JPS59156280A - グリセロ−ル脱水素酵素及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 且つクリセロール（　ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に対し基質特
異性を有する新規グリセロール脱水素酵素Ｂ及びその製
造法に関するものである。

従来、ガラフタル酸を特異的に資化利用する微生物を用
いてグリセロールに対し基質特異性を有する脱水素酵素
を採取する方法及び該脱水素酵素については全く知られ
ていない。グリセロールデヒドロダナーゼは、ＮＡＤの
存在下でグリセロールを酸化してジヒドロキシアセトン
を生成し、又還元型ＮＡＤの存在下でクリセーロールを
生成せしめるが、従来のグリセロールデヒドロダナーゼ
は、上記酸化、還元における最適ｐｉ条件（　ｐＨ域）
は全く異なる（例えば、酸化の場合ｐＨ９−９．３、還
元の場合、ｐＨ５〜７程度である）。本発明者等は、先
にガラフタル酸を含む培地で、バチルス（　Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属に属するガラフタル酸質化利用性菌を培養し
、その培養物よシ培養菌体を回収することｔ−特徴とす
る細菌菌体の製造法を完成したが（特願昭！；ｌ，−７
３．　ｇコ／号明細書参照）、その産生物質についで鋭
意研究した結果、グリセロールに対する基質特異性が極
めて高く、又、上記グリセロール酸化、ジヒドロキシア
セトンの還元の双方における最適ｐｉ条件が近似してい
る新規なグリセロール脱水素酵素を分離採取することに
成功し、本発明を完成するに至った。

本発明において、「グリセロール脱水素酵素Ｂ」とは、
以下に記載する理化学的性＊を有する酵素で、特徴的な
性質として最適作用ｐＨをほぼ９！３附近に有し、且つ
グリセロールに対する基質特異性が極めて高いグリセロ
ール脱水素酵素を相称するものとする。

以下に、本発明について詳述する。

ガラフタル酸（ムチン酸）は、ガラクトースの糖酸であ
シ、木材などに含まれるガラクタン、及びガラクトース
、ラクトース、ラフィノース、ガラクトース、植物粘液
質などガラクトース又はその誘導体を含む物質を硝酸酸
化することにより大量に得られる物質である。

本発明方法に用いる微生物は、以下に詳述されるように
、ガラフタル酸を資化利用するものであシ、バチルス属
に属する菌種であって、この菌種トシて、前記バチルス
・エスピー・Ｇ−／（’Ｂａｃｉｌ！ｊ＋ｓ　５ｐ−Ｇ
　−／　）　（以下、ｒＧ−／菌］と称する）が挙げら
れる。

なお、前記Ｇ−／菌の他にその自然的又は人為的変異種
もガラフタル酸の資化利用性を有する限シ、本発明方法
に用い得ることは当然である。

前記Ｇ−／菌は、昭和５６年３月ｌｑ日、工業技術院微
生物工業技術研究所へ、微工研菌寄第５９２Ｓ号として
寄託された。前記Ｇ−／菌は、次の菌学的性質を有する
。

なお下記の菌学的諸性質の試験及び分類方法はすべて「
バージニーズ　マニュアル　オブ　デタミネイティブ　
バクテリオロジー」　（第３版、ｉｑ’ｔｔｔ年）　Ｃ
Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒ　Ｉｏｌｏｇｙ　（ざｔ
ｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ　＋　／９７’Ａ　）　）に準拠し
て行なわれた。

