JPS5914792A - Preparation of citric acid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To prepare citric acid, in high yield, by culturing microoganism capable of producing citric acid, in a medium containing a sugar obtained from the waste liquid of SP pulp as a carbon source. CONSTITUTION:Microorganisms beloging to Candida genus, Mycotorula genus, Torulopsis genus, Trigonopsis genus, Saccharomyces genus, Kloeckera genus or Trichosporon genus and capable of producing citric acid, e.g. Candida guilliermondii (IFO 0566), Mycotorula japonica (IAM 4185), etc. are inoculated in a medium containing a sugar existing in the filtrate obtained by the ultrafiltration of the waste liquid of SP pulp as a carbon source, and cultured at 24-37 deg.C and 5-9pH for about 2-7 days under aerobic condition. Citric acid can be separated from the culture liquid.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるクエン酸の製造法に関するもので
ある。特に本発明はクエン酸生産能を有するカンデイダ
属、マイコトルラ属、トルロプシス属、トリゴノプシス
属、サツカロミセス属、クレッケラ属、トリコスポロン
属に属する酵母をＳＰパルプ排液を限外濾過して得られ
る透・過液中の糖を炭素源とする培地へ接種□し好気的
に培養して培地中に生成蓄積されたクエン酸を単離回収
するととを特徴とするクエン酸の製造法に係るものであ
る。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing citric acid using microorganisms. In particular, the present invention uses yeast belonging to the genus Candida, Mycotorula, Torulopsis, Trigonopsis, Satucharomyces, Kreckera, and Trichosporon, which have citric acid-producing ability, and the filtrate obtained by ultrafiltrating SP pulp effluent. This relates to a method for producing citric acid, which is characterized by inoculating the sugar in a medium as a carbon source, culturing it aerobically, and isolating and recovering citric acid produced and accumulated in the medium.

従来、発酵法によるクエン酸の製造法としては糸状菌や
酵母あるいは細菌を用い炭素源として糖質、或いは炭化
水素から生産する方法が工業的に採られている。しかし
炭素源として利用される廃糖蜜に代表される糖質、或い
は炭化水素は何れも最近値上シの傾向にある。特に将来
的に考えた場合、従来から用いられている炭素源に代わ
る、安価な新しい炭素源を利用するクエン酸発酵を工業
的に確立することは、極めて意味の有ることである。杢
発明者等はｉＰパルプ排液に着目・し１．鋭意検討した
結果、ＳＰパルプ排液を限外Ｅ過処理して得られる透過
液については成る種の酵母類が極めて良く糖を資化し１
．培地中に極めて著量のクエン酸を蓄積することを見出
した。Conventionally, citric acid has been produced industrially by fermentation using filamentous fungi, yeast, or bacteria and using carbohydrates or hydrocarbons as a carbon source. However, the prices of sugars and hydrocarbons, typified by blackstrap molasses, used as carbon sources have recently been on the rise. Especially when considering the future, it is extremely meaningful to industrially establish citric acid fermentation using a new, inexpensive carbon source in place of conventionally used carbon sources. The inventors focused on iP pulp drainage and 1. As a result of intensive studies, we found that the permeate obtained by ultra-E filter treatment of SP pulp effluent is extremely well utilized by yeast species.
．． It was found that very significant amounts of citric acid accumulated in the culture medium.

ＳＰパルプ排液は、通常Ｎ材の場合にはグルコースを主
体にした糖を５％、Ｌ材の場合にはキシロースを主体に
した糖を同程度含んでいる。しかし発酵の糖源としてみ
ると、培養阻害物質を可成り含んでいるため、菌の生育
が阻害され、現在では発酵技術として工業的に利用され
ているＩＦＩＩとしては、墾酸系調味料、及び飼料を目
的にしたカンデイダ・ウテイリスの培養に限られている
。The SP pulp effluent normally contains 5% sugar mainly composed of glucose in the case of N material, and the same amount of sugar mainly composed of xylose in the case of L material. However, when viewed as a sugar source for fermentation, it contains a considerable amount of culture-inhibiting substances, inhibiting the growth of bacteria, and is currently used industrially as a fermentation technology. It is limited to the cultivation of Candida uteilis for feed purposes.

