JPS59130185A - Plasmid and its separation - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To separate a plasmid by culturing a microbial strain belonging to Thermomonospora genus. CONSTITUTION:A microbial strain belonging to Thermomonospora genus and containing plasmid is cultured in a medium, and the grown microbial cells are collected and subjected to bacteriolysis. The objective plasmid is separated from the bacteriolyzed product. The plasmid is e.g. the plasmid pATM1001 having a molecular weight of about 2.5 M-dalton and the number of sensitive sites to restriction enzyme of 3 for Sal I , or the plasmid pATM1002 having a molecular weight of about 6.1 M-dalton and the number of sensitive sites to restriction enzyme of 1 for HindIII.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プラスミドおよびその製造法に関する。[Detailed description of the invention] The present invention relates to a plasmid and a method for producing the same.

近年、抗生物質などの二次代謝産物の生産能力を有する
放線菌における組換ＤＮＡ技術の導入のため、放線菌に
おける宿主・ベクター系の研究が進められている。宿主
・ベクターとして、放線菌由来のものとしては、ストレ
プトミセス属菌、ノカルディア属菌およびミクロモノス
ポラ属菌のプラスミドが知られているにすぎない。In recent years, research on host-vector systems in actinomycetes has been progressing in order to introduce recombinant DNA technology into actinomycetes, which have the ability to produce secondary metabolites such as antibiotics. The only known host vectors derived from actinomycetes are plasmids of Streptomyces, Nocardia, and Micromonospora.

そこで本発明者らは、組換ＤＮＡ技術に用いることがで
きるプラスミドを種々探索研究したところ、サーモモノ
スポラ属菌からプラスミドを得ることができることを見
いだし、これに基づいてさらに研究した結果、本発明を
完成した。Therefore, the present inventors conducted various search studies for plasmids that can be used in recombinant DNA technology, and found that plasmids can be obtained from Thermomonospora bacteria.As a result of further research based on this, the present invention was developed. completed.

本発明は、（１）、サーモモノスポラ属菌から分離され
たプラスミド。The present invention provides (1) a plasmid isolated from a Thermomonospora bacterium;

（２）、サーモモノスポフ属に属しプラスミドを有する
微生物を培地に培養し生育させ、その菌体を集め溶菌し
、溶菌物からプラスミドを単離することを特徴とするサ
ーモモノスポラ属菌のプラスミドの分離法。(2) Isolation of plasmids of Thermomonospora bacteria, characterized by culturing and growing microorganisms belonging to the Thermomonospora genus and having plasmids in a medium, collecting and lysing the cells, and isolating plasmids from the lysate. Law.

（３）、約２．５メガダｐトンの分子量を有し、制限酵
素に対する感受性部位数がＳａｌ　Ｉにおいで３である
プラスミドｐＡＴＭ１００１．および（４）、約６．１
メガダルトンの分子量を有し、制限酵素に対する感受性
部位数がＨｉ、ｎｄｍにおいて１であるプラスミドｐＡ
ＴＭ１００２である。(3) Plasmid pATM1001., which has a molecular weight of approximately 2.5 megadaptons and has a number of sensitive sites for restriction enzymes of 3 in Sal I. and (4), about 6.1
Plasmid pA having a molecular weight of megadaltons and the number of sensitive sites for restriction enzymes being 1 in Hi and ndm.
It is TM1002.

本発明方法において用いられるサーモモノスポラ属に属
しプラスミドを有する微生物としては、たとえばサーモ
モノヌ゛ポラ・ホｐモセンシヌ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏ
ｓｐｏｒａ　　ｆｏｒｍｏｓｅｎｓｉｓ　）が挙げられ
、具体的にはサーモモノヌポラ・ホルモセンシフＣ−３
６８２０株（以下、「ｃ−３６８２０株」と１ｌｌｉ４
称することもある。）が挙げられる。The microorganisms belonging to the genus Thermomonospora and having plasmids used in the method of the present invention include, for example, Thermomonospora hopmoscensinus (Thermomonospora
spora formosensis), specifically Thermomononupora formosensif C-3
6820 strain (hereinafter referred to as “c-36820 strain” and 1lli4
It is also called. ).

Ｃ−３６８２０株は、中華民国（台湾）台北市の土壌か
ら通常行なわれる分離手段に従って分離された株であシ
、その菌学的性質は、以下のとおりである。Strain C-36820 was isolated from soil in Taipei City, Republic of China (Taiwan) according to conventional isolation methods, and its mycological properties are as follows.

１　形態学的性質 寒天培地上、よく分枝した基土菌糸から、単純分校状に
０．５μ内外の直状ないしやや屈曲した気菌糸を伸長し
、その主軸にそって形成された短かい胞子柄に単胞子を
形成する。以上のように、おもに気菌糸に単胞子が形成
されるが、わずかに基土菌糸にも形成されることもある
。なお胞子柄の叉状分岐は認められない。胞子は球形（
直径約１μｍ）でその表面は平滑である。その他の特殊
な器官すなわち胞子のう、鞭毛胞子、菌核は形成されな
い。1 Morphological properties Short spores formed along the main axis of straight or slightly curved aerial hyphae of around 0.5 μm extending in a simple branched manner from well-branched substratum hyphae on agar medium. Forms monospores on the stalk. As mentioned above, monospores are mainly formed in aerial hyphae, but they may also be formed in substratum hyphae. Note that no forked branching of the sporophyte is observed. Spores are spherical (
It has a diameter of approximately 1 μm) and a smooth surface. Other specialized organs such as sporangia, flagellated spores, and sclerotia are not formed.

