JPS59198994A - Preparation of l-aspartyl-l-phenylalanine methyl ester - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the titled compound useful as a sweetener, in high efficiency, by utilizing a microbial strain capable of producing the titled compound by the condensation of L-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester. CONSTITUTION:The objective L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (abbreviated as APM) can be prepared by condensing L-aspartic acid with L-phenylalanine methyl ester by the action of a microbial strain belonging to Achromobacter genus, Corynebaterium genus, Candida genus, Cryptococcus genus, Flavobacterium genus, Micrococcus genus, Xanthomonas genus, etc. and capable of condensing L-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester to produce APM.

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステル（以下、ＡＰＭと略ス。）の製造法に関す
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (hereinafter abbreviated as APM).

Ａ　Ｉ）　Ｍは、１１−味剤として近年注目されている
ペプチドである。AI) M is a peptide that has recently attracted attention as an 11-flavor agent.

ＡＰＭの製造法としては、化学合成法上酵素的合成法が
知られている。Chemical synthesis methods and enzymatic synthesis methods are known as methods for producing APM.

化学的合成法としては、Ｎ〜保護のＬ−アスパラギン酸
無水物とＬ−フェニルアラニンメチルエステル（以下、
ＰＭと略す。）を縮合させてＮ−保護のＡＰＭとし、そ
の後保護基を除去する方法があり、酵素合成法としては
、Ｎ　−保ＮのＩ７−アスパラギン酸とＰＭに蛋白分解
酵素を作用させてＮ−保護のＡＰＭあるいはＮ−保護の
ＡＰＭのＰＭ　（＝１加物とし、その後、保護基を除去
してＡＰＭにする方法が知られているが、両方法とも保
護基の導入、脱ｉｌｌが必要で工程が複雛となる。As a chemical synthesis method, N-protected L-aspartic anhydride and L-phenylalanine methyl ester (hereinafter referred to as
Abbreviated as PM. ) is condensed to form N-protected APM, and then the protecting group is removed.An enzymatic synthesis method involves the action of a protease on N-protected I7-aspartic acid and PM to form N-protected APM. A known method is to make APM or N-protected APM into APM (=1 additive) and then remove the protecting group to make APM, but both methods require the introduction of a protecting group and deilling. becomes a compound chick.

また保護基を使用しないＡＰＭの製造方法（特開昭５８
−／１３７９３、昭和５８年日本農芸化学大会要旨集Ｐ
４２）も知られており、シュードモナス属、アルカリゲ
ネスｆｉ、＋−ルロプンス属、ロドトルラ属、スポロボ
ロミセス属のいずれかを用いる微生物的合成法であるが
収率が非常に低く工業的なＡＰＭの生産には必ずしも適
していない。In addition, a method for producing APM without using a protecting group (Japanese Unexamined Patent Publication No. 58
-/13793, 1981 Japanese Agricultural Chemistry Conference Abstracts P
42) is also known, and is a microbial synthesis method using any of the genus Pseudomonas, Alcaligenes fi, +-Rulopuns, Rhodotorula, and Sporobolomyces, but the yield is very low, making it difficult to produce APM industrially. is not necessarily suitable for

本発明者らは、このような従来のＡＰＭの製造法に対し
、より効率の良い方法を見い出すべく研究した結果、微
生物を用いる事によってＬ−アスパラギン酸とＰＭから
ＡＰＭが直接、効率よく生成する事を見い出した。The present inventors conducted research to find a more efficient method than the conventional APM production method, and found that APM can be directly and efficiently produced from L-aspartic acid and PM by using microorganisms. I found out something.

