JPS59156280A - グリセロ−ル脱水素酵素及びその製造法 - Google Patents
グリセロ−ル脱水素酵素及びその製造法Info
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- JPS59156280A JPS59156280A JP58032626A JP3262683A JPS59156280A JP S59156280 A JPS59156280 A JP S59156280A JP 58032626 A JP58032626 A JP 58032626A JP 3262683 A JP3262683 A JP 3262683A JP S59156280 A JPS59156280 A JP S59156280A
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- glycerol
- enzyme
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
且つクリセロール( glycerol)に対し基質特
異性を有する新規グリセロール脱水素酵素B及びその製
造法に関するものである。
異性を有する新規グリセロール脱水素酵素B及びその製
造法に関するものである。
従来、ガラフタル酸を特異的に資化利用する微生物を用
いてグリセロールに対し基質特異性を有する脱水素酵素
を採取する方法及び該脱水素酵素については全く知られ
ていない。グリセロールデヒドロダナーゼは、NADの
存在下でグリセロールを酸化してジヒドロキシアセトン
を生成し、又還元型NADの存在下でクリセーロールを
生成せしめるが、従来のグリセロールデヒドロダナーゼ
は、上記酸化、還元における最適pi条件( pH域)
は全く異なる(例えば、酸化の場合pH9−9.3、還
元の場合、pH5〜7程度である)。本発明者等は、先
にガラフタル酸を含む培地で、バチルス( Bacil
lus)属に属するガラフタル酸質化利用性菌を培養し
、その培養物よシ培養菌体を回収することt−特徴とす
る細菌菌体の製造法を完成したが(特願昭!;l,−7
3. gコ/号明細書参照)、その産生物質についで鋭
意研究した結果、グリセロールに対する基質特異性が極
めて高く、又、上記グリセロール酸化、ジヒドロキシア
セトンの還元の双方における最適pi条件が近似してい
る新規なグリセロール脱水素酵素を分離採取することに
成功し、本発明を完成するに至った。
いてグリセロールに対し基質特異性を有する脱水素酵素
を採取する方法及び該脱水素酵素については全く知られ
ていない。グリセロールデヒドロダナーゼは、NADの
存在下でグリセロールを酸化してジヒドロキシアセトン
を生成し、又還元型NADの存在下でクリセーロールを
生成せしめるが、従来のグリセロールデヒドロダナーゼ
は、上記酸化、還元における最適pi条件( pH域)
は全く異なる(例えば、酸化の場合pH9−9.3、還
元の場合、pH5〜7程度である)。本発明者等は、先
にガラフタル酸を含む培地で、バチルス( Bacil
lus)属に属するガラフタル酸質化利用性菌を培養し
、その培養物よシ培養菌体を回収することt−特徴とす
る細菌菌体の製造法を完成したが(特願昭!;l,−7
3. gコ/号明細書参照)、その産生物質についで鋭
意研究した結果、グリセロールに対する基質特異性が極
めて高く、又、上記グリセロール酸化、ジヒドロキシア
セトンの還元の双方における最適pi条件が近似してい
る新規なグリセロール脱水素酵素を分離採取することに
成功し、本発明を完成するに至った。
本発明において、「グリセロール脱水素酵素B」とは、
以下に記載する理化学的性*を有する酵素で、特徴的な
性質として最適作用pHをほぼ9!3附近に有し、且つ
グリセロールに対する基質特異性が極めて高いグリセロ
ール脱水素酵素を相称するものとする。
以下に記載する理化学的性*を有する酵素で、特徴的な
性質として最適作用pHをほぼ9!3附近に有し、且つ
