JPS5889200A - Cholesterol determination using cholesterol dehydrogenase depending upon nad(p) and reagent for determining it - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To determine cholesterol easily, accurately, and directly, by using cholesterol dehydrogenase depending upon NAD(P) obtained by cultivating a bacterium aerobically. CONSTITUTION:A reagent for determination consisting of cholesterol dehydrogenase depending upon NAD(P) collected from a culture solution or culture mold of a bacterium such as Nocardia sp. No Ch2-1 (FERM-P 6217), Alcaligenes sp. No 4 (FERM-P 6216), etc. belonging to the genus Nocardia, Alcaligenes or Proteus, gwoing under aerobic conditions, and NAD or NADP is reacted with a specimen such as serum, etc., and the increase in formed NAD(P) is determined by an absorbance at 340nm.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＮＡＤ［Ｆ］依存性コレステロール脱水素酵
素（Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａ
ｓｅ　：以下ｒＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＨＪと略す）に関す
る。さらに詳しく説明すると、微生物を好気的条件下で
培養し、その菌体もしくは培養液から製造したＮＡＤ［
Ｆ］−ＣＤＩ（を使用するコレステロールの定量法およ
びＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＨを含有するコレステロールの定
量用試薬に関する。ここでいうＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＨと
は、補酵素としてＮＡＤにコチンアミドアデニン、ジヌ
クレオチド）、ＮＡＤＰにコチンアミドアデニン、ジヌ
クレオチドリン酸）を要求し、電子供与体（コレステロ
ール）から水素をうばい、電子受容体（ＮＡＤ又はＮＡ
ＤＰ）に付加する反応を触媒する酩素をいう。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to NAD[F]-dependent cholesterol dehydrogenase.
se: hereinafter abbreviated as rNAD[F]-CDHJ). To explain in more detail, microorganisms are cultured under aerobic conditions, and NAD [
This relates to a method for quantifying cholesterol using NAD[F]-CDI and a reagent for quantifying cholesterol containing NAD[F]-CDH. dinucleotide), cotinamide adenine, dinucleotide phosphate) from NADP, steals hydrogen from the electron donor (cholesterol), and transfers hydrogen from the electron acceptor (NAD or NADP).
DP)

従来好気性微生物が、コレステロールオキシダーゼ、コ
レステロールオキシダ−ゼを生産することは既に知られ
ている。またノカルジア・エリスロポリスがコレステロ
ールの酸化を触媒する間・素を生産するとの報告（Ａｎ
ｎ、　ｃｌ　ｉｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　。It is already known that aerobic microorganisms produce cholesterol oxidase. It has also been reported that Nocardia erythropolis produces a compound that catalyzes the oxidation of cholesterol (An
n, clin, Biochem, .

員 １０巻、７９号ト、１９７３年）がある。この酵素の場
合は、ＮＡＤ［Ｆ］への依存性は認められない。また、
チリウム・ステロリカム（特装＊昭４８　１１９０）に
ついても同様のことがいえる。さらには、絶対嫌気性微
生物である、オイバクテリウムｓｐ。Vol. 10, No. 79, 1973). In the case of this enzyme, no dependence on NAD[F] is observed. Also,
The same can be said about Thylium sterolicum (Special Edition *1190, 1972). Furthermore, Oibacterium sp., which is an obligate anaerobic microorganism.

ＡＴＣＣ２１４０８がＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを生産する
との報告（特開昭５３−５６０９０）も廿が、酵素学的
性質等の記載はほとんどなされていないばかりか、ＮＡ
Ｄ（Ｐ）依存性の記載があるにもかかわらず、ＮＡＤ（
Ｐ）の存在なしにも反応が進行する例が記載されている
。したがってこの酵素は、本発明でいうステロールオキ
シダーゼを使用する方法が広く用いられているが、発色
系に導くためにパーオキシダーゼ等が必要であり、操作
が繁雑である。しかも血中のビリルビン、アスコルビン
酸等により影響をうけ、これにより誤差が生じやすいと
いう欠点を有している。コレステロールの定量において
、ＮＡＤ［Ｆ］の存在なしには反応が進行しないＮＡＤ
［Ｆ］−ＣＤＨを用い、下記反応式に示される反応によ
り生ずるＮ　Ａ　Ｄ（ＰＩＨを直接光度計で測定できれ
ば、操作が簡単であり、前記のコレステロールオキシダ
ーゼを用いる方法の種々の問題も解決される。There was also a report (Japanese Patent Application Laid-open No. 53-56090) that ATCC21408 produces NAD(P)-CDH, but there is almost no description of the enzymatic properties, etc.
Despite the description of D(P) dependence, NAD(
Examples are described in which the reaction proceeds even in the absence of P). Therefore, the method of using sterol oxidase as referred to in the present invention is widely used for this enzyme, but peroxidase or the like is required to introduce it into the coloring system, and the operation is complicated. Moreover, it has the disadvantage that it is influenced by bilirubin, ascorbic acid, etc. in the blood, which tends to cause errors. In the determination of cholesterol, the reaction does not proceed without the presence of NAD [F].
If NAD (PIH) produced by the reaction shown in the reaction formula below can be directly measured using a photometer using [F]-CDH, the operation will be simple and the various problems of the above-mentioned method using cholesterol oxidase will be solved. Ru.