即ち、本発明は、アクロモバクタ−属、コリネバクテリ
ウム属、キャンディダム、クリプトコツカス属、エシェ
リヒア属、フラボバクテリウム属ジ第１・リクム属、ミ
クロコツカス属、バキソレン属、ザルチナ属、サツカロ
ミセス属、トリコスポロン属、キサントモナス属、クル
イヘロミセス属及０・エノ］ミセスｉｄに属）−Ｌ−ア
スパラキン酸とＬ−ノエニルアラニンメチルエステルヲ
縮合シてＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルを生成する能力を有する微生物な■、−アス
パラギン酸とＬ−フェニルアラニンメチルエステルに作
用せしめてＬ−アスパルチル−Ｔ、、　−７エー・ルア
ラニ７メプールＪステルを’１成する事ヲ特徴とするＡ
　Ｐ　Ｍの製Ａ’を方法である。That is, the present invention is directed to the genus Achromobacter, the genus Corynebacterium, the genus Candida, the genus Cryptococcus, the genus Escherichia, the genus Flavobacterium genus Diilicum, the genus Micrococcus, the genus Baxoren, the genus Sartina, the genus Satucharomyces, and the genus Trichosporon. genus Xanthomonas, genus Kluyheromyces, and genus Eno]myces id) - has the ability to condense L-aspartic acid and L-noenylalanine methyl ester to produce L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester. A characterized by forming L-aspartyl-T by acting on microorganisms, -aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester.
The method of manufacturing PM is A'.

Ｌ−アスパラギン酸とＰＭを縮合してＡＰＭを牛成す２
．能力を有する微生物の作用に、）、す、水＋Ｉ＋媒体
中にて１７−アスパラキン酸とＰＭを縮合してＡ　Ｐ　
ｌｖｉに変換せしめる方法は水溶性媒体中にて■、−ア
スパラギン酸七ＰＭと上記微生物の菌体、培養液あるい
は菌体処理物とを接触ぜしめ１１ば良い。APM is produced by condensing L-aspartic acid and PM2
．． Upon the action of capable microorganisms, 17-aspartic acid and PM are condensed in water + I + medium to produce
The conversion to lvi can be carried out by bringing 1,-aspartic acid heptaPM into contact with the cells, culture solution, or treated product of the microorganism described above in an aqueous medium.

本発明において用いるＬ−アスパラギン酸とｌ〕Ｍヶ縮
合してＡ　Ｐ　Ｍに変換せしめる能力を有する微生物々
しては、例えば、 ア＋１１　　　　　　　　　　　　　２４５３アクロモ
バクタ−・１−艦謔＝＝Σ身　　　ＡＪ−ＦＥＲ，Ｍ−
Ｐ　　フθｊ／コリネバクテリウム−エスピー　　　　
　ＡＴＣＣ２＋２５＋コリネハクテリ１ンム・ギセロン
ス　　　　ＡＴＣＣ３７３ギヤンデイダ・インターメデ
ィア　　　　ＡＪ４６］９　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　ｒ７ｏ
ｔｙクリプトコツカス・ネオフ、ＡＩレマンス　ＴＰＯ
４２８９＋’ｙ、：ｒ−＋）　ヒフ　−コＩＪ　　　　
　　　　　　　ＡＪ　２６０６　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　”
１Ｄｒｒフラボバクテリウム・セワネンス　　　　ＡＪ
２ｕ６　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　ｒｌ好）ジオトリタム・キ
ャンディダム　　　　　ＩＦＯ４５９９ミクロコツカス
ールテウス　　　　　　　ＡＴＣＣ４６９８パキソレン
ータンノフイラス　　　　　　ＩＦＯ１（Ｘ１７ｆルｑ
−ｙ−−−ｒルヒタＡＪ　１２１０　　　ＦＥＲＭ−Ｐ
　ｒｌｏ４９１・リコスボロン・カビタータム　　　　
　ＩＦＯ］１９７クルイヘロミセス・サーモトレランス
　　ＴＰＯＯｆ＋６２エンドミセス・オペテンシス　　
　　　　ＩＦＯ１２０１サツカロミセス・セレビシェ　
　　　　　ＩＦＯ２００３これらの微生物の菌体を得る
には、通常の培地を用いて、培養の始めから、あるいは
培養の途中でＩ、−アスパラギン酸とＰＭを添加して培
養すればよい。Examples of microorganisms that have the ability to condense L-aspartic acid with L-aspartic acid and convert it into APM include A+11 2453 Achromobacter AJ-FER ,M-
P Fu θj/Corynebacterium sp.
ATCC2+25+Corynebacterium 1inmu Gicerons ATCC373 Guyandeida Intermedia AJ46] 9 FERM-P r7o
ty Cryptococcus neoph, AI Remans TPO
4289+'y, :r-+) Hifu-ko IJ
AJ 2606 FERM-P”
1Drr Flavobacterium sewanens AJ
2u6 FERM-P rl) Geotritum Candidum IFO4599 Micrococcus sulteus ATCC4698 Paxolene-tannophyllus IFO1 (X17f rq
-y---r Luhita AJ 1210 FERM-P
rlo491・lycosboro・cavitatum
IFO] 197 Kluyheromyces thermotolerans TPOOof+62 Endomyces opertensis
IFO1201 Satsukaromyces cerevisiae
IFO2003 In order to obtain cells of these microorganisms, it is sufficient to culture them using a normal medium and adding I,-aspartic acid and PM from the beginning of the culture or during the culture.

