JPS5916671B2 - 固定させた免疫吸着剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は免疫吸着剤に関し、更に詳しくはたとえば放射
線免疫分析のような、免疫吸着剤を反復分析に使用する
ことができる免疫分析法において使用するための改良さ
れた免疫吸着剤に関するものである。

放射線免疫汗析は、抗体分子上の抗原結合個所に対する
抗原の競合（親和性）に依存した分析技術である。

実際上は、それぞれが（ａ）同一かつ既知の濃度のラベ
ルした抗原、および（６）種々かつ既知の濃度のラベル
してない抗原を、含有するような複数の試料から集めた
データにより、標準曲線を作成する。抗原は放射性同位
元素トレーサーでラベルする。混合物を抗体と接触させ
て培養し、遊離の抗原を抗体およびそれに結合された抗
原から分離し、次いでたとえばγ線またはβ線検知器の
ような適当な検知器を用いて、結合されているかまたは
遊離しているいずれかのラベルした抗原またはその両者
の比率を測定する。この手順を、種種既知の濃度のラベ
ルしてない抗原を含有する複数の試料について反復し、
そしてその結果をプロツトする。結合されているトレー
サー抗原の比率を抗原濃度の函数としてプロツトする。
典型的には、全抗原濃度が増加するにつれて、抗体に結
合されるトレーサー抗原の相対的量は減少する。標準グ
ラフを作成した後、分析をうける試料中の抗原濃度を決
定するため、後にこれを使用する。実際の分析において
、抗原の濃度を決定しようとしている試料を既知量のト
レーサー抗原と混合する。

トレーサー抗原は試料中に存在することが知られている
抗原と同じものであるが、これは適当な放射性同位元素
でラベルされたものである。トレーサーを有する試料は
次いで抗体と接触して培養される。その後、これは適当
な検知器で計数することができ、検知器は試料中に残存
する遊離の抗原を計数する。抗体または免疫吸着剤に結
合された抗原もまた同様にして計数することができる。
次いで、標準曲線から、元試料中の抗原の濃度を決定す
る。その後、抗体または免疫吸着剤物質は捨てる。抗体
に結合されている抗原（結合抗原）の比率および／また
は遊離もしくは未結合のま＼であるものの比率を検出す
るためには、先ず試料を結合抗原含有と画分と遊離抗原
のみを含有する画分とに分ける必要がある。

これを行なうための一つの一般的方法は、デキストラン
被覆した木炭を混合物に加えることである。デキストラ
ンは、結合抗原よりも低分子量の未結合抗原がデキスト
ランを通過するのを許し、そして木炭は遊離の抗原を吸
着する。吸着した遊離抗原を有する木炭を次いで遠心分
離によつて抗体（および結合抗原）から分離する。もう
１つの公知方法は最初の抗体（結合抗原を有するもの）
を選択的に沈澱させるような他の抗体を混合物に加え、
かくして遊離抗原のみを溶液中に残すことである。

次いで、適当な遊離画分および結合画分への分類は、遠
心分離またはその他の適当な手段により沈澱を上澄液か
ら分けることによつて行なう。或る研究者は抗体をプラ
スチツク容器の内壁に結合させ、この容器に抗原含有の
試料を満たし、これを典型的には４〜７２時間の範囲の
培養期間静置させ、次いで容器を排液および洗浄して遊
離抗原を結合抗原から分離し、容器中に抗体および結合
抗原のみを残すという技術を用いた。最近開発された技
術は、抗体を不溶性の架橋デキストラン上に結合させて
免疫吸着剤を調製することである。免疫吸着剤および抗
原含有の試料を培養し、次いで結合抗原を有するデキス
トランを適当な手段で溶液から分離する。上記方法の全
てにおいて、結合画分または遊離画分のいずれか、また
はその両者におけるラベルした抗原の比率を測定し、そ
して標準曲線を用いて抗原濃度を決定する。

その後、免疫吸着剤は捨てる。上記の放射線免疫分析技
術は貴重な手法であることが証明されかつ広範な承認を
得ているが、それらはまだ望まれる完べきなものではな
い。

何故なら、抗体（免疫吸着剤）が各分析の際に消費され
、したがつて捨てなければならないからである。更に、
従来の慣行はバツチ型であり、そして試験管中の抗体に
対して幾種かの試薬が添加され、その際たとえば培養、
洗浄などのような別々の工程が行なわれるので、操作が
遅くなりかつ高価となる。米国特許出願第３４２５１３
号は免疫分析法における実質的な改良を記載しており、
そこでは抗体物質（これは基質上に固定化されている）
に結合されている抗原を免疫吸着剤から放出させること
により同一の免疫吸着剤を複数回の分析に対して反復使
用することができる。

即ち、免疫吸着剤上の抗原は全て、分析が完了した後に
、選択的かつ化学量論的に放出させる。本発明は再使用
可能な免疫吸着剤に向けられている。抗体は免疫学的吸
着剤の使用により単離することができるということが文
献から公知であり、そしてこの技術は抗体の定量分析と
いうよりも寧ろこれを単離および精製するのに有用であ
る。

（Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ，ＰｒＯｃ．Ｎａｔ３ｅ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．３７（１９５１）５７５参
照）。特定の抗原を単離および精製する目的でこれを抽
出するために、不溶性重合体に結合させた抗体を使用す
るということはウイートアール等（Ｗｅｅｔａｌｌｅｔ
ａｌ）によつて記載されている（ＢｉＯｃｎｅｍ．Ｂｌ
Ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．ｌＯ７（１９６５）１５０〜１
５２）。

酵素を固定化するための基質として、多孔性ガラスが記
載されている（Ｗｅｅｔａｌ，ＢｉＯｃｈｅｍ．ＢｌＯ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２ｌ２（１９７０）１〜７参照）
。

そこでは、ガラスをγ−アミノプロピルトリエトキシラ
ンで処理し、そしてイソチオシアネート誘導体を手オホ
スゲンでの処理によつて作つている。酵素はイソチオシ
アネート誘導体に結合させる。また、アリールアミン誘
導体の製造に際し、アルキルアミンガラスとｐ−ニトロ
ベンゾイルクロライドとを反応させ、それに続いてナト
リウムジチオネートを使用してニトロ基を還元するとい
うことが記載されている。次いで、アリールアミンガラ
スはジアゾ化され、そしてこれに酵素が結合される。ウ
イートアール（ＢｉＯｃｈｅｍ．Ｊ（１９７０）１１７
，２５７〜２６１）は、また、シラン結合剤を介して多
孔性ガラスに結合されている抗体の使用を記載しており
、こ＼で免疫吸着剤は特定抗原を単離および精製するた
めに使用されている。

しかし、与えられたデータが示すところでは、固定化さ
れた抗体免疫吸着剤から抗原が溶出されたような再使用
カラムは性能上全くばらつきが大きい（米国特許第３６
５２７６１号、１９７２年３月２８日、参照）。即ち、
放出される抗原の回収率は７４０１）から１００（：ｆ
ｌ）まで変化する。上記の系は、単離用の系としては有
用であるが、抗原の実質的定量の放出が必要とされる定
量分析においては、使用しうる道具としての観点からか
なりの異論がある。米国特許第３５５５１４３号（１９
７１年１月１２日）は放射線免疫分析法に関するもので
あり、こ＼では固定化した免疫吸着剤をたつた１回のみ
使用し、そしてこれを捨て＼しまう。

免疫吸着剤は、グリセリンエーテル橋により架橋されか
つｐニトロフエノキシーヒドロキシープロピルエーテル
基で置換されたデキストラン〔セフアジツクス（Ｓｅｐ
ｈａｄｉｘ）Ｇ２５，スーパーフアイン〕であるニトロ
基はナトリウムジチオナイトによつてアミノ基まで還元
される。次いで、ｐ−アミノーフエノキシーヒドロキシ
ープロピル基で置換されているセフアデツクスをチオホ
スゲンで処理して、ｐ−イソチオシアネートーフエノキ
シーヒドロキシプロピル基で置換されたセフアデツクス
を生成せしめ、抗体はこの後者で置換されている生成物
に結合させる。蛋白質を不溶化させるために広く使用さ
れている反応は、臭化シアノーゲンで活性化されたセル
ロースマトリツクスに対する蛋白質の共有結合に関連す
る。

そのような活性化のメカニズムは文献（Ｂａｒｔｌｉｎ
ｇｅｔａｌ，ＢｉＯｔｅｃｈｎＯｌＯｇｇａｎｄＢｌＯ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＯｌＸ（１９７２）１０３９
〜１０４４）に示されている。米国特許第３５０２８８
８号（１９７１年７月１３日）、第３６３９５５９号（
１９７２年２月１日）および第３７２０７６０号（１９
７２年３月１３日）も興味あるものである。

固定化させた免疫吸着剤をたつた１回のみ使用してこれ
を捨てる場合、基質の長期的性質は大して重要でない。

たとえば、セフアデツクス（デキストラン）またはセフ
アロース（ビーズ状のアガロース生成物）のような材料
が、米国特許第３５５５１４３号に記載されているよう
に、抗体を結合せしめる基質として良好に働らく。免疫
吸着剤を反復使用する場合には、米国出願第３４２５１
３号に記載されているように、或る種の問題が生ずる。

異論の一つは、セフアデツクスおよびセフアローズの型
の製品は脱水する傾向があるということである。

即ち、ゲルは崩壊しそして物体を通過する流れが実質的
に妨げられる程度につまつてしまい、抗原を結合するた
めの抗体の能力が変化し、したがつて反復使用に対する
免疫吸着剤の再現性および安定性に影響が生ずる、とい
うことである。ガラスおよびその他固体の無機物質は望
ましい選択性を提供する。

何故なら、それらはビーズに成形して、カラム型の配置
中へより容易に充填しかつより良好な流動を得ることが
できるからである。この種の材料は崩壊することがなく
、長期間の使用の際にも脱水を受けない。ガラス型のも
のは、望ましい選択ではあるが、これも欠点を有してい
る。問題の一つは、抗体を基質に十分に結合させるとい
うことである。初期の不十分な結合のため定量分析用具
としては欠乏した活性を与えるか、或いは望ましくない
抗体放出により免疫吸着剤の寿命にわたつて活性が変動
する。ウイートアールの引例において使用されているよ
うにガラスが高度に多孔性である場合は、非常に大きな
活性ガラス表面積が存在するので抗体の十分な結合が生
ずるが、一方抗原の非特定的結合も生じてしまう。

