JPS59159790A - Production of codein with immobilized plant cells - Google Patents
Production of codein with immobilized plant cellsInfo
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- JPS59159790A JPS59159790A JP3486983A JP3486983A JPS59159790A JP S59159790 A JPS59159790 A JP S59159790A JP 3486983 A JP3486983 A JP 3486983A JP 3486983 A JP3486983 A JP 3486983A JP S59159790 A JPS59159790 A JP S59159790A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、固定化植物細胞を用いたコディンの製造方法
に関Jる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing codin using immobilized plant cells.
たとえば固定化HfRによるアルコール発酵のように、
微生物の固定化細胞を利用して種々の天然物を生産させ
たり、あるいは中間物質を投与してこれをより有用な物
質に変換させたりする、いわゆるバイオリアクター法は
、すでに実用されている。For example, alcoholic fermentation with immobilized HfR,
The so-called bioreactor method, which uses immobilized microorganism cells to produce various natural products or administers intermediate substances and converts them into more useful substances, is already in practical use.
高等植物の細胞や細胞培養物のもつ代謝能力を利用して
、同様なことを行なう試みがなされており、たとえば特
許出願公表昭56−500736号公報には、多孔質の
ポリマー粒子中に植物細胞を固定化したものを「触媒」
とよび、これを用いて天然物の生産または変換を行なう
ことが提案されている。 具体的な開示は、固定化ケジ
ギタリノ
ス細胞を用いたジギトキシンのジゴキシンへのヒドロキ
シ化、固定化ニチニチソウ細胞を用、いたアジュマリシ
ンやセルペンチンの製造、および固定化A7エヤマアオ
キ細胞を用いたアントラキノン類の合成である。 固定
化植物細胞が、このようなバイオリア・フタ−として使
用できるためには、その植物細胞のもつ特殊な代謝機能
が固定化後も失なわれないこと、および代謝生産物を培
地中に放出し培地から回収可能であり、固定化植物細胞
がくり返し使用できることが必要である。Attempts have been made to do similar things by utilizing the metabolic abilities of higher plant cells and cell cultures. A “catalyst” is a substance that has been immobilized.
It has been proposed to use it to produce or convert natural products. Specific disclosures include the hydroxylation of digitoxin to digoxin using immobilized Kegitalinos cells, the production of ajmaricin and serpentin using immobilized Catharanthus periwinkle cells, and the synthesis of anthraquinones using immobilized A7 Eyama Aoki cells. be. In order for immobilized plant cells to be used as such biorea lids, it is necessary that the special metabolic functions of the plant cells are not lost even after immobilization, and that metabolic products are not released into the medium. It is necessary that the fixed plant cells can be recovered from the culture medium and used repeatedly.
本発明者は、周知の鎮咳作用を有するためきわめて有用
であるにもかかわらず、薬用植物から抽出するほかに取
得できなかったコディンを、固定化植物細胞を利用して
コディノンの変換により製造することを着想して実験の
結果、これが高い収率で実現することを見出したので、
ここに提案する次第である。The present inventor has developed a method to produce codin by converting codinone using immobilized plant cells, which is extremely useful due to its well-known antitussive effect but could not be obtained other than by extracting it from medicinal plants. As a result of experiments, we found that this can be achieved with a high yield.
I would like to propose it here.
本発明の固定化植物細胞を用いたコディンの製造方法は
、ケシ植物の細胞を固定化して得た固定化植物細胞に、
培養液中で、コディノンを投与してコディンに変換させ
、生成したコディンを分離回収することからなる。 こ
の目的に使用できるケシ植物は、P apaver
somniferum またはPsetigerum
である。The method for producing codin using immobilized plant cells of the present invention includes immobilized plant cells obtained by immobilizing poppy plant cells,
The method consists of administering codinone to convert it into codin in a culture solution, and separating and collecting the produced codin. A poppy plant that can be used for this purpose is Papaver
somniferum or Psetigerum
It is.
固定化づべぎ細胞は、寒天培地など適宜の培地で培養し
てカルスとしたものを、液体培地に移して培養を続け、
生育を活発にしたものが有用であるが、カルスでもよく
、さらには新鮮な細胞そのものでも使える。 また、プ
ロトプラストも使用可能である。゛ 固定化に使用する
植物の部位は任意であるが、カルスを経る場合は花系ま
たは芽生え、また新鮮細胞を用いる場合は、さく果がと
くに好適である。Immobilized Zubegi cells are cultured in an appropriate medium such as agar medium to form a callus, then transferred to a liquid medium and continued to be cultured.