２、培養性状 各種培地上での諸性状は第１表に示すとおシである。2. Culture properties Properties on various media are shown in Table 1.

・、以下余白） 第　　１　　表 註：　（’）内ｔｄカラー・ハーモニー・マニュアル（
Ｃｏｌｏｒ　　Ｈａｒｍｏｎｙ　　Ｍａｎｕａｌ　）第
４版ｔ１９５８年（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎｏｆ　　Ａｍｅｒｉｃａ　　発行）の色番号
を示す。・, blank space below) 1st Table Notes: (') td Color Harmony Manual (
Color Harmony Manual) 4th edition 1958 (Container Corporation
tion of America) color number.

３、生理的性質 Ｃ−３６８２０株の生理的諸性質は第２表に示すとおり
である。3. Physiological properties The physiological properties of strain C-36820 are shown in Table 2.

（イースト・麦芽寒天培地上） メラニン様色素の生成 ペプトン・イアスト鉄基天培地　　　　陰　性千ロジン
寒天培地　　　　　　　　　陰　性スターチの加水分解
　　　　　　　陰　性ゼラチンの液化　　　　　　　　
　陽　性硝酸塩の還元　　　　　　　　　　陰　性脱脂
牛乳の凝固　　　　　　　　　陰　性プリーダム・ゴト
リープの方法〔ジャーナル・オプ・バクテリオロジイ（
Ｊｏｕｒｎａｌ　　　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　
）第５６巻、１０７頁、１９４８年〕に準拠して各種炭
素源の利用性を調べ、第３表に示す結果を得念。(on yeast/malt agar medium) Production of melanin-like pigments Peptone/iast iron base medium Negative 1,000 rosin agar medium Hydrolysis of negative starch Liquefaction of negative gelatin
Positive Reduction of nitrates Negative Coagulation of skim milk Negative Priestham-Gotlieb's method [Journal of Bacteriology]
Journal of Bacteriology
) Vol. 56, p. 107, 1948], the usability of various carbon sources was investigated, and the results shown in Table 3 were obtained.

第３表 ＋：よく利用する ＋　：利用する。Table 3 +: Frequently used +: Use.

±　：利用は疑わしい。±: Usage is questionable.

４、全細胞分解物の性質 ｃ−３６８２０株をイースト・エキス（１％）。4. Properties of whole cell decomposition products yeast extract (1%) of c-36820 strain.

グルコース（１％）からなる液体培地に接種し、生育し
て得られた菌体をベラカー（Ｂｅｃｋｅｒ）　　らの方
法〔アプライド・ミクロビオロジイ（Ａｐｐ−１ｉｅｄ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第１２巻、４２１−４２
３頁（１９６４）、：］に準拠して、２．６−ジアミノ
ピメリン酸の異性体について調べた結果、メン型であっ
た。また同菌体を用い、〜シエバリエ（Ｌｅｃｈｅｖａ
ｌｉｅｒ）の方法〔ジャーナル・オグ・スポラトリー・
アンド・クリニカル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ　　
ｏｆ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　ａｎｄ　Ｃ１ｉｎｉ
ｃａ１Ｃ１１ｎｉｃａ１　）第７１巻、９３４−９４４
頁（１９６８年）〕に従い、菌体の加水分解物をペーパ
ー・クロマトグラフィーによシ分析した結果、グルコー
ス、ガラクトース、マジュロースがそれぞれ明瞭に認め
られた。すなわち、Ｃ−３６８２０株は細胞壁タイプ■
、糖パターンＢに属する。A liquid medium consisting of glucose (1%) was inoculated and the resulting bacterial cells were grown using the method of Becker et al.
Microbiology) Volume 12, 421-42
3 (1964), :], the isomer of 2,6-diaminopimelic acid was investigated, and it was found to be men-type. In addition, using the same bacterial body, ~ Lecheva
lier) method [Journal og sporatory
and Clinical Medicine (Journal
of Laboratory and C1ini
ca1C11nica1) Volume 71, 934-944
(1968)], the hydrolyzate of bacterial cells was analyzed by paper chromatography, and as a result, glucose, galactose, and madulose were each clearly recognized. In other words, the C-36820 strain has cell wall type ■
, belongs to sugar pattern B.

以上の菌学的性質のうち、気菌糸に単胞子を形成し、胞
子は非運動性であシ、細胞壁タイプ■型で、中温性であ
ることから、本菌株をサーモモノスポラ属（Ｔｈｅｒｍ
ｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　）の中温性菌群に帰属すると見
なすのが妥当である。従って、既知の類縁種として以下
の菌種が挙げられる。Among the above mycological properties, this strain forms monospores in aerial hyphae, the spores are non-motile, the cell wall type is type II, and it is mesophilic.
It is reasonable to consider that it belongs to the mesophilic bacteria group (Omonospora). Therefore, known related species include the following bacterial species.

