JPS5896025A - 新規生理活性物質ｃｈ−１およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規生理活性物質ＣＨ−１およびその製造法に
関する 従来よりインターフェロン誘起能あるいけ抗癌性を有す
る数多くの多糖類が報告されており、ＰＳＫなどが抗癌
剤として実用化されている。しかしながら、これらの物
質は、抗癌性と明確なインターフェロン誘起能の両面の
性質を有するものは殆んど知られていない。

そこで、本発明者は上記に着目して抗癌性およびインタ
ーフェロン誘起能を有する物質について検索すべく研究
を重ねた結果、クロレラ属に属するクロレラ・ピレノイ
ドーサ細胞よシ抽出・分離した物質が先に示した両面の
性質を有することを見出し、本発明を完成したものであ
る。

本発明の新規生理活性物質Ｃ）］−１（以下ＣＨ−１と
称す）は、下記の性状よシ明らかな通り、酸性多糖類に
属し、インターフェロン誘起能および抗癌性を有する生
理活性物質である、このＣＨ−１は、次の理化学的性質
を有する物３− 質である。

０゛）少なくとも炭素原子、水素原子、酸素原子、窒素
原子からなり、 元素分析；Ｃ：ａｓ、４９チ、Ｈ＝６．０７係、Ｎ＝１
．８９％ ■分子量；セロファン膜を通過せず、 超遠心法によシ濃度Ｏ９２％、０．２ＭｐＨ７，２＋）
ン酸バッファー・ローター型式ＲＡ６０ＯＨＣ５１２０
Ｏｒｐにて測定Ｓ＝６．１５ ■融点；約２４０℃で着色し、それ以上の昇温により徐
々に炭化する。

■比旋光度；〔α）Ｄ−９，５２（Ｃ＝１水）。

■紫外部吸収スペクトル；０．１２５％水溶液で吸収が
見られず。

■赤外部吸収スペクトル；ＫＢｒ法による赤外部吸収ス
ペクトルは第１図に示 す通りであって、８４２０゜ ２９８０．１６４０，１３８０゜ １１２５．１０６５，１０４０゜ ４− ９９０．９１５．８３５，８００ ｉ１の各波長に吸収帯を有 する。

■溶剤に対する溶解性；水に可溶、メタノールなどの一
般有機溶媒に不溶。

■呈色反応；アンスロン反応、モーリッシュ反応、カル
バゾール硫酸反応に陽性、フォリ ンローリ−反応、ニンヒドリン反応に 陰性。

■塩基性、酸性、中性の区別；酸性、アセテート膜での
電気泳動（０，１ Ｍピリジン−酢酸、 ｐＨ５，０，２００ｖ （４ｍＡ）、２０分 原点よりΦ側に０．８ 譚泳動する）は第２ 図の通り、 ［Ｆ］動物質色；白色粉末。

■蛋白含量；蛋白検出されず。ＩＦｏＩｉｎ−Ｌｏｗｒ
ｙ法呈色反応）。

■構成糖；７チ硫酸中２時間加熱還流により加水分解し
、ペーパークロマトグラフィーおよび高速液体クロマト
グラフィーにより主構成糖としてラムノース、アラビノ
ース、クルコース、カラクトース、グルクロン酸を検出
した。

■糖含量；グルコ〜ス換算で５８チ ■超遠心法によるパターン；第３図の通り。

また、ＣＨ−１の生物学的性質は次の通シである。

■インターフェロン誘起能 １）測定方法Ａ（ｉｎｖｉｔｒｏ法） 日本白色ウサギを放血致死させ、その牌を摘出シフ、浮
遊細胞にして混合し、その２〜５×１０個細胞を含むよ
うに調製した細胞浮遊液にＣＨ−１を第１表に示す濃度
に加え、２５℃、２４時間培養した後、遠心分離し、そ
の上清液を採取し、インターフェロン活性を測定する。