クエン酸発酵の場合にも、排液をその侭培地中に加えだ
のでは排液中の阻害物質汐玉原因で菌の生育が阻害され
、培地中でのクエン酸の蓄積はｈ忍められなかづた。In the case of citric acid fermentation, if the waste liquid is added to the culture medium while it is being carried out, bacterial growth will be inhibited due to the inhibitory substance Shiodama in the waste liquid, and the accumulation of citric acid in the medium will not be tolerated. Nakazuta.

ＳＰパルプ排液中には、培養阻害物質として１ノ゛ゲニ
ン・フルフラール、亜硫酸など力量存在している。本発
明者等は之等の阻害物質とクエン酸生成との因果関係に
ついて、種々検討した結果、１】ゲニン類、が最も菌の
生育、クエン酸生成に影響を及ぼすことを明らかにした
。　　　　′ つまシ曝気処理することによシフルフラール。In the SP pulp effluent, there are a large amount of culture-inhibiting substances such as 1-genin, furfural, and sulfite. As a result of various studies on the causal relationship between these inhibitory substances and citric acid production, the present inventors revealed that 1) genins have the greatest effect on bacterial growth and citric acid production. ′ Cyfurfural by aeration treatment.

亜硫酸を除去しただけのノ（ルブ排液を糖源とする培地
では菌の生育、クエン酸の生成は認められなかった。No growth of bacteria or production of citric acid was observed in the culture medium in which sulfite was simply removed and the effluent was used as a sugar source.

一方、限外濾過処理することによシ高分子１）ゲニンの
みを除去したノくルプ排液を糖源とする培地では、菌の
生育が認められクエン酸も著量蓄積された。また限外濾
過処理に曝気処理を組合わせるこ：とによシ若干の効果
の増加も認められた。On the other hand, in a culture medium in which the sugar source was Norkulp effluent from which only the polymer 1) genin had been removed by ultrafiltration treatment, bacterial growth was observed and a significant amount of citric acid was accumulated. Furthermore, a slight increase in effectiveness was also observed when ultrafiltration treatment was combined with aeration treatment.

′　□更に驚くべきことに従来、酵母によるクエン酸発
酵の場合、インクエン酸が同吋に生成し蓄積され、後の
分離精製が困難になるという欠点があつ・だが、ＳＰパ
ルプ排液の限外濾過液を糖源とした場合には全く生成し
ないという有利な点もあることが判明した。' □More surprisingly, conventional citric acid fermentation using yeast has the disadvantage that ink citric acid is simultaneously produced and accumulated, making subsequent separation and purification difficult. It has been found that using the filtrate as a sugar source has the advantage that no sugar is produced at all.

本発明に使用されるパルプ排液は、Ｎ材、Ｌ材゛　何れ
に由来するものでも差し支えない。但しＮ材の場合はグ
ルコースが主体なのでグルコース資化能を有する菌、Ｌ
材の場合はキシロースが主体なのでキシロース資化會す
有する菌であることが必要である。′　　　　　□ またパルプ排液を限外濾過する場合、使用する膜はポリ
スルホン膜な、ど常用のもので差し支えなく、また圧そ
の他の条件も特に限定されない。更に濃縮倍率もｌ・２
〜６倍の範囲程度であれば良い。The pulp waste liquid used in the present invention may be derived from either N material or L material. However, in the case of N material, since glucose is the main component, bacteria with glucose assimilation ability, L
In the case of wood, xylose is the main ingredient, so the bacteria must be able to assimilate xylose. ′ □ Furthermore, when ultrafiltrating pulp waste liquid, the membrane used may be a commonly used membrane such as a polysulfone membrane, and the pressure and other conditions are not particularly limited. Furthermore, the concentration ratio is 1.2
It is sufficient if it is in the range of ~6 times.

本発明の方法に使用される酵母菌株の代表例として次の
ものが挙げられる。Representative examples of yeast strains used in the method of the present invention include the following.