したがつて、ガラスに結合された抗原は完全には放出さ
れなくなる。即ち、定量分析にとつて必要とされる化学
量論的放出が各使用の度に起こらずに、放出特性は変動
しかつ予測不可能となる。このことはウイートアールの
デ一夕から確認される。このようなガラスは通常９６％
の空気もしくはボード空間を有するので、抗原結合個所
として使用する抗体によつて占拠されていないようなか
なりの活性ガラス表面積が存在する。高度多孔性のガラ
ス品に関するもう一つの難点は、孔隙中に多数の亀裂が
存在し、このため亀裂内での捕獲が起こり、そして亀列
内での緩慢な拡散のため放出が遅くなる、ということで
ある。

たとえば自動化装置におけるように迅速な応答を必要と
する場合、反応体の拡散が律速段階となり、そしてよく
知られているように、拡散は比較的緩慢な過程である。
したがつて、たとえ基質に結合していなくても、抗原の
拡散が比較的遅く、そのため迅速な自動化分析装置の目
的には、抗原は急速かつ定量的に放出されずに寧ろ強力
に結合されている。表層多孔質の支持体がクロマトグラ
フイ一用の用途として知られている（たとえば米国特許
第３５０５７８５号、１９７０年４月１４日、参照）。

これはイ一・アイ・デユポン・デ・ニモアス・アンド・
カンパニーから「ジパツクス（Ｚｉｐａｘ）」の商標の
下に市販されている製品である。クロマトグラフカラム
の充填物として使用されるこの支持体ビーズは不浸透性
の核を有する複数の個々の巨大粒子から成つており、そ
こに不可逆的に結合した一連の被覆を有しており、この
被覆は順次に吸着されたようなコロイド性微粒子の単層
の複数から成つている。たとえば、直径約３０ミクロン
の球状の微細ガラスビーズは約１ミクロンの厚さの外部
の多孔性表面外皮を含んでいる。そのような物質は、基
質として使用した場合、所望の活性に対してかなりの表
面積を与えるが、しかしこの基質は適切な迅速応答と定
量的放出とを確保するためには適切に製造しなければな
らない。このように、各分析の度に抗原を化学量論的に
放出しかつ再使用できる免疫吸着剤を提供することは全
く望ましいことである。

免疫吸着剤が、実質的に脱水を起こさずかつ物質を通過
する流れを免疫吸着剤の有効寿命にわたつて望ましい特
性に保つようにつめられているならば、実質的に改良さ
れた再使用しうる固定化免疫吸着剤が提供される。本発
明によれば、放射線免疫分析法に反復使用するための科
良された固定化免疫吸着剤が提供される。

基質、即ち基礎マトリツクスは脱水および崩壊に対して
安定であり、それぞれが高表面積の外部表面を有する固
体粒子の集団の形態である。そのような基質の典型的な
ものは表層多孔質の耐火性粒子からできており、その各
々は不浸透性の核を含んでおり、これはそこに結合され
た十分な微粒子の層を有し、核の上に外部多孔性被覆を
形成し、高表面積を与える。基質には、水不溶性の重合
体物質を結合せしめる。

この重合体は、アミノアルキルシラン誘導体を生成させ
るように基質を処理し次いで重合体を結合させるための
イソチオシアノアルキルシラン誘導体を生成させるよう
に処理することによつて、結合させることができる。代
表的な有用重合体物質の例はデキストランである。デキ
ストランは、抗原が結合されうる基質の活性個所を、後
の分析を妨げるように覆うための、バリヤーとして作用
する。

本発明の免疫吸着剤は、結合抗体から抗原を分離させる
溶出用媒体を使用することにより反復使用されるので基
質に結合されうる如何なる抗原の放出も後の分析で誤差
を生じさせる。この誤差は、予測不可能かつ未知である
保持量または放出量のために、生ずる。したがつて、重
合体は、基質が抗原を結合するのを防ぐためのバリヤー
として効果的に働らく。次いで、臭化シアノゲンで処理
することにより、重合体を活性化せしめ、共有結合を介
して抗体を結台させる。

この反応のメカニズムはバートリング等（上記Ｂａｒｔ
ｌｉｎｇｅｔａｌ）によつて記載されている。得られた
固定化した免疫吸着剤を、次いで米国出願Ｓ．Ｎ．第３
４２５１３号に記載されているような自動化装置におい
て使用するため、独特な構造を有するチヤンバ一・ホル
ダーの中に入れる。

