JPS59122499A - 支持体への核酸結合方法 - Google Patents

支持体への核酸結合方法

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JPS59122499A
JPS59122499A JP58234928A JP23492883A JPS59122499A JP S59122499 A JPS59122499 A JP S59122499A JP 58234928 A JP58234928 A JP 58234928A JP 23492883 A JP23492883 A JP 23492883A JP S59122499 A JPS59122499 A JP S59122499A
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INTEGUREETETSUDO JIENETEITSUKU
INTEGUREETETSUDO JIENETEITSUKUSU Inc
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えばＤＮＡのハイブリッド形成（混成分子
形成）ＶＣよる検定を行）ために、核酸（ＲＮＡ及びＤ
ＮＡ）を支持体に結合させることに関する。
このような検定はここ数年間試料中の特定のＤＮＡ配列
を検出するために使用されてきており、特許や技術文献
（例えば、Ｆａｌｋｏｗ等による米国特許第４３５８５
３５号明細書、これは参照することによりここに引用さ
れる）に開示されている。
このような検定は一般的に試料中のウィルス、原核細胞
または真核細胞に特定のＤＮＡ配列を含むことが予想さ
れる試料（例えば、尿）をＤＮＡ結合支持体（例えば、
ニトロセルロース膜）上に点在させ、必要により細胞を
溶解し、ＤＮＡを変性並びに中和して、その後ハイブリ
ッド形成による検定を行う前にそのＤＮＡを支持体に固
定することを包含する。一般に固定は、例えばＧ１１ｌ
ｅｓｐｉｅ等によるＪ、ＭｏＩＢｉｏ１１２，８２９（
１９６５）に記載されるごとく、自然乾燥させてその後
真空炉中で２時間乾燥させることにより実施される。
一般的に、本発明は核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を核酸
結合支持体に結合させる方法に特徴があり、この方法は
核酸をその支持体上に付着させ、次いでその核酸と支持
体とを支持体と適合しかつ核酸を支持体に結合させ得る
有機溶媒を含有する結合溶液に、結合を行わしめるのに
十分な時間の間、接触させることを包含する。
好′ましい実施態様において、核酸はハイブリッド形成
により検定されるべき試料中に含まれており、結合溶液
はハイブリッド形成を妨害するような方法でＤＮＡを変
化させず、そしてその有機溶媒は分子中に２０個より多
くない炭素原子を含みかつその有機溶媒が実質的に溶媒
の全てをなしており、アルコール、エーテル、芳香族化
合物またはケトンであり、最も好ましくはエタノール、
メタノール、　　５ｅｃ−ブチルアルコール、イソアミ
ルアルコール、イソプロピルアルコール、イソブチルア
ルコール、エチルエーテル−１ｊｌルエンである。他の
好ましい実施態様において、結合溶液は１種以上のこの
ような有機溶媒の混合物を含み、そして核酸と支持体と
がその結合溶液と接触する時間は１秒ないし１０分、最
適には約５分である。
本発明方法は非常に短時間で、すなわちたいていの場合
には５分またはそれ以下で、核酸を固定化することがで
きる。こうして、ドツトの吸い取り（Ｄｏｔ　ｂｌｏｔ
ｓ　）、サザンの吸い取りＣ３ｏｕｔ−ｈｅｒｎ　ｂｌ
ｏｔｓ　）、コロニー***、および変性核酸を支持体に
固定化するのに要する他の技術を完了させるのに必要な
全時間が非常に短縮される。その上に１本発明方法は真
空ポンプや真空炉のような高価な装置を使用する必要が
ない。
本発明の他の特徴および効果は次の好ましイ実施態様の
記述から明らかになるだろ）。
多くの異なった部類の有機化合物である非常に広範囲の
有機溶媒が核酸を核酸結合支持体に結合させるのに使用
される。最も好ましい部類の化合物はアルコール類であ
り、これは一般に毒性が少ないために他の部類の化合物
より取り扱いが簡単である。核酸を結合させるがアルコ
ール類はど望ましいものではない他の部類の化合物には