２）測定方法Ｂ（ｉｎｖｉｖｏ法） ４週令のｄｄＹマウスにＣＨ−１を１００■／ｋｌ？投
与し、経時的に採血して、その血清中のインターフェロ
ン活性を測定した。

３）インターフェロン（ｌＦ＋活性測定法ＲＫ１８ウサ
ギ腎株化細胞を用いてベスキュラ・ストマテイテイス・
ウィルス（Ｖｅｓｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉ
ｒｕｓ）を攻撃用ウィルスとしてプラーク５０−減少法
でＩＰ’活性を測定した。

４）測定結果； ■ｉｎｖｉｔｒｏ法 試料濃度 ＩＦ価 ■ｉｎｖｉｖｏ法 上記の通り インターフェロン誘起能を有する、 ■ウィルス感染阻止能 １１測定方法 ＣＨ−１をｄｄＹマウスの尾静脈より投与し、２〜１２
時間後にワクチニアウィルスを尾静脈より注入して８目
移に尾部の皮ふに表われるポツク数を観察した〇 ２Ｉ測定結果； 下記表に示す辿り。

、ウィルス感染阻止能 ■抗癌作用 ■Ｐ−３８８マウス白血病に対する作用Ｐ−８８８細胞
ＩＸ１０個をＣＤＦ、マウスの腹腔に移植し翌日より連
日１５日間ＣＨ−ｓを投与した。

結果 ■Ｓ−１８０固型腫瘍に対する効果 Ｓ−１８０細胞１×１０個をＩＣＲマウス皮下に移植し
翌日より連日９日間腹腔的投与１．ｆｒ、。

従来、クロレラ属より得られた多糖類で抗癌作用を有す
る物質としては、クロレラ・レギュラリス（Ｃｈｌｏｒ
ｐ目Ｒｒｅｇｕｌａｒｉｓ）がら分離精製された制癌剤
（特開昭５２−７９０１６号）が挙けられるが、この公
知物質は８．６係の蛋白を含有しているのに対し、本発
明のＣ）ｌ−１は蛋白が検出されない。しかも上記公知
物質の構成糖成分がグルコース９５±２チ、ラムノース
が微量、ガラクトースが微量であって、いわゆるグルコ
ースを主成分とする多糖類であるのに対し、本発明のＣ
Ｈ−１はガラクトース、アラビノース、グルコースおよ
びグルクロン酸を各々少量づつ含有し、ラムノースを主
成分とする多糖類であって、構成糖において明らかに異
なる。従って、ＣＨ−１は新規物質であると認められる
。

本発明においては、クロレラ属に属するクロレラを培地
に培養し、その培養細胞からＣＨ−１を採取することを
特徴とするＣＨ−１の製造法も提供される。

本発明に使用されるクロレラは広く天然に存在し、クロ
レラ属に属する単細胞緑藻である。本発明における使用
細胞としてはクロレラ・ピレノイドーサがその一具体例
であって、この細胞を例えば紫外線、Ｘ線、放射線、化
学薬剤などを用いる人工的変異手段で変異して得られる
変異株は勿論、自然変異株も含め、クロレラ属に属する
細胞であって、ＣＨ−１の性能を有するものはすべて本
発明において使用することができる。

本発明を実施するにあたっては、先ずクロレラ属に属す
るクロレラが適当な培地で培養上れる。

培地と１．ては、酢酸、炭酸ガス、カルシウム塩、マグ
ネシウム塩、カリウム塩力どを栄養源と１２、その他適
宜、その他の炭素源例えばグルコース、窒素源例えば尿
素、ビタミン類を添加してもよい。