本発明の改良された固定化免疫吸着剤は主として放射線
免疫分析法に使用する目的を有する。

本発明のシステムによつて定量的に測定しうる物質の代
表的なものは次の通りである：エストリオール、ジゴキ
シン、ジギトキシン、テストステロン、エストラジオー
ル、アルドステロン、プロゲステロン、コルチソール、
１１−デソキシーコルチオステロン、１１−デソキシコ
ルチソール、たとえばチロキシン（Ｔ４）、トリイオド
チロニン（Ｔ３）のようなチロイドホルモン、たとえば
アンギオテンシンのようなポリペプタイド、ＴＳＨ（チ
ロイド刺戟性ホルモン）、ＡＣＴＨ．．ＧＨ（生長ホル
モン）、ＨＰ（人間胎盤−ラクトゲン）、パラソルモン
、カルシトニン、インシユリン、グルカゲン、たとえば
ＣＥＡ（カルシノ・エンブリオ・アンチゲン）のような
ポリペプタイド蛋白、α−フエトプロテイン、インテル
フエロン、たとえばオーストラリア・アンチゲンのよう
なビールス、たとえばビタミンＤおよびＢ，２葉酸のよ
うなビタミン、たとえばバルビチユレート一およびシラ
ンチッのような薬剤。これらはほんの僅かの例である。
上記の抗原に対する抗血清が知られており、たとえば放
射性同位元素でラベルした物質の形態、普通は１１２５
同位元素またはＨ３同位元素の形態で入手しうるラベル
した抗原がある。

本発明の固定化した免疫吸着剤は、抗体を比較的永久に
結合させた基質を包含する。

使用の際、既知濃度のラベルした抗原を含有するラベル
してない抗原試料を、チヤンバ一・ホルダー中に置かれ
た固定化免疫吸着剤と接触させる。接触すると、ラベル
した抗原およびラベルしてない抗原の混合物の一部が基
質上に結合されている特異的抗体と結合する。その後、
結合しなかつた抗原もしくは結合した抗原、或いはその
両者を計数し、そしてラベルしてない抗原の濃度を標準
データから決定する。その後、固定化免疫吸着剤を、た
とえばメチルアルコール、イソプロプルアルコールまた
はエチルアルコール、ならびにジメチルホルムアミドの
ような溶媒を含有する適当な水溶液によつて洗い、結合
したラベル抗原および非ラベル抗原を固定化免疫吸着剤
から化学量論的に放出させる。

洗い、即ち溶出操作は免疫吸着剤を再使用のために効呆
的に再生し、そしてその後この同じ免疫吸着剤を、固定
化した抗体が特異的に働らくような抗原の分析のために
、上記したように各使用の間に洗浄を行ないながら、反
復使用することができる。抗原物質は再使用された免疫
吸着剤を支持しているチヤンバ一の中に流入するので、
基質の流れ特性は支持抗体と抗原混合物との間に接触が
達成されるようなものでなければならない。更に、基質
は結合した抗原の放出を妨げずかつ結合抗体を保持する
ような型でなければならない。再現性、安定性および速
度がこの改良方法の利点の幾つかであり、そしてたとえ
ば基質は、使用しうる抗原結合個所をもつた結合抗体で
表わして、十分な活性が得られるようなものでなければ
ならない。それ故、基質は微粒子および球状のもの即ち
個々の粒子の集団から作られたものであることが好まし
い。何故なら、これにより、ラベルしたおよびラベルし
てない抗原の試料混合物のみならず洗いもしくは溶出用
媒体も、それらの望ましい流過特性が高まるからである
。活性未知の必要抗体を備えうる微粒子状物質はたとえ
ばセフアデツクス、セフアロース、多孔性ガラスなどで
あつた。

たとえばセフアデツクスおよびセフアロースのような物
質はゲル型の物質であり、長期間にわたる使用で脱水す
る傾向があり、その結果崩壊が起こり、流れを妨げるよ
うなつまりが生ずる。たとえば多孔性ガラスのような物
質は極めて活性であり、抗原がガラスに結合して放出さ
れなくなる。したがつて、本発明の重要な局面は微粒子
状基質の上にバリヤー被覆を形成せしめることであり、
このバリヤー被覆は本質上の潜在的活性個所を抗原の不
可逆的結合から防ぐためのマスクを与えるように、事実
上、作用する。

また、このバリヤーは、抗体を付着させうる基質の固定
化成分としても作用する。分析は水性および非水性溶媒
中で行なわれるから、バリヤー被覆はこの方法に使用す
る溶媒および溶液に不溶でありかつこれらによつて悪影
響を受けないことが好ましい。たとえばデキストランの
ような水不溶性の重合体物質が本発明において好適であ
る。基質自体は脱水および崩壊に対して抵抗性の微粒子
材料であることが好ましい。

比較的高い流速における迅速な物質移動は基質の幾何学
およびチヤンバ一・ホルダー中の充填特性の函数である
。好適な基質は調節された表面孔度を有する物質であり
、不浸透性の非多孔性核を有する個々の巨大粒子から作
られた表層多孔質の耐火性粒子でありかつそれに結合さ
せた一連の被覆、即ち順次に吸着されたような無機微粒
子の単層より成る一連の被覆、を有するものである。例
示の目的で示した第１図について説明すれば、固定化免
疫吸着剤用の基質を形成する表層多孔質の耐火性粒子１
０は、不浸透性かつ非多孔性の核である巨大粒子の形の
核１２を含んでいる。

