ｗ
ａｔｅｒｓ ）流速：２ｍｌ／分 耐出液 ニアセトニトリルを含む、２０ｍＭ−ＴＥＡＡ
緩衝液（ＰＨ７，２） 濃度勾配ニアセトニ） ＩＪルの饋度６〜１４％／１６
分（１６分以後は１４％を続ける）
〔■〕約１．ＯＯＤを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶
液（ｐＨ８，３）１０μｌｖｃ溶解し、ｌ−フルオロ−
２，４−ジニトロベンゼンのエタノール浴液（５０ｍｇ
／ｍｌ ） ５μｌ （大過剰）ヲ加えて３７℃で２時
間反応させた後、水加μｌ を加えエーテル１５０μｌ
で４回抽出を行ない、２，４−ジニトロフェニル−ペ
ンタデカアデニル酸［Ｑ］ｗ得る。反応の確認は、高速
液体クロマトグラフィーにより行なった。 またその際、反応性の比較のため上記で合成しタオリゴ
ヌクレオチド［■〕な脱係１うｏして得た５′−水酸基
をもつ化＠物［ＩＱ］も同様に１−フルオロ−２，４−
ジニトロベンゼンと反応サセル。 上記実Ｂ１−２．１−３および１−４で合成した化合物
し■〕についても実戯２−１と同様な操作を行なって各
々について化合物し０〕乞製造する。 また、反応の比較のため５′−水酸基をもつ化合物〔◎
〕をも製造し、化合物〔◎〕と１−フルオロ−２，４−
ジニトロ−ベンゼンとを谷々反比、させる。このときの
実験す谷々実１Ｑ２−２．２−３および２−４とした。 実験２で製造した化合物ｆ？ｒ：第２表に示す。 ただし、この表でＡｌ’ｌアデニン、Ｔはチミン％Ｇは
グアニン、Ｃはシトシンを示す。 以上の結果を第４図（高速液体クロマトグラフィーの結
果）に示す。 第４図は高速液体クロマトグラフィーの浴出・ξターン
を示すものである。図中、■は倒れも反応前の化合物そ
のもの、２は何れも化合物と１−フルオロ−２，４−ジ
ニトロベンゼンとを反応させたもの、のクロマトグラム
である。イは実験２−１で式〔◎〕である化合物、口は
実Ｊｉｌ−１で式［ｅ）である化合物、ハは実験２−２
で式〔◎〕である化合物、二は実験１−２で式〔■〕で
ある化合物、ホは実験２−３で式〔◎〕である化合物、
へは実験１−３で式［ｅ〕である化合物、トは実験２−
４で式〔◎〕である化合物、チは実験１−４で式〔［株
］〕である化合物について上記のような操作を行なった
際のクロマトグラムを示す。なおピーク上の数値は保持
時間を示す。 これらの結果からみれば、式◎で示される５′−水酸基
乞もつ化合物（第４図のイーエ、）１−１１ホー１．お
よびトー１）は１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼ
ンと反応していないことがわかる（第４図イー２．）・
−２，ホー２、およびトー２）。 それに対してオリゴヌ、クレオチＰ誘樽体〔Ｑ〕は１−
フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンと反応させると、
高速液体クロマトグラフィーの溶出・ξターンに変化が
生じ、て、原料のピーク（第４図ロー１、ニー１、へ−
１およびチー１）はなくなっており、１−フルオロ−２
，４−ジニトロベンゼンと反応して新しい化合物（第４
図ロー２、ニー２．へ−２およびチー２）ができて（・
ることかわかる。 すなわち、−級アミノ基を有する化合物〔■〕は１−フ
ルオロ−２，４−ジニトロベンセ゛ント選択的に反応し
、５′−水酸基をもつ化合物［Ｑ］とは全く反応しない
ことがわかる。 なお、第４図の保持時間５分程度で各々溶出されるピー
クは、２，４−ジ丁゛トロフェノールと考えられる。 上記において、高速液体クロマトグラフィーは日本分光
ＨＰＬＣＳｙｓｔｅｍ Ｔｒｉ−Ｒｏｔｅｒｌｍ ？：
用い、次の条件により測定を行なった。 カラム ： ｔｔ −Ｂｏｎｄａｐａｋ ０１８ （Ｗ
ａｔｅｒｓ ）流速：２ｍｌ／分 耐出液 ニアセトニトリルを含む、２０ｍＭ−ＴＥＡＡ
緩衝液（ＰＨ７，２） 濃度勾配ニアセトニ） ＩＪルの饋度６〜１４％／１６
分（１６分以後は１４％を続ける）
第１図は、本発明の化合物を合成する方法の一例を示す
フローチャートである。 第２図は、実験例で示した本発明化合物の製造法のフロ
ーチャートである。 第３図Ａ〜Ｄは、実験例で示した化合物［ＶＩ］の高速
液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。 第４図は、高速液体クロマトグラフィーの溶出、Ｒター
ンを示す図である。 第１ 図 第 ２図
フローチャートである。 第２図は、実験例で示した本発明化合物の製造法のフロ
ーチャートである。 第３図Ａ〜Ｄは、実験例で示した化合物［ＶＩ］の高速
液体クロマトグラフィーの結果を示す図である。 第４図は、高速液体クロマトグラフィーの溶出、Ｒター
ンを示す図である。 第１ 図 第 ２図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、下式〔■〕で示される２、４−ジニトロフェニルー
オリビデオキシリゼヌクレオチドであることを特徴とす
る、２，４−ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体。 〔■〕 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれＯまたは任意の自然数
であり、Ｒ１は２価の直鎖または分岐鎖の炭化水素残基
であり、Ｂはヌクレオチドを構成する塩基である（Ｂが
複数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよ
い）。〕２、塩基Ｂがアデニン、チミン、シトシンおよ
びグアニンからなる群より選ばれた°ものである、特許
請求の範囲第１項記載の２，４−ジニトロフェニルヌク
レオチド誘導体。 ３、Ｒ１が炭素数２〜２０の直鎖または分岐鎖のアルキ
レン基である、特許請求の範囲第１項または第２項記載
の２，４−ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体。 ４ｍがＯまたは６までの自然数、ｎがＯまたは４０まで
の自然数である、特許請求の範囲第１〜３項のいずれか
一項に記載の２．４−ジニトロフェニルヌクレオチド誘
導体。 ５、下式（ｖｉ）で示されるオリザヌクレオチド誘導体
の末端アミノ基に２，４−ジニトロベンゼンを結合させ
て下式〔■〕で示される２、４−ジニトロフェニルーオ
リゴデオキシリゼヌクオチ１？を得ることを特徴とする
。２，４−ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体の製造
法。 〔■〕 〔ただし、ｍおよびｎはそれぞれＯまたは任意の自然数
であり、Ｒは２価の＠鎖または分岐鎖の炭化氷菓残基で
あり、ＢはヌクレオチＰを措成する塩基である（Ｂが複
数個存在するときは、それらは同一でも異なってもよい
）。〕６、アミン基と２，４−ジニトロベンゼンとの結
合を、アミン基と１−ハロゲノ−２，４−ジニトロベン
ゼンとの脱ハロゲン化氷菓反応にヨッて行なわせる、特
許請求の範囲第５項記載の２．４−ジニトロフェニルヌ