培養は通常密閉容器内で好気的条件下で無菌的に培養プ
れる。光は太陽光線または通常の螢光灯を用いる。

このようにして得られた培養細胞からＣＨ−１を採取す
るのであるが、上記培養細胞をそのｉｔの状態かまたは
噴霧乾燥した状態で熱水抽出する。

抽出は、通常８０〜９０℃で１時間程度行えばよい。抽
出液は減圧濃縮するか才たけすることなく親水性有機溶
媒を加えて溶媒沈澱させる。親水性有機溶媒としては低
級アルコール例えばメタノ−ｌｌ− ル、エタノールなどが好ましい。使用量割合は、溶媒濃
度が４０〜８０％の範囲内で適宜選択される。

このようにして得られた沈澱物は遠心分離々どの操作に
より回収され、これを水に溶解して水溶液と１２、セロ
ファンチューブなどの半透性膜を用いて透析することに
より、低分子物質、蛋白質などの不純物の除去処理を行
えばよい。

次に、上記の透析溶液を吸着クロマトグラフィーおよび
ゲルヂ過処理を施してＣＨ−１を分離精製すればよい。

例えばまず該透析溶液をＤＥＡＥ−セルロースに吸着さ
せ、希アルカリ水溶液でカラムクロマトを行い、溶出液
を中和した後、ＣＭ−セルロースのカラムに通過させ、
活性区分を凍結乾燥する。これを水に溶解して再びＤＥ
ＡＥ−セファ−セルに吸着させ、水→ＩＭ食塩１０．Ｏ
ＩＮ塩酸を用いる濃度勾配法によるカラムクロマトを行
えばよい。活性区分をゲルヂ過剤例えばセファデックス
Ｇ−７５によるゲルｐ過を行い、活性区分を凍結乾燥し
て所望のＣＨ−１を得ることができる。