コレステロール＋ＮＡＤ［Ｆ］＝コレステノン＋ＮＡＤ
■Ｈ 本発明者等は、上記反応に適した酵素すなわち、コレス
テロールに特異性が高（、ＮＡＤ■依存性である脱水素
酵素を広く自然界に求めたところ、意外にも好気的条件
下に生育する微生物が、著量のＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを
生産することを見い出した。Cholesterol + NAD [F] = Cholestenone + NAD
■H The present inventors searched widely in nature for an enzyme suitable for the above reaction, that is, a dehydrogenase that is highly specific for cholesterol (and NAD■ dependent), and unexpectedly found that it could be used under aerobic conditions. It has been found that the growing microorganisms produce significant amounts of NAD(P)-CDH.

ネスｓｐ、Ｎｎ　４　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ
、Ｎａ　４　）およびプロテウス−ブルガリＸ　ＩＡＭ
１０２５　（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ　ＩＡＭ
１０２５）が例示される。Alcaligenes sp, Nn 4 (Alcaligenes sp.
, Na 4 ) and Proteus-BVLGARI X IAM
1025 (Proteus vulgaris IAM
1025) is exemplified.

次にノカルジアｓｐ４．ｃｉ１　およびアルカリゲネス
Ｈｐ−Ｎｎ４の菌学的性質を以下に述べる。Next, Nocardia sp4. The mycological properties of ci1 and Alcaligenes Hp-Nn4 are described below.

（１）ノカルジアｓｐ、嵐ｃｈ２−１ キ（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、　！’！１ｃｈ２　１　
）の菌学的性質に生育し分岐を生する。その後、不規則
な分断が生じ細胞は、桿菌状となる。大きさは０．８〜
１゜０μ×１．５〜４．０μ位である。(1) Nocardia sp, Arashi ch2-1 Ki (Nocardia sp, !'!1ch2 1
) grows and branches according to mycological properties. Thereafter, irregular division occurs and the cells become rod-shaped. The size is 0.8 ~
It is about 1°0μ×1.5 to 4.0μ.

気菌糸を形成せず胞子のう胞子も形成しない。It does not form aerial hyphae or sporangium.

２）ダラム染色性二陽性 ３）抗酸性：陽性 ４）運動性：無し ０　化学的組成分析 ジアミノピメリン酸、グリシンは含まない。2) Durham staining double positive 3) Anti-acidity: positive 4) Motility: None 0 Chemical composition analysis Contains no diaminopimelic acid or glycine.

（Ｑ　各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培地＝３０°Ｃで４日培養後、直径０
．５〜１．Ｑｍｍの円形コロニーを形成する。。周辺は
金縁もしくは、波状である。(Q Growth status in each medium 1) Meat juice agar plate medium = After 4 days of culture at 30°C, diameter 0
．． 5-1. Form a circular colony of Qmm. . The periphery is gold-rimmed or wavy.

表面、は平滑で半球状であり、中心部が凸状に***する
場合もある。色調は薄いクリーム色で不透明である。培
地中に色素は出さない。The surface is smooth and hemispherical, and the center may be convex. The color is pale cream and opaque. No dye is released into the medium.

２）シ、−クロース硝酸塩寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリーム色である
。水溶性色素は出さない。2) C.-Crose nitrate agar medium Growth is medium and the color of the colonies is white to pale cream. Does not release water-soluble dyes.

３）グルコース・アスパラギン寒天培地生育中程度で集
落の色はクリーム色である。水溶性色素は出さない。　
　　　　−４）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育
中程度で集落の色は泊色ないし薄クリーム色である。水
−溶性色素は出さない。3) Glucose-asparagine agar medium Growth is medium and the color of the colonies is cream-colored. Does not release water-soluble dyes.
-4) Glycerin/asparagine agar medium Growth is medium and the color of the colonies is night-colored or light cream-colored. Does not release water-soluble dyes.

５）スターチ無機塩寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリーム色である
。水溶性色素は出さない。5) Starch inorganic salt agar medium Growth is medium and the color of the colonies is white to light cream color. Does not release water-soluble dyes.

６）チロシン寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリーム色である
。水溶性色素は出さない。6) Tyrosine agar medium Growth is medium and the colony color is white to light cream color. Does not release water-soluble dyes.

７）栄養寒天培地 生育良好で集落の色はクリーム色である。7) Nutrient agar medium It grows well and the color of the colony is cream-colored.

水溶性色素は出さない。Does not release water-soluble dyes.

８）イースト麦芽寒天培地 生育良好で集落の色はクリーム色である。8) Yeast malt agar medium It grows well and the color of the colony is cream-colored.

水溶性色素は出さない。Does not release water-soluble dyes.

９）オートミール寒天培地 生育中程度で集落の色は白色ないし薄クリーム色である
。水溶性色素は出さない。9) Oatmeal agar medium Growth is medium and the colony color is white to light cream color. Does not release water-soluble dyes.

０　生理的性質 １）生育温度：１５°Ｃ〜４３°Ｃで生育する。0 Physiological properties 1) Growth temperature: Grows at 15°C to 43°C.

１０°Ｃ１４５°Ｃで生育しな（，１゜最適温度は３０
〜３５°Ｃであ る。Grows at 10°C to 145°C (1° optimal temperature is 30°C)
~35°C.

