JPS5910523A - 血液凝固因子８：ｃの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血液分別法、更に詳しく言えば血液凝固因子ｖ
ｉ　：　ｃの製造方法に関する。

１１１１液凝固の過程は正常全面の中に見出される多数
の物質を含む複雑な生理学的活動である。血液凝固機構
と関連したある種の因子がある個人ではひどく欠乏して
いることが知られている。このように、古典的血友病に
罹っている患者においては、抗血友病因子Ａ　（ＡＨＦ
　、因子Ｖｌ　）が欠乏している。

１１１１反病Ｂに罹っている患者においては血漿トロン
ボシラスチン成分（ＰＴＣ，因子■）が血液から人けで
いる。血友病の小自分率もまた因子〜・圃の不町人成分
であるいわゆるホン・ビレブランド因子を欠いている。

血漿因子ＶＷは明らかに異なる機能、生化学的および免
疫′４四性買、および発生学的ｆＡｒ４ｉｊを有する二
つの成分の複合体であるということが現在一般に認識さ
れている。因子Ｖｌ複合体の一成分は抗血友病因子ｔ：
ｊＪ　イ疑固剤活性を有し、通常は因子Ｖｌ　：　Ｃと
称される。１川の大きい方の成分は大部分タンパク質果
団かしなり、第一次の止１ｒ１を増進する仕方で血小板
と相互作用し、そして通常は因子ｖＩＲ（リストセチン
補足因子またはホン・ビレブランド抗原）と呼ばれる。

Ｘ−クロモソーム遺伝により伝達された因子■：Ｃ欠乏
をＭする患者（血友病Ａ患者）は正常な因子〜’ｉ　Ｒ
合成と機能ＹＷする。従って、このような患４は小皿の
維持のために因子〜′ＩＩＲの外因的投与を必要とぜず
、因子ＶＩ　Ｒを含まない因子ｖｉ　：　Ｃのｍ　ｌｒ
ｄ物が十分であり、ある場合には好ましくさえある。

因子ｖ１１１複合体およびその二つの成分の構造と機能
に関する更に詳しい背景の清報は次の三つの最近の概観
記事、それぞれホイヤー（Ｈｏｙｅｒ　）、Ｊ・Ａｍｅ
ｒ、　Ｓｏｃ、　ｏｆ　Ｈｅｍａ、ｔ、ｏｆ、　５８　
（１）　＋　１−１３（１９８１）、ハリス（Ｈａｒｒ
ｉｓ　）　８、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

およびファルチャー（Ｆｕｌｃｈｅｒ　）等、Ｐｒｏｃ
　、　Ｎａｔｌ　。

（１９８２）を参照すれば得られる。

因子〜’Ｉｌｌ　ｔ／ＩＩ縮物の臨床的重要性およびそ
の十分な供給源に対する爪犬な要望はこのような血液画
分の改良製造法を開発する動機を与えた。従来の低温で
行なわねばならない血液分別のコーン（Ｃｏｈｎ）アル
コール法に代わるものとして、好適の室温（とり巻いて
いる温度）で使用できる分別剤を使用する押りな他の方
法が開発された。一つのこのような方法は、例えば米国
特許第３，６３１，０１８号、第６，６５２，５３０号
、および第３．＜５８２．８８１号明細磐に記載の通り
、重合体ポリエチレングリコール（ＰＥ（））を用いて
いる。しかし、これら特許に記載された１１１１死方法
−は、史に冷却沈殿工程を使用しており、これは低温装
置の使用を必要としまた因子Ｖｌｌｌ　０）硫性Ｑ）実
連緻を失なう結果ともなっている。

これらｐｍｏ／律却沈殿分別法の棟々な段階において、
因子ＶＩＩｌの収厳を増加させるだめのヘパリン添ノ几
が米国特許第３，８０３，１１．５号、再発行第２９，
６９８号、第４，２０３，８９１号、および第４．２８
９，６９１号明細書に示唆された。これら特許明細書に
おける最初の二つにおいては、ヘパリンを冷却沈殿工程
の後で添加しているのに対し、後の二つの特許明細書に
おいてはヘパリンな冷却沈殿工程ｍで添加している。

ポリエチレングリコール冷却沈殿、およびヘパリンの使
用による因子Ｖｌの上記の従来の製造法は、−子Ｖ１１
重合体から区別されるように、因子■：Ｃｄｆｌ物を与
えるようには報告されていない。しかし、ヘパリンは、
米国特許第４，２１０，５８０号および第４，２７８，
５９４号明細書によれば、低温沈殿およびクロマトグラ
フィーにょるＡＨＦ　、ホン・ビレブランドリストセチ
ン補足因子およびフィブロネクチンの分離のだめの分別
方法論において、血漿への添加が示唆されている。

従来のコーンアルコール血液分別法に勝るもう一つの改
良法は、例えば米国特許第３，５５４，９８５号、第３
，５５５，００１号、第４．１１８，５５４号及び第４
，１５７．４５１号明細書に、またエイ・ジェイ・ジョ
ンソン（Ａ’、　Ｊ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　）等、Ｊ、　
Ｌａｂ。