本微生物の培養のために用いられる培地はＬ−アスパラ
ギン酸とＰＭを含むほかは通常の炭素源、窒素源、無機
イオンを含有する通常の培地である。The medium used for culturing this microorganism is a conventional medium containing L-aspartic acid and PM, as well as conventional carbon sources, nitrogen sources, and inorganic ions.

−５−・ 更に８ヒクミン、アミノ酸等の有機機甲栄養素を添加す
ると望ましい結果かｔｌ）られる場合が多い。-5-・Furthermore, desirable results can often be obtained by adding organic nutrients such as 8 hikumin and amino acids.

炭素源としては、クルコース、シークロース等の炭水化
物、＾１酸等の有機酸、アルコール類、その他か適宜使
Ｊｌ＋される。窒素源とり、ては、アンモニアノＪス、
アンモニア水、アンモニウム塩、その他力＝ｒ［１いら
Ｊする。無機イ」ンと１〜では、マグネシラノ、イオン
、燐酸イオン、カリイオン、鉄イオン、その他が必要ｔ
こ応じ適宜使用される。As the carbon source, carbohydrates such as crucose and seaucrose, organic acids such as acid, alcohols, and others may be used as appropriate. As a nitrogen source, use ammonia gas,
Ammonia water, ammonium salt, and other forces = r [1 to J. Inorganic ions and 1~ require magnesilano ions, phosphate ions, potassium ions, iron ions, and others.
Used accordingly.

Ｊ７τ養は好気的条件丁に、ｐ　＋（４ないし８、温度
２５ないし４０℃の適当な範囲に制御しつつ１ないしｌ
ＯＦｌ培養を行えば望ましい結果が得られる。J7τ is carried out under aerobic conditions with p
Desirable results can be obtained using OFl culture.

菌体としては、培養終了後の培養液そのまま、培養液よ
り分離された菌体、洗浄された菌体などいずれも使用可
能である。菌体処理物と１−では凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体、Ｉ・ルエン、界面活性剤等と接触せしめた
菌体、リゾチームで処理した菌体、超音波にさらした菌
体、機械的に摩砕した菌体等のほか、これら菌体処理物
から得られたＬ−アスパラギン酸とＰＭをＡＰＭに変換
せし　６− める酵素ｌｉ’ｌｌ’ｌを有する酵素蛋白区分、更には
、これらの菌体の固定化物、菌体処理物の不溶化物、そ
の他いずれも使用てきる。As the bacterial cells, it is possible to use the culture solution as it is after completion of culturing, the bacterial cells isolated from the culture solution, the washed bacterial cells, etc. For bacterial cell treatment products and 1-, freeze-dried bacterial cells, acetone-dried bacterial cells, I. luene, bacterial cells contacted with surfactants, etc., bacterial cells treated with lysozyme, bacterial cells exposed to ultrasound, mechanical In addition to the microbial cells ground into microorganisms, an enzyme protein fraction containing an enzyme li'll'l that converts L-aspartic acid and PM obtained from the processed microbial cells into APM, and furthermore, Immobilized products of these bacterial cells, insolubilized products of treated bacterial cells, and others can be used.