核１２は球状として示されている。何故なら、この形状
が充填目的に好適であるからである。球状の形の核は直
径５〜５００ミクロンであり、そしてガラスでできてい
るが、砂、セラミツクなどであつてもよい。核は均一な
寸法即ち平均直径の約５０（ｆ）以内に全てが入る寸法
であることが好ましい。

核１２に付属して微粒子１４の複数層が存在し、これら
は外側の多孔性被覆を形成する。微粒子の寸法は５ミリ
ミクロン乃至１ミクロンの範囲とすることができ、そし
て層の数は２〜３０とすることができる。微粒子は無定
形のシリカ、アルミナ、トリアなどであつてもよい。明
らかなように、上記した基質材料は、多孔性被覆１５に
基づいて比較的大きい表面積を有するが、核物質中には
殆んど孔隙がない。

全直径３０ミクロンかつ多孔性外皮１ミクロンであるビ
ーズについては、０．８〜１．０イ／９の表面積が得ら
れ、この場合充填した床密度は１．５９／ＣＣである。
規則的な幾何学、脱水および崩壊に対する安定性および
嵩は上記の物質を基質として全く格別なものにしている
。しかしながら、そのような物質は、抗体物質用にその
ま＼基質として上記の形態で使用するならば、抗原混合
物またはその成分を非放出的に結合してしまうような活
性個所を含有する傾向がある。

この問題は、本発明の重要な目的である固定化免疫吸着
剤の再使用の場合に、全く異論を生ずる。分析の精度お
よび速さは、一部、抗体が抗原を結合しそして洗いのと
きにこれを定量的に放出するという能力に関係している
ので放出されない抗原は以後の分析の精度に悪影響を与
える。バツクグランド計数を取ることもできるであろう
が、これは全く満足できるものでない。何故なら、保持
一放出の現象は不均一でありかつ予測できないからであ
る。本発明により、そのような傾合は、シラン結合剤を
介して基質に付着されたバリヤー被覆を用いることによ
つて除去される。

即ち、基質の外部表面部分に、重合体をシラン結合によ
つて直接に結合させる。次いで、この重合体は臭化シア
ノゲンで処理して活性化せしめ、かくしてこれは蛋白質
（抗体）を重合体活性化せしめた微粒子基質に共有結合
的に結合させる。重合体被覆は、基質だけの潜在的活性
個所を効果的にマスクするバリヤーとして作用するだけ
でなく、抗体を共有結合的に結合させうる活性表面をも
提供し、この場合結合は比較的強力と見られる。典型的
な手順において、本発明によれば、微粒子状基質材料（
上記したような直径３０ミクロンの表層多孔質の耐火性
粒子）１２９を５００ｍ１容フラスコに入れ、これに３
−アミノプロピルトリエトキシシラン２０ｍ１（１８．
８４９）およびトルエン１８０ｍ１を加えた。

混合物を２２時間還流させてガラス基質のアミノアルキ
ルシラン誘導体を生成せしめた。この誘導体をろ過し、
フイルタ一支持上に保ちながら２００ｍ１のトルエンで
洗浄し、そして風乾し、次いで１００ｍ１のクロロホル
ムで２回目の洗浄を行ないそして２回目の風乾を行なつ
た。上記で作つたアミノアルキルシランガラス誘導体を
チオホスゲン１６．６ｍ１（２５９）およびクロロホル
ム１５０ｍ１で処理して、イソチオシアノアルキルシラ
ン誘導体を作つた。

反応容器を遮光し、１８時間還流させて上記の誘導体を
生成せしめ、これを淵過し、クロロホルムで洗浄しそし
て風乾した。このような手段の結果、「活性化」基質が
調製され、これに水不溶性の重合体を結合させることが
できる。

本発明によれば、分子量７０，０００のテキストランを
使用するのが好ましいが、その他の物質を使用すること
もできる。

たとえば、０．１モル重炭酸ナトリウム（ＰＨ９．ｌ中
のデキストラン１％溶液２００ｍ１を、上記の「活性化
］基質に加えた。

混合物を３時間撹拌し、淵過し、３００ｍ１の水で洗浄
し、１００ｍ１のアセトンで洗浄しそして風乾して、重
合体被覆された微粒子状基質１１．６９を得た。手順の
残りの工程は、重合体被覆された基質の活性化、および
必要に応じて抗体の精製、および被覆基質に対する抗体
の結合であり、これはしばしば調製基質に対する抗体の
コンジユゲーシヨンと呼ばれ＋。

デキストランを活性化させるために、臭化シアノゲン２
０９を水２００ｍ１中に溶解させた。

臭化シアノゲンは極めて有毒であり、従つて安全規準上
の注意を払わねばならない。ゲキストラン被覆した基質
（１１．６９）を加え、そして混合物を撹拌した。ＰＨ
を、６Ｎ水酸化ナトリウム２３ｍ１によつて、３．６か
ら１０〜１１に高めた。６Ｎ水酸化ナトリウムの添加に
より、ＰＨを１０〜１１に２分間保つた。