（１）　　サーモモノスポラ・メソフイラ（Ｔｈｅｒｍ
ｏｍｏｎｏｅｐｏｒａ　　ｍｅｓｏｐｈｉｌａ　）ジャ
ーナル・オグ・ファメンテーション・チクノロシイ（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｆｅｒｍｅｎｔａ、ｔｉｏｎ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）第４９巻、８９５−９０３員
。(1) Thermomonospora mesophila (Therm
omonoepora mesophila) Journal of Fermentation Chikunoroshii (J
Our own of Fermenta, tion
Technology) Volume 49, 895-903 members.

１９７１年 （２）サーモモノスポラ・メンビホルミス（Ｔｈｅｒｍ
ｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ　　ｍｅｓｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）
ジャーナル・オブ・ファーメンテ−ジョン・チクノロシ
イ　第５２巻、１０〜１３頁、　１９７４年 そこで、Ｃ−３６８２０株と上記既知菌種（サーモモノ
スポラ・メソフイラＩＦＯ１４１７９゜サーモモノスポ
ラ・メソビホルミスＩＦＯ１＋７８）とを同−条件下で
菌学的比較を行った。その結果、ＵＦＯ１４１７８株は
生育にビタミンＢ群が必須であることから、各種分類培
地上での生育が極めて貧弱か、あるいは全く生育が認め
られず、Ｃ−３６８２０株との違いは明瞭であった。一
方、ＩＦｏ　　１４１７９株は灰色の気菌糸を着生し、
硝酸塩の還元が陽性であシ、Ｄ−フラクトース、Ｄ−キ
シロース、Ｄ−マンニットの資化性が非常に良好である
。以上の性質はＣ−３６８２０株の結果と特に異なる性
質である。1971 (2) Thermomonospora menbiformis (Therm
omonospora mesoviformis)
Journal of Fermentation, Vol. 52, pp. 10-13, 1974. Therefore, the C-36820 strain and the above-mentioned known bacterial species (Thermomonospora mesophylla IFO14179°, Thermomonospora mesobiformis IFO1+78) were identified as the same. - Mycological comparisons were made under conditions. As a result, since the UFO14178 strain requires B vitamins for growth, it showed extremely poor growth or no growth at all on various classification media, and the difference from the C-36820 strain was clear. . On the other hand, IFo 14179 strain grows gray aerial mycelia.
The reduction of nitrate is positive, and the assimilation of D-fructose, D-xylose, and D-mannite is very good. The above properties are particularly different from the results of the C-36820 strain.

上記したことから、Ｃ−３６８２０株はサーモモノスポ
ラ属の新菌種に分類されることが適当と認メラれ、本菌
種はサーモモノスポラ・ホルモセンシス（Ｔｈｅｒｍｏ
ｍｏｎｏｅｐｏｒａ　　ｆｏｒｍｏｅｅｎｓｉｓ　）と
命名された。Based on the above, it is recognized that strain C-36820 is appropriately classified as a new bacterial species of the genus Thermomonospora, and this bacterial species is Thermomonospora hormocensis (Thermomonospora genus).
monoepora formeensis).

Ｃ−３６８２０株は、昭和５７年９月１４日に財団法人
発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号Ｉ］１ｉ’０１４２０
４として寄託され、また本微生物は昭和５７年９月２７
日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＢ
Ｉ）に受託番号ＦＥＢＭＰ−６７３０として寄託されて
いる。The C-36820 strain was deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) on September 14, 1981, with accession number I]1i'01420.
4, and this microorganism was deposited on September 27, 1981.
Ministry of International Trade and Industry, Agency of Industrial Science and Technology, Microbial Technology Research Institute (FB)
I) under accession number FEBMP-6730.

サーモモノスポラ属に属する微生物は他の放線菌と同様
に、その性質が変化しやすく、例えば紫外線やＸ線、薬
品などを用いる人工変異手段を適用することによυ容易
に変異し得る。しかし、これらの変異株であってもグラ
スミドを保有する性質を失わない限シ本発明方法に使用
することができる。Like other actinomycetes, microorganisms belonging to the genus Thermomonospora are susceptible to change in their properties, and can be easily mutated by applying artificial mutagenesis means using, for example, ultraviolet rays, X-rays, and chemicals. However, even these mutant strains can be used in the method of the present invention as long as they do not lose the property of possessing Grasmid.

′サーモモノヌポラ属菌は、通常の深部通気培養により
生育させることができる。培養の培地としては、微生物
の利用できる栄養物を含有するものが用いられる。すな
わち、炭素源として例えば、グルコース、でん粉、グリ
セロール、デキストリン、シュークローヌ、水飴、糖蜜
なとが、また窒素源として、例えば脱脂大豆粉、生大σ
粉、コーン・ヌチープ・リカー、小麦胚芽、綿実粉、酵
母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの
有機及び無機窒素化合物がいずれも有効に利用される。'Thermomononupora bacteria can be grown by conventional deep aeration culture. As a culture medium, one containing nutrients that can be used by microorganisms is used. That is, carbon sources include, for example, glucose, starch, glycerol, dextrin, sucrone, starch syrup, and molasses, and nitrogen sources include, for example, defatted soybean flour and raw sigma.
Both organic and inorganic nitrogen compounds such as flour, corn nut liquor, wheat germ, cottonseed flour, yeast extract, ammonium sulfate, ammonium nitrate, etc. are usefully utilized.

また必要に応じて炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩
化カリウム９リン酸塩など無機塩類を添加しても良い。Further, inorganic salts such as calcium carbonate, sodium chloride, and potassium chloride 9-phosphate may be added as necessary.