次に実施例を挙けて本発明のＣＨ−１の製造例を具体的
に説明するが、これにより０Ｈ−１の製造法を限定する
ものではない。

実施例１ クロレラ・ビレノイドーサの噴霧乾燥粉末１ｋｇに水５
１を加え、８０〜９０℃で１時間抽出する。

抽出液を７００Ｏｒ、ｐｏｍで２０分間遠心分離し、得
られた上清液に４０％濃度になるようにメタノールを加
え、−夜５℃で放置する。これを９００゜ｒ、ｐ、ｍで
２０分間遠心分離し、得られた上清液に８０％濃度にな
るようにメタノールを加え、−夜５℃で放置した後、９
０００ｒ、ｐ、ｍで２０分間遠心分離する。沈澱物に水
を肌身て溶解し、この水溶液をセロファンチューブに入
れ、流水（イオン交換水）で−夜透析する。内液をＯｏ
ｏ０５ＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したＤ
ＥＡＥ−セルロースのカラム（６，４Ｘ３９ｃｔｒＬ）
に吸着させ、０．０５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で溶出
する。各フラクションを１０ｍ１づつ分画し、工Ｆ誘起
能を指標として活性区分を追跡し、活性の高いフラクシ
ョンを集め、Ｎ塩酸で中和する。この溶液をＣＭ−−セ
ルロースのカラム（４Ｘ１５ａｎ）に通し、流出液を減
圧濃縮した後、凍結乾燥する。得られた粗粉末をできる
だけ少量の水に溶かし、この水溶ｉをＤＥＡＥ−セファ
−セルのカラム（２，５ｘ５０ｃｒｎ）に吸着させ、水
５００ｍ１とＩＭ食塩７０．０１Ｎ塩酸５００１の濃度
勾配法により溶出する。各フラクションを１０１ｎｌづ
つ分画し、アンスロン−硫酸法で活性区分を追跡し、糖
含量の高いフラクションを集め、０．０２Ｎ水酸ナトリ
ウム水溶液で中和した後、セロファンチューブに入れ、
流水で一夜透析する。内液をセファデックスＧ−７５の
カラム（５ｘ７０ｃｍ）に通してゲル濾過を行う。流出
液を凍結乾燥して白色粉末２００ｇを得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は新規生理活性物質ＣＨ−１の光外部吸収スペク
トル図、第２図は同上物質のアセテート膜土での電気泳
動による、第３図は同上物質の超遠心法によるパターン
である。 １５− 第１図 手続補正書 昭和５７年１月ｌｆ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第１９２８９９号 事件との関係特許出願人 住所東京都港区白金５丁目９番１号 名称北里研究所（社団法人） 所長吉岡勇雄 ４、代理人 自発 ６、補正により増加する発明の数 ７、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の項 ８、補正の内容 （１）明細書中温７−！−ジ上から３行目「高速液体」
とあるを「高速ガス」に訂正する。 （２）明細書中温８ページ上から８行目ないし１６６行
目４）測定結果；インターフェロン誘起能を有する。」
とあるを下記のように訂正する。 「４）測定結果； ■ｉｎｖｉｌｒｎ法 試料濃度＜μｇ／ｎｌ）１０１０．１０．０１１Ｆ価（
ｏ）４９３４２０− ■ｉｎｖｉｖｏ法 採血時間２時間後５時間後 ＩＦ価（ｕ）２４０１５ 上記の通りインターフェロン誘起能を有する。」（３）
明細書第】３ペジ上から７行目［、蛋白質」ととあるを
削除する。 （４）明細書中温１５ページ上から２行目「Ｎ塩酸」と
あるをｒｌＮ塩酸」に訂正する。 （５）同ページ甲下から６行目１白色粉末２００ｇをを
得る。」とあるを「白色粉末２００ｍｇを得る。」に訂
正する。 手続補正書 昭和５７年１２月６日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５６年特許願第１９２８９９号 ３、補正をする者 ４１件との関係特許出願人 １Ｆ所東京都港区白金５丁目９査１号 名称北里研究所（社団法人） 所長吉岡勇雄 ４、代理人 自発 ６、補正により増加する発明の数 ）ン）′；′：・− （２）明細■（のト特許請求の範囲」の欄・−″・８、
補正の内容 止子／ｂ。 （２）本願の特許請求の範囲を別紙のとおりに訂正する
。 補正後の特許請求の範囲 （１）下記の理化学的性質を有する新規生理活性物質Ｈ
−１ ■少なくとも炭素原子、水素原子、酸素原子、窒素原子
からなり、 元素分析；Ｃ！＝３８．４９％１．Ｈ＝６．０７％、Ｎ
＝１．３９％ ■分子量；セロファン膜を通過せず、 Ｓ＝６．１５８（超遠心法） ■融点；約２４０℃で着色し、それ以上の昇温により徐
々に炭化する・ ４゛比旋光度；〔α］Ｄ−９，５２（Ｃ＝１．水）。 ■紫外部吸収スペクトル；０．１２５％水溶液で吸収が
見られず。 ■光外部吸収スペクトル；第１図の通り。 ■溶剤に対する溶解性；水に可溶、メタノールなどの一
般有機溶媒に不溶。 ■呈色反応：アンスロン〜応、モーリッシュ反応、ガン
バゾール硫酸反応に陽性、フオ リ／ローリ−反応、ニンヒドリン反 応に陰性。 ■塩基性、酸性、中性の区別；酸性、アセテート膜での
電気泳動は 第２図の通り。 ［相］物質の色；白色粉末 ■蛋白質；検出されず（’Ｆｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法の
呈色反応により測定〕 ０構成糖；７％硫酸中で２時間煮沸により加水分解し、
ペーパークロマトグラフィーお よび高速液体クロマトグラフィーによ りラムノース、ガラクトース、アラビ ノース、クルコースオヨヒクルクロン 酸を検出した。 ■糖含量ニゲルコース換算で５３％ （２）クロレラ属に属するクロレラを熱水抽出し、その
抽出液に親水性有機溶媒を加えて溶媒沈澱分画し、得ら
れた沈澱物を水に溶解して透析し、得られた透析溶液を
吸着クロマトグラフィーおよびゲルｐ過を施して生理活
性物質ＣＨ−１を採取する３− ことを特徴とする新規生理活性物質０Ｈ−１の製造法。 （３）溶媒沈澱分画が低級アルコール沈澱分画である特
許請求の範囲第２項記載の製造法。 （４）低級アルコール分画がメタノール沈澱分画である
特許請求の範囲第３項記載の製造法。 （５）メタノール沈澱分画をメタノール濃度４０〜８０
％の間で行う特許請求の範囲第４項記載の製造法。 （６）吸着クロマトグラフィーの吸着剤がＤＥＡＥ−セ
ルロースおよびＣＭ−セルロースである特許請求の範囲
第２項記載の製造法。 （７）ゲル濾過のゲルｐ過剤がセファデックスＧ−７５
またはセファデックスＣ，−１００である特許請求の範
囲第２項記載の製造法。 （８）クロレラがクロレラ・ビレノイドーサである特許
請求の範囲第２項記載の製造法。 ５− ４−