Actively growing cells are useful, but callus or even fresh cells themselves can be used. Protoplasts can also be used.゛ The part of the plant used for immobilization is arbitrary, but when using callus, the flower system or sprout is particularly suitable, and when using fresh cells, the capsule is particularly suitable.
こうして得た細胞の固定化は、既知のいずれの方法によ
ってもよいが、包括法とくにアルギン酸ノJルシウムの
ゲルで包み込む方式が最適である。The cells thus obtained may be immobilized by any known method, but the enveloping method, especially the enveloping method in a gel of lucium alginate, is optimal.
これは、たとえば後に記す実施例のように、小さな細胞
を3%くらいのアルギン酸ナトリウム水溶液中に懸濁さ
せたものを、塩化カルシウムのような強電解質のホー液
中に滴下して、ゲルを固まらせ、直径がたとえば3II
IIIlの粒状体を形成することにより実施すればよい
。 このようにしてゲル中に包括した細胞は、さらにあ
る期間培養液中で成育させて、バイオリアクター用の固
定化植物細胞とする。 培養液は、M uraslli
(Je and S k001]培地にKineti
n のような植物成長調節剤を加えた系が適当である
。 もちろん、他の系統の培養液も使用できる。For example, as in the example described later, small cells suspended in an aqueous solution of about 3% sodium alginate are dropped into a strong electrolyte solution such as calcium chloride, and the gel is solidified. For example, if the diameter is 3II
This may be carried out by forming granules of III. The cells thus encapsulated in the gel are further grown in culture for a period of time to provide immobilized plant cells for the bioreactor. The culture solution is Muraslli
(Je and S k001) Kineti in the medium
Systems with added plant growth regulators such as n. Of course, culture solutions of other strains can also be used.
このようにして固定化植物細胞の活性が高まったならば
、培地中にコデイノンを投与して、コディンへの変換反
応を行なわせる。 投与量は、培地中の濃度にして0.
01〜10%、とくに0゜02〜5%程疫が適当である
。 あまり少量では収聞が低いし、多量にすぎると10
0%近い変換を望めなくなる。Once the activity of the immobilized plant cells has been increased in this manner, codeinone is administered into the medium to cause the conversion reaction to codin. The dose is 0.00% in concentration in the medium.
0.01 to 10%, especially 0.02 to 5% is suitable. If the amount is too small, the reception will be low, and if it is too large, it will be 10
You will not be able to expect a conversion close to 0%.
変換反応は、バッチ式が容易であるが、連続的にも実施
でき、大規模な@i造の場合はその方が有利になるであ
ろう。The conversion reaction can easily be carried out batchwise, but it can also be carried out continuously, which would be more advantageous in large-scale production.
温度は、15〜37℃で実施でき、18〜26℃が適当
である。The temperature can be 15-37°C, suitably 18-26°C.
時間は、上記の濃度および渇麿条件において、バッチ式
の場合、1週間以内とくに1〜3日間が適当であって、
3日の後には投与したコデイノンのほぼ100%がコデ
ィンに変換される。In the case of batch type, the appropriate time is within one week, especially 1 to 3 days, under the above concentration and drying conditions.
After 3 days, almost 100% of the administered codeinone is converted to codine.
生成したコディンの分離回収は、まず、培地から固定化
ケシ植物細胞を分離して、液を酸性にし、有機溶剤抽出
を行なって得た水層にアンモニア水などを加えて弱アル
カリ性とし、再度溶剤抽出をして、有11tlf?iを
得る。これがモルフィナンアルカロイド分画であって、
ここからコディンを再結晶などの手法で回収精製する。To separate and recover the generated codin, first separate the immobilized poppy plant cells from the medium, make the solution acidic, perform organic solvent extraction, make the aqueous layer slightly alkaline by adding aqueous ammonia, etc., and then remove the solvent again. After extraction, there is 11tlf? get i. This is the morphinan alkaloid fraction,
From this, codin is recovered and purified using methods such as recrystallization.
分離した固定化ケシ植物細胞は、くり返し使用する。The isolated immobilized poppy plant cells are used repeatedly.