グリセロールに対する基質特異性が極めて高いグリセロ
ール脱水素酵素を相称するものとする。
以下に、本発明について詳述する。
ガラフタル酸(ムチン酸)は、ガラクトースの糖酸であ
シ、木材などに含まれるガラクタン、及びガラクトース
、ラクトース、ラフィノース、ガラクトース、植物粘液
質などガラクトース又はその誘導体を含む物質を硝酸酸
化することにより大量に得られる物質である。
シ、木材などに含まれるガラクタン、及びガラクトース
、ラクトース、ラフィノース、ガラクトース、植物粘液
質などガラクトース又はその誘導体を含む物質を硝酸酸
化することにより大量に得られる物質である。
本発明方法に用いる微生物は、以下に詳述されるように
、ガラフタル酸を資化利用するものであシ、バチルス属
に属する菌種であって、この菌種トシて、前記バチルス
・エスピー・G−/(’Bacil!j+s 5p−G
−/ ) (以下、rG−/菌]と称する)が挙げら
れる。
、ガラフタル酸を資化利用するものであシ、バチルス属
に属する菌種であって、この菌種トシて、前記バチルス
・エスピー・G−/(’Bacil!j+s 5p−G
−/ ) (以下、rG−/菌]と称する)が挙げら
れる。
なお、前記G−/菌の他にその自然的又は人為的変異種
もガラフタル酸の資化利用性を有する限シ、本発明方法
に用い得ることは当然である。
もガラフタル酸の資化利用性を有する限シ、本発明方法
に用い得ることは当然である。
前記G−/菌は、昭和56年3月lq日、工業技術院微
生物工業技術研究所へ、微工研菌寄第592S号として
寄託された。前記G−/菌は、次の菌学的性質を有する
。
生物工業技術研究所へ、微工研菌寄第592S号として
寄託された。前記G−/菌は、次の菌学的性質を有する
。
なお下記の菌学的諸性質の試験及び分類方法はすべて「
バージニーズ マニュアル オブ デタミネイティブ
バクテリオロジー」 (第3版、iq’ttt年) C
Bergey’ s Manual of Deter
minativeBacter Iology (ざt
h edition + /97’A ) )に準拠し
て行なわれた。
バージニーズ マニュアル オブ デタミネイティブ
バクテリオロジー」 (第3版、iq’ttt年) C
Bergey’ s Manual of Deter
minativeBacter Iology (ざt
h edition + /97’A ) )に準拠し
て行なわれた。
0バチルス・エスピー・G−/菌の菌学的性質(a)
形態(肉汁寒天斜面培地) (1)細胞の大きさは、θろ〜θgμ×、2.0〜30
μの桿菌である。
形態(肉汁寒天斜面培地) (1)細胞の大きさは、θろ〜θgμ×、2.0〜30
μの桿菌である。
(2)細胞の多形性はガい。
(,71運動性があり鞭毛は周毛である。
(リ 胞子の大きさは07μ×07μで、胞子のうは細
胞の端に形成される。
胞の端に形成される。
(イ) ダラム染色性は変動性でおる。
ら)抗酸性は陰性である。
(b) 培地における生育状態
(1) 肉汁液体培地
苗種を形成し、沈渣を生じる。菌体は灰白色を呈する。
@ 肉汁寒天平板培地
発育は旺盛で、菌体は灰白色を呈するが、色素は培地中
に拡散しない。表面は平滑で、光沢があシ、コロニーの
周縁は金縁〜波状を呈する。
に拡散しない。表面は平滑で、光沢があシ、コロニーの
周縁は金縁〜波状を呈する。
■ 肉汁寒天斜面培地
(2)と同様の生育状態を示し、拡布状に生育する。
←) グルコース肉汁寒天平板培地
(2)と同様である。
α) 肉汁ゼラチン穿刺培地
pH7においては、ゼラチンを液化して、表面で発育し
、菌体は灰白色を呈する。pn / 0においては、ゼ
ラチンを液化しない。
、菌体は灰白色を呈する。pn / 0においては、ゼ
ラチンを液化しない。
<b) ’−”プトノ水
pH7およびpH/ 0においては表面に菌種全形成し
て、沈渣を生じる。1体は灰白色を呈するが、色素は培
地中に拡散しない。
て、沈渣を生じる。1体は灰白色を呈するが、色素は培
地中に拡散しない。
(7) リドマスミルク