カンデイダ・ギヤマンディ（ＩＦＯ０５６６）、マイコ
トルラ・ヤポニカ（ＩＡＭ４１８５）　、ト７レロブシ
ス・コリキュローサ（ＩＡＭ４４２６）、）リコ″ノブ
シス・バリアビス（ＩＡＭ４９９４）、サツカロミセス
・ノ（イリー（ＩＦＯ０４６８）、クレツケル・アビキ
ュラー゛り（ＩＦＯ０８６５）、）、リコスポロン・ペ
ーレンデイ（ＩＦＯ’０８４４）。Candida guiyamandi (IFO0566), Mycotorula japonica (IAM4185), Tollobussis coliculosa (IAM4426), ) Rico'nobsis variavis (IAM4994), Satucharomyces no (Illy (IFO0468), Kretzkell aviculosa (IFO0865)) ), Lycosporon perendei (IFO'0844).

窒素源、無機塩類、有機微量栄養素などに関しては通常
の場合と同様で差し支えない。例えば、窒では第１燐酸
塩、第２燐酸塩、硫酸塩、塩酸塩、カリウム塩、ナトリ
ウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、マンガン塩など、通常
の無機塩、更に′ｐＨを調製するために用いる炭酸カル
シウムなどが用いられる。Nitrogen sources, inorganic salts, organic micronutrients, etc. may be the same as in normal cases. For example, for nitrogen, common inorganic salts such as primary phosphates, secondary phosphates, sulfates, hydrochlorides, potassium salts, sodium salts, magnesium salts, iron salts, manganese salts, etc. are used to adjust the pH. Calcium carbonate etc. are used.

有機微量栄養素を含むものとして、イーストエキストラ
クト、麦芽エキストラクト、コーンステイープリカー、
ポリペプトン、肉エキス、大豆蛋白加水分解物などが用
いられる。Contains organic micronutrients such as yeast extract, malt extract, cornstarch liquor,
Polypeptone, meat extract, soybean protein hydrolyzate, etc. are used.

発酵条件としては好気的条件が良い培養温度は２４℃な
いし３７℃、培養中のｐＨは５〜９の範囲が良い。培養
中ｐＨを炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、アンモニア
などで調節する。培養は通常２ないし７日間行なう。As for fermentation conditions, aerobic conditions are preferable, the culture temperature is preferably 24°C to 37°C, and the pH during culture is preferably in the range of 5 to 9. During culture, adjust the pH with calcium carbonate, sodium carbonate, ammonia, etc. Culture is usually carried out for 2 to 7 days.

液体培地中に蓄積されたクエン酸は通常の方法、例えば
、遠心分離、濾過などの方法で菌体を分離し、イオン交
換樹脂で処理したシ、或いはその侭濃縮したシして、ク
エン酸またはその塩として分離採取することが出来る。The citric acid accumulated in the liquid medium can be recovered by separating the bacterial cells using a conventional method such as centrifugation or filtration, and treating the cells with an ion exchange resin, or concentrating the citric acid. It can be separated and collected as its salt.

以下、実施例によシ本発明を更に説明する。The present invention will be further explained below with reference to Examples.

実施例１ （１）限外ｐ過透過液の調製 り材のＳＰ排液をＰＣＩ社製Ｔ６／Ｂ膜を使用し、下記
の条件で２倍濃縮し透過液を得た。こうして得られた液
をＬ−８ＳＬ−透過液と称し、以下の、実験に供する。Example 1 (1) Preparation of ultrap-permeate permeate The SP effluent of the material was concentrated twice using a PCI T6/B membrane under the following conditions to obtain a permeate. The liquid thus obtained is called L-8SL-permeated liquid and is used in the following experiments.

運転条件　　使用膜Ｌ７ｍ″ モジュールタイプ　　　パラレルフロー入口圧力　８　
ｋｇ　／ｃｒｒｉ’　Ｇ運転温度　４５℃ 分析結果　　原液総固形分１３チ　　　還元糖５チ透過
液総固形分８チ　　　還元糖４・５ｑ６（２）Ｌ　−５
ＳＬ−透、過液５０　ｍｔ　ＶＣＮＨ４Ｃｔを０．１ｇ
。Operating conditions Membrane used L7m'' Module type Parallel flow inlet pressure 8
kg / crri' G operating temperature 45℃ Analysis results Stock solution total solid content 13 t Reducing sugar 5 t Permeate total solid content 8 t Reducing sugar 4.5q6 (2) L -5
SL-clear, filtrate 50 mt VCNH4Ct 0.1g
.