新しい固定化ケシ植物細胞にはじめに投与したコデイノ
ンは、はぼ100%コディンに変換されるようであるが
(高濃度に投与しない限り培地中に未反応コデイノンは
ほとんど残留していない)、一部は細胞中にとり込まれ
るので、すべてを取得することはできないが、くり返し
使用して定常状態に至れば、培地中に放出される量が増
えるので、収率にして60%を確保することは容−易で
ある。Codeinone initially administered to freshly immobilized poppy plant cells appears to be almost 100% converted to codine (there is almost no unreacted codeinone remaining in the medium unless administered at high concentrations), but some Since it is taken up into the cells, it is not possible to obtain all of it, but if it is used repeatedly and reaches a steady state, the amount released into the medium will increase, so it is not possible to secure a yield of 60%. It's easy.
丸−LJL
ケシ(P apaver somniferum)の
和光の部分を切断し、寒天培地上で3″ij4間培養し
て得たカルスを液体培地に移植して、温度26℃、暗い
所で6日間、振とう培養した。Maru-LJL The Wako part of poppy (Papaver somniferum) was cut and cultured on an agar medium for 3''ij4. The resulting callus was transplanted to a liquid medium and incubated at a temperature of 26°C in the dark for 6 days with shaking. It was cultivated for a long time.
活発に生育しはじめた細胞を34メツシユのナイロンク
ロスでふるって大きい塊を除き、20メツシユのナイロ
ンクロスで紹取した。Cells that had begun to grow actively were sieved with a 34-mesh nylon cloth to remove large clumps, and introduced with a 20-mesh nylon cloth.
濾取した新鮮細胞0.50cm3を計量して、別に用意
した3呪アルギン酸ナトリウム液に懸濁した。 この液
は、市販のアルギンm<粘度的100′)Ip)を3%
水溶液としてオートクレーブ滅菌し、室温に冷却したも
のである。0.50 cm3 of the fresh cells collected by filtration was weighed and suspended in a separately prepared sodium alginate solution. This liquid contains 3% commercially available algin m<viscosity 100')Ip)
It was sterilized in an autoclave as an aqueous solution and cooled to room temperature.
細胞を懸濁した3%アルギン酸すl〜リウム液50−を
0.1M−Ca Cl 2溶液中に滴下して、直径3I
IIIIlはどのゲルを得た。A solution of 3% sodium alginate in which cells were suspended was added dropwise to a 0.1M CaCl2 solution, and a diameter of 3I was added.
III Which gel was obtained?
このゲルをナイロンクロスで濾取し、培養液に入れて再
び温度26℃の条件で、暗所において80 rpmの回
転振とう機を用いて3日間生育させて固定化細胞とした
。 ゲル1粒あたりの細胞数は、平均約330個であっ
た。This gel was collected by filtration using a nylon cloth, put into a culture medium, and grown again at a temperature of 26° C. in the dark for 3 days using a rotary shaker at 80 rpm to obtain fixed cells. The average number of cells per gel was about 330.
上記の固定化ケシ植物細胞を、
2.4−D 1ppm
K 1netin 0 、 11)l)II
Iココナツト・ミルク 7%
を含む M urashige and 3 koo
g 培地で1週間培養後、(−)−コディノンを培養
液2’50dあ1=す5mgの割合で投与して固定化細
胞による変換反応を行なわせた。The above immobilized poppy plant cells were treated with 2.4-D 1 ppm K 1 netin 0, 11) l) II
I Contains 7% coconut milk Murashige and 3 koo
After culturing in the medium for one week, (-)-codinone was administered at a ratio of 5 mg of the culture solution 2'50 d/1 to induce a conversion reaction using the immobilized cells.
3日後、固定化細胞と培地とをナイロンクロスで分離し
、培地は下記の抽出操作で処理して、モルフィナンアル
カロイド画分を得た。After 3 days, the fixed cells and the medium were separated with a nylon cloth, and the medium was treated with the extraction procedure described below to obtain a morphinan alkaloid fraction.
上記のモルフィナンアルカロイドを、シリカゲルを用い
たTLC法により、定性および定量分析した。 その結
果、投与したコディノンは完全に消失し、コディンが生
成していることが確認された。 1週間の反応後の変換
率はほぼ100%と推定されるが、培地中に含まれてい
たコディンは約2maであるから、収率は40%であっ
た。 残りは固定化細胞中にとり込まれているものと考
えられる。The above morphinan alkaloid was qualitatively and quantitatively analyzed by TLC method using silica gel. As a result, the administered codinone completely disappeared, and it was confirmed that codin was being produced. The conversion rate after one week of reaction is estimated to be approximately 100%, but since the codin contained in the medium was approximately 2 ma, the yield was 40%. The remainder is considered to have been incorporated into the fixed cells.