エーテル類（例えば、エチルエーテル）、芳香族化合物
（例えば、トルエン）およびケトン類（例えば、アセト
ン）がある。さらに他の部類の有機溶媒にはアルカン類
、アルケン類、アルキン類、エステル類およびハロゲン
化アルカンのようなヘテロ有機化合物（例えば、クロロ
ホルムや四塩化炭素）がある。全ての部類の有機溶媒に
とって、このような使用のために費用等を考えると、炭
素原子数が２０個より多くないものであること、最適に
は１０個より多くないものであるということが必要であ
る。
特定の場合における溶媒の選択はいくつかの要因により
決められるだろう。まず第一に、溶媒を含む結合溶液は
その結合方法の意図した目的な妨害するような方法で核
酸を変化させるものであってはならず、例えば、核酸を
ハイブリッド形成による検定のために固定化する場合に
その核酸は溶媒での処理後にハイブリッド形成が可能で
なげればならない。
第二に、溶媒を含む結合溶液は使用する支持体と適合す
るものでなげればならず、すなわち、溶媒はその結合方
法の目的を妨害する程度に支持体を溶解してはならない
。いくつかの核酸結合支持体は他のものより有機溶媒に
溶解されやすい。こうして実際に、高い耐溶媒性を示す
ナイロン基材の支持体はどの有機溶媒も安全に使用する
ことができるが、一方ニトロセルロースのような比較的
溶解されやすい支持体に対しては溶媒の選択がより限定
されたものとなる。例えば、無水メタノールやアセトン
はハイブリッド形成による検定に許容されない程度にニ
トロセルロース膜を軟化スるのでニトロセルロース膜に
対しては適合せス、一方ナイロン基材の支持体には適合
する。有機溶媒と支持体とが不適合である場合に、核酸
結合溶液は１例えば水との稀釈によりあるいはより緩和
な有機溶媒との組み合わせにより、しばしば改質される
。こうして１例えば９０％メタノールは有効な結合溶液
であり、ニトロセルロースに適合するが、無水メタノー
ルは不適合である。
最後に、結合溶液は使用温度において液体であるべきで
ある。多くの場合にこれは室温であるが、いくつかの場
合には室温より高いかまたは低くてもよい。
実施例 本発明方法の例は、血清中のＢ型肝炎ウィルスＤＮＡを
検出する場合において、次の通りである。
血清試料７μｌを０．４５μＭのニトロセルロース膜上
に滴下させて自然乾燥させる。その膜を０．５Ｍ　Ｎａ
ＯＨ，１，５ＭＮａＣＩＩ／Ｃ１分間浸漬して試料中の
ＤＮＡを変性し、その後その膜を１．０Ｍトリス（ｐＨ
７，５）、３ＭＮａＣ’１Ｖｃ１分間浸漬して中和する
。次いで膜は自然乾燥させ、その膜を無水５ｅｃ−ブチ
ルアルコールに５分間浸漬してＤＮＡを膜に結合させる
。その後膜を取り出して（９） 自然乾燥させろ。
ＤＮＡが結合した膜をプラスチックの袋に入れ、次いで
この袋に次の組成のハイブリッド形成溶液を加えろ：　
６Ｘ　５ＳＣＰ（０，９０Ｍ　ＮαＣ１゜０．０９０Ｍ
クエン酸ナトリウム、０．１２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７、
Ｏ）、２Ｘデンハート溶液ＣＤｅｎｈ−ａｒｄｔ’ｓ　
５ｏｌｕｔｉｏｎ　：　　０．０４％牛血清アルブミン
。
０．０４％ポリビニルピロリドン、０．０４％フィコー
ルり００）、４０％ホルムアミド、１０％デキストラン
硫酸、５００μｇ／−さけ***ＤＮＡ、およヒ１．６　
ｍｙ／ｌｎｌ追加の牛血清アルブミン。その後、放射能
で標識をしたＢ型肝炎ウィルスＤＮＡプローブ（比放射
能−２〜３　Ｘ　１０８ｃｐｍ／μｇ）をハイブリッド
形成溶液１−あたり１×１０７カウントに対応する量で
加える。
プラスチックの袋を密封して３７℃で２〜３時間ハイブ
リッドの形成を進行させる。次いで膜を取り出し、３ｍ
Ｍ　）　ＩＪス塩基で２０分間洗浄して特異的に結合さ
れないプローブを除去する。洗浄した膜ばＸ−線フイル
ム下に配置して、血清試料（１０） 中のＢ型肝炎ウィルスＤＮＡを定量するために４〜２４
時間の間オートラジオグラフにかげる。
他の実施態様は特許請求の範囲内のものである。
例えば、核酸結合技術はいずれかの適当な核酸結合支持
体（例えば、ポール・バイオジン　ナイロン膜、　Ｐａ
１ｌ　Ｂｉｏｄｙｎｅ　ｎｙｌｏｎ　ｍｅｍｂｒａｎｅ
ｓ　）と関連して使用され、試料および核酸は所望のい
ずれかの起源（例えば、尿や唾液試料中の細菌ＤＮＡま