Ｃ１１ｎ、　Ｍｅｄ、　９．２　（ａ　）、１９４−２
１０　（１９７８）により記述されているように、水不
溶性の橋かけ結合された高分子電解質共重合体吸着剤を
使用するものである。これら重合体物質は、因子ＶＩ　
Ｐを実質的に含まない因子■：Ｃｒａ縮物を製造するた
メジチオトレイトール、セファロースＣＬ−４Ｂおよび
セファデックスＧ−１００といった他の薬剤と組み合わ
せて使用された。ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）等、　Ｂ１０
５Ｊ王、、−Ｂ、ｊｏｐ、Ｑ−ｙｓ、−Ａｑ−ｔａ　６
６８　４５６−４７０（１９８１）。

異なる一度および一レベルにおいて、二っｏ＞異なる水
不溶性、倫かけ結合高分子屯解買共重合体を使用する−
続きの吸層工程で、各々外因的ヘパリンの祥在Ｆ４温に
おいて、因子ｖｖＡ：ｃの一縮物を血漿から尚収量で分
別しうろことがここに発見された。本発明によると、因
子Ｖｌ　：　Ｃσ）このような製材６１勿は、 （イ）　＋１１１漿またはその濃縮′１勿を７．０から
８．５までのＰＨにおいて、６モルチから１０モルチま
での低級アルキルイミノビス（低級アルキルアミン）で
橋かけ結合されそして９０モルチがら１００モルチまで
のペンダントジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド
官能基を含むエチレンと無水マレイン酸と力水不醪性高
分子屯解質共重合体０．０１％から０．１市ｉｔ％まで
と外因的ヘパリンの存在ドに混合し、 （ロ）生じた吸着血漿画分からＪ：澄を分離し、（ハ）
　前記−ヒｌげを５．５から６．５までの２１４におい
゛て、６モルチから１ｏモルチまでの低級アルキルイミ
ノビス（低級アルキルアミン）で槁かけ結合され、５モ
ルチから７モルチまでのペンダントジ低級アルキルアミ
ノ低級アルキルイミド官能基を含み、実買的にすべての
残存遊離カルボキシル部位または無水物部位がアルコキ
シアルキルアミンで封１１されているという点でＩＰ！
ｆｍづけられるエチレンと無水マレイン酸との水不溶性
高分子電解質共重合体１％から１０車に％までと外因的
ヘパリン存在ＦＫイ昆合し、 に）その結果生じた吸着血漿画分をヒ澄から分離し、吸
着剤からの溶離により因子Ｖｌ　：　Ｃの濃縮物を採取
し、そして り９　前記アルキルおよびアルコキシが１から４炭素原
子までを有する。

１ｍｌ当りｏ、ｏ　ｉから２単位まで、そして最も好ま
しくは血漿１ｍｌ当り０．１から１単位までにわたる。

ここで用いる高分子電解質の荷に適当な濃度は吸着」二
程（イ）においては０．０３　％から０．０４％までそ
して吸着工程（ハ）においては５％から６チまでにわた
る。

本明細博で用いたヘパリン１単位とは、Ｉ　Ｕ、Ｓ、Ｐ
。

（米国薬局方）単位を意味すると定義する。ヘパリンの
米国薬局方単位はクエン酸添加羊皿漿１．０ｍｌを、１
　：　１００　ＣａＣｊ２浴液０．２ｍｌの添加後１時
間凝血から防止する量である。ヘパリンは一般に肝臓お
よび肺といったマスト細胞を含む哺乳類の組織からの単
離により得られる。本明細Ｗ中で用いた「ヘパリン」と
いう用語はその製薬−Ｌ容認しりる水溶性塩、例えばす
）　ＩＪウム塩を含むことも意味する。市販ヘパリンナ
）　ＩＪウム製品の適当な１＋りは、リボーヘピン”’
　（Ｌｉｐｏ−Ｈｅｐｉｎ■）〔リッカー・ラボラトリ
イズ（Ｒｉｋｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）Ｊ、
リ　り　ア　ミ　ンｏ　　ヲー　ト　リ　ウ　ム　（Ｌ
ｉｑｕａｅｍｉｎ’　　Ｓｏｄｉｕｍ　　）（オルガノ
ン（Ｏｒｇａｎｏｎ）　）、およびパンへ７０リン■（
Ｐａｎｈｅｐｒｉｎ■）〔アボット・うがラトリイズ（
Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　Ｊであ
る。