リドマス色素を僅かに赤変し、凝固する。
娑)バレイショ培地
菌体は灰白色を呈する。
に) 白現的性質
V)゛硝酸塩の還元
還元する。
C2) 脱窒反応
隙性
(3メチルレッド(MR)試験
陰 性
←) 7.t−’l’ス・プロスカラエル(■P)反
応陰 性 0) インドールの生成 陰 性 (υ 硫化水素の生成 陽 性 (7)でんぷんの加水分解 陽性 ば) クエン酸の利用性(Koser培地及びChr
1stensenの培地) いずれも利用しない。
応陰 性 0) インドールの生成 陰 性 (υ 硫化水素の生成 陽 性 (7)でんぷんの加水分解 陽性 ば) クエン酸の利用性(Koser培地及びChr
1stensenの培地) いずれも利用しない。
(9)無機窒素源(アンモニウム塩、硝酸塩、尿素等)
の利用性 利用する。
の利用性 利用する。
(10)色素の生成
色素は生成しない。
(//) リドマス、メチレンブルー、コ、6−ジク
ロルフェノール、インドフェノ−ルナトノ色素の還元 リドマスを僅かに赤変する他、変化なし。
ロルフェノール、インドフェノ−ルナトノ色素の還元 リドマスを僅かに赤変する他、変化なし。
(/(2)ウレアーゼ
陰 性
(13)オキシダーゼ
陽 性
(/4) カタラーゼの生成
陽 性
(15)生育の範囲
生育し得る条件−は、pH7、θ〜/10、温度25〜
e5’cで好・気的であり、最適生育条件は、ptl
9.3近辺、温度37℃前後である。
e5’cで好・気的であり、最適生育条件は、ptl
9.3近辺、温度37℃前後である。
(/6)敢累に対する態度−
好欲性
(/7)O−Fテスト(Hugh Leifson法に
よる)酸化的並びに還元的に生育する。
よる)酸化的並びに還元的に生育する。
好気的並びに還元的にガスの生成はない。
(1g)牛乳の凝固
凝固する。
(/q)アンモニアの生成
陰 性
(刀 ゼラチン、カゼインの変化
液化する。
(,2/)塩化ナトリウムの耐性
S%塩化す) IJウム上で生育するが、10チ以上の
塩化ナトリウム上では生育しない。
塩化ナトリウム上では生育しない。
(d) 炭素源のオU用性
(1) L−アラビノース −
(2) D−キシロース −
(,7) D−グルコース +←) D−マン
ノース + (5)D−フルクトース + (6)D−ガラクトース + (η ラクトース − 富) マルトース 士 (9) サッカロース + (10)トレハロース + (ll)D−ソルビット − (/、2) D−マンニット +(13)イノ
ジット − (/4)グリセリン + (l(支)デンプン + (/6)ラフィノース − (/7)イヌリン − (7g)デキストリン + (/9)繊維素 − (至)サリシン + 以上の炭素源よシ好気的並びに嫌気的にガスの生成はお
こなわない。
ノース + (5)D−フルクトース + (6)D−ガラクトース + (η ラクトース − 富) マルトース 士 (9) サッカロース + (10)トレハロース + (ll)D−ソルビット − (/、2) D−マンニット +(13)イノ
ジット − (/4)グリセリン + (l(支)デンプン + (/6)ラフィノース − (/7)イヌリン − (7g)デキストリン + (/9)繊維素 − (至)サリシン + 以上の炭素源よシ好気的並びに嫌気的にガスの生成はお
こなわない。
(注):+ オリ用する(酸を生成する)。
−殆んど利用しない(酸全生成しな
い)
以上の微生物の菌字的諸性質から前記文献の分類方法に
従って使用微生@を検索するに当シ、前記のG−/菌を
バチルス(Baci I 1us) 属に為する公知
の′菌種と比較した。
従って使用微生@を検索するに当シ、前記のG−/菌を
バチルス(Baci I 1us) 属に為する公知
の′菌種と比較した。
前記G−/菌は、バチルス・ズブチリス(Bacill
us 5ubtilis )、バチルス・プミルス(a
aci l lus pumi 1us) 、バチルス
・すへニフォーミス(Bacillus lichen
iformis)、バチルス・セレウス(3aCi目u