水溶性媒体としては、水、バッファーおよびエタノール
等の有機溶媒を含むものが使用できる。As the aqueous medium, those containing water, buffers, and organic solvents such as ethanol can be used.

更に必要に応じて、微生物の生育に必要な栄養素、抗酸
化剤、界面活性剤、補酵素、ヒドロキシルアミンおよび
金属イオン等を水性媒体に添加することイ、できる。Furthermore, if necessary, nutrients, antioxidants, surfactants, coenzymes, hydroxylamine, metal ions, etc. necessary for the growth of microorganisms can be added to the aqueous medium.

１−記微Φ物の菌体な水溶性媒体中で培養しながら、菌
体とＩ、−アスパラギン酸とＰＭを接触せしめて作用せ
しめる場合には、Ｌ−アスパラギン酸とＰＭを含み、か
つ微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンな
どの栄養素を含む水性媒体が用いられる。更にビタミン
、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結
果が得られる場合が多い。1- When the microorganism containing L-aspartic acid and PM is brought into contact with the microorganism and the microorganism is cultured in an aqueous medium containing L-aspartic acid and PM, An aqueous medium containing nutrients such as carbon sources, nitrogen sources, and inorganic ions necessary for growth is used. Additionally, desirable results can often be obtained by adding organic micronutrients such as vitamins and amino acids.

炭素？ｌＩ？としては、グルコース、シュクロース等の
炭水化物、酢酸等の有機酸、アルコール類、その他が適
宜使用される。窒素源としては、アンモニアノＪス、ア
ンモニア水、アンモニウム塩、その他か用いら１１ろ。carbon? lI? As appropriate, carbohydrates such as glucose and sucrose, organic acids such as acetic acid, alcohols, and others are used. Nitrogen sources include ammonia gas, ammonia water, ammonium salts, and others.

無機イオンと１〜では、マグネシウムイオン、燐酸イオ
ン、ツＪリイオン、鉄イオン、その他が必要に応じ適宜
使用される。Among the inorganic ions 1 to 1, magnesium ions, phosphate ions, trichloride ions, iron ions, and others are used as appropriate.

培養は好気的条件下に、ｐ　Ｔ（４ないＬ８．温度２５
ないし４０℃の適当な範囲に制御しつつ行えは望−＋１
．い結宋か得られる。Cultures were carried out under aerobic conditions at pT (4 not L8.Temperature 25
It is desirable to do this while controlling the temperature within the appropriate range of 40°C to 40°C.
．． You can get it from the Song Dynasty.

かくして１ないし１０［１間も培養を行えば、Ｌ−アス
パラギン酸とＰ　ＭはＡＰＭのみに効率よく変換さＪｌ
ろ。Thus, if the culture is continued for 1 to 10 [1], L-aspartic acid and PM are efficiently converted to only APM.
reactor.

これに勾し、１−記微生物の培養液をそのまま、培養菌
体あるいＱｊ菌体処理物を■、−アスパラギン酸拓よひ
ＰＭ七接触せ［２めて作用せしめる場合には、Ｌ−アス
パラギン酸とＰ　Ｍと培養液、培養菌体あるいは菌体処
理物を溶解または懸濁した水性媒体を１０℃ないし７０
℃の適当な温度に調節しｐ　Ｉ−１を４ないし８に（呆
ちつつ、暫時静置または攪拌すＪｌばよい。かくして５
ないし１００時間も経過すれは水性媒体中に多量のＡＰ
Ｍが生成蓄積される。Then, the culture solution of the microorganism described in 1. is directly applied, and the cultured bacterial cells or the Qj bacterial cell treated product are brought into contact with ■, -Aspartic Acid Takuyohi PM7 [2. An aqueous medium in which aspartic acid, PM, culture solution, cultured bacterial cells, or treated bacterial cells are dissolved or suspended is heated at 10°C to 70°C.
Adjust the temperature to an appropriate temperature of ℃ and adjust the p I-1 to 4 to 8 (while waiting for a while, let it stand or stir for a while. Thus, 5
After 100 hours have passed, a large amount of AP will be present in the aqueous medium.
M is generated and stored.