０バチルス・エスピー・Ｇ−／菌の菌学的性質（ａ）　
　形態（肉汁寒天斜面培地） （１）細胞の大きさは、θろ〜θｇμ×、２．０〜３０
μの桿菌である。

（２）細胞の多形性はガい。

（，７１運動性があり鞭毛は周毛である。

（リ　胞子の大きさは０７μ×０７μで、胞子のうは細
胞の端に形成される。

（イ）　ダラム染色性は変動性でおる。

ら）抗酸性は陰性である。

（ｂ）　　培地における生育状態 （１）　　肉汁液体培地 苗種を形成し、沈渣を生じる。菌体は灰白色を呈する。

＠　肉汁寒天平板培地 発育は旺盛で、菌体は灰白色を呈するが、色素は培地中
に拡散しない。表面は平滑で、光沢があシ、コロニーの
周縁は金縁〜波状を呈する。

■　肉汁寒天斜面培地 （２）と同様の生育状態を示し、拡布状に生育する。

←）　グルコース肉汁寒天平板培地 （２）と同様である。

α）　肉汁ゼラチン穿刺培地 ｐＨ７においては、ゼラチンを液化して、表面で発育し
、菌体は灰白色を呈する。ｐｎ　／　０においては、ゼ
ラチンを液化しない。

＜ｂ）　　’−”プトノ水 ｐＨ７およびｐＨ／　０においては表面に菌種全形成し
て、沈渣を生じる。１体は灰白色を呈するが、色素は培
地中に拡散しない。

（７）　　リドマスミルク リドマス色素を僅かに赤変し、凝固する。

娑）バレイショ培地 菌体は灰白色を呈する。

に）　白現的性質 Ｖ）゛硝酸塩の還元 還元する。

Ｃ２）　　脱窒反応 隙性 （３メチルレッド（ＭＲ）試験 陰　　　性 ←）　　７．ｔ−’ｌ’ス・プロスカラエル（■Ｐ）反
応陰　　　性 ０）　インドールの生成 陰　　　性 （υ　硫化水素の生成 陽　　　性 （７）でんぷんの加水分解 陽性 ば）　クエン酸の利用性（Ｋｏｓｅｒ培地及びＣｈｒ　
１ｓｔｅｎｓｅｎの培地） いずれも利用しない。

（９）無機窒素源（アンモニウム塩、硝酸塩、尿素等）
の利用性 利用する。

（１０）色素の生成 色素は生成しない。

（／／）　　リドマス、メチレンブルー、コ、６−ジク
ロルフェノール、インドフェノ−ルナトノ色素の還元 リドマスを僅かに赤変する他、変化なし。

（／（２）ウレアーゼ 陰　　　性 （１３）オキシダーゼ 陽　　　性 （／４）　　カタラーゼの生成 陽　　　性 （１５）生育の範囲 生育し得る条件−は、ｐＨ７、θ〜／１０、温度２５〜
ｅ５’ｃで好・気的であり、最適生育条件は、ｐｔｌ　
９．３近辺、温度３７℃前後である。

（／６）敢累に対する態度− 好欲性 （／７）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法に
よる）酸化的並びに還元的に生育する。

好気的並びに還元的にガスの生成はない。

（１ｇ）牛乳の凝固 凝固する。

（／ｑ）アンモニアの生成 陰　　　性 （刀　ゼラチン、カゼインの変化 液化する。

（，２／）塩化ナトリウムの耐性 Ｓ％塩化す）　ＩＪウム上で生育するが、１０チ以上の
塩化ナトリウム上では生育しない。

（ｄ）　　炭素源のオＵ用性 （１）　　Ｌ−アラビノース　　　− （２）　Ｄ−キシロース　　　　− （，７）　　Ｄ−グルコース　　　　＋←）　Ｄ−マン
ノース　　　　＋ （５）Ｄ−フルクトース　　　＋ （６）Ｄ−ガラクトース　　　＋ （η　ラクトース　　　　　　− 富）　マルトース　　　　　　士 （９）　　サッカロース　　　　　＋ （１０）トレハロース　　　　　　＋ （ｌｌ）Ｄ−ソルビット　　　　　− （／、２）　　Ｄ−マンニット　　　　＋（１３）イノ
ジット　　　　　　− （／４）グリセリン　　　　　＋ （ｌ（支）デンプン　　　　　　　＋ （／６）ラフィノース　　　　　− （／７）イヌリン　　　　　　　− （７ｇ）デキストリン　　　　　＋ （／９）繊維素　　　　　　　　− （至）サリシン　　　　　　　＋ 以上の炭素源よシ好気的並びに嫌気的にガスの生成はお
こなわない。

（注）：＋　オリ用する（酸を生成する）。

−殆んど利用しない（酸全生成しな い） 以上の微生物の菌字的諸性質から前記文献の分類方法に
従って使用微生＠を検索するに当シ、前記のＧ−／菌を
バチルス（Ｂａｃｉ　Ｉ　１ｕｓ）　　属に為する公知
の′菌種と比較した。

前記Ｇ−／菌は、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）、バチルス・プミルス（ａ
ａｃｉ　ｌ　ｌｕｓ　ｐｕｍｉ　１ｕｓ）　、バチルス
・すへニフォーミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎ
ｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・セレウス（３ａＣｉ目ｕ
ｓ　ｃｅｒｅｕｓ　）　、バチ＃　ス−７７ソラシス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）　、バチｋ　
ス−７，リンジエンシス（Ｂａｃｌｌｌｕｓ　ｔｈｕｒ
ｉｎｇｌｅｎｓｉｓ）、バチシス０メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ　）、バチルス・
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈＮｕｓ　）　　及びバチルス・フィ
ルマス（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ　ｆｉｒｍｕｓ　）と類似
している。