s cereus ) 、バチ# ス−77ソラシス(
Bacillus anthracis) 、バチk
ス−7,リンジエンシス(Baclllus thur
inglensis)、バチシス0メガテリウム(Ba
cillus megaterium )、バチルス・
ステアロサーモフィラス(Bacillusstear
othermophNus ) 及びバチルス・フィ
ルマス(Baci flus firmus )と類似
している。
us 5ubtilis )、バチルス・プミルス(a
aci l lus pumi 1us) 、バチルス
・すへニフォーミス(Bacillus lichen
iformis)、バチルス・セレウス(3aCi目u
s cereus ) 、バチ# ス−77ソラシス(
Bacillus anthracis) 、バチk
ス−7,リンジエンシス(Baclllus thur
inglensis)、バチシス0メガテリウム(Ba
cillus megaterium )、バチルス・
ステアロサーモフィラス(Bacillusstear
othermophNus ) 及びバチルス・フィ
ルマス(Baci flus firmus )と類似
している。
しかしながら、G−/l[、アラビノース及びキシO−
スから酸の生成をせず、且つグルコースからのアセトイ
ンの生成がないのに対し、バチル、ス・ズブチリス及び
バチルス・リヘニフォーミスは共に、アラビノース及び
キシロースかうの酸)生成があり、且つグルコースから
のアセトインの生成カl:+ルA1.<チルス・フィル
マスは、アラビノース及びキシロースから酸の生成があ
る点、G−7茜は、でんぷんの加水分解を行い、且つ硝
酸塩の還元を行うのに対し、バチルス・プミルスは、い
ずれも行わない点にそれぞれ特徴的な差異を見出すこと
ができる。
スから酸の生成をせず、且つグルコースからのアセトイ
ンの生成がないのに対し、バチル、ス・ズブチリス及び
バチルス・リヘニフォーミスは共に、アラビノース及び
キシロースかうの酸)生成があり、且つグルコースから
のアセトインの生成カl:+ルA1.<チルス・フィル
マスは、アラビノース及びキシロースから酸の生成があ
る点、G−7茜は、でんぷんの加水分解を行い、且つ硝
酸塩の還元を行うのに対し、バチルス・プミルスは、い
ずれも行わない点にそれぞれ特徴的な差異を見出すこと
ができる。
又、G −/7muバチルス・セレウス、バチルス・ア
ンソラシス、バチルス・スリンジエンシス、バチルス・
ステアロサーモフィラス及ヒバチルス・メガテリウムと
比較して、菌体の大きさ、内生胞子の形態及びその位置
が異なり、更に、G−/菌は、マンニットからの酸の生
成があるのに対し、上記いずれの菌種も、共に酸の生成
がない点において特徴的な差異を見出すと七ができる。
ンソラシス、バチルス・スリンジエンシス、バチルス・
ステアロサーモフィラス及ヒバチルス・メガテリウムと
比較して、菌体の大きさ、内生胞子の形態及びその位置
が異なり、更に、G−/菌は、マンニットからの酸の生
成があるのに対し、上記いずれの菌種も、共に酸の生成
がない点において特徴的な差異を見出すと七ができる。
以上の検索結果を総括すると、G−/菌は、形態その他
の諸性質から、バチルス属に属する微生物とすることが
妥当でるるが、前記のとお#)種々の特徴的な菌学的性
質及びpF17.0〜/10の如き広範囲のアルカリ性
において生育する性質から判断して、明らかにバチルス
属に属する公知の菌種と区別されるため、これら′f:
新菌種として設定することが適当でおると結論され−f
c。
の諸性質から、バチルス属に属する微生物とすることが
妥当でるるが、前記のとお#)種々の特徴的な菌学的性
質及びpF17.0〜/10の如き広範囲のアルカリ性
において生育する性質から判断して、明らかにバチルス
属に属する公知の菌種と区別されるため、これら′f:
新菌種として設定することが適当でおると結論され−f
c。
次に培養条件として重要な点は、培養液のp)Iである
。実験結果から前記G−/菌を培養するに当ってその生