ヘパリング）凝固防＋ｈ剤の性質は１９２２年におケル
ハウエル（Ｈｏｗｅｌｌ　）の発見以来公知である。

Ａｒｎｅｒ、、Ｊ、　Ｐ、ｈｙｓｏｌ−１６暖−、４３
４−４５５（１９２２）。

ヘパリンが血漿補足因子により間接的に凝固防止剤とし
て作用することは現在公知である。ヘパリン補足因子、
アンチトロンビンＩはＣ２−グロブリンおよびセリンプ
ロテアーゼ阻害剤で、後者はセリンプロテアーゼを凝血
因子の不活性化から防止する。アンチトロンビン■はト
ロンビンと複合体を形成し、結果として、両方のタンパ
ク質が不活性化される。ヘパリンはその速度を著しく加
速はするがこの反応の程度を促進することはない。低濃
度のヘパリンはアンチトロンビン■の活性を増加し、こ
れが治療剤としてのヘパリンの投与の基礎をなす。

供血者血液の収集および保存のための血液へのへバリン
添加は、例えばバラトン（Ｂｕｔｔｏｎ　）　’４、Ｔ
ｒａｎＱｕｓｉｏｎ　３−、３７−４０　（１９６３）
から明らかなように、よく知られている。また、トロン
ビンによる因子■の不活性化を防止するため貯蔵血液ヘ
ヘパリンを添加できることも公知である。

リップ（Ｒｉｚｚａ　）等、Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン
）　１８０゜１４３（１９５７）およびスチーベ（８ｔ
ｉｂｂｅ　）等、（１９７２）。しかし、供血者血液は
、今では一般に、亦皿球延１市の目的のためヘパリンの
代りにＡ、ＣＤ　、　ＣＰＤまたはＣＰＤ＋アゾ＝ン（
ＣＰＤＡ−１）凝固防止剤に集められる。更にまた、ヘ
パリン添ス′ロ血液は棟々な試験、例えば補体、イソア
グルチニン、または赤血球脆弱性を含む試験に対して不
適当である。それ故に、このような試験に用いようとす
る血液はヘパリン凝固防止剤の除去または中和を必要と
するであろう。

これまでヘパリンは本発明に用いた型の高分子電解質重
合体を使用する、血液分別法と関連して用いられて来た
けれども、ヘパリンな吸着剤からの溶離液へ添加し、次
にこれをポリエチレングリコールで分別して因子■、■
１、■およびＸ（プロトｏ　ンヒ７　？）１合体）が得
られている。エイ・ジェイ・ジョンソン（Ａ、　Ｊ、　
Ｊｏｈｎｓｏｎ　）等、Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃ１１ｎ。

Ｍ、ｅｄ、９−２（ａ）、　１９４−２　１０（１９７
８）　　。　ｌ６性化された凝血因子を抑制するため、
ヘパリン−活性化アンチトロンビンＮを提供するために
エイ。

ノエイ、ジョンソンにより＠告されたように、ポリエチ
レングリコール沈殿による７°ロトトロンビン係合体の
製造にヘパリンが使われた。Ｔｈｒｏｍｂ。

１）ｉａｔｈ、　Ｈａｅ＋ｎｏｒｒｈ、ろ４　、Ｎ２　
、’５８９　（１９７５）を見よ。以前の技術において
、本明細、優に定義された因子Ｖｌ：Ｃ嬢縮物を細物祉
で得るため、高分子亀解負屯合体を用いる血液分別＋ｔ
１　）ヤにおいて、ヘパリンを使用することは何等示唆
されたこと力菟ない。

本発明によりヘパリンと組み合わせて使用される島分子
戒解質重合体は公知の化合物であり、米国特許第５，５
５４，９８５号、第５，５５５．ＯＱ　１号、第４，１
１８，５５４号、および第４，１５７，４３１号明細丼
記載の方法により製造することができる。

例えば、エチレンと無水マレイン酸（ＥＭＡ）σ）ペー
ス共重合体はエチレンおよび無水マレイン酸を適当１．
ｃ溶媒媒質中退酸化物触媒の存在丁に反応させろことに
よりつくりうる。共重合体は、なるべくは実質的に等モ
ル量のエチレン残基および無水物残基を含むのがよい。

ベースＥＭＡ共亜合体は２個の第一アミン基を有し傭か
け結′合したＥＭＡ共Ｍ合体へと導く低級アルキルイミ
ノビス（低級アルキルアミン）と反応させることができ
る。ＥＭＡ共嵐合体は６モル係から１０モモル係での倫
かけ結曾剤と反応させるべきである。このようにして、
望むペンダントジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミ
ド１１ヒ基を鳴かけ結合共軍曾体の中へ、ＥＭＡ共本合
本合体存遊離無水物基の一部または全部とジ低級アルキ
ルアミノも６モル係のレベルまで導入することができる
。

本発明に降る工程（イ）で用いる高分子亀解質市合体吸
層剤の一製造に対しては９０モモル係も１００モルモル
係のジ低級アルキルアミノ低級アルキルアミンを用いる
のがよく、それに対して本発明に係るその後の工程（・
）で用いる吸着剤を製造するにはなるべくは６モル係か
ら７モル係までを用いるのがよい。後者の商分子亀解質
重合体吸漸剤の場合には、米国特許第４，１　５　７，
４　３　１号明細督に記載のように、実質的にすべての
残存遊離カルボキシル部位または無水物部位をアルコキ
シアルキルアミンで封鎖する。