培地のｐｉ（は約６ないし８に調整するのがよい。培養
温度は、生育可能な任意の温度、例えば約１８ないし５
０℃、好ましくは約２０ないし３７℃が用いられる。培
養時間は７２ないし３６０時間が適当である。The pi (pi) of the medium is preferably adjusted to about 6 to 8. The culture temperature is any temperature that allows growth, for example about 18 to 5.
0°C is used, preferably about 20 to 37°C. A suitable culture time is 72 to 360 hours.

本発明のプラスミドを分離するには、上記培養によって
生育させた菌体を集め、溶菌し、溶菌物からプラスミド
を単離する。菌体を集める方法は、自体公知の方法に従
えばよく、たとえば、遠心分離、濾過などの方法が挙げ
られる。To isolate the plasmid of the present invention, the bacterial cells grown by the above culture are collected, lysed, and the plasmid is isolated from the lysate. The bacterial cells may be collected according to a method known per se, and examples thereof include methods such as centrifugation and filtration.

溶菌方法は、自体公知の方法に従えばよく、たとえば、
溶菌酵素（例、リゾチーム）を用いる方法があげられる
。なお必要があれば溶菌酵素のほかに、プロテアーゼな
どの酵素類やザルコシール、ラウリル硫酸ナトリウムな
どの界面活性剤を加えたり、凍結融解をほどこすことに
よシ溶菌全容易にすることができる。The bacteriolytic method may be carried out according to a method known per se, for example,
Examples include methods using lytic enzymes (eg, lysozyme). If necessary, in addition to the lytic enzyme, lysis can be facilitated by adding enzymes such as protease, surfactants such as sarcosil or sodium lauryl sulfate, or by subjecting to freeze-thawing.

つぎに、このようにして得られた溶菌物から、プラスミ
ドを単離するにはそれ自体公知の方法に従えばよく、た
とえばクリアードライゼイト法、アルカリ変性法、エタ
ノ−μあるいはポリエチレングリコ−ｆｉ／ｆ用いるＤ
ＮＡの沈殿法、エチジウムブロマイド−塩化セシウム密
度平衡遠心法、ショ糖密度勾配遠心法、ヒドロキシルア
パタイトクロマトグラフィー、ゲｌｖ電気泳動法、セロ
ファン膜などを用いる透析処理法などを適宜組み合わせ
てプラスミドを単離することができる。Next, a plasmid can be isolated from the lysate thus obtained by following a method known per se, such as the clear lysate method, alkali denaturation method, ethanol-μ or polyethylene glyco-fi/ D using f
Plasmids are isolated using an appropriate combination of NA precipitation, ethidium bromide-cesium chloride density equilibrium centrifugation, sucrose density gradient centrifugation, hydroxyl apatite chromatography, gel LV electrophoresis, dialysis using cellophane membranes, etc. can do.

後述の実施例１において得られたグラスミドｐＡＴＭ１
００Ｉは、約２．５メガダルトンの分子量を有し、制限
酵素に対する感受性部位数がＳａ、：］−Ｉにおいて３
である。さらに、グラスミドｐＡＴＭ１００１は、Ｅｃ
ｏＲＩ　＋　ＨｉｎｄＪＩｌ　＋　Ｋ、ｐｎ　Ｉ　＋　
ＢａｍＨＩおよびＢｇｌ　ＩＩに対する感受性部位数は
０である。Grasmid pATM1 obtained in Example 1 described below
00I has a molecular weight of approximately 2.5 megadaltons, and the number of sensitive sites for restriction enzymes is 3 in Sa, :]-I.
It is. Furthermore, Grasmid pATM1001 has Ec
oRI + HindJIl + K, pn I +
The number of sensitive sites for BamHI and Bgl II is 0.

また、後述の実施例１において得られたグラスミドｐＡ
ＴＭ１００２は、約６．１メガダルトンの分子量を有し
、制限酵素に対する感受性部位数がＬＨ，ｎｄ、ｍにお
いて１である。さらに、プラスミドｐＡＴＩＡ　　１０
０２は、制限酵素Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　に対する感受性部
位数がＩ　、　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　Ｋ対するそれは１゜
Ｋｐｎ　Ｉに対するそれはＩ　＋　Ｂａｍ　Ｈ１に対す
るそれは２　、　Ｂｇｌ　ＩＩに対するそれは２以上、
およびＳａｌ　Ｉに対するそれは２以上である。In addition, Grasmid pA obtained in Example 1 described below
TM1002 has a molecular weight of approximately 6.1 megadaltons, and the number of sensitive sites for restriction enzymes is 1 in LH, nd, and m. Additionally, plasmid pATIA 10
02 has the number of sensitive sites for restriction enzyme Eco RI of I, for Hind III K of 1°, for Kpn I of I + of Bam H1 of 2, for Bgl II of 2 or more,
and that for Sal I is 2 or more.

本発明のグラスミドの分子量は、たとえば電子顕微鏡観
察による方法、制限酵素消化、アガロ−スゲμ電気泳動
による方法など自体公知の方法により決定することがで
きる。The molecular weight of Grasmid of the present invention can be determined by methods known per se, such as electron microscopy, restriction enzyme digestion, and agarose gel μ electrophoresis.