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有する新規生理活性物質Ｃ
   Ｈ−１ ■タカくとも炭素原子、水素原子、酸素原子、窒素原子
   からなり、 元素分析；Ｃ＝；ｌｉ８．４９％、）Ｉ＝６．０７チ、
   Ｎ＝１゜８９％、 ■分子量；セロファン膜を通過せず、 Ｓ＝６゜１５Ｓ（超遠心法） ■融点；約２４０℃で着色し、それ以上の昇温により徐
   々に炭化する。 α）比旋光度；〔α〕Ｄ−９，５２（Ｃ＝１．水）。 ■紫外部吸収スペクトル；０゜１２５チ水溶液で吸収が
   見られず。 ■赤外部吸収ヌー・クトル；第１図の通り。 ■溶剤に対する溶解性；水に可溶、メタノールなどの一
   般有機溶媒に 不溶。 ■）呈色反応；アンスロン反応、モーリッシュ反応、ガ
   ルバゾール硫酸反応に陽性、フォ リンローリ−反応、ニンヒドリン反 応に陰性。 ＠塩基性、酸性、中性の区別；酸性、アセテート膜での
   電気泳動は 第２図の通シ。 ■物質の色；白色粉末 ■蛋白質；検出されず。（Ｆｏｌｉｎ−Ｌｏｗｒｙ法の
   呈色反応により測定） ［株］構成糖；７チ硫酸中で２時間煮沸により加水分解
   し、ペーパークロマトグラフィーお よび高速クロマトグラフィーによりラ ムノース、カラクトース、アラビノー ス、グルコースおよびグルクロン酸ヲ 検出した。 ■糖含量；グルコース換算で５８チ
2. （２）クロレラ属に属するクロレラを熱水抽出し、その
   抽出液に親水性有機溶媒を加えて溶媒沈澱分画し、得ら
   れた沈澱物を水に溶解して透析し、得られた透析溶液を
   吸着クロマトグラフィーおよびゲルシ過を施して生理活
   性物質ＣＨ−１を採取することを特徴とする新規生理活
   性物質ＣＨ−１の製造法。
3. （３）溶媒沈澱分画が低級アルコール沈澱分画である特
   許請求の範囲第２項記載の製造法。
4. （４）低級アルコール分画がメタノール沈澱分画である
   特許請求の範囲第８項記載の製造法。
5. （５）メタノール沈澱分画をメタノール濃度４０〜８０
   チの間で行う特許請求の範囲第４項記載の製造法。
6. （６）吸着クロマトグラフィーの吸着剤がＤＢＡＢ−セ
   ルロースおよびＣＭ−セルロースである特許請求の範囲
   第２項記載の製造法。
7. （７）グル濾過のゲル漣過剤がセファデックスＧ−７５
   またはセファデックスＧ−１００である特許請求の範囲
   第２項記載の製造法。
8. （８）クロレラがクロレラ・ピレノイドーサである特許
   請求の範囲第２項記載の製造法。