ＮＨ１ｌＰＯ４０−０５Ｂ：、Ｍｇ５Ｑ＋・フルＱ、０
．０５ｇ、酵母エキス０．１［１！、　、ＣａＣ０ａ　
５ｇを加え殺菌後、カンデイダ・ギヤマンデ（ＩＦＯ０
５６６）をその斜面培地から３白金耳接種し、３０℃で
４日間振盪培養した所、クエン酸の生成量は１５ｍｇ／
ｙｎＪａであった。尚、培地中にはインクエン酸の生成
は認められなかった。NH1lPO40-05B:, Mg5Q+・Full Q, 0
．． 05g, yeast extract 0.1 [1! , ,CaC0a
After adding 5g and sterilizing, Candida gearmande (IFO0
566) was inoculated from the slant medium and cultured with shaking at 30°C for 4 days, the amount of citric acid produced was 15mg/
It was ynJa. Incidentally, no production of incitric acid was observed in the medium.

この発酵終了液１ｔを９０℃に加熱、遠心分離して、ク
エン酸石灰を得た。クエン酸石灰のスラリーに１０　Ｎ
　ＨＩＩＳ　Ｏａを加え、生成した硫酸カルシウム及び
菌体を遠心分離によって除いた。上澄液をカチオン交換
樹脂（ＩＲ−１２０Ｂ）、アニオン交換樹脂（ＩＲＡ−
６８）、活性炭で処理した後、濃縮晶析によってクエン
酸の結晶１２．２ｇを得た。One ton of this fermentation-finished liquid was heated to 90°C and centrifuged to obtain citrate lime. 10 N in citrate lime slurry
HIIS Oa was added, and the produced calcium sulfate and bacterial cells were removed by centrifugation. The supernatant liquid was treated with cation exchange resin (IR-120B) and anion exchange resin (IRA-
68), 12.2 g of citric acid crystals were obtained by concentration crystallization after treatment with activated carbon.

対照として、限外濾過せず、曝気のみをした液を用いた
場合、培地中へのクエン酸の蓄積は全く認められなかっ
た。As a control, when a solution that was only aerated without ultrafiltration was used, no accumulation of citric acid in the medium was observed.

実施例２　　。Example 2.

実施例１　’　−（２）の場合と同じ培地に、カンデイ
ダ・アルビカンス（ＩＦｏ　０５８８）を接種し、７日
間の培養によって７ｍｇ／ｍｌのクエン酸を含む発酵液
を得た。この場合も、インクエン酸の生成は認められな
かった。１ｔの発酵液を同様に処理することによシ５ｇ
のクエン酸の結晶が得られた。Candida albicans (IFo 0588) was inoculated into the same medium as in Example 1'-(2), and cultured for 7 days to obtain a fermentation solution containing 7 mg/ml citric acid. In this case as well, no production of incitric acid was observed. By treating 1 ton of fermented liquid in the same way, 5 g of
of citric acid crystals were obtained.

対照として、限外濾過せず曝気のみをした液を用いた場
合、培地中へのクエン酸の蓄積は全く認められなかった
。As a control, when a solution that was only aerated without ultrafiltration was used, no accumulation of citric acid was observed in the medium.

実施例３ 実施例１−（１）でＬ材のＳＰ排液をＮ材のＳＰ排液に
代えて同様にして得られたものをＮ　−ＳＳＬ　−透過
液と称し実施例１−（２）で、Ｌ−８ＳＬ−透過液の代
わシにＮ−８ＳＬ−透過液に置き換えた培地にサン力ロ
ミセス・バイリー（ＩＦＯ０４６８）を接種し、８日間
の培養後、９ｍｇ／ｍｔのクエン酸を含む発酵液を得た
。この場合もインクエン酸の生成は認められなかった。Example 3 The product obtained in the same manner as in Example 1-(1) by replacing the SP effluent of the L material with the SP effluent of the N material was referred to as the N-SSL-permeated liquid, and was used as Example 1-(2). Then, the culture medium in which L-8SL-permeate was replaced with N-8SL-permeate was inoculated with IFO0468, and after culturing for 8 days, fermentation containing 9 mg/mt citric acid was carried out. I got the liquid. In this case as well, no production of incitric acid was observed.