しかしながら、Ｇ−／ｌ［、アラビノース及びキシＯ−
スから酸の生成をせず、且つグルコースからのアセトイ
ンの生成がないのに対し、バチル、ス・ズブチリス及び
バチルス・リヘニフォーミスは共に、アラビノース及び
キシロースかうの酸）生成があり、且つグルコースから
のアセトインの生成カｌ：＋ルＡ１．＜チルス・フィル
マスは、アラビノース及びキシロースから酸の生成があ
る点、Ｇ−７茜は、でんぷんの加水分解を行い、且つ硝
酸塩の還元を行うのに対し、バチルス・プミルスは、い
ずれも行わない点にそれぞれ特徴的な差異を見出すこと
ができる。

又、Ｇ　−／７ｍｕバチルス・セレウス、バチルス・ア
ンソラシス、バチルス・スリンジエンシス、バチルス・
ステアロサーモフィラス及ヒバチルス・メガテリウムと
比較して、菌体の大きさ、内生胞子の形態及びその位置
が異なり、更に、Ｇ−／菌は、マンニットからの酸の生
成があるのに対し、上記いずれの菌種も、共に酸の生成
がない点において特徴的な差異を見出すと七ができる。

以上の検索結果を総括すると、Ｇ−／菌は、形態その他
の諸性質から、バチルス属に属する微生物とすることが
妥当でるるが、前記のとお＃）種々の特徴的な菌学的性
質及びｐＦ１７．０〜／１０の如き広範囲のアルカリ性
において生育する性質から判断して、明らかにバチルス
属に属する公知の菌種と区別されるため、これら′ｆ：
新菌種として設定することが適当でおると結論され−ｆ
ｃ。

次に培養条件として重要な点は、培養液のｐ）Ｉである
。実験結果から前記Ｇ−／菌を培養するに当ってその生
育繁殖はｐＨ条件によって非常に影響を受けるので、培
地のｐＨは、はぼり０〜／１０の範囲から選ばれた値に
調整することが心安であることが確かめられた。

かくて上記の培養条件の下に前記微生物を接種し、適当
な条件、例えは、／ｇ待時間３７℃で振盪培養を行ない
、次いで、１０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ　で１０分間遠心分
離後、水洗し、再度遠心分離して菌体を集め、蒸留水で
洗浄後、／、’１０Ｍ、　ｐＨｇ、　Ｓのトリス緩衝液
（Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ）　　で懸渇し、該懸濁液を
超音波処理して菌体内酵素系の抽出を行う。

この抽出液を再度、遠心分離法によって上澄液を分離し
て該上澄液を菌体内酵素液とし、次いで硫酸アンモニウ
ムによる飽和分画を行い、さらにＤＥＡＥ−セルロース
、ＤＥＡＥ−セフアゾ′ツクス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）、
ウルトログＡ／ＡＣＡ％”イドロキシアノ＜？タイト（
ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）　　ｋ用いてカラムク
ロマトグラフィー及びダル濾過を行うことによって脱水
素酵素の精製標品を得ることができる。

なお、菌体の破砕に当っては超音波処理方法のみならず
、通常知られている物理的方法が適用し得ることは当然
である。

このようにして得られた脱水素酵素Ｂ（以下、「本酵素
」という。）は、以下に記載する如く、最適作用ｐｉが
ほぼ９．３附近で、グリセロールに対する基質特異性が
極めて高い性質を有する既知文献未載の新規脱水素酵素
（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）であることが証明され
た。

０本酵素の理化学的性質 ７作用及び基質特異性 本酵素は、前記Ｇ−／菌が、基質のガラフタル酸を炭素
源として発育した菌体より得られる脱水素酵素である。

後述の酵素活性迎Ｊ定法（８）により、多数の糖類及び
その誘導体に対する本酵素の基質特異性を調べたところ
、第１表のとおりの結果が得られた。この結果、特にグ
リセロールに対して基質特異性が極めて高いことが明ら
かにされた。表中の数値は、酵素活性（％）を示す（グ
リセロールを用いた場合を１００％とする）。