本発明に用いる崗分子屯解貞Ｍ台体月科は才だ米国１時
ｒＦ第４，１　１　８，５　５　４号明細書に記載の凝
集−１−程を用いる方法により製造できる。

特に適当なジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官
能基はジメチルアミラフ０ロビルイミドであり、特に適
当な橋かけ結合剤はメチルゴミノビスフ０ロビルアミン
であり、そして特に４当なアルコキシアルキルアミ°゛
ン封鎖剤はメトキシグロビルアミンである。

高分ーｒー市Ｍ質重合体吸着剤のＬ記製造法は説明を目
的としているだけであること、および本発明方法により
これら物質を用いて血液を分別する方法はその特定の製
造法に限定されないことは明らかであろう。

本発明の一部にとって、尚分千成解質重合体を用いる両
方の吸着工程の間に外因的ヘパリンを使用することは現
在重要であると考えられるが、それは第一の吸着工程が
該媒質へ外因的に隙〃口されたとき実質的緘のヘパリン
を血漿媒質から吸着することもありうるかりである。一
般に、第二のＩ吸着工程に先豆ち、姫〃０されるヘパリ
ンの敏は第−吸着工程により断去される敵と等価であろ
う。ヘハＩＪンは最初に血液収集過程で加〜グゝること
ができるし、あるいはＡＣＤ　、　ＣＰＤまたはＣＰＤ
Ａとぼった曲の１９を固防１Ｅ剤甲に集められた血液へ
添〃１１することもできる。

本発明のもう一つの而によれば、血液を重合体で処理す
る前に商分子亀Ｍ賀事合体と共に１σ接ヘパリンを麟加
することもできる。後者の場せ、ヘパリンはまたイメン
紹合により重合体へ拘束されて、旨分子屯解質車合体／
ヘパリン酸汗体を形成する。この尚分子屯解買重合体／
ヘパリン複合体は、ヘパリンおよび重合体を水性懸１蜀
液中でぞ昆合し、続いて、生じた重合体を分離し、そし
て乾燥することにより１更利につくりうる。

出発の血漿月料は全部の血漿でもよいし、あるいは、例
えば、冷却沈殿−細物のよなな因ｆｌｕ：Ｃを含むこと
が判っている濃縮物でもよい。

血液分別法の吸着工程は水性１峰濁液中で、なるベくは
生理賞塩水中で行なわれろ。望む塩基性またはＶ膜性レ
ベルへの適当なＰＨ調）＠は、それぞれ、水沫の牧漸土
程（イ）においては７．０から８．５までの範囲にＰＩ
Ｉ乞ヒげるためにＮａＱＨを用いて、そして水沫の散層
工程（ハ）においては５．５から６．５　ｆ、での小も
囲にＰ１１ヶＦけるためにＨＣｊＬ、酢［俊またはなる
べくはクエン酸ヲ用いて血漿媒質を処理することにより
なされる。

谷吸着工程後それぞれの上澄からの吸着血漿画分の分離
はｆ過、遠心および同様な分離手続きにより行ないつる
。望む因子Ｖｌ　：　Ｃ濃細物の溶離は。

１ｔｌｔ後の吸漸剤を、１から６モルのＮａＣｆ、なる
べくは１．５から１．８モルＮａ（Ｊを用いて、また他
σ）このような生理学的に容認しうる溶離ＭＩＪを用い
て洗浄することにより行なうことができる。

因子Ｖｌ：Ｃ（７４縮物は、部分的脱塩および濃縮（例
えば、膜限外ｆ過）、無菌１過（例えば、細孔マＪ′法
４ミクロンを有する半多孔性嘆を化してのｊｊ過により
）およびその後の凍結乾燥を用いることにより、生理学
−ヒ適当な無菌固体形に変えるこ最終の採取土Ｊ戊１勿
における因子シ用：Ｃγ占性はγ古注化された部分的ト
ロンボプラスチン゛時間（ＰＴＴ）５１１１１１足を用
いる辿トイの−Ｐｉ、１竹または二段階検定法により決
定できる。これらの試験゛におい−〔は、試験血漿への
部分的トロンボプラスチンの添）ＩＩＩは種種な血漿因
子の不足と釣合いをとることになるであろう。クイック
（Ｑｕｉｃｋ　）により開発された分節の一段階プロト
ロビン時間試験が特に」、い。一段階検定試験について
の背景となる情ｒｔｔを求めるには、クイック、　’　
Ｈｅｍａｒｒｈａｇｉｃ　Ｉ）ｉｓｅａｅｅｓ　’　。