上記の方法により測定したｐＡＴＭｌｏｏｌの分子量は
、約２，５メガダμトンであるが、その誤差範囲は±０
．１メガダルトンである。また、ｐＡＴＭ１００２の分
子量は約６，１メガダルトンであるが、その誤差範囲は
±０．１メガダルトンである。The molecular weight of pATMlool measured by the above method is about 2.5 megatons, but the error range is ±0
．． It is 1 megadalton. Furthermore, the molecular weight of pATM1002 is approximately 6.1 megadaltons, but the error range is ±0.1 megadaltons.

本発明のグラスミドの制限酵素に対する感受性部位数は
、過剰量の制限酵素の存在下におけるプラスミドＤＮＡ
の消化の後、断片を０．８％アガロース電気泳動にかけ
分別される断片数から決定される。用いる制限酵素は次
の菌種より得られたものである。５ａｌＩ＋７．）レデ
トミセス・アルプス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃａｓ　　ａ
ｌｂｕｓ　）＋　ＥｃｏＲＩ：　エシェリヒア・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　）＋　　Ｅｌｉ
ｎｄｌｌｌ：ヘモフイ／レス・インフルエンザ（Ｈａｅ
ｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　）　＋　Ｋｐ
ｎＩ　：クレブシイラ・ニラモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ
ｌａ　　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）　＋　ＢａｍＨＩ：
バチμヌ・アミロリクエファシェンス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓ　）　＋　ＢｇｌｌＩ　：バチルス・グロビギー
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｇｌｏｂｉｇｉｉ）。The number of sensitive sites for restriction enzymes of Grasmid of the present invention is determined by
After digestion, the fragments are subjected to 0.8% agarose electrophoresis and the number of fractionated fragments is determined. The restriction enzymes used were obtained from the following bacterial species. 5alI+7. ) Streptomyces a
lbus ) + EcoRI: Escherichia coli (
Escherichia coli ) + Eli
ndlll: Haemophy/Res Influenza (Hae
mophilusinfluenzae) + Kp
nI: Klebsiella nilamonia
la pneumoniae) + BamHI:
Bacillus amyloliquefaciens
ens ) + BgllI: Bacillus globigii.

これらの制限酵素は、宝酒造株式会社、ニューイングラ
ンド・パイオラグズ社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎ、ｄＢｉ
ｏｌａｂｅ　＋　Ｉｎｃ、　）　（米国）、ベーリンガ
ー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍＧｍｂＨ）　（西ドイツ）などから入手するこ
とができる。また、これらの制限酵素は、メソツズ・イ
ン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　）第６８巻第２７−４　＋貝（１９７
９年）に記載されている。These restriction enzymes were purchased from Takara Shuzo Co., Ltd., New England Piolaguz Co., Ltd. (New England, dBi
olabe + Inc, ) (USA), Boehringer Mannheim (Boehringer Mannheim)
HeimGmbH) (West Germany), etc. In addition, these restriction enzymes are available from Methods in Enzymology.
ymology) Volume 68, No. 27-4 + Shellfish (197
9).

本発明のグラスミドのうち、ｐＡＴＭ　　１００２１ｄ
、複数の制限酵素感−受性部位を有することから、該グ
ラスミドを修飾してより小型のプラスミドを調製するこ
とができる。本発明のプラスミドを異種のグラスミドの
断片との複合プラスミドであって、異種の宿主でも増殖
できるシャ）／レベクターに調製することができる。本
発明のグラスミドに薬剤耐性を支配するＤＮＡ断片を付
加し、より使用しやすいベクターとして用いることがで
きる。Among the Grasmids of the present invention, pATM 10021d
Since the grasmid has multiple restriction enzyme sensitive sites, it is possible to modify the grasmid to prepare a smaller plasmid. The plasmid of the present invention can be prepared as a complex plasmid with a fragment of a heterologous grasmid into a vector that can be propagated even in a heterologous host. A DNA fragment that controls drug resistance can be added to Grasmid of the present invention, and it can be used as an easier-to-use vector.

本発明のグラスミドあるいはその誘導体プラスミドは、
放線菌、細菌、酵母など醗酵工業上重要な微生物のクロ
ーニング・ベクターとして有用である。たとえば、抗生
物質、生理活性物質、酵素などの多種多様の生産性を示
す放線菌の生産性に関与する構造遺伝子あるいは調節遺
伝子を、これらのベクタープラスミドを用いてクローン
化することにより生産性の増大をもたらすことができる
。Grasmid or its derivative plasmid of the present invention is
It is useful as a cloning vector for microorganisms important in the fermentation industry, such as actinomycetes, bacteria, and yeast. For example, productivity can be increased by using these vector plasmids to clone structural or regulatory genes involved in the productivity of actinomycetes, which exhibit a wide variety of productivity such as antibiotics, physiologically active substances, and enzymes. can bring.

また、本発明のプラスミドあるいはその誘導体１ラスミ
ドは、微生物遺伝子にかぎらず高等動植物の遺伝子（た
とえば、インスリン、ソマトスフチンなどをコードする
遺伝子、窒素固定に関与する遺伝子）をクローン化する
ためのベクターとしても使用できる。The plasmid of the present invention or its derivative 1 lasmid can also be used as a vector for cloning not only microbial genes but also genes of higher animals and plants (for example, genes encoding insulin, somatosfutin, etc., genes involved in nitrogen fixation). Can be used.

上記開用において、目的とする遺伝子を含む組換グラス
ミドの作製方法それ自体は公知である。In the above-mentioned application, the method for producing a recombinant grasmid containing the gene of interest is known per se.