第　　／　　表 基　　　質　　　　　　　　　活　性（）グリセロール
　　　　　　　　／　００．０エチレングリコール　　
　　　　　弘り１１２−プｏ　□４７　シ、ｔ　−／Ｉ
／　　　　７　Ｑ　Ｓ／、３−ゾロノｆンジオール　　
　’Ｉ　Ｏ，！；ｌ、３−ブタンジオール　　　　／３
．ｓコ、３−ブタンジオール　　　　ざ弘。

ハ２．ＩＩ−ブタントリオール　／ム？ハＳ−ベンタン
ジオール　　　　乙θ エタノール　　　　　　　　　　　。

コープロバノール　　　　　　　　　。

メソイノシトール　　　　　　　　　３．クガラクチト
ール　　　　　　　　　ユコユ最適ｐｉ及び安定ｐｉ範
囲　− 八〇−”Ｍピロリン酸緩衝液を用い、基質にグリセロー
ルを用いて３０℃にて６ｐＢにおける相対活性を調べた
ところ第７図の曲Ｉ！ａ（〇−〇）のとおシの結果が得
られた。この結果、本酵素の、グリセロールを用いた場
合の最適ｐＨは、はぼ９！３附近であることが明らカニ
サれた。、又同様にして、基質にジヒドロキシアセトン
を用いて調べたところ、第１ＩＥのｂ　（＠）−＠）の
とおりの結果が得られ、本酵素の、ジヒドロキシアセト
ンを用いた場合の最適ｐ■は、はホ９！０附近であるこ
とが明らかにされた。

又、本酵素の種々のｐｎ溶液を２５℃、６゜分間処理し
た後、１０−’Ｍビロリン酸緩衝液で’ｐａｌ！；とし
、本酵素の残存活・性を調べたところ、第１図の曲線Ｃ
（Δ−Δ）のとおりの結果が得られ、ｐＨ’Ｚ　Ｏ−９
，６の範囲に安定ｐＨが存在することが明らかにされた
。

３、作用適温の範囲 本酵素液を１０−’Ｍピロリン酸緩衝液によりｐＨ９３
としく各温度における相対活性を調べたところ、第２図
の曲線ｄ（○−Ｏ）のとおりの結果が得られ、本酵素の
最適作用温度は、４．５−℃附近であることが明らかに
された。

弘失活条件（温度安定性） 本溝素液をｌθ−１Ｍピロリン酸緩衝液によシｐＢ９．
３に調整し、２０〜７０℃の各温度にて７０分間処理後
、残存活性を測定したところ第２図の曲線ｅ（Δ−Δ）
の゛とおりの結果が得られ、本酵素の温度安定性は−５
０℃以下であることが明らかにされた。

ぷ力価の測定法 本酵素の酵素活性は、！；　ｘ　／　０−ｓＭＮＡＤθ
ｊｄ：ｐＨ？！、？、ｌθ−１Ｍピロリン酸緩衝液θＳ
−；水ユＯ−；酵素液０．　／　ｍｔ　；　３　Ｍグリ
セロール溶液θ／ｄよりなる反応系を用いて、３１１　
Ｑ　ｎｍの吸光度の増加を測定し、／ｎモｋ　Ｎ　Ａ　
Ｄ　Ｈ！生成／ｗＩ分’ｉ／単位（／　ｕｎｉｔ）とし
た。

ム阻害、活性化および安定化 本酵素は、ピラゾール、０−フェナンスロリン、ｐ−メ
ルクリ安息香酸によって阻害され、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ
を補酵素とし、Ｍｇイオンにより活性化される。安寞化
は硫酸アンモニウムにより行われる。

２酵素の精製法 前記Ｇ−／菌の培養菌体を、遠心分離法により集め、こ
れをトリス緩衝液（ｐＨｇ、！；）に懸濁し、超音波処
理によシ亀体内酵素抽出を行う。再度遠心分離後、上澄
液を硫酸アンモニウムによる飽和画分の分画を行い、Ｄ
ＥＡＥ−セルロースでカラムクロマトグラフィーを行い
、得られた溶出液をダル涙遇することによって最終酵素
標品と°する。

と分子量 グル濾過法によ、る本酵素の分子量は、約ｉｏｏ、ｏｏ
ｏ以上と測定された。

父　本酵素は結晶化されていないので、結晶構造は明ら
かでない。

ｎ　元素分析 本酵素の元素分析値は次のとおりである。

ｃ：ｓｉｉ％、Ｈ：’７．２％、Ｎ：／４４３％／／　
本酵素のミバエリス係数（Ｋｍ）は、グリセロールに対
して、Ｋｍ＝ｉＳＸ１０−２Ｍであり、ＮＡＯ＋　に対
しては、（財）＝１２．５Ｘ１０”Ｍであった。