育繁殖はpH条件によって非常に影響を受けるので、培
地のpHは、はぼり0〜/10の範囲から選ばれた値に
調整することが心安であることが確かめられた。
。実験結果から前記G−/菌を培養するに当ってその生
育繁殖はpH条件によって非常に影響を受けるので、培
地のpHは、はぼり0〜/10の範囲から選ばれた値に
調整することが心安であることが確かめられた。
かくて上記の培養条件の下に前記微生物を接種し、適当
な条件、例えは、/g待時間37℃で振盪培養を行ない
、次いで、10.00Or、p、m で10分間遠心分
離後、水洗し、再度遠心分離して菌体を集め、蒸留水で
洗浄後、/、’10M、 pHg、 Sのトリス緩衝液
(Tris buffer) で懸渇し、該懸濁液を
超音波処理して菌体内酵素系の抽出を行う。
な条件、例えは、/g待時間37℃で振盪培養を行ない
、次いで、10.00Or、p、m で10分間遠心分
離後、水洗し、再度遠心分離して菌体を集め、蒸留水で
洗浄後、/、’10M、 pHg、 Sのトリス緩衝液
(Tris buffer) で懸渇し、該懸濁液を
超音波処理して菌体内酵素系の抽出を行う。
この抽出液を再度、遠心分離法によって上澄液を分離し
て該上澄液を菌体内酵素液とし、次いで硫酸アンモニウ
ムによる飽和分画を行い、さらにDEAE−セルロース
、DEAE−セフアゾ′ツクス(sephadex)、
ウルトログA/ACA%”イドロキシアノ<?タイト(
hydroxyapatite) k用いてカラムク
ロマトグラフィー及びダル濾過を行うことによって脱水
素酵素の精製標品を得ることができる。
て該上澄液を菌体内酵素液とし、次いで硫酸アンモニウ
ムによる飽和分画を行い、さらにDEAE−セルロース
、DEAE−セフアゾ′ツクス(sephadex)、
ウルトログA/ACA%”イドロキシアノ<?タイト(
hydroxyapatite) k用いてカラムク
ロマトグラフィー及びダル濾過を行うことによって脱水
素酵素の精製標品を得ることができる。
なお、菌体の破砕に当っては超音波処理方法のみならず
、通常知られている物理的方法が適用し得ることは当然
である。
、通常知られている物理的方法が適用し得ることは当然
である。
このようにして得られた脱水素酵素B(以下、「本酵素
」という。)は、以下に記載する如く、最適作用piが
ほぼ9.3附近で、グリセロールに対する基質特異性が
極めて高い性質を有する既知文献未載の新規脱水素酵素
(dehydrogenase)であることが証明され
た。
」という。)は、以下に記載する如く、最適作用piが
ほぼ9.3附近で、グリセロールに対する基質特異性が
極めて高い性質を有する既知文献未載の新規脱水素酵素
(dehydrogenase)であることが証明され
た。
0本酵素の理化学的性質
7作用及び基質特異性
本酵素は、前記G−/菌が、基質のガラフタル酸を炭素
源として発育した菌体より得られる脱水素酵素である。
源として発育した菌体より得られる脱水素酵素である。
後述の酵素活性迎J定法(8)により、多数の糖類及び
その誘導体に対する本酵素の基質特異性を調べたところ
、第1表のとおりの結果が得られた。この結果、特にグ
リセロールに対して基質特異性が極めて高いことが明ら
かにされた。表中の数値は、酵素活性(%)を示す(グ
リセロールを用いた場合を100%とする)。
その誘導体に対する本酵素の基質特異性を調べたところ
、第1表のとおりの結果が得られた。この結果、特にグ
リセロールに対して基質特異性が極めて高いことが明ら
かにされた。表中の数値は、酵素活性(%)を示す(グ
リセロールを用いた場合を100%とする)。
第 / 表
基 質 活 性()グリセロール
/ 00.0エチレングリコール
弘り112−プo □47 シ、t −/I
/ 7 Q S/、3−ゾロノfンジオール
’I O,!;l、3−ブタンジオール /3
.sコ、3−ブタンジオール ざ弘。
/ 00.0エチレングリコール
弘り112−プo □47 シ、t −/I
/ 7 Q S/、3−ゾロノfンジオール