リー＆フエビガ−（Ｌｅａ、＆　Ｆｅｂｉｇｅｒ　）、
フィラデルフィア、ペンシルバニア、１９５７；ラング
デル（Ｌａｎｇｄｅｌｌ　）等、Ｊ、　Ｌａｂ、０１ｉ
ｎ、　Ｍｅｒｌ−４１＋６３７（１９５３）；および・
・−デイスチイ（ＨａｒｄｉＳｔｙ　）　等、Ｔｈｒｏ
ｍｂ、　Ｄｉａｔｈ、　Ｈａｅｍｏｒｒｈ、　７　＋２
１５（１９６２）を見よ。

最終生成物中の因子ＶＩＲＲ活性の存在は抗生物質リス
トセチンに暴露したときの凝集および免投亀気兆動ある
いは放射性免役検による測定により決定できる。このよ
うな適当な検定手順は・・リス（Ｈａｒｒｉ、ｓ　）　
＠、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔ
ａ　６−←す＋４５６−４７０＜　１９８１　）により
、またフルチャー（Ｆ’ｕｌｃｈｅｒ　）　等、Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、。

ＵＳＡ−７？　、　１６４８−１６５２．（１９８２）
により記述されている。

ここではヒト血液を特に記述しているが、他の動物血、
例えば牛、豚、馬および羊のｆｉｌｌ　ｒ（ｌ［も本発
明方法により同様に分別できることは明らかであろう。

Ｆ記の例により更に本発明を説明するが、本発明はこれ
ら特定の例あるいはそこに再び引用された詳細事項に制
限されないことは理解されるであろう。

例　　１ ヒト供皿者血液をＣＰＤＡ　−１＃固防市剤を含むプラ
スチック製の血液収集バッグに引出す。収集後４時間以
内に冷凍遠心により血清から血漿を分離する。血漿σ）
４０単位を貯賦し、５００一単位の移動バッグに分け（
２００ｔＲｔ）、これを次に冷−し、−２００で貯える
。

４１ｆ鮮な冷伸血漿を、二つの異なる水不浴・注σ）憫
かけ＋ｌ＃曾した市分子屯解買樹脂を用いる一連の吸層
工程で外因的ヘパリン存在下室温において分別する。こ
れらの１！１脂は５モルチのメチルイミノビスプロピル
アミンで倫かけ紹汗されたペンダントジメチルアミノプ
ロビルイミドペンダント基を倉む実質的に等モル酸のエ
チレンと無水マレイン酸との共重合体である。第一の樹
脂、樹脂Ａ、は９０モモルのこれらペンダント基を含む
のに対し、第二〇樹脂、樹脂Ｂ、６は５モルチの該ペン
ダント基を含む。樹脂Ｂにおいては、すべての遊離カル
ボキシル基または無水物基が更にメトキシプロピルアミ
ンで封鎖されている。

使用に先立ち、樹脂Ｂを次のように前整調する。

樹脂１２グラムを０．１％牛皿消アルデミン（ＢＳＡ）
をざむ０．１５４　Ｍ　Ｎａ（４２００ｍｌ中に分散す
る。

（ＢＳＡの代りにヒト血７＃アルブミンも使用できるλ
ＰＩＩを１．０Ｍクエン酸で４．０に調節し分散を促進
する（かきまぜながら約５〜５分）。浮遊液をｊ−Ｊ過
し、ｎＪ故を慣でる。碕れた樹月旨塊乞再び２００．ｄ
のＮａ＋：１／　ＢＳＡ　酢液に分数させる。かきまぜ
ながしｐｔｌ　ｆ　ｉ　、Ｑ　Ｍ　ＮａＯＨで５．８に
調節し、かきまぜを更に１０分間続ける。浮遊液をｌツ
過し、湿塊なその後の分別に使用するため保存する。

分別に用いるすべての溶離剤および抗浄腎ｌ夜もまた望
むタンパク質の拘束を最小にしかつ因子ｖｍ　：ｃｏ＞
ｙ定則として史に１／［用させるためＵ、１％ＢＳＡを
含む。

豚ヘパリン（ナトリウム塩）を約２００単位／ｍｌを含
む浴液が得られるように生理食塩水（０，９ＮａＣｊ−
）に溶かすことによりこの分別に用いる。

分別過程は次のように行なわれる： 新鮮な凍結血漿の１バツグ（即ち、２００ｍＡ）を３７
−Ｃでかきまぜた水浴中に置くことにより迅速に融かす
。ヘパリンを添加する試験に対しては、１ｍｌのヘパリ
ン浴液（即ち、２００単位）をビーカー中の融かした血
漿へ加え、混合物を６〜５分かきまぜる。血漿の試料を
凝固侠定のため採取する。体積および時間を記録する。

ヘパリンを血漿へ７６ｍ　〃ｕせず、それ以外は試験実
験と同一である対照実験を行１．Ｃう。

樹脂Ａ（７０ｍｇ）を血漿（またはヘパリン疾加血漿）
へ加え、ＰＨをＩ　Ｍ　ＮａＯＨで８．０に調節し、か
きまぜながらこのＰＨに２０分Ｍ保つ。次に、これをｊ
−ｊ遇する。ｌＪ液は因子’Ｗｍ：Ｃ油性の大部分を言
む。濡れた倒Ｊ猶塊を２０−の蒸留水に丙懸７蜀し、５
分間かきまぜ　、ＩＪ過し、次にこれら二つの１液を合
わせ、因子ｖｌｌｌ；Ｃ活性を倹屋するだめの試料を採
取する。存在する全凝固単位のｄＩ画ができるように１
本々責をｉ己録する。