２）硝酸塩還元性：陽性 ３）カタラーゼ：陽性 ４）オキシ−１−ゼ：陰性 ５）ウレアーゼ：陽性 ６）デンプン加水分解：陰性 ７）ゼラチン液化：陰性 １０）キサンチン加水分解：陰性 １１）　　ＤＮＡの分解：陰性 １２）リドマスミルク：アルカリ性、ペプトン化凝固共
にしない。2) Nitrate reducing property: positive 3) Catalase: positive 4) Oxy-1-ase: negative 5) Urease: positive 6) Starch hydrolysis: negative 7) Gelatin liquefaction: negative 10) Xanthine hydrolysis: negative 11) DNA Decomposition: Negative 12) Lidmus milk: Neither alkaline nor peptonized coagulate.

１３）メラニン様色素の生成：無し １４）エスクリン加水分解：陽性。13) Production of melanin-like pigment: None 14) Aesculin hydrolysis: Positive.

１５）　　Ｔｗｅｅｎ２０−４０−６０−８０加水分解
：すべて陽性 １６）ペニシリン耐性試験：耐性 １７）酸素に対する態度：好気性 １８）無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩共に
利用する。15) Tween 20-40-60-80 hydrolysis: All positive 16) Penicillin resistance test: Tolerance 17) Attitude towards oxygen: Aerobic 18) Use of inorganic nitrogen sources: Both ammonium salts and nitrates are used.

α １９）　　Ｎａｉ生育範囲＝θ〜６％で生育する。α 19) Grows in Nai growth range = θ ~ 6%.

７％で生育しない。Will not grow at 7%.

２０）各種炭素源の同化性（プリドハム、ゴドリーブ寒
天培地） Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、 マンノース、グリセリン、トレハロー し スを同化する。←−アラビノース、Ｄ −キシロース、す↓カロース、イノシ し フト、敬−ラムノース、ラフィノース、Ｄ−ガラクトー
ス、Ｄ−マンニット、〜マルトース、ソルビットを同化
しない。20) Assimilation of various carbon sources (Pridham, Godelive agar medium) Assimilates D-glucose, D-fructose, mannose, glycerin, and trehalose. Does not assimilate ←-arabinose, D-xylose, ↓ callose, boar thief, rhamnose, raffinose, D-galactose, D-mannitol, maltose, and sorbitol.

２１）各稲穂から酸の生成 り−グルコース、マンノース、Ｄ−フ ラクトース、トレハロース、グリセリ し ンから酸を生成する。トーアラビノー ス、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトー ス、マルトース、サッカロース、ラフ −ドース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、イノシフ
ト、デンプンから酸を 生成しない。21) Production of acid from each ear of rice - Acid is produced from glucose, mannose, D-fructose, trehalose, and glycerin. Does not produce acid from toarabinose, D-xylose, D-galactose, maltose, saccharose, rough-dose, D-sorbitol, D-mannite, inosyft, or starch.

以上の菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　
ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｏｇｙ第８版を参考に検討した結果、細胞壁中にｍｅｓ
ｏ−ジアミノピメリン酸、アラビノース、ガラクトース
を含み、騰−ジアミノピメリン酸、グリシンが含まれな
いこと、好気性で菌糸状によく生育し、後に分断して桿
菌状となること、抗酸性であること、胞子のる胞子お゛
よび気菌糸を着生しないこと等から本菌はＮｏｃａｒｄ
ｉａに属する菌である。The above mycological properties are summarized in Bergey's Manual.
of Determinative Bacteriol
As a result of the study with reference to the 8th edition of Ogy, it was found that mes is present in the cell wall.
Contains o-diaminopimelic acid, arabinose, and galactose, but does not contain o-diaminopimelic acid and glycine; grows well in aerobic mycelial form, and later divides into rod-like forms; is acid-resistant; spores This fungus is known as Nocard because it does not attach spores or aerial mycelium.
It is a bacterium that belongs to ia.

よって本菌は、本発明音らがノカルジアｓｐ。Therefore, the present bacterium according to the present invention is Nocardia sp.

（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、　）　Ｎ１１Ｃｈ２−１と
命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に菌寄第６２
１７号（ＦＥＲＭ−Ｐ嵐６２１７）として寄託されてい
る。(Nocardia sp.) It was named N11Ch2-1 and the 62nd bacterium was sent to the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology.
It has been deposited as No. 17 (FERM-P Arashi 6217).

（ｚ）アルカリケネスＳｐ、Ｎ１１４ 爆Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　Ｎ［１４の菌学的
性質■形　態 １）細胞の形および大きさ：０．４〜０．６μ×０．８
〜１．２μの桿菌である。(z) Alcaligenes Sp, N114 Mycological properties of Alcaligenes sp, N[14 ■ Morphology 1) Cell shape and size: 0.4-0.6μ x 0.8
It is a bacillus of ~1.2μ.

２）細胞の多形性の有無：多形性は認められ４）胞子の
有無：胞子は形成しない。2) Presence or absence of cell pleomorphism: Pleomorphism is observed. 4) Presence or absence of spores: Spores are not formed.

５）ダラム染色性：陰性 ６）抗酸性：陰性 （ロ）各培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培養 円形コロニーで表面は平滑、半レンズ状の***、全縁状
で薄クリーム色、半透明、光沢あり ２）肉汁寒天斜面培養 生育中程度、糸状に生育、薄クリーム色で半透明 ３）肉汁液体培養 菌膜をつくらない、やや濁り洗上も少しある。5) Durham staining: Negative 6) Acid-fast: Negative (b) Growth status in each medium 1) Cultured on broth agar plate Round colonies with smooth surface, semi-lens-shaped ridges, entire rim, light cream color, and translucent , glossy 2) Meat juice agar slant culture medium growth, filamentous growth, light cream color and translucent 3) Meat juice liquid culture No bacterial film, slightly cloudy and some surface washing.