以上のとおり、本発明は、前記Ｇ−／狛の如。きバチル
ス属に属するガラフタル酸質化利用性菌全培養し、その
培養液よ１）ｐＨ９，３附近に最適ｐ！Ｉ　ｋ有し、且
つグリセロールに対し極めて基質特異性の高い新規なグ
リセロール脱水素酵素及びその製造法を提供するもので
ある。

以下、本発明を実施例により詳述する。

実施例／ ガラフタル酸を炭素源とした場合の使用培地は、次の通
りである。

ガラフタル酸　　　　ＩＱｇ ポリペプトン　　　　　７ｇ 酵母エキス　　　　　　／９ Ｋｌ−１，！ＰＯ，／ｇ ＭｇＳ○、・’７１−１２０　　　　　θ３１！ＫＮＯ
ａ　　　　　　　　　　３　ｇ Ｆ！ａｘＣＯｓ　　　　　　　　　／θＩ全　　容　　
量　　　　　　／ｌ （培地のｐＨは／θ０である。） ３００　ｖｔｅ容フラスコに上記の培地ｓｏｄをと９１
これを殺菌し、前記Ｇ　−／函（微工研菌害第！；９．
２．Ｓ；号）を無釉的に接花して、３７℃で／ざ時間振
盪培養を行った。得られた培養Ｐｒ！ＪＤを、１０．０
０Ｏｒ、ｐ−ｍで１０＋閾遠心分離後、水洗し、／　０
＝　Ｍ　）　ＩＪス緩衝液に懇濁しｆ′ｃ、この量濁液
を、７０にＣ，ＩＱ分分間音波列、理して自体内扉素の
抽出を行い、／　０．００Ｏｒ、ｐ、ｍ　テ／　０　分
間Ｍ！　、４心分離して上澄液を分離した。この上澄液
を硫酸アンモニウムを用いて０〜θｓ飽和画分、次いで
θ！；　−０，７の飽和画分の分画を行い、後者の両分
全リン酸緩衝液（／　００　ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４−Ｎａ
１ＨＰ０４　％ｐＨｇ、５）で平衡化したＤＥＡＥ−セ
ルロースカラムに吸着した後、０−　／　Ｍ　Ｎａαの
直線濃度勾配で゛溶出した。次いで、前記リン酸緩衝液
（脱気したもの）で平衡化したＤＥＡＥ−セファデック
スカラムに、前記ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマト
グラフィーで得られた活性画分を同−Ｑ緩衝液で透析し
てカラムに吸着後、θ〜／　Ｍ　Ｎａα　直線濃度勾配
で溶出した。得られた活性画分をウルトログルＡｃＡ　
Ｊ　Ｉｔカラムに吸着後、ｌＯｏｍＭＮａαを含む前記
リン酸緩衝液で溶出した。更に、絖いてハイドロキシル
・アＩ？タイトを用い、前記ウルト・ログルを用いた場
合と同様の条件で処理し、本酵素の精製標品を得几（収
率／、２％）。

本酵素標品は、ＮＡＤ＋−をコフアクターとして、グリ
セロールをヅヒドロキシアセトンに変換することが薄層
クロマトグラフィーで確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による酵素の最適ｐＨ及び安定ｐＢｔ
−示すグラフ、第２図は、本発明による酵素のゑ連作用
温度及び温度安定性（失活条件）を示すグラフである。 特許出願人　理化学研究所 第１図 ｐＨ 第２図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　最適作用ｐＨをはホ９．３附近に有し、且つ
   グリセロールに対し基質特異性を有するグリセロール脱
   水素酵素Ｂ０ ＠　バチルス属に属するガラフタル酸質化利用性菌を培
   養し、その培養物より最適作用ｐＨをほぼ９３附近に有
   し、且つグリセロールに対し基質特異性を有するグリセ
   ロール脱水素酵素Ｂを採取することを特徴とするクリセ
   ロール脱水素酵素日の製造法。 ゆ　バチルス属に属するガラフタル酸質化利用性菌がバ
   チルス拳エスピー伽Ｇ　−／　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
   ｐ。 Ｇ−／）（微工研菌寄第３９．２５号）である特許請求
   の範囲第（２）項記載のル造法。