次に８１１　Ｖ調した樹脂Ｂ（１２ｇ）をｆｊ液（また
はヘパリン添加ｄ３液）にυｌえ、−１を１Ｍクエン酸
で５．８に調節し、Ｐｌｌを５．８に保ちつつｈ題ｌ蜀
液を２０分間かきまぜろ。次に、これをｆ」過し、１塊
を２００−の０．００２　Ｍ　ＮａＣｆで洗浄する。合
わせたｆ：ｉ液をアルブミンおよびガンマ−グロブリン
血漿画分の採取のため保持する。ｒ塊を２００　ｍｌの
Ｑ、３　Ｍ　ＮａＣ，１，中に分数し、ＰＨを５．８に
調節し、懸濁液を５分間かきまぜる。懸濁液を再びｒ過
し、他の２００−の０．５　Ｍ　ＮａＣＬでｆａｇ−ヒ
で洗浄し、Ｃｆ仮を債てる。

仄に１１１塊を、順化ナトリウム（１，５Ｍ）、リジン
（０，１Ｍ　）　（安定剤として）、および牛血清アル
プミ・ン（０，１％）を含む溶離剤溶液２００−中に分
１牧させる。ＰＨを６．０に調節し、懸濁液を２０分か
きまぜる。懸濁液を１過し、ケーキを約２０ｍ（！（７
）（ｄ離削＠液で任意に洗浄し、合わせたｅ液の体積を
６己録し、Ｆ自己表１に示したように凝固検定のための
試料を採る。

次に、本来の因子ｖｉ　：　ｃ凝固活性の４０〜７０％
＆精製された形で含むＰ液をそれ以上濃縮し、かつ部分
的な脱塩を果すために処理することができる。これは例
えば望む分子の保持のため適当な分子峡カットオフを有
するポリスルホン繊維半透膜ヲ１１市えたミリポア・ペ
リコン■カセット（Ｍｉｌ、１ｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｌｉ
ｃｏｎ１８１Ｃａｓｓｅｔｔｅ　）　’ｔｌ”過早ある
いはアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）ＤＨ４中空繊維濃縮器
系を使用することにより達成できる。次に、濃縮された
Ｙ（１液を凍結乾燥し、貯蔵のため世装する。しかし、
これりのこれ以上の濃縮および処理工程はこの荷別な例
１においては行なわなかった。

Ｆ記Ｑ）衣１は貯留されたＣＰＤＡ−ゲ足化血漿および
上記方法を用いる晟つかの分別実験の結果を示している
。これらの結果は市分子屯１９１員車合体分別と組み叶
わせた貯留血漿へのヘパリン添加の有蔓な効果を実制す
る。これらは因子■頑合体を取り除く樹脂Ａ処理後の因
子■：Ｃ１凝固油性の回収および散層および樹脂Ｂから
の溶＃後の全活性回収（もとの血漿におけるレベルに基
づく）における再現性のある改善を例証している。

因子Ｖｌ　：　Ｃ測定はＭＬＡエレクトラ凝同タイマー
〔メディカル・ラボラトリイー・オートメーション社（
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｕｔｏｍａ
ｔｉｏｎ＋　Ｉｎｃ、）Ｊでの通當の一段階ＰＴＴ検定
方式により行なう。この装置は凝固過程の開始を示すた
め光学的感覚を用いている。こσ）もＯ）は凝固速度の
二次微分（即ら、ｆ≠同速度の変化速度）を測る。この
検定はデート・ダイアグノスティックス社（Ｄａｄｅｌ
）ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ＋Ｉｎｃ、）により商業的に供
給される試薬キットと＋ＩＩＩｔｉを用いて行ない、該
キットには米国待ボ［第３，４８６．９８１号明細ｐｔ
Ｋ記戦のように、因子νＯ１人乏血漿およびエラグ酸粘
性化体が邑゛まれでいる。凝固時間は試験試料（分別さ
れた試料）の連続布イノ＜に対して測定し、七〇紹米馨
もとの貯ｉＹｔ　１１１１漿試料におけるレベルに基づ
き因子シＩＩＩ：Ｃ法性の回収のパーセントとして表わ
す。これら実験において、貯留血漿は因子シトｃ凝固を
重性１単位／　ｍｅ　ｆ含むと仮定する。それ故に首実
・職は合計２００凝固午１■で開始した。谷倒脂処理後
の累槓弔１−＋′ｌおよび活性回収パーセントを示す。