４）肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンは液化しない。4) Meat juice gelatin puncture culture: Gelatin does not liquefy.

５）リドマスミルク培養：アルカリ性になるがペプトン
化し−ない、凝固しない。5) Lidmus milk culture: Becomes alkaline but not peptonized or coagulated.

０　生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽性 ２）脱窒反応：陰性 ５）インドールの生成：陰性 ６）硫化水素の生成：間隔性 ７）デンプン加水分解：陰性 ８）り・エン酸塩の利用：　Ｋｏｓｅｒの培地とＣｈｒ
ｉｓｔｅｎｓｅｎの培地で共に利用する。0 Physiological properties 1) Nitrate reduction: Positive 2) Denitrification reaction: Negative 5) Indole production: Negative 6) Hydrogen sulfide production: Interval 7) Starch hydrolysis: Negative 8) Utilization of lysates : Koser's medium and Chr
Ittensen's medium is used together.

９）無機窒素源の利用：硝酸塩およびアンモ′三）ム塩
を利用する。9) Use of inorganic nitrogen sources: Use nitrates and ammonium salts.

１０）色素の生成：水溶性色素を生成しない。10) Formation of pigment: Does not produce water-soluble pigment.

１１）ウレアーゼ：陰性、間隔性 １２）オキシダーゼ：陽性 １３）カタラーゼ：陽性 １４）生育範囲ＰＨ：ＰＨ５，０〜１０．０テ生育する
。11) Urease: negative, interval 12) Oxidase: positive 13) Catalase: positive 14) Growth range PH: PH5.0 to 10.0.

温度：５°Ｃ〜３７°Ｃで生育す る。Temperature: Grows at 5°C to 37°C Ru.

４２°Ｃで生育しない。Will not grow at 42°C.

１５）酸素に対する態度：好気性 １６）　　ＯＦテスト（Ｈｕｇｈ　−Ｌｅ　ｉ　ｆ　ｓ
ｏｎ法）：フラクトースから好気的に酸を生成する。15) Attitude towards oxygen: Aerobic 16) OF test (Hugh-Leifs
on method): Generate acid aerobically from fructose.

・１７）糖類から酸およびガスの生成の有無Ａｙｅｒｓ
、　Ｒｕｐｐ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎの培地でフラク
トースとグリセリンから酸を生成 ス、マンノース、ガラクトース、麦芽 糖、シロ糖、乳糖、トレハロース、ソ ルビット、マンニット、イノシフト、 デンプンからは酸もガスも生成しない。・17) Presence or absence of acid and gas generation from sugars Ayers
, Rupp and Johnson's medium generates acids from fructose and glycerin, mannose, galactose, maltose, silucose, lactose, trehalose, sorbitol, mannitol, inosift, and starch do not generate acids or gases.

１８）独立栄養的生育：水素ガス、炭酸ガス、酸素ガス
を含有する気体中で生育し ない。18) Autotrophic growth: Does not grow in gases containing hydrogen gas, carbon dioxide gas, or oxygen gas.

１ｇ）　　Ｔｗｅｅｎ　８０　ノ分解性：　陽性２０）
　　資化性：　Ｄ−フラクトース、曝−フェニルアラニ
ン、レブリン酸カルシ ラム、参−スレオニンを資化ス る。マンノース・、マルトース、 マンニット、ベタインを資化し ない。1g) Tween 80 degradability: Positive 20)
Assimilation ability: Assimilates D-fructose, exposed phenylalanine, calcium levulinate, and zhen-threonine. Does not assimilate mannose, maltose, mannite, and betaine.

以上の菌学的諸性質からＢｅｒｇｃｙ’ｓ　ｍａｎｕａ
ｌ、　ｏｆ　−Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ　（第８版）の記載に照合して検討す
ると短桿菌で周ペン毛により運動ること、カゼインおよ
びゼラチンを分解しないこと、オキシダーゼ陽性である
こと等からＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属に分類される。Based on the above mycological properties, Bergcy's manua
l, of -Determinative Bact
According to the description in ``Eriology'' (8th edition), it is classified into the genus Alcaligenes because it is a short bacillus and moves by pericenta, does not degrade casein and gelatin, and is oxidase positive.

生育の点で異なる。またＡ、ｆａｅｃａｌｉｓとは主に
４２０Ｃにおける生育、Ｄ−７ラクトースの資化性で古 Ａ、ａ＠ｖａｍａｒｉｎｅｓとは主にデンプンの分解性
、マルトースの資化性で、Ａ、ｐａｃｉｆｉｃｕｓとは
主にスレオニンζ′ｒ”４％インの資化性で、Ａ、ｃｕ
ｐｉｄｕｓとは主にニン、ベタインの資化性で、Ａ、ａ
ｅｓｔｕｓとは主にマンニット、スレオニン、フェニル
アラニンの資化性で異なる。They differ in terms of growth. In addition, A.faecalis mainly grows at 420C, and D-7 has the ability to assimilate lactose. Assimilation of threonine ζ′r”4% in, A, cu
pidus is mainly for the assimilation of nin and betaine, A, a
It differs from S. estus mainly in its ability to assimilate mannitol, threonine, and phenylalanine.