活性化したデキストラン被覆の基質を次いで水４００ｍ
１１容量基準で水５０（：ｆ）およびアセトンの４００
ｍ１１容量基準で水２５（ｆ）およびアセトンの４００
ｍ１１および最後に、アセトン４００ｍ１により洗浄し
た。次いで、生成物を風乾した。重合体被覆した基質を
臭化シアノゲンで処理すると、重合体の隣接水酸基との
反応が起こつてイミドカーボネートが生成し、これは抗
体の親核基（アミノ基）と結合して、加水分解時に炭酸
エステルを生成する。酸性媒体中でイミドカーボネート
を急速加水分解すると、環状カーボネートが生成し、こ
れは結合においてイミドカーボネートほど効果的でない
。したがつて、環状カーボネート生成を促進するような
条件を避けるよう、注意を払うべきである。結合（コン
ジユゲーシヨン）に先立つ抗体の簡単な精製は必要に応
じて次のように行なうことができる。

１８％硫酸ナトリウム液１ｍ１を抗血清０．１ｍ１に加
えた。

この溶液を渦巻撹拌させ、１時間培養してγ−グロブリ
ンを沈殿させた。次いで、得られた混合物を室温で１０
００Ｘｇにて５分間遠心分離し、次いでデカントし、上
澄液を捨てた。ペレツトを、水０．１０ｍ１の添加によ
つて、１８（ｆ）硫酸ナトリウム液１０ｗＬ１中に懸濁
させた。次いで、得られた混合物を再び渦巻撹拌し、遠
心分離した。上澄液をデカントし、ペレツトを０．１モ
ル重炭酸ナトリウム溶液０．８ｍ１中に溶解された。本
発明においては、基質がこれに特異的で奔る抗原で飽和
されている間に、この基質に抗体をコンジユゲートさせ
るのが好ましい。この手順の理由は、コンジユゲーシヨ
ン過程の際に抗体上の活性個所を保護することによつて
、高められた活性を得るということであり、即ち活性個
所の使用性を確保するような基質との関係を抗体が保つ
ことを効果的に保証するためである。活性個所と抗原と
の結合は、或る意味で、抗体の配向をもたらし、これは
コンジユゲーシヨン過程による活性個所のマスキングを
低下させる。したがつて、抗体に対し特異的である抗原
の０，１〜／ｍｌ溶液０．５ｍ１部を、エタノール一水
溶液（エタノール２部および水１部）の中に溶解し、そ
して窒素ガスを用０て試験内で乾操させた。

精製した抗血清を０．１モルの重炭酸ナトリウム０．８
ｍ１に溶解させ、即ち０．１モル重炭酸ナトリウム０．
８中の抗血清０．１ｄを、乾操抗原含有の試験管に加え
、次いで密栓した培葉管中で１時間培養した。その後、
シアノゲン活性化した重合体被覆基質３００Ｔｒ１９を
、抗体溶液含有の試験管に加え、そして混合しながら４
℃で１〜３日間培養した。培養期間中、抗原結合個所を
有する抗体が結合抗原によつて保護されながら、コンジ
ユゲーシヨンが起こつた。培養の後、懸濁物を１０００
Ｘ９にて５分間遠心分離し、そして上澄液をデカントし
て捨てた。

ペレツトを０．５モル重炭酸ナトリウム溶液１．０ｍ１
で゛２回洗浄した。各洗浄の後、懸濁物を遠心分離し、
そして上澄液を捨てた。次いで、抗体被覆された基質を
０．１モル酢酸塩緩衝液（ＰＨ４）１０ｍ１で２回洗浄
した。次いで、この抗体被覆した基質を、塩化ナトリウ
ム０．０５モルおよび０．５の子牛血清アルブミンおよ
び保在料としての０．０２０１）のナトリウムアジを含
有する０．０５モルの隣酸塩緩衝液（ＰＨ７．５）の１
０ｍ１で洗つた。次いで、得られた生成物を最終の洗浄
溶液１０ｍ１の中に再懸濁させ、４℃で貯蔵した。得ら
れた生成物は、分析に使用する前に、上記した溶液の一
つで洗い、固定化抗体に結合させている抗原を放出させ
る・。

しかし、貯蔵の際には抗原が抗体に結合されたま＼であ
ることが好ましい。本発明によれば、抗体を遊離の状態
で基質に結合させることが可能である。この過程は、シ
アノゲン活性化された重合体？覆基質に対する抗体の混
合、次いで培養および既述したような後処理を含む。本
発明の一局面は、固定化した免疫吸着剤に対するチヤン
バ一・ホルダーを提供することである。