たとえば、サイエンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　）　　１９７５
年第２３３巻隘１第２４〜３３頁に記載されている。For example, Scientific American (Sci
1975
It is described in Vol. 233, No. 1, pp. 24-33.

上記使用において、得られた組換プラスミドを宿主へ導
入する方法自体は公知であシ、たとえば　　−ネイチャ
ー（Ｎａｔｕｒｅ　）第２７４巻ｆｆ１３９８−４００
頁（１９７８年）に記載されている。また、クローン化
の方法は、たとえばジャーナル・オグ・バクテリウムジ
−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｆ、ｏｌｏ（
７ｙ）第１５１巻第６６８〜６８５頁（１９８２年）。In the above-mentioned use, the method of introducing the obtained recombinant plasmid into the host is known, for example, - Nature, Vol. 274, ff1398-400.
(1978). Further, cloning methods are described, for example, in the Journal of Bacterium, olo (
7y) Vol. 151, pp. 668-685 (1982).

同書第１４６巻第３６０〜３６８頁（１９８１年）。Ibid. Vol. 146, pp. 360-368 (1981).

ジー：ｙ　（Ｇｅｎｅ　）第１８巻第１３３−１４１頁
（１９８２年）などに記載されている。Gene, Vol. 18, pp. 133-141 (1982).

また、本発明のプラスミドをベクターとして用い、目的
とする物質の生合成に必要な遺伝子をｍみ込んだグラス
ミドを宿主微生物に導入し、これを自体公知の方法で培
養して目的とする物質全培地中あるいは菌体内に生成蓄
積させ、その培養物から目的とする物質を分にＦ精製す
ることにより、目的とする物質をｆｙ！ｉ告することが
できる。Furthermore, using the plasmid of the present invention as a vector, Grasmid containing the genes necessary for the biosynthesis of the target substance is introduced into a host microorganism, and the host microorganism is cultured by a method known per se to produce the entire target substance. By producing and accumulating the target substance in the culture medium or inside the bacterial cells, and then refining the target substance from the culture in minutes, the target substance can be fy! i can report.

本発明のグラスミドは、放線−由来のグラスミドである
から、放線菌を宿主とする系にベクターとして用いるこ
とができるばかシではなく、他のグラム陽性菌、たとえ
ばバシラヌ（ＢａｃＮ、：Ｉ−ｕｑ　）、コリネバクテ
リウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）、ブレビ
バクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａ、ｃｔｅｒｉｕｍ　）な
どの細菌に、ベクターとしても使用できる可能性がある
。Since the grasmid of the present invention is an actinomycete-derived grasmid, it is not a grasmid that can be used as a vector in a system with actinobacteria as a host, but can be used as a vector for other gram-positive bacteria, such as BacN (BacN, :I-uq). , Corynebacterium , Brevibacterium , and Brevibacterium , may also be used as vectors.

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。The present invention will be explained in more detail with reference to Examples below.

実施例１ ストレプトミセス・ホルモセンシスＣ−３６８２０（工
ＦＯ１４２０４，ＦＥ′Ｒｕ　　Ｐ−６７３０）をＴＹ
Ｇ培地（バクトドリプトン１％、酵母エキス０．６％、
グルコース１％、ｐＨ７，０）中、３０℃。Example 1 Streptomyces hormocensis C-36820 (TECH FO14204, FE'Ru P-6730) was
G medium (Bactodryptone 1%, yeast extract 0.6%,
Glucose 1%, pH 7,0) at 30°C.

２４時間振盪培養し、その種培養＋５１！Ｍ！を３００
ｍ１のＴＹＧ培地に接種して３０℃、２４時間振盪培養
した。培養後、６０００Ｘｆ　、１５分の遠心分離によ
り菌体を集菌した。集菌した菌体をシュークロース１５
％を含有するＴＥ緩衝液〔０，０５Ｍトリス（ヒドロキ
シメチ／Ｉ／）アミノメタン（トリス）　、　０．０５
　Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０１）で洗浄後、１　ｑ／
　ｍｌのＮ−アセチルムラミダーゼＳ　Ｇ　（生化学工
柴株式会社製）及び１５％シュークロースを含むＴＥ緩
衝面２０ゴに再懸濁させた。３７℃で３０分加温し、２
　”Ｉｔ’　／　ｍｌのプロティナーゼＫ（メルり社製
、米国）２耐を加え、更に、３７℃で３０分加温した。After shaking culture for 24 hours, the seed culture +51! M! 300
It was inoculated into m1 TYG medium and cultured with shaking at 30°C for 24 hours. After culturing, the bacterial cells were collected by centrifugation at 6000Xf for 15 minutes. Collected bacterial cells are treated with sucrose 15
TE buffer containing % [0.05 M Tris (hydroxymethy/I/) aminomethane (Tris), 0.05
After washing with M EDTA, pH 8,01), 1 q/
It was resuspended in 20ml of TE buffer containing 15% sucrose and N-acetylmuramidase SG (manufactured by Seikagaku Shiba Co., Ltd.). Heat at 37℃ for 30 minutes,
"It'/ml of Proteinase K (Merli, USA) 2 resistant was added, and the mixture was further heated at 37°C for 30 minutes.