１１す２ １こ記例１と同様に覗加の分別実験をイｉなうが、ただ
し、τ、つの異なる一度のヘパリン（１゜Ｏ単位／　ｍ
ｌ、１．５　＋１１位／ｍ／！、お」：びＯ，１４ｉ−
位／　ｍｅ　）　’ｌ　（ｉｔ脂八へよる吸着に先立ち
工程（イ）における最初σ）血漿へそし”〔また樹脂Ｂ
による散層に先立ち工程（ハ）におけろ流出液（ｌｊ液
）へ添加する。

］：゛記の表２はこれら分別実験の結果を、もとの貯留
血漿が１単位／−を宵むと仮定した因子ｖ■。

（ユ粘性の回収パーセントとしてノドす。

表　２ １　、０４１’−１１７７ｍ／！　　０　、５　ｒＰａ
ｒＶｍｌ！　”　０　、１　単（ｒ”Ｕ’ｍ１ｖ１回の
起験のみ Ｉ’１１．５ ・ド１＋りにｔｄい−（は、］二ｉ己１’／ＩＩ　１の
、ぞ−れぞノ１の１ｆｆ１月旨Ａｔ６よび１（ＩＪ　ｌ
ｌ１Ｔ　Ｈ生成物を一＼パリンナトリウノ、り）水浴液
と接触させ、生じた陵台体を乾燥することによりＪ欧初
に市分子ｊ＠、’　Ｉイ買屯合体／−＼バリン暖片体を
調製する。仄に、これら１１１涌／−＼バリンｒ（合体
乞′７１」いて、ヘパリン浴液のこれ以上０）外因的ｔ
ｌ：］−ＪＪ［Ｉ　７．Ｃしにｌ＋ｌＪ　１のＪ＝順に
９ｔい即成を分別する。

最初に、１区−＼バリン、ナトリウム塩（水５　Ｑ　ｍ
ｅ中に暦ｊ眸したＩＬ１０３単Ｉ立）な （５）水１　［Ｊ　Ｏｍｌ中に赫！蜀した＋耐１１旨Ａ
　３１１　（Ｊ　ｍ？、ｊ６よび （Ｂ）　　／に２００　ｍｌ！中に懸濁した四指１−う
５Ｌ］、？の谷々へ加える。

谷嚇台において、通常のデ温（約２２〜２５ｃ）でかき
ませ？１時間ＩＹつ。明脂／ヘノ？リンｍば体はホ゛ノ
ットマンＩＬ５４セルロースｄ’紙（製置ｊ４８によれ
ば２Ｕ〜２５ミクロ／で９８％ｌ呆持効勾）［、でｌＩ
過し、４＝ｊｆ、イて１　［Ｊ　Ｏｍｅ）−’）　０）
水テＥ　１１１１　（Ａ’、　／７１［７（未結汀ヘパ
リノに１子人することにより中Ｆｉｌｅされる。ｔｉｃ
　（ｔｃ　！Ｌｌ　＋＋’ａ　／　ヘパリ／　ＰＭ升体
を血液分別＋ｔ４　Ａ゛ｌ−Ｃ開用する「１１Ｊに乾燥
ずろ。

１１］トπ’ｘ：　ｉ’／すｉ−Ｃ記述したのとＪ’−
ｔ’Ｚ的に同１−ｐに分別するが、ただし樹脂／ヘパリ
、ン榎会体を対応する樹脂の代りに使用し、それ以上の
外因的ヘパリンτ１１％）Ｊ１１シ（（７グＭ＜　　。

本例においては、樹脂Ａ／ヘパリン複合体処理後の因子
■：Ｃ凝固活性の回収が、通常の実験−走の範囲内で定
数内であった（１１７％）。散層および樹脂Ｂ／ヘパリ
ン複合体からの溶離後の全回収はこの特別な例における
もとの血漿のレベルの７８．４％であった。

上記例１〜′５において、樹脂Ａは米国特許第４，０９
７，４７３号および第４，１１８．５５４号明細書の例
１ならびに米国特許第４，１５７，４３１号明細書の例
１２に記載の反応体およびモル割合を用いろ方法に実質
的に従ってつくった。樹脂Ｂは米国特許第４，１５７．
４３１号明細書の例１に記載された反応体およびモル割
合を用いる方法に実質的に従ってつくった。

例　　４ ジエチルアミンエチルアミンを等モル量のジメチルアミ
ノプロピルアミンの代りに使用するトキ、そして（また
は）エチルイミノビスエチルアミンを弄モル鑵のメチル
イタノビスフ０ロビルアミンの代りに使用するとき、そ
して（または）エトキシエチルアミンヶ、前記列１〜６
における青モル財のメチルゾロビル゛ｒミンの代りに（
史用するとき、ヒ１己例１〜５でｆ尋られたのと実質的
に同様な結果が［悼りれる。

本発明の発表を読んだ後は、各棟の他の例が本発明の主
旨と＋ｔＱ囲からはずれることなく当業者にとって明ら
かになるであろうが、すべてのこのよりな′曲の列は特
許請求の範囲の中に包含されるものとする。