’I O,!;l、3−ブタンジオール /3
.sコ、3−ブタンジオール ざ弘。
ハ2.II−ブタントリオール /ム?ハS−ベンタン
ジオール 乙θ エタノール 。
ジオール 乙θ エタノール 。
コープロバノール 。
メソイノシトール 3.クガラクチト
ール ユコユ最適pi及び安定pi範
囲 − 八〇−”Mピロリン酸緩衝液を用い、基質にグリセロー
ルを用いて30℃にて6pBにおける相対活性を調べた
ところ第7図の曲I!a(〇−〇)のとおシの結果が得
られた。この結果、本酵素の、グリセロールを用いた場
合の最適pHは、はぼ9!3附近であることが明らカニ
サれた。、又同様にして、基質にジヒドロキシアセトン
を用いて調べたところ、第1IEのb (@)−@)の
とおりの結果が得られ、本酵素の、ジヒドロキシアセト
ンを用いた場合の最適p■は、はホ9!0附近であるこ
とが明らかにされた。
ール ユコユ最適pi及び安定pi範
囲 − 八〇−”Mピロリン酸緩衝液を用い、基質にグリセロー
ルを用いて30℃にて6pBにおける相対活性を調べた
ところ第7図の曲I!a(〇−〇)のとおシの結果が得
られた。この結果、本酵素の、グリセロールを用いた場
合の最適pHは、はぼ9!3附近であることが明らカニ
サれた。、又同様にして、基質にジヒドロキシアセトン
を用いて調べたところ、第1IEのb (@)−@)の
とおりの結果が得られ、本酵素の、ジヒドロキシアセト
ンを用いた場合の最適p■は、はホ9!0附近であるこ
とが明らかにされた。
又、本酵素の種々のpn溶液を25℃、6゜分間処理し
た後、10−’Mビロリン酸緩衝液で’pal!;とし
、本酵素の残存活・性を調べたところ、第1図の曲線C
(Δ−Δ)のとおりの結果が得られ、pH’Z O−9
,6の範囲に安定pHが存在することが明らかにされた
。
た後、10−’Mビロリン酸緩衝液で’pal!;とし
、本酵素の残存活・性を調べたところ、第1図の曲線C
(Δ−Δ)のとおりの結果が得られ、pH’Z O−9
,6の範囲に安定pHが存在することが明らかにされた
。
3、作用適温の範囲
本酵素液を10−’Mピロリン酸緩衝液によりpH93
としく各温度における相対活性を調べたところ、第2図
の曲線d(○−O)のとおりの結果が得られ、本酵素の
最適作用温度は、4.5−℃附近であることが明らかに
された。
としく各温度における相対活性を調べたところ、第2図
の曲線d(○−O)のとおりの結果が得られ、本酵素の
最適作用温度は、4.5−℃附近であることが明らかに
された。
弘失活条件(温度安定性)
本溝素液をlθ−1Mピロリン酸緩衝液によシpB9.
3に調整し、20〜70℃の各温度にて70分間処理後
、残存活性を測定したところ第2図の曲線e(Δ−Δ)
の゛とおりの結果が得られ、本酵素の温度安定性は−5
0℃以下であることが明らかにされた。
3に調整し、20〜70℃の各温度にて70分間処理後
、残存活性を測定したところ第2図の曲線e(Δ−Δ)
の゛とおりの結果が得られ、本酵素の温度安定性は−5
0℃以下であることが明らかにされた。
ぷ力価の測定法
本酵素の酵素活性は、!; x / 0−sMNADθ
jd:pH?!、?、lθ−1Mピロリン酸緩衝液θS
−;水ユO−;酵素液0. / mt ; 3 Mグリ
セロール溶液θ/dよりなる反応系を用いて、311
Q nmの吸光度の増加を測定し、/nモk N A
D H!生成/wI分’i/単位(/ unit)とし
た。
jd:pH?!、?、lθ−1Mピロリン酸緩衝液θS
−;水ユO−;酵素液0. / mt ; 3 Mグリ
セロール溶液θ/dよりなる反応系を用いて、311
Q nmの吸光度の増加を測定し、/nモk N A
D H!生成/wI分’i/単位(/ unit)とし
た。
ム阻害、活性化および安定化
本酵素は、ピラゾール、0−フェナンスロリン、p−メ
ルクリ安息香酸によって阻害され、NAD又はNADP
を補酵素とし、Mgイオンにより活性化される。安寞化
は硫酸アンモニウムにより行われる。
ルクリ安息香酸によって阻害され、NAD又はNADP
を補酵素とし、Mgイオンにより活性化される。安寞化