たは真核生物ＤＮＡ、血液試料中のウィルスＲＮＡ　）
からのものであり、そして核酸は支持体上に点在させる
前に精製してもよい。
特許出願人　　インテグレーテッド・ジエネテイツクス
・インコーホレーテッド （＋１） ８１４−

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）核酸を核酸結合支持体上に付着させ、次いでその
    核酸と支持体とを支持体に適合しかつ核酸を支持体に結
    合させ得る有機溶媒を含有する結合溶Ｍ、に、結合を行
    わしめるのに十分な時間の間、接触させることを特徴と
    する核酸を核酸結合支持体に結合させる方法。
  2. （２）核酸は前もって決定された型の核酸に対するハイ
    ブリッド形成九より検定されるべき試料中尾含まれ、そ
    の試料を核酸結合支持体上に付着させる、特許請求の範
    囲第１項に記載の方法。
  3. （３）核酸はＤＮＡであり、支持体に結合させる前にそ
    のＤＮＡをハイブリッド形成による検定で使用するため
    に変性し次いで中和する、特許請求の範囲第２項に記載
    の方法。
  4. （４）付着させた後の核酸と支持体は核酸結合溶液に接
    触させる前に自然乾燥させる、特許請求の範囲第１項に
    記載の方法。
  5. （５）核酸結合溶液との接触はハイブリッド形成を妨害
    するような方法で核酸を変化させない、特許請求の範囲
    第２項に記載の方法。
  6. （６）有機溶媒は分子中に２０個より多くない炭素原子
    を含む、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  7. （７）核酸結合溶液は実質的にその全てが有機溶媒から
    なっている、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  8. （８）　　有機溶媒はアルコール、エーテル、芳香族化
    合物またはケトンである、特許請求の範囲第６項に記載
    の方法。
  9. （９）核酸結合溶液は１種以上の有機溶媒の混合　物を
    含み、その混合物は核酸を核酸結合支持体に結合させる
    ことができる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  10. （１０）　　有機溶媒は各々分子中に２０個より多くな
    い炭素原子を含む、特許請求の範囲第９項に記載の方法
    。
  11. （１１）　　有機溶媒は各々互いに無関係にアルコール
    、エーテル、芳香族化合物またはケトンである。特許請
    求の範囲第９項に記載の方法。
  12. （１２）有機溶媒はエタノール、メタノール、５ｅＣ−
    ブチルアルコール、イソアミルアルコール、イソプロピ
    ルアルコール、イソブチルアルコール、エチルエーテル
    またはトルエンでアル、特許請求の範囲第８項に記載の
    方法。
  13. （１３）　　有機溶媒は各々互いに無関係にエタノール
    、メタノール、５ｅｃ−ブチルアルコール、イソアミル
    アルコール、イソプロピルアルコール、イソブチルアル
    コール、エチルエーテルまたはトルエンである、特許請
    求の範囲第１１項に記載の方法。
  14. （１４）　　有機溶媒は５ｅｃ−ブチルアルコールであ
    る、特許請求の範囲第８項に記載の方法。
  15. （１５）　　有機溶媒のうちの１種は５ｅｃ−ブチルア
    ルコールである、特許請求の範囲第１３項に記載の方法
    。
  16. （１６）　　接触時間は１秒ないし１０分である、特許
    請求の範囲第１項に記載の方法。
  17. （１７）　　接触時間は約５分である、特許請求の範囲
    第１６ｍに記載の方法。
  18. （１８）　　接触させた後に支持体と核酸を自然乾燥さ
    せる、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
JP58234928A 1982-12-13 1983-12-13 支持体への核酸結合方法 Granted JPS59122499A (ja)

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