２０％ラウリル硫酸ナトリウノ・を含むＴＥ緩衝液５．
５　ｔｇｌを加えて、緩やかに混和させ、３７℃で１時
間加温し、５５℃に温度を変更し５分間加温した。２５
０　ｍｌ容ガラスビーカーに溶菌液を移し、マグネティ
ック・スターラーを利用し、ゆつくシ混和しながら４Ｎ
水酸化ナトリウム水溶液を滴下し、ｐＨ１２，３〜１２
４に調整した。°正確に４分後２Ｎ）！Ｊヌ・塩酸緩衝
液（ｐＨ７，０）を加えてｐＨ８，０に補正した（約７
ゴを要した）。溶菌液３０齢に対して１５ゴの２０％ラ
ウリμ硫酸ナトリウムを含むＴＥ緩衝液を加え、さらに
５Ｍ塩化ナトリウム水溶ｇ！、’ｆｅ　３．２　ｍｌ加
えてゆつくシ混和させ、氷水中に１時間保持し、その後
、冷蔵庫（４℃）中に一晩放置した。４５．０００ＸＩ
／、６０分間遠心分離し、上清の全容量の４分の１容の
５０％ポリエチレングリコ−７１’６０００を含むＴＥ
緩衝液（ｐＨ８，０）を加え、冷蔵庫（４℃）に−晩装
置した。１８．０００ｘｆ、５分間遠心分離し沈殿物を
集め、緩衝ｇ！ｌ（０、ＯＩＭ）ＩＪス。TE buffer containing 20% sodium lauryl sulfate 5.
5 tgl was added, mixed gently, heated at 37°C for 1 hour, then changed the temperature to 55°C and heated for 5 minutes. 25
Transfer the lysate to a 0 ml glass beaker and use a magnetic stirrer to gently mix the solution for 4N.
Add sodium hydroxide aqueous solution dropwise to pH 12.3-12.
Adjusted to 4. °2N after exactly 4 minutes)! The pH was corrected to 8.0 by adding J-HCl buffer (pH 7.0) (approx.
). To the 30-year-old bacteriolytic solution, add 15 grams of TE buffer containing 20% lauri μ sodium sulfate, and then add 5 M sodium chloride aqueous solution! , 3.2 ml of 'fe were added, mixed gently, kept in ice water for 1 hour, and then left in a refrigerator (4°C) overnight. 45.000XI
/, centrifuged for 60 min, and added 1/4 volume of the total volume of supernatant to TE containing 50% polyethylene glycol-71'6000.
A buffer solution (pH 8,0) was added and the mixture was placed in a refrigerator (4°C) overnight. Centrifuge at 18,000xf for 5 minutes, collect the precipitate, and buffer g! l(0, OIM)IJS.

０．００２　Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０＞に溶解させ、
同じ緩衝液に対して４℃で一晩透析した。４　ｍｌのＤ
ＮＡ溶解液に対して４．３ｆの塩化セシウムを加えて溶
解させ、更に４．８　ｔ！ｆ／　／　ｗｌのエチジウム
・ブロマイド′ｆｔ０．４３　ｍｌ加えて良く混和、溶
解させた。ベックマン社（米国）製分離用超遠心機Ｌ８
−５５において垂直ローターＶＴｉ　−６５を用いて、
５０’、０００ｐｐｍ　、　１６時間遠心分離した。紫
外線ランプを用いてプラスミドバンドを検出し、チュー
ブ側面から、注射器を用いてプラスミドバンドを抜き取
った。これをＴＥ緩衝液で飽和させたイソアミルアルコ
ールを用い、５回抽出してエチジウム・ブロマイドを除
去した。得られたＤＮＡ溶液にＴＥ緩衝液を加えて４．
　Ｏｗｌにした。これに０．４阿どの３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４，８）を加えて、９、７　ｚｌの一２０℃に
冷却したエタノールを加え混和後、冷凍庫（−２０℃）
に２時間放置し、２０．０ＯＯＸｆで１５分間遠心分離
し、上清を完全に除去し、−２０℃に冷却したエタノー
ルで洗浄し、減圧下にエタノールを除去し、緩衝液（０
，０１ｍ　Ｒ（）リス、０．００２ＭＥＤＴＡ）に溶解
させた。Dissolved in 0.002 M EDTA, pH 8.0>
Dialysis was performed overnight at 4°C against the same buffer. 4 ml of D
Add 4.3f of cesium chloride to the NA solution, dissolve it, and add 4.8t! Add 0.43 ml of ethidium bromide of f//wl and mix well to dissolve. Separation ultracentrifuge L8 manufactured by Beckman (USA)
-55 with vertical rotor VTi -65,
Centrifuged at 50',000 ppm for 16 hours. The plasmid band was detected using an ultraviolet lamp, and the plasmid band was extracted from the side of the tube using a syringe. This was extracted five times using isoamyl alcohol saturated with TE buffer to remove ethidium bromide. 4. Add TE buffer to the obtained DNA solution.
I made it Owl. Add 0.4 ml of 3M sodium acetate (pH 4.8) to this, add 9.7 zl of ethanol cooled to 20°C, mix, and then store in the freezer (-20°C).
Leave for 2 hours at
, 01m R( ) Lis, 0.002 MEDTA).