生成したＡＰＭは、公知の分離方法により分離精製する
事ができる。生成したＡＰＭはアミノ酸アナライザーを
用いて測定した。The generated APM can be separated and purified by a known separation method. The generated APM was measured using an amino acid analyzer.

実施例Ｉ グルコース　２．Ｏｆｌｄｉ、　（ＮＨ４）２Ｓｏ４０
．５　ｆ／／ｄｌ、ＫＨｙＰＯ，Ｑ、１？／ｃｌ／、に
２ＨＰＯ，０，１９／ｄｅ、ＭｇＳＯ４”７Ｈ２００，
０５Ｗｉｄｅ　、　Ｆｅ５０４−７　Ｈ，，０１１ｎ９
／ｄｉ　、　ＭｎＳＯ４＠４Ｈ２０１ｍ’ｉＥｌ　。Example I Glucose 2. Ofldi, (NH4)2So40
．． 5 f//dl, KHyPO, Q, 1? /cl/, 2HPO, 0,19/de, MgSO4”7H200,
05Wide, Fe504-7 H,,011n9
/di, MnSO4@4H201m'iEl.

酵旬エギス　１．ＯＷｉｄｅ、マルツエキス０．５　Ｗ
ｉｄｅ　。Fermented Shun Egisu 1. OWide, malt extract 0.5 W
ide.

炭素カルシウム４．Ｏｆｌｄｌ　　（別殺菌）を含む培
地（ｐＨ７，０）を５００　ｍｌ容フラスコに５０ゴ入
れ】２０℃で１５分間殺菌した。Carbon calcium 4. Fifty volumes of a medium (pH 7.0) containing Ofldl (separately sterilized) was placed in a 500 ml flask and sterilized at 20°C for 15 minutes.

これにブイヨン寒天培地で３０℃にて、２４時間培養し
た表３の微生物を１白金耳接種し、３０℃で２０時間培
養した。この培養液より菌体を遠心分離により採取し、
培養液と同量の生理食塩水で１回洗浄し、菌体を集めた
。One platinum loop of the microorganisms shown in Table 3, which had been cultured on a bouillon agar medium at 30°C for 24 hours, was inoculated thereto and cultured at 30°C for 20 hours. Bacterial cells were collected from this culture solution by centrifugation,
The cells were washed once with the same amount of physiological saline as the culture solution, and the bacterial cells were collected.

これらの菌体を表１に示す反応液Ｓ十？／ｄｔになる、
Ｌうに添加しく終末ｐ　Ｈ５，４，５ｍｅ　）、３７℃
に１６時間保持反応した。These bacterial cells were mixed with the reaction solution S10 shown in Table 1. becomes /dt,
Addition to sea urchin (final pH 5,4,5me), 37°C
A holding reaction was carried out for 16 hours.

　９− この時に生成したＡＰＭをアミノ酸アナライザーで測定
し、その結４巳を表２に示した。9- The APM produced at this time was measured using an amino acid analyzer, and the results are shown in Table 2.

表　　１ ※０．］ＭＩＪン酸・・７フアー中に上記基質を含む（
最終ｐ　ｎ　５．−１　） 　１０− 表　　２ 実施例２ 実施例１と同様に培養し、洗浄したフラボバクテ　リ　
ｒシ　ノ、　−（！　　’７　　ネ　／　）、　　　　
ＡＪ　　２４７６　　　ＦＥＲＭ−Ｐ　　　ｒＯ’５＞
５７を反応液Ａ−−−−−１０ｔｌ　ｍｅに一一一一、
投入１１、：３７℃、２４時間反応した。Table 1 *0. ] MIJ acid... Contains the above substrate in 7 fur (
Final p n 5. -1) 10- Table 2 Example 2 Flavobacteria cultured and washed in the same manner as in Example 1
r しノ, -(! '7 ne/),
AJ 2476 FERM-P rO'5>
57 to reaction solution A---10 tl.
Input 11: Reacted at 37°C for 24 hours.