よって本菌は本発明者がアルカリゲネスｓｐ。Therefore, the present inventors identified this bacterium as Alcaligenes sp.

（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、）％４と命名し、工
業技術院微生物工業技術研究所に菌寄第６２１６号（Ｆ
ＥＲＭＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（第８版）■　Ｊ、
Ｂａｃｔ、１１０Ｑ）４０２　４２９（１９７２）■　
坂崎和−訳：医学細菌同定の手びき（２版）近代出版、
東京、１９７４ 次にこれらの菌を用いてＮＡＤ（Ｐｉ−ＣＤＨを製造す
る方法について詳述する。これらの菌はいづれも構成的
にＮＡＤ（Ｐ）　−ＣＤＨを生産する能力を有し、通常
のペプトン、酵母エキス又は硫酸アンモニウム等のチッ
ソ源及びグルコース、グリセロール等の炭素源、その他
無機塩等を含有する培地でもＮＡＤ■−ＣＤＨを生産す
るが、コレステロールを培地に添加することによりさら
に多量にＮＡＤ（Ｐｉ−ＣＤＨを生産する。この際コレ
ステロールの添加は、培養開始時あるいは途中からのい
ずれでもよい。またその他培養条件に関しては、通常行
なわれる範囲で実施できる。これらの菌によ素を回収す
ることができる。これらの培養濾液又は菌体抽出液を硫
酸アンモニウム等による塩析又は、アセトン、エタノー
ル等の溶剤沈澱して得た粗酵素は、そのままコレステロ
ールの定量に使用す衣か、あるいは更に精製して使用す
ることもてマ の方法により可能である。(Alcaligenes sp.) %4, and it was submitted to the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology, as bacterial infection number 6216 (F
ERMBacteriology (8th edition) ■ J,
Bact, 110Q) 402 429 (1972) ■
Translated by Kazu Sakazaki: Handbook of Medical Bacteria Identification (2nd edition), Kindai Publishing,
Tokyo, 1974 Next, we will explain in detail the method for producing NAD(Pi-CDH) using these bacteria.All of these bacteria have the ability to constitutively produce NAD(P)-CDH, and NAD■-CDH is also produced in a medium containing nitrogen sources such as peptone, yeast extract or ammonium sulfate, carbon sources such as glucose and glycerol, and other inorganic salts, but by adding cholesterol to the medium, even larger amounts of NAD ( Produce Pi-CDH. At this time, cholesterol may be added either at the start of the culture or during the culture. Other culture conditions can be carried out within the usual range. To collect oxygen from these bacteria. The crude enzyme obtained by salting out the culture filtrate or bacterial cell extract with ammonium sulfate or by precipitation with a solvent such as acetone or ethanol can be used as is for the determination of cholesterol, or it can be further purified. It is possible to use it in a certain way.

ここで得られるＮＡＤ■−ＣＤＨは、コレステロール含
有物質中のコレステロールの定量に使用でき、例えば、
血液、血中のコレステロール定量等に有利に使用できる
。The NAD■-CDH obtained here can be used for quantifying cholesterol in cholesterol-containing substances, for example,
It can be advantageously used for blood, blood cholesterol quantification, etc.

本発明に使用するＮＡＤ（Ｐｉ−ＣＤＨの活性測定法を
以下に示す。The method for measuring the activity of NAD (Pi-CDH) used in the present invention is shown below.

ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの酵素活性は、コレステロ−と ルとＮＡＤ［Ｆ］Ｎ基質として反応した場合のＮＡＤ（
ＰＩＨの生成量−を、３４０Ｑｍにおける吸光度の増加
として、分光光度計で測定し算出する。すなわち、０．
１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ＰＨ８，６）２．６５　ｍｌ
。The enzymatic activity of NAD(P)-CDH is as follows:
The amount of PIH produced is measured and calculated using a spectrophotometer as an increase in absorbance at 340Qm. That is, 0.
2.65 ml of 1M Tris-HCl buffer (PH8,6)
.

２８ｍＭＮＡＤ溶液０．１ｍｌ、（８％トリト＞Ｘ−１
００溶液０−１５ｍＪ　）、１％コレステロール溶液０
．０５　ｍｌ及びＮＡＤ（Ｐ）　−ＣＤＨ水溶液０．０
５ｍＺを混合し、３０°Ｃで反応させ、反応開始後１分
間の３４０ｍｍにおける吸光度の増加を測定する。0.1 ml of 28mM NAD solution, (8% Trito>X-1
00 solution 0-15 mJ), 1% cholesterol solution 0
．． 05 ml and NAD(P)-CDH aqueous solution 0.0
5mZ is mixed and reacted at 30°C, and the increase in absorbance at 340 mm for 1 minute after the start of the reaction is measured.

対照として上記組成でコレステロールの代りに水を用い
同様の操作を行ない、対照液の３４０ｍｍにおける吸光
度の増加を試験液のそれから差し引く。得られた値から
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成量を求め、これより試料中のＮＡ
Ｄ（Ｐ）−ＣＤＨ活性を算出する。As a control, a similar operation is carried out using water instead of cholesterol with the above composition, and the increase in absorbance at 340 mm of the control solution is subtracted from that of the test solution. The amount of NAD(P)H produced is determined from the obtained value, and from this the amount of NA in the sample is determined.
Calculate D(P)-CDH activity.