調製アガロース（０，８％）Ｗｉ気気泳動法よシ、小さ
い分子量のｐＡＴＭ　　１００１とより大きい分子量の
ｐＡＴＭ　　１００２を分離した。アガロースからのプ
ラスミドＤＮＡの回収は、フリーズ・スクイズ法〔アナ
リテイカル・バイオケミヌトリー（Ａｒ＋ａ１ｙｔｉｃ
ａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　Ｗ’ｒ　６６
＠第２１３〜２２０頁１９７５年）〕に従った。Using prepared agarose (0.8%) Wi-electrophoresis, pATM 1001 with a lower molecular weight and pATM 1002 with a larger molecular weight were separated. Recovery of plasmid DNA from agarose is carried out using the freeze-squeeze method [Analytical Biochemistry (Ar+Alytic)].
al Biochemistry) W'r 66
@ pages 213-220, 1975)].

プラスミド　ｐＡＴ）、ｉ　Ｉ　Ｏ０１及びＰＡ、ＴＭ
　Ｉ　００２の各種制限酵素に対する感受性と分子量の
泪り定は、と記で調製したプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　（０
，８７７ｇ）を用い、各々の制限酵素（いずれも宝酒造
株式会ｔＪ１＋μ）の適正条件（供給者指定のもの）下
で、２倍過剰の酵素量を用いて行なった。制限酵素によ
り切断されたＤ↑ＴＡ試料は、０．８％アガロースゲル
に供し、１α当り４■の一定付加電圧で、１６時間電気
泳動を行なった。１μｇ　／　ｙｔｌのエチジウＪ・・
ブロマイド溶液中に１５分染色し、流水中３０分洗浄後
、生成した断片の数を紫外線下で検出し各々の分子量を
求めた。分子量は、同時に電気泳動に付したラムダファ
ージ（λｃＩ　　８５７）ＤＮＡのＨｉｎ　ｄＩＩＩ消
化物による断片を標準として求めた〔ジャーナル・オグ
・モレキュラー・バイオロジー　（Ｊｏｕｒｎａｌ　　
ｏｆ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ　）１
２３巻第３７１〜３８６頁１９７８年）〕。Plasmid pAT), i I O01 and PA, TM
The sensitivity and molecular weight of I002 to various restriction enzymes were determined using plasmid DNA (0
, 877 g) under appropriate conditions (specified by the supplier) for each restriction enzyme (both Takara Shuzo Co., Ltd. tJ1+μ) and using a 2-fold excess amount of enzyme. The D↑TA sample cleaved with the restriction enzyme was applied to a 0.8% agarose gel and electrophoresed for 16 hours at a constant applied voltage of 4 μ/α. 1μg/ytl Echijiu J...
After staining in a bromide solution for 15 minutes and washing in running water for 30 minutes, the number of generated fragments was detected under ultraviolet light and the molecular weight of each was determined. The molecular weight was determined using a fragment obtained from a Hin dIII digest of lambda phage (λcI 857) DNA that was simultaneously subjected to electrophoresis as a standard [Journal og Molecular Biology (Journal
of Molecular Biology)1
23, pp. 371-386, 1978)].

ププラスミドＡＴＭ　　１０旧及びｐＡＴＭ　１００２
の分子量は、生成断片の分子量を加算して求めた。結果
を第５表に示す。Plasmid ATM 10 old and pATM 1002
The molecular weight of was determined by adding the molecular weights of the produced fragments. The results are shown in Table 5.

第５表　１１１１ＡＴＭ　ｌ　００１及びＴ）ＡＴＭ　
ｌ　００２の制限酵素に対する感受性、生成断片の分子
量及び加算して得られるｐＡＴＭ　　ｔｏｏｌ及びｐＡ
ＴＭ　１００２の分子量（注）※小さい方の断片はこの
系では検出されな　　・いから、全体の分子量は不明で
ある。Table 5 1111ATM l 001 and T) ATM
The sensitivity of l 002 to restriction enzymes, the molecular weight of the generated fragment, and the pATM tool and pA obtained by addition.
Molecular weight of TM 1002 (Note) *The smaller fragment is not detected by this system, so the overall molecular weight is unknown.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１）、す！モモノスポラ属菌から分離されたプラスミ
　　ド。 （２ン、サーモモノヌポラ属に属しプラスミドを有する
微生物を培地に培養・し生育させ、その菌体を集め溶菌
し、溶菌物から１ラヌミドを単離することを特徴とする
サーモモノスポラ属菌のプラスミドの分離法。 （３）、約２．５メガダルトンの分子＃を有し、制限酵
素に対する感受性部位数がＳａｌ　Ｉにおいて３である
プラスミドｐＡＴＭ　１００１゜ （４）、約６．１メガダｙｂ　）ンの分子量を有し、制
限酵素に対する感受性部位数がＨｉｎｄｌｌＩにおいて
１であるプラヌミＦｐＡＴＭ１００２゜[Claims] (1), Su! A plasmid isolated from Momospora. (2) A plasmid of a Thermomonospora bacterium characterized by culturing and growing a microorganism belonging to the Thermomonospora genus and having a plasmid in a medium, collecting and lysing the microorganisms, and isolating 1 Ranumid from the lysate. (3) The plasmid pATM 1001° (4), which has a molecular # of approximately 2.5 megadaltons and the number of sensitive sites for restriction enzymes is 3 in Sal I (4), approximately 6.1 megadaltons. Planumi FpATM1002゜ having a molecular weight of , and the number of sensitive sites for restriction enzymes being 1 in HindllI.