代理人　　浅　村　　　皓 １５５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １１１　　血漿から因子Ｖｌ　：　ＣＯ）−絹物を製造
   する方法において、 （イ）血漿またはその濃縮物を、７゜０から８．５まで
   の−１において、６モルチから１０モルチまでの低級ア
   ルキルイミノビス（低級アルキルアミン）で橋かけ結合
   されそして９０モルチから１００モル％までのペンダン
   トジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官能基を含
   むエチレンと無水マレイン酸との水不溶性高分子電解質
   共重合体０．０１チから０．１屯蹟チまでと外因的ヘパ
   リンの存在下に（昆合し、 （ロ）　その結果中じた吸着血漿画分から上澄を分離し
   、 （ハ）　前記１鍬な、５．５から６．５までのｐ１４に
   おいて、６モルチがら１０モルチまでの低級アルキルイ
   ミノビス（低級アルキルアミン）で欄かけ結合され、６
   モルチから７モル％までσ）ペンダントジ低級アルキル
   アミノ低級アルキルイミド１゛能基を言み、更に実貞的
   にすべての残りの遊離カルボキシル部位または無水物部
   位がアルコキシアルキルアミンで１１されているという
   点で特徴づけられろエチレンと無水マレイン酸との水不
   浴性高分子１１解貞共重合体１％から１０重址チまでと
   外因的ヘパリン存在下に混合し、 に）その結果中じた吸着血漿画分を上澄から分離１−１
   吸着剤からの溶離により因子■：Ｃの濃縮物を採取し、
   そして （ホ）　ＩＩＪ記アシアルキルびアルコキシが１から４
   炭素原子を有し、外因的ヘパリンが血漿１ｍ７！当り０
   ．０１から２単位までの範囲内にあることを特徴とする
   一ヒ記方法。 ！２）　　エチレンと無水マレイン酸との共重合体をメ
   チルイミノビスプロピルアミンで槁かけ結合し、ペンダ
   ントジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官能基が
   ジメチルアミノプロピルイミドである上記第１項の方法
   。 ｔ３１　　工程（イ）および（ハ）におけるヘパリン一
   度がＯｏｌかり１単位／ｍ７！である第１項の方法。 （４）工程（イ）における高分子電解質共重合体の濃度
   が０．０３〜０．０４％であり、工程（ハ）においては
   ５〜６％であるト記第１項の方法。 （５）　　エチレンと無水マレイン酸との共重合体をメ
   チルイミノビスプロピルアミンで橋かけ結合し、ペンダ
   ントジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド官能基が
   ジメチルアミノプロピルイミドであり、工程（イ）と（
   ハ）におけるヘパリン一度が０．１から１単位／ｍ７！
   であり、そして工程（イ）における高分子嵯解質共重合
   体の一度が０５０３〜０．０４％また工程（ハ）におい
   ては５〜６％である上記第１項の方法。 （６）外因的ヘパリンを工程（イ）における血漿および
   工程（ハ）における上澄と共に溶液に添加する上記第１
   項の方法。 （力　外因的ヘパリンな工程（イ）における血漿および
   上程（ハ）における上澄と共に溶液に添加する上記第５
   項の方法。 （８）外因的ヘパリンを工程（イ）および（ハ）で使用
   する鍋分子屯屏貞共爪会体と前複合化する一Ｆ記第１項
   の方法。 （９）外因的ヘパリンを工程（イ）および（ハ）で１史
   用する篩分子亀解買共亜合体と前複合化する上記第５項
   の方法。 ＬＩＯ）　　胆液凝固因子の分別法に用いるのに適した
   ヘパリンとの商分子屯解質車合体榎合体において、前記
   複合体が、６モルチかも１０モルチまでの低級アルキル
   イミノビス（低級アルキルアミン）で僑かけ結合されそ
   して少なくとも６モルチのペンダントジ低級アルキルア
   ミノ低級アルキルイミド官能基（前記低級アルキルは１
   から４炭素原子までを有するアルキルである）を含むエ
   チレンと無水マレイン酸との水不溶性共重合体へ、ヘパ
   リンをイオン的に結合することによりつくられる上記高
   分子亀ｍ質重曾体複合体。 （Ｉυ　エチレンと無水マレイン酸との共重合体がメチ
   ルイミノビスプロピルアミンで橋かけ結合され、そして
   ペンダントジ低級アルキルアミノ低級アルキルイミド１
   能基がジメチルアミノプロピルイミドである上記第１０
   項の複合体。 ０２９０モルチから１００モルチまでのペンダンｌ−ジ
   メチルアミノノロビルイミドを含有する上記第１１唄の
   複合体。 ＬＩ：１　３モルチから７モルチまでのジメチルアミノ
   プロピルイミドを含有し、実質的にすべての残存遊離カ
   ルボキシルまたは無水物部位がアルコキシアルキルアミ
   ン（アルキルおよびアルコキシが１から４炭素原子まセ
   を有する）で封鎖されているＬ配車１１項の複合体。