クレオチＹｍａ体の製造法。 ７、 １−ハロ）ｌ／−２，４−ジニトロベンゼンが１
−フルオロ−２，４−ジニトロペンぜンテする、特許請
求の範囲第６項記載の２，４−ジニトロフェニルヌクレ
オチド誘導体の製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7587883A JPS59204200A (ja) | 1983-04-28 | 1983-04-28 | ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
| US06/578,678 US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1984-02-09 | Oligonucleotide derivatives |
| EP84101392A EP0119448B1 (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
| CA000447146A CA1212914A (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
| DE8484101392T DE3463384D1 (en) | 1983-02-14 | 1984-02-10 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
| US06/855,710 US4849336A (en) | 1983-02-14 | 1986-04-25 | Oligonucleotide derivatives and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7587883A JPS59204200A (ja) | 1983-04-28 | 1983-04-28 | ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59204200A true JPS59204200A (ja) | 1984-11-19 |
| JPH0435480B2 JPH0435480B2 (ja) | 1992-06-11 |
Family
ID=13588975
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7587883A Granted JPS59204200A (ja) | 1983-02-14 | 1983-04-28 | ２，４―ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59204200A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03500773A (ja) * | 1987-10-28 | 1991-02-21 | ハワード・フローレイ・インスティテュト・オブ・イクスペリメンタル・フィジオロジー・アンド・メディシン | オリゴヌクレオチド‐ポリアミド コンジュゲート |
| WO2010061922A1 (ja) | 2008-11-27 | 2010-06-03 | 独立行政法人理化学研究所 | 新規ＭｕｔＳタンパク質およびそれを用いた変異の判定方法 |
| WO2010113452A1 (ja) | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 凸版印刷株式会社 | 遺伝子型の識別方法 |
| WO2011122501A1 (ja) | 2010-03-29 | 2011-10-06 | 凸版印刷株式会社 | 標的塩基配列の識別方法 |
| EP2415878A1 (en) | 2003-12-25 | 2012-02-08 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
| WO2013035875A1 (ja) | 2011-09-08 | 2013-03-14 | 独立行政法人理化学研究所 | プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法 |
-
1983
- 1983-04-28 JP JP7587883A patent/JPS59204200A/ja active Granted
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03500773A (ja) * | 1987-10-28 | 1991-02-21 | ハワード・フローレイ・インスティテュト・オブ・イクスペリメンタル・フィジオロジー・アンド・メディシン | オリゴヌクレオチド‐ポリアミド コンジュゲート |
| EP2415878A1 (en) | 2003-12-25 | 2012-02-08 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
| US8206902B2 (en) | 2003-12-25 | 2012-06-26 | Riken | Method of amplifying nucleic acid and method of detecting mutated nucleic acid using the same |
| WO2010061922A1 (ja) | 2008-11-27 | 2010-06-03 | 独立行政法人理化学研究所 | 新規ＭｕｔＳタンパク質およびそれを用いた変異の判定方法 |
| WO2010113452A1 (ja) | 2009-03-31 | 2010-10-07 | 凸版印刷株式会社 | 遺伝子型の識別方法 |
| US9523119B2 (en) | 2009-03-31 | 2016-12-20 | Toppan Printing Co., Ltd. | Method of distinguishing genotypes |
| WO2011122501A1 (ja) | 2010-03-29 | 2011-10-06 | 凸版印刷株式会社 | 標的塩基配列の識別方法 |
| WO2013035875A1 (ja) | 2011-09-08 | 2013-03-14 | 独立行政法人理化学研究所 | プライマーセット及びそれを用いた標的核酸配列の増幅方法並びに変異核酸の検出方法 |
| US9586987B2 (en) | 2011-09-08 | 2017-03-07 | Kabushiki Kaisha Dnaform | Primer set for isothermal amplication of a target nucleic acid sequence |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0435480B2 (ja) | 1992-06-11 |
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