酵素活性の表示は、ＰＨ８，６，３００Ｃの条件下で１
分間に１μｍｏ１６のＮＡＤ■Ｈを生成する酵素を１単
位とした。Enzyme activity is shown as 1 under the condition of PH8, 6,300C.
One unit was an enzyme that produced 1 μmo16 of NAD■H per minute.

次に本発明に使用するＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの作用を示
す。Next, the action of NAD(P)-CDH used in the present invention will be shown.

コレステロール＋ＮＡＤ（Ｐ）−：コレステノン＋ＮＡ
Ｄ（ＰｌＨ 本発明におけるＮＡＤ■−ＣＤＨは全てこの反応を触媒
する。Cholesterol + NAD (P) -: Cholestenone + NA
D(PlH) All NAD■-CDH in the present invention catalyzes this reaction.

以下に本発明に使用するＮＡＤ（Ｐ）％ＣＤＨの一般的
性質をノカルジアｓｐ、　ＮｎＣｈ２−１（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａｓｐ、ＮｎＣｈ２７１）及びにルヵリゲネス８１
）−Ｎａ４（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　Ｎａ４
　）　の生産するものについて示す。The general properties of NAD(P)%CDH used in the present invention are as follows: Nocardia sp, NnCh2-1 (Nocardia sp.
diasp, NnCh271) and Lucarigenes 81
)-Na4 (Alcaligenes sp, Na4
) shows what is produced.

≠母系４゜ １）至適ＰＨ 第１図に３０°ＣにおけるＰＨと活性の関係を示した。≠ Matrilineal 4゜ 1) Optimal pH Figure 1 shows the relationship between PH and activity at 30°C.

２）ＰＨ安定性 第２図に３７°ＣにおけるＰＨと安定性の関係を示した
。2) PH stability Figure 2 shows the relationship between PH and stability at 37°C.

３）至適温度 第３図にＰＨ８，５における温度と活性の関係を示した
。3) Optimal temperature Figure 3 shows the relationship between temperature and activity at pH 8.5.

４）熱安定性 第４図にＰＨ７，Ｑにおける温度と安定性の関係を示し
た。4) Thermal stability Figure 4 shows the relationship between temperature and stability at PH7 and Q.

５）基質特異性 本酵素は、３ｐ位に水酸基をもつステロイドに反応し、
コレステロールを１００とスルテ とスティグマスチロール３５、β−シトステロール２５
、ソの他デヒドロエピアン、トロステロン、エルゴステ
ロール等にわずかに作用する。5) Substrate specificity This enzyme reacts with steroids having a hydroxyl group at the 3p position,
Cholesterol: 100, Surte, Stigmastyrol: 35, β-sitosterol: 25
, has a slight effect on dehydroepian, trosterone, ergosterol, etc.

６）補酵素 ＮＡＤを要求する。6) Coenzymes Request NAD.

■　アルカリゲネスｓｐ、Ｎｎ４　（Ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ　８ｐ。■ Alcaligenes sp, Nn4 (Alcaligenes sp.
nes 8p.

隘４）の生産するＮＡＤ（Ｐｉ−ＣＤＨＵ　至適ＰＨ 第５図に３０８ＣにおけるＰＨと活性の関係を示した。4) NAD (Pi-CDHU optimal pH) produced by Figure 5 shows the relationship between PH and activity in 308C.

２　　ＰＨ安定性 第６図に３７°Ｃに１．けるＰＨと安定性の関係を示し
た。2 PH stability Figure 6 shows 1 at 37°C. The relationship between pH and stability was shown.

３　至適温度 第７図にＰＨ８，６における温度と活性の関係を示した
。3 Optimal temperature Figure 7 shows the relationship between temperature and activity at pH 8 and 6.

４　熱安定性 第８図にＰ　Ｈ７，９における温度と安定性の関係を示
した。4. Thermal stability Figure 8 shows the relationship between temperature and stability at pH 7 and 9.

５　基質特異性 本酵素は３ｐ位に水酸性をもつステロイドに反応し、コ
レステロールを１００とするとβ−シトステロール３６
、スチグマステロール２０．その他デヒドロエピアンド
ロステロン、エルゴステロール等にわずかに作用する。5 Substrate specificity This enzyme reacts with steroids that have hydroxyl properties at the 3p position, and when cholesterol is 100, β-sitosterol 36
, stigmasterol 20. It has a slight effect on other substances such as dehydroepiandrosterone and ergosterol.

６　補酵素 ＮＡＤを要求する。6 Coenzyme Request NAD.

次に本発明のＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを使用したコレステ
ロールの定量について詳述する。Next, the determination of cholesterol using NAD(P)-CDH of the present invention will be described in detail.

コレステロールを定量する場合、実際には緩衝液、Ｎ　
Ａ　Ｄ　（Ｐｉ、基質（血清、コレステロール等）及び
ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを混合し、一定時間反応し、生成
するＮ　Ａ　Ｄ（ＰＩＨの増加を吸光度３４０λｍで測
定する。また必要に応じて、生成したＮＡＤ［Ｆ］Ｈの
水素を７エナジンメソサルフエート（ＰＭＳ　）、ジア
フォラーゼ等により、ホルマザン色素等の発び安定化剤
等の添加も可能である。反応時のＰＨは６〜１０の範囲
で実施できるが、優れているＰＨ範囲は７〜９である。When quantifying cholesterol, actually a buffer solution, N
A D (Pi, substrate (serum, cholesterol, etc.) and NAD (P) - CDH are mixed, reacted for a certain period of time, and the increase in the generated N A D (PIH) is measured at an absorbance of 340 λm. Also, if necessary, Hydrogen of the generated NAD[F]H can be treated with 7-enazine meso sulfate (PMS), diaphorase, etc., and stabilizers such as formazan dyes can also be added.The pH during the reaction is between 6 and 10. An excellent pH range is 7-9.

次にＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤ？Ｉによるコレステロール定量
用試薬の量的組成についての１例を述べれば、反応系３
ｍ／当り、ＮＡＤ（Ｐ）−Ｃ，ＤＨｏ、１〜１０単２ｏ
ｏｒｐｍ）Ｌ／ながら４０時間培養した。Next is NAD(P)-CD? To give an example of the quantitative composition of the cholesterol quantification reagent according to I, reaction system 3
m/per, NAD(P)-C, DHo, 1-10 2o
The cells were cultured for 40 hours under the condition of (orpm) L/.

菌体を破砕した。この菌体破砕液を遠心分離（１１００
０ｒｐ、　１９分間）し、清澄な菌体抽出液を得た。得
られた清澄液に硫酸アンモニウムを３５％飽和になるよ
うに加え酵素を沈澱せしめた。The bacterial cells were crushed. This cell suspension was centrifuged (1100
0 rpm for 19 minutes) to obtain a clear bacterial cell extract. Ammonium sulfate was added to the resulting clear solution to a saturation of 35% to precipitate the enzyme.

沈澱を遠心分離（８０００ｒｐｍ　１０分間）で集め２
０ｍＭリン酸緩衝液ＰＨ７，０，１００ｍＺに溶かし、
セロファンチューブで、２０ｍＭリン酸緩衝液ＰＨ７，
０に対して２４時間透析した。Collect the precipitate by centrifugation (8000 rpm for 10 minutes) 2
Dissolved in 0mM phosphate buffer PH7, 0, 100mZ,
In a cellophane tube, add 20mM phosphate buffer PH7,
Dialyzed against 0 for 24 hours.

次に得られた透析液を２０ｍＭＩＪン酸緩衝液ＰＨ７，
０で平衡化したＤＥＡＥ・セルロース２００ｍｘを充填
したカラムに通し、酵素を吸着せしめた。同様の緩衝液
でカラムを洗浄後、緩衝液濃度を０．１Ｍに上げてＮＡ
Ｄ■−ＣＤＨを溶出した。ＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＨを含む
両分を集め、これを濃縮後２０ｍＭリン酸緩衝液Ｐ　’
Ｈ７，０に対して透析した。これを同様の緩衝液で平衡
化したヘキシルセフ１０−ス２９　ｍ　ｌを充填したカ
ラムに通し、吸着せしめた。Next, the obtained dialysate was mixed with 20mM J acid buffer PH7,
The enzyme was adsorbed through a column packed with 200 mx of DEAE/cellulose equilibrated with 0. After washing the column with the same buffer, the buffer concentration was increased to 0.1M and the NA
D■-CDH was eluted. Both fractions containing NAD[F]-CDH were collected, concentrated, and then added to 20mM phosphate buffer P'.
Dialyzed against H7,0. This was passed through a column packed with 29 ml of Hexylcef 10-su equilibrated with the same buffer solution and adsorbed.

このカラムを２０ｍＭリン酸緩衝波緩衝液７．９で洗浄
び した。次に０−５ＭＮａ−を含む同様の緩衝液でＮＡＤ
（Ｐ）−ＣＤＨを溶出し、活性画分を集め、濃縮し、５
０単位／ｍ　ｌのＮＡＤ（Ｉ’ｊ−ＣＤＨ溶液５．Ｑｍ
Ｚを得た。全体の活性収率は３０％であった。The column was washed with 20mM phosphate buffer buffer 7.9. Then NAD was added in a similar buffer containing 0-5M Na-
(P)-CDH was eluted, active fractions were collected, concentrated, and
0 units/ml NAD (I'j-CDH solution 5.Qm
Got Z. The overall activity yield was 30%.

実施例２ Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｇｐ、Ｎｂ２　（ＦＥＲＭ−
ＰＮｏ６２１６）をコレステロール’１０ｇ／ｌ、グリ
セロール２ｇ／’ｓ　コーンスチープリカ−５ｇ／ｌ　
、　ＫＨｚ　ＰＯ４５ｇ／ｌ　１Ｍｇ５Ｃ）４７　Ｈ２
Ｏ９，２ｇ７　ｔ　、消泡剤０．５ｇ／ｌの組成よりな
る培地に培養し、実施例１と同様の操作を行ない、４０
単位／ｍｌのＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ溶液を５．ＱｍＺ得
た。全体の活性収率は４０％であった。Example 2 Alcaligenes gp, Nb2 (FERM-
PNo. 6216), cholesterol' 10g/l, glycerol 2g/'s, corn steep liquor - 5g/l
, KHz PO45g/l 1Mg5C)47 H2
The cells were cultured in a medium consisting of O9,2g7t and antifoaming agent 0.5g/l, and the same operation as in Example 1 was carried out to obtain 40
unit/ml NAD(P)-CDH solution 5. I got QmZ. The overall activity yield was 40%.

実施例３ Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ＩＡＭ１０２５を
用い、実施例１に準する操作を行ない、３７単位／ｍ／
のＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨ溶液溶液４憂ｌた。全体の活性
収率は５２％であった。Example 3 Using Proteus vulgaris IAM1025, an operation similar to Example 1 was performed to obtain 37 units/m/
The NAD(P)-CDH solution solution was 4 liters. The overall activity yield was 52%.