−一−０の眉間溶媒で展開し、生成Ａ　Ｐ　Ｍの部分を
かきｋす、／へ留水て抽出後の反応生成物を結晶化させ
５６０ηの結晶を得た。この結晶の旋光度、融点、比旋
光庶を測定ｊまた結宋、反応液Ａよりの生成物はＡ　Ｐ
　Ｍ標品と完全に一致した。-1-0 was developed, the resulting APM portion was scraped off, and the reaction product after extraction with distilled water was crystallized to obtain crystals of 560η. The optical rotation, melting point, and specific rotation of this crystal were measured. Also, the product from reaction solution A was A P
It matched perfectly with the M standard.

実施例３ 実施例１と同様の培地を用いて３０℃で１２時間培養し
た工／エリヒア・コリ　ＡＪ　２６０６　ＦＥＲＭ−Ｐ
ＩＶｏｔ５　の培養液中にＬ−アスパラギン酸　５２と
ＰＭ】０２を含む水溶液１０ｍ（！（ｐ　Ｈ５，４ニ調
製）を無菌的に投入し、無菌的に培養液のｐ　Ｉ−Ｉを
５．４に調製後、更に１０時間培養を行った。培養中は
２時間おきにｐ　Ｈを５．４になるように無菌的に調製
した。Example 3 Erychia coli AJ 2606 FERM-P cultured at 30°C for 12 hours using the same medium as in Example 1
10 ml of an aqueous solution containing L-aspartic acid 52 and PM]02 (prepared at pH 5,4) was aseptically poured into the culture solution of IVot5, and the p I-I of the culture solution was aseptically adjusted to 5.4. After preparation, the culture was further carried out for 10 hours.During the culture, the pH was adjusted aseptically to 5.4 every 2 hours.

この培養液中での生成物をアミノ酸アナライザーで測定
した結果、ＡＰＭが３２０　ｑ／ｄｌ生成していた。As a result of measuring the products in this culture solution using an amino acid analyzer, it was found that 320 q/dl of APM was produced.

特許出願人　味の素株式会社 　１３− 第１頁の続き Ｃ１２Ｒ１／８５　） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１１０１） （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ ＣＩ２　Ｒ１／６４５） ０発　明　者　久保田浩二 川崎市多摩区長尾４−６−４Patent applicant: Ajinomoto Co., Inc. 13- Continuation of page 1 C12R1/85) (C12P 21102 C12R1101) (C12P 21102 CI2 R1/645) 0 shots Akira Koji Kubota 4-6-4 Nagao, Tama-ku, Kawasaki City

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] アクロモバクタ−属、コリネバクテリウム属、キャンデ
ィダ属、クリプトコツカス属、エシェリヒア属、フラボ
バクテリウム属、ジオトリクム属、ミクロコツカス属、
パキソレン属、ザルチナ属、→ｔ７カロミセス属、トリ
コスポロン属、キサントモナス属、クルイヘロミセス属
及びエンドミセス属ｃｉＬＬ−アスパラキン酸とＬ−フ
ェニルアラニンメチルエステルを縮合してＬ−アスパル
チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルヲ生成スる
能力を有する微生物をＬ−アスパラキノ酸とＬ−フェニ
ルアラニンメチルエステルに作用セシメて、Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルを生成す
る＝Ｉｆを特徴とする■、−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルの製造方法。Achromobacter, Corynebacterium, Candida, Cryptococcus, Escherichia, Flavobacterium, Geotrichum, Micrococcus,
Paxoren sp., Zarutina sp., →t7 Calomyces sp., Trichosporon sp., Xanthomonas sp., Kluiheromyces sp. and Endomyces sp. ciLL-aspartic acid and L-phenylalanine methyl ester are condensed to produce L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester. ■, -Aspartyl-L-phenylalanine methyl ester characterized by =If, which produces L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester by acting on L-asparaquinic acid and L-phenylalanine methyl ester with a microorganism that has the ability to manufacturing method.