は硫酸アンモニウムにより行われる。
2酵素の精製法
前記G−/菌の培養菌体を、遠心分離法により集め、こ
れをトリス緩衝液(pHg、!;)に懸濁し、超音波処
理によシ亀体内酵素抽出を行う。再度遠心分離後、上澄
液を硫酸アンモニウムによる飽和画分の分画を行い、D
EAE−セルロースでカラムクロマトグラフィーを行い
、得られた溶出液をダル涙遇することによって最終酵素
標品と°する。
れをトリス緩衝液(pHg、!;)に懸濁し、超音波処
理によシ亀体内酵素抽出を行う。再度遠心分離後、上澄
液を硫酸アンモニウムによる飽和画分の分画を行い、D
EAE−セルロースでカラムクロマトグラフィーを行い
、得られた溶出液をダル涙遇することによって最終酵素
標品と°する。
と分子量
グル濾過法によ、る本酵素の分子量は、約ioo、oo
o以上と測定された。
o以上と測定された。
父 本酵素は結晶化されていないので、結晶構造は明ら
かでない。
かでない。
n 元素分析
本酵素の元素分析値は次のとおりである。
c:sii%、H:’7.2%、N:/443%//
本酵素のミバエリス係数(Km)は、グリセロールに対
して、Km=iSX10−2Mであり、NAO+ に対
しては、(財)=12.5X10”Mであった。
本酵素のミバエリス係数(Km)は、グリセロールに対
して、Km=iSX10−2Mであり、NAO+ に対
しては、(財)=12.5X10”Mであった。
以上のとおり、本発明は、前記G−/狛の如。きバチル
ス属に属するガラフタル酸質化利用性菌全培養し、その
培養液よ1)pH9,3附近に最適p!I k有し、且
つグリセロールに対し極めて基質特異性の高い新規なグ
リセロール脱水素酵素及びその製造法を提供するもので
ある。
ス属に属するガラフタル酸質化利用性菌全培養し、その
培養液よ1)pH9,3附近に最適p!I k有し、且
つグリセロールに対し極めて基質特異性の高い新規なグ
リセロール脱水素酵素及びその製造法を提供するもので
ある。
以下、本発明を実施例により詳述する。
実施例/
ガラフタル酸を炭素源とした場合の使用培地は、次の通
りである。
りである。
ガラフタル酸 IQg
ポリペプトン 7g
酵母エキス /9
Kl−1,!PO,/g
MgS○、・’71−120 θ31!KNO
a 3 g F!axCOs /θI全 容
量 /l (培地のpHは/θ0である。) 300 vte容フラスコに上記の培地sodをと91
これを殺菌し、前記G −/函(微工研菌害第!;9.
2.S;号)を無釉的に接花して、37℃で/ざ時間振
盪培養を行った。得られた培養Pr!JDを、10.0
0Or、p−mで10+閾遠心分離後、水洗し、/ 0
= M ) IJス緩衝液に懇濁しf′c、この量濁液
を、70にC,IQ分分間音波列、理して自体内扉素の
抽出を行い、/ 0.00Or、p、m テ/ 0 分
間M! 、4心分離して上澄液を分離した。この上澄液
を硫酸アンモニウムを用いて0〜θs飽和画分、次いで
θ!; −0,7の飽和画分の分画を行い、後者の両分
全リン酸緩衝液(/ 00 mM KH2PO4−Na
1HP04 %pHg、5)で平衡化したDEAE−セ
ルロースカラムに吸着した後、0− / M Naαの
直線濃度勾配で゛溶出した。次いで、前記リン酸緩衝液
(脱気したもの)で平衡化したDEAE−セファデック
スカラムに、前記DEAE−セルロースカラムクロマト
グラフィーで得られた活性画分を同−Q緩衝液で透析し
てカラムに吸着後、θ〜/ M Naα 直線濃度勾配
で溶出した。得られた活性画分をウルトログルAcA
J Itカラムに吸着後、lOomMNaαを含む前記
リン酸緩衝液で溶出した。更に、絖いてハイドロキシル
・アI?タイトを用い、前記ウルト・ログルを用いた場
合と同様の条件で処理し、本酵素の精製標品を得几(収
率/、2%)。
a 3 g F!axCOs /θI全 容
量 /l (培地のpHは/θ0である。) 300 vte容フラスコに上記の培地sodをと91
これを殺菌し、前記G −/函(微工研菌害第!;9.