培地と分離した固定化細胞を再度使用し、コデイノンか
らコディンへの変換反応をくり返した。The fixed cells separated from the medium were used again to repeat the conversion reaction from codeinone to codin.
定常状態では、コディンの収率は60〜69%に達した
。At steady state, the yield of codin reached 60-69%.
(モルフィナン
アルカロイド分画)
特許出願人 古 谷 力
代理人 弁理士 須 賀 総 夫
手続ネ…正書(自発)
昭和58年4月7日
特許庁長官 若 杉 和 夫 殿
1、事件の表示
昭和5E!、年特許願第34869号
2、発明の名称
固定化植物細胞を用いた]ディンの製造方法3゜補正を
する者
事件との関係 特許出願人
住所 東京都練馬区南大泉四丁目20番33号氏名 古
谷 力
4、代理人〒104
住所 東京都中央区築地二丁目15番14号明細書の
発明の詳細な説明の欄
頁−行 誤 正
5−6 花糸 花糸
7−19 花糸 花糸
8−8 アルギン酸 アルギン酸ナトリウム8−16
3日間 7日間(Morfinan alkaloid fraction) Patent applicant: Riki Furuya Patent attorney: Souo Suga Proceedings (spontaneous) April 7, 1980 Commissioner of the Patent Office Kazuo Wakasugi 1, Indication of the case Showa 5E! , Patent Application No. 34869 2, Title of the Invention: Process for producing din using immobilized plant cells 3゜Relationship with the person making the amendment Patent applicant address: 20-33 Minami-Oizumi 4-chome, Nerima-ku, Tokyo Name Chikara Furuya 4, Agent 104 Address 2-15-14 Tsukiji, Chuo-ku, Tokyo Column for detailed description of the invention in the specification Page-Line Wrong Correct 5-6 Filar thread Filar thread 7-19 Filar filament 8-8 Alginic acid Sodium alginate 8-16
3 days 7 days
Claims (4)
胞に、培養液中で、コディノンを投与してコディンに変
換させ、生成したコゲインを分離回収することからなる
固定化植物細胞を用いたコディンの製造方法。(1) Using immobilized plant cells, which is obtained by immobilizing poppy plant cells, administering codinone to the immobilized plant cells in a culture medium to convert them to codine, and separating and collecting the produced cogaine. How to make Kodin.
ン酸カルシウムのゲル中に固定したものである特許請求
の範囲第1項の製造方法。(2) The manufacturing method according to claim 1, wherein the immobilized plant cells are poppy plant callus immobilized in calcium alginate gel.
3 koog培地に少量の2.4−DlKinet
in およヒーsコナット・ミルクを加えたものを特
徴する特許請求の範囲第1項または第2項の製造方法。(3) As a culture solution Murashige and
3 Add a small amount of 2.4-DlKinet to Koog medium
3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that coconut milk is added to the coconut milk.
した培養液を酸性にし、有機溶媒で抽出して得た水層を
弱アルカリ性としたのち有機溶媒で抽出することにより
行なう特許請求の範囲第1項ないし第3項のいずれかの
製造方法。(4) A claim that separates and recovers codin by acidifying a culture solution from which immobilized plant cells have been separated, making the aqueous layer obtained by extraction with an organic solvent slightly alkaline, and then extracting with an organic solvent. The manufacturing method according to any one of paragraphs 1 to 3.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3486983A JPS59159790A (en) | 1983-03-03 | 1983-03-03 | Production of codein with immobilized plant cells |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3486983A JPS59159790A (en) | 1983-03-03 | 1983-03-03 | Production of codein with immobilized plant cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59159790A true JPS59159790A (en) | 1984-09-10 |
JPH0518558B2 JPH0518558B2 (en) | 1993-03-12 |
Family
ID=12426159
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3486983A Granted JPS59159790A (en) | 1983-03-03 | 1983-03-03 | Production of codein with immobilized plant cells |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59159790A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4657861A (en) * | 1984-02-24 | 1987-04-14 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | S-tetrahydroprotoberberineoxidase, process for producing the same and use thereof |
-
1983
- 1983-03-03 JP JP3486983A patent/JPS59159790A/en active Granted
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4657861A (en) * | 1984-02-24 | 1987-04-14 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | S-tetrahydroprotoberberineoxidase, process for producing the same and use thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0518558B2 (en) | 1993-03-12 |
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