１ｔの発酵液を同様に処理することにょシ、６．５ｇの
クエン酸の結晶が得られた。When 1 ton of fermented liquid was treated in the same manner, 6.5 g of citric acid crystals were obtained.

対照として、限外濾過せずに曝気のみを行なった液を用
いた場合、培地中へのクエン酸の蓄積は全く認められな
かった。As a control, when a solution that was only aerated without ultrafiltration was used, no accumulation of citric acid was observed in the medium.

実施例４ 実施例１−（２）でＬ−８ＳＬ−透過液の半量をＮ〜５
ＳＬ−透過液に置き換えた培地に、マイコトルラ・ヤポ
ニカ（ＩＡＭ４１８５）を接種して７日間の培養後、８
．５ｍｇ／ｍｌのクエン酸を含む発酵液を得た。Example 4 In Example 1-(2), half of the L-8SL-permeate was added to N~5
Mycotorula japonica (IAM4185) was inoculated into the medium replaced with SL-permeate, and after 7 days of culture, 8
．． A fermentation liquid containing 5 mg/ml of citric acid was obtained.

この場合もインクエン酸の生成は認め６れなかった。１
ｔの発酵液を同様に処理することによ、９６．０ｇのク
エン酸の結晶が得られた。In this case as well, no production of ink citric acid was observed6. 1
By treating the fermentation liquor of Example t in the same manner, 96.0 g of citric acid crystals were obtained.

対照として限外濾過せず、曝気のみを行なった液を用い
た場合、培地中へのクエン酸の蓄積は全く認められなか
った。When a liquid without ultrafiltration and only aeration was used as a control, no accumulation of citric acid was observed in the medium.

手続補正書 昭和５７年１１月８日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 １、事件の表示 特　　願　昭　　５７−１２２９９３　　号２、発明の
名称 クエン酸の製造法 ６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　東京都千代田区丸の内１−４−５名称　　（２
３４）山陽国策バルブ株式会社取締役社長　那　須　　
忠　己 ４、代理人〒１００ 住所　東京都千代田区丸の内１−４−５５、自５発訂正
　　　　　　　　　（・、ハ５夕６、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 Ｚ　補正の内容 明細書中め下記の点を゛補正致します。Procedural amendment dated November 8, 1980 Kazuo Wakasugi, Commissioner of the Patent Office1, Special application for indication of the case No. 1982-1229932, Title of invention: Process for producing citric acid6, Person making the amendment Relationship with the case Patent applicant address 1-4-5 Marunouchi, Chiyoda-ku, Tokyo Name (2
34) Nasu, President and Director of Sanyo Kokusaku Valve Co., Ltd.
Tadaki 4, Agent 100 Address 1-4-55 Marunouchi, Chiyoda-ku, Tokyo Self-amendment (5/6) Column Z for detailed explanation of the invention in the specification to be amended Details of the contents of the amendment I would like to correct the following points during writing.

（１）第６頁第２行目 「好気的条件が良い培養温度」とあるを「好気的条件が
良い。培養温度」と補正致します。(1) In the second line of page 6, the phrase "culture temperature with good aerobic conditions" will be corrected to "culture temperature with good aerobic conditions."

（２）第７頁第６行目 ・「Ｎ几ＰＯ，Ｊとあるを ［迅ＰＯ，Ｊと補正致します。(2) Page 7, line 6 ・``Nori PO, J and Aruwo [Corrected as PO, J.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] Ｉ　　ＳＰパルプ排液を限外濾過して得られる透過液中
の糖を炭素源としてカンデイダ属、マイコトルラ属、ト
ルロプシス属、トリゴノプシス属、サツカロミセス属、
クレツケラ属、トリコスポロン属に属する酵母を培養し
、培地中に生成蓄積されたクエン酸を採取することを特
徴とするクエン酸の製造法。Candida sp., Mycotorula sp., Torulopsis sp., Trigonopsis sp., Satucharomyces sp.,
A method for producing citric acid, which comprises culturing yeast belonging to the genus Cretschella and Trichosporon and collecting citric acid produced and accumulated in the medium.