第２図について述べれば、チヤンバ一・ホルダー２５は
支持体２７を含んでおり、この支持体は装置を容易化す
るため形状が円筒状である。支持体２７内にはチヤンバ
一３０が設けられ、これは微粒子物質として示した固定
化免疫吸着剤３２を含有する。免疫吸着剤は、多孔性プ
ラグ３４（これの孔寸法は免疫吸着剤を構成する粒子よ
りも小さい）によりチヤスバー内に支持される。入口３
８からチヤンバーを通つて流出する物質の出口として出
口３６が備えられる。プラグ３４は支持体にプレスフイ
ツトさせ６、これはたとえばポリプロピレンまたは「デ
ルリン（ＤＥＬＲＩＮ）」のようなプラスチツク材料で
あつてもよい。例として、チヤンバーは直径１／８イン
チ、長さ１／４インチであり、一方プラグは１／８イン
チ×１／８インチでありかつ孔寸法１０ミクロンである
。入口通路内にはフイルター要素４１および４３が位置
しており、フイルター要素４１は４００メツシユのナイ
ロンスクリーンの形態であつて、これは好ましくはポリ
テトラフルオロエチレンより成りかつ孔寸法１０ミクロ
ン以下のフエルト状をしたフイルター円板４３に支持さ
れている。

図示されているように、チヤンバ−３０はその両末端に
、拡大した末端部分４６および４７を有しており、これ
らはそのそれぞれがプレスフイツ卜したプラグ４８およ
び４９を受入れるような深座ぐりの形をしている。各プ
ブグはそれぞれ内部深座ぐり５１，５３およびそこを通
る通路を図のように有している。チヤンバ−３０に面す
るプラグの一端に、プラグは末広状の円錐形開口５６，
５７およびＯ−リングシール要素を受け入れる環状シヨ
ルダーを図示したように有しており、０リング要素は支
持体２７のそれぞれの深座ぐり末端にシールを形成して
いる。プラグ４９はフイルタ−４１および４３を所定位
置に押し付けるように働らき、スクリーン４１はフエル
トが円錐状開口５７に入り込むのを防ぐように働らいて
いる。

チヤンバー・ホルダーへの接続は末端プラグ４８，４９
およびその末端ボア５１，５３を介している。

したがつて、チヤンバー・ホルダーは一単位として取外
され、そして特定分析に付される抗原に対して特異的な
抗体を有する免疫吸着剤のチヤンバー・ホルダーと交換
される。使用しない場合、適当に同定されているチヤン
バー・ホルダーは４℃で貯蔵することができる。固定化
した免疫吸着剤を支持するための上記のようなチヤンバ
ー・ホルダーは同定された各種抗原の分析に使用される
。

本発明の免疫吸着剤はそれぞれの免疫吸着剤につき５０
０回の分析にわたつて使用され、それでもなお古典的方
法で得られる結呆よりも好ましい結果、即ち標準偏差５
〜６％を以て働らき続ける。チヤンバー・ホルダーは、
チヤンバーに対する入口末端に末広がりの円錐５７を含
んでおり、この円錐５７の目的は千ヤンバ−３０内の微
粒子状免疫吸着剤の床全体に流れを分散させるためであ
る。

末広がり開口５６は出てくる物質のコレクターとして作
用し、一方プラグ４６はチヤンバー内に多孔性プラグ３
４を支持する。使用しうる重合体としてデキストランを
挙げたが、本発明はそのような特定の物質に限定される
ものではない。

臭化シアノゲン活性化を受けうる水酸基を有するその他
の水不溶性重合体物質、たとえばセルロースなども使用
することができる。しかし、デキストランが好適である
。何故なら、従来技術の放射線免疫分析にこの物質たと
えばデキストラン被覆された木炭がかなり使用されるか
らであり、そして環境におけるその挙動はこの方法に対
して不利益でない。ここに開示された主題に関し種々の
変更をなしうることは当該分野の技術者にとつて明白で
ある。