実施例４ 実施例１で得られたＮＡＤ（Ｐｌ−ＣＤＨを用い、標準
血清におけるコレステロールの定量を行なった。Example 4 Using NAD (Pl-CDH) obtained in Example 1, cholesterol in standard serum was quantified.

０．１Ｍトリス塩酸緩衝液Ｐ　Ｈ８，６，２，７１ｍＪ
　１禾８％トリトンＸ−１０００，１ｍ／％　ＮＡＤ２
００ｍｇ／ｍｌ　溶液０．１ｍ／Ｎコレステロールエス
テラーゼ（°ベーリンガー社製）１００単位７’ｍ！溶
液０−０５ｍ／。0.1M Tris-HCl buffer P H8,6,2,71mJ
1.8% Triton X-1000, 1m/% NAD2
00mg/ml solution 0.1m/N cholesterol esterase (°Boehringer) 100 units 7'm! Solution 0-05m/.

標準血清ｏ、ｏ２ｍｔを混合し、３０°Ｃで反応させ、
３４０ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。反応は３
分以内に終点に達した。Mix standard serum o and o2mt and react at 30°C.
The increase in absorbance at 340 nm was measured. The reaction is 3
Reached the end point within minutes.

対照として上記反応組成物のＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの代
りに水を用い同様の操作を行ない対照液の３４０ｎｍに
おける吸光度の増加を試験液のそれから差し引いた。As a control, the same operation was carried out using water instead of NAD(P)-CDH in the above reaction composition, and the increase in absorbance at 340 nm of the control solution was subtracted from that of the test solution.

この標準血清における総コレステロール量は、あらかじ
め作成した検量線より、コレステロール２８９　ｍｇ　
／１３’ｔの値が得られた。　コレステロールオキシダ
ーゼを含む、市販の測定用試薬を用い行なった比較測定
からは、コレステロール２９０ｒｒｇＡｘ　ｌの値が得
られた。The total cholesterol amount in this standard serum was found to be 289 mg cholesterol based on the calibration curve prepared in advance.
A value of /13't was obtained. Comparative measurements performed using a commercially available assay reagent containing cholesterol oxidase yielded a value of 290 rrgAxl for cholesterol.

実施例５ 実施例２〜実施例３で得られたＮＡＤ■−ＣＤＨを用い
、実施例゛４に準じた操作を行ない、実質的には同じ結
果が得られた。Example 5 Using the NAD■-CDH obtained in Examples 2 and 3, the same procedure as in Example 4 was carried out, and substantially the same results were obtained.

実施例６ 実施例１で得られたＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨを使用し、実
施例４と同様の操作により、各種血清サンプルのコレス
テロールを定量１ハ以下の結果を得た。Example 6 Using the NAD(P)-CDH obtained in Example 1 and performing the same procedure as in Example 4, cholesterol in various serum samples was quantified with results of 1 h or less.

１　　　２８９　ｍｇ／ｄｌ　　　　　２９０　ｍｇ／
ｄ１２　　　１５０　　　　　　　１４６ ３　　　２１９　　　　　　　２２１ ４　　　１４３　　　　　　　１４３ ５　　　１７３　　　　　　　１７０1 289 mg/dl 290 mg/
d12 150 146 3 219 221 4 143 143 5 173 170

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図はノカルジアｓｐ、陥Ｃｈ２−ＩＦＥＲＭ−ＰＮ
［１６２１７の生産するＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの３０°
Ｃにおける至適ＰＨを示す図であり、第２図は本ＮＡＤ
の−ＣＤＨの３７°ＣにおけるＰＨ安定性を示す図であ
り、第３図は本ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの至適温度を示す
図であり、第４図は本ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの熱安定性
を示す図である。 第５図はアルカリゲネスｓｐ、　Ｎ１１４　ＦＥＲＭ−
Ｐ尚６２１６の生産するＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの３０℃
における至適ＰＨを示す図であり、第６−図は本ＮＡＤ
［Ｆ］−ＣＤＨの至適温度を示す図であり、第８図は本
ＮＡＤ［Ｆ］−ＣＤＨの熱安定性を示す図である。 第１図 ７　　８　　９ Ｈ 第２図 第８図 温度 第４図 温度 Ｄ　　　ｔ　　　７　　１５　　９　　１０　　１１Ｈ 第７図 温度 第８図 温度 手続補正書（方式） ％式％ ！、事件の表示 昭和５６年特許願第１８６１８４号 ２、発明の名称 ＮＡＤ（Ｐ）依存性コレステロール脱水素酵素を使用す
るコレステロールの定量法およびその定量用試薬 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所　愛知県名古屋市中区錦−丁目２番７号６、補正の
内容 明細書第２９ページ第７行「・・・・・・至適ｐＨを示
す図であり、」の後に次の文を加入する。 ［第７図は本ＮＡＤ（Ｐ）−ＣＤＨの３７℃におけるｐ
Ｈ安定性を示す図であり、」Figure 1 shows Nocardia sp. Ch2-IFERM-PN
[30° of NAD(P)-CDH produced by 16217
FIG. 2 is a diagram showing the optimum pH in C.
FIG. 3 is a diagram showing the optimum temperature of the present NAD(P)-CDH, and FIG. 4 is a diagram