2.S;号)を無釉的に接花して、37℃で/ざ時間振
盪培養を行った。得られた培養Pr!JDを、10.0
0Or、p−mで10+閾遠心分離後、水洗し、/ 0
= M ) IJス緩衝液に懇濁しf′c、この量濁液
を、70にC,IQ分分間音波列、理して自体内扉素の
抽出を行い、/ 0.00Or、p、m テ/ 0 分
間M! 、4心分離して上澄液を分離した。この上澄液
を硫酸アンモニウムを用いて0〜θs飽和画分、次いで
θ!; −0,7の飽和画分の分画を行い、後者の両分
全リン酸緩衝液(/ 00 mM KH2PO4−Na
1HP04 %pHg、5)で平衡化したDEAE−セ
ルロースカラムに吸着した後、0− / M Naαの
直線濃度勾配で゛溶出した。次いで、前記リン酸緩衝液
(脱気したもの)で平衡化したDEAE−セファデック
スカラムに、前記DEAE−セルロースカラムクロマト
グラフィーで得られた活性画分を同−Q緩衝液で透析し
てカラムに吸着後、θ〜/ M Naα 直線濃度勾配
で溶出した。得られた活性画分をウルトログルAcA
J Itカラムに吸着後、lOomMNaαを含む前記
リン酸緩衝液で溶出した。更に、絖いてハイドロキシル
・アI?タイトを用い、前記ウルト・ログルを用いた場
合と同様の条件で処理し、本酵素の精製標品を得几(収
率/、2%)。
本酵素標品は、NAD+−をコフアクターとして、グリ
セロールをヅヒドロキシアセトンに変換することが薄層
クロマトグラフィーで確認された。
セロールをヅヒドロキシアセトンに変換することが薄層
クロマトグラフィーで確認された。
第1図は、本発明による酵素の最適pH及び安定pBt
−示すグラフ、第2図は、本発明による酵素のゑ連作用
温度及び温度安定性(失活条件)を示すグラフである。 特許出願人 理化学研究所 第1図 pH 第2図
−示すグラフ、第2図は、本発明による酵素のゑ連作用
温度及び温度安定性(失活条件)を示すグラフである。 特許出願人 理化学研究所 第1図 pH 第2図
Claims (1)
- (1) 最適作用pHをはホ9.3附近に有し、且つ
グリセロールに対し基質特異性を有するグリセロール脱
水素酵素B0 @ バチルス属に属するガラフタル酸質化利用性菌を培
養し、その培養物より最適作用pHをほぼ93附近に有
し、且つグリセロールに対し基質特異性を有するグリセ
ロール脱水素酵素Bを採取することを特徴とするクリセ
ロール脱水素酵素日の製造法。 ゆ バチルス属に属するガラフタル酸質化利用性菌がバ
チルス拳エスピー伽G −/ (Bacillus s
p。 G−/)(微工研菌寄第39.25号)である特許請求
の範囲第(2)項記載のル造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58032626A JPS59156280A (ja) | 1983-02-28 | 1983-02-28 | グリセロ−ル脱水素酵素及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58032626A JPS59156280A (ja) | 1983-02-28 | 1983-02-28 | グリセロ−ル脱水素酵素及びその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59156280A true JPS59156280A (ja) | 1984-09-05 |
JPH0372272B2 JPH0372272B2 (ja) | 1991-11-18 |
Family
ID=12364057
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58032626A Granted JPS59156280A (ja) | 1983-02-28 | 1983-02-28 | グリセロ−ル脱水素酵素及びその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59156280A (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5513095A (en) * | 1978-05-22 | 1980-01-29 | Atkinson Anthony | Glycerol dehydrogenase enzyme |
JPS5621590A (en) * | 1979-07-27 | 1981-02-28 | Toyobo Co Ltd | Novel glycerol dehydrogenase, and its preparation |
-
1983
- 1983-02-28 JP JP58032626A patent/JPS59156280A/ja active Granted
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5513095A (en) * | 1978-05-22 | 1980-01-29 | Atkinson Anthony | Glycerol dehydrogenase enzyme |
JPS5621590A (en) * | 1979-07-27 | 1981-02-28 | Toyobo Co Ltd | Novel glycerol dehydrogenase, and its preparation |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0372272B2 (ja) | 1991-11-18 |
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