たとえば、バリヤー被覆は、基質の活性が潜在的な問題
となつているような他の基質をマスクするためにも使用
することができる。本発明の例示的な上記の記載から、
本発明の範囲を逸脱することなしに、その他の変更、変
化および選択もなしうることが明白である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、切断された部分を有する透視断面図であり、
本発明にしたがつて使用しうる基質を図示している。 第２図は、本発明によるチヤンバー・ホルダーの断面図
である。図において、１０は基質を形成する粒子、１２
は核、１４は微粒子、１５は多孔性被覆であり、また２
５はチヤンバー・ホルダー、２７は支持体、３２は固定
化した免疫吸着剤、３４は多孔性プラグ、そして４１お
よび４３はフイルター要素である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 支持構造体、 該支持構造体内に形成されたチャンバー、該チャンバー
   該チャンバー内に位置せしめた固定化した免疫吸着剤よ
   り成り、該免疫吸着剤は脱水および崩壊に対して安定な
   耐火性粒子より成る基質を含んでおり、該基質はそれに
   化学的に結合した水不溶性の重合体より成るバリヤー被
   覆と、特定抗原を結合するための該バリヤー被覆に化学
   的に結合した抗体を有しており、さらに該チャンバー内
   に該固定化した免疫吸着剤を支持するため、該チャンバ
   ーと協力する支持手段から成る、固定化した免疫吸着剤
   のためのチャンバー・ホルダー。 ２ 支持構造体はチャンバーを通る流体の通路のための
   入口および出口を形成する手段を含んでいる、特許請求
   の範囲第１項記載のチャンバー・ホルダー。 ３ 入口は流体が免疫吸着剤と接触する前にフィルター
   手段を通るように、フィルター手段を有している特許請
   求の範囲第２項記載のチヤンバー・ホルダー。 ４ 基質が１０〜５００ミクロンの範囲の平均直径を有
   するビーズでできている、特許請求の範囲第１項記載の
   チャンバー・ホルダー。 ５ 支持手段が多孔性プラグである、特許請求の範囲第
   ４項記載のチャンバー・ホルダー。 ６ プラグ中の孔隙がビーズの直径よりも小い、特許請
   求の範囲第５項記載のチャンバー・ホルダー。 ７ ビーズが、多孔性である表面および該多孔性表面と
   結合した固体の核を含んでおり、バリヤー被覆は該多孔
   性表面と結合している、特許請求の範囲第４項記載のチ
   ャンバー・ホルダー。 ８ 基質が、核と核に比較して小直径で全体として大き
   な表面積の外部表面を有している固体粒子の集団とを含
   み、該固体粒子の外部表面がバリヤー被覆されている特
   許請求の範囲第１項記載のチャンバーホルダー。 ９ 重合体がデキストランである、特許請求の範囲第８
   項記載のチャンバー・ホルダー。 １０ プラグ中の孔隙が１０ミクロン以下である、特許
   請求の範囲第６項記載のチャンバー・ホルダー。 １１ 入口が、流体チャンバーに入るにしたがつて該流
   体の流れを分散させるための手段を含む、特許請求の範
   囲第２項記載のチャンバー・ホルダー。 １２ 脱水および崩壊に対して安定な耐火性粒子より成
   る基質、該基質に化学的に結合された水不溶性の重合体
   、および特定抗原を結合するために該重合体に化学的に
   結合された抗体、から成る固定化した免疫吸着剤。 １３ 基質が大きな表面積の外部表面を有し、水不溶性
   の重合体が水酸基を有しており、そして抗体がイミドカ
   ーボネート結合により該重合体に結合されている、特許
   請求の範囲第１２項記載の固定化した免疫吸着剤。 １４ 重合体がデキストランである、特許請求の範囲第
   １３項記載の固定化した免疫吸着剤。 １５ 粒子が、微球形物の外部多孔性外皮で被覆された
   不浸透性のガラス球状物である、特許請求の範囲第１４
   項記載の固定化した免疫吸着剤。 １６ 球状物が直径５〜５００ミクロンであり、そして
   微球状物が直径５ミリミクロン乃至１ミクロンである。 特許請求の範囲第１５項記載の固定化した免疫吸着剤。
   １７ 基質の表面積が０．８〜１．０ｍ＾２／ｇである
   、特許請求の範囲第１６項記載の固定化した免疫吸着剤
   。 １８ 重合体がシラン結合によつて粒子に結合されてお
   り、そして抗体がイミドカーボネート結合によつて重合
   体に結合されている、特許請求の範囲第１２項記載の固
   定化した免疫吸着剤。 １９ 抗体が、該抗体に対して特異的である抗原をそこ
   に放出可能に結合しうる、特許請求の範囲第１２項記載
   の固定化した免疫吸着剤。 ２０ 水不溶性重合体物質を結合させるために、脱水お
   よび崩壊に対して安定な耐火性粒子より成る基質を処理
   してこれを化学的に活性化せしめ、該活性化された基質
   に該重合体物質を化学的に結合せしめ、抗体を結合させ
   るために、該重合体を化学的に活性化せしめ、そして該
   活性化された重合体基質に、該抗体に対して特異的であ
   る抗原を化学的に結合して有する抗体の集団をコンジユ
   ゲートさせる、ことを特徴とする、固定化した免疫吸着
   剤の形成方法。 ２１ 既知量のラベルした抗原および未知かつラベルし
   てない抗原を、該抗原に対して特異的な抗体を結合して
   有する固定化した免疫吸着剤と接触せしめて、ラベルし
   たおよび未知である抗原の一部を結合させ、それによつ
   て結合した画分と結合してない画分とを形成せしめ、そ
   して未知抗原の濃度を結合したもしくは結合してない画
   分またはその両者の函数として測定し、そして免疫吸着
   剤を溶出用媒体で洗うことにより該免疫吸着剤から、結
   合している画分を放出せしめる、放射線免疫分析法にお
   いて、既如量のラベルした抗原および未知かつラベルし
   てない抗原の混合物を、該抗原に対して特異的である抗
   体であつてかつ耐火性粒子より成る基質に化学的に結合
   された水不溶性の重合体に対して共有結合的に結合され
   ている該抗体に、接触させつゝ流すことを特徴とする方
   法。 ２２ 水不溶性の重合体が水酸官能基を有する、特許請
   求の範囲第２１項記載の放射線免疫分析法。 ２３ 重合体がデキストランである、特許請求の範囲第
   ２２項記載の放射線免疫分析法。 ２４ 基質が表層多孔質である、特許請求の範囲第２１
   項記載の放射線免疫分析法。 ２５ 重合体がシラン結合によつて物質に結合されてお
   り、そして抗体がイミドカーボネート結合によつて該重
   合体に結合されている、特許請求の範囲第２４項記載の
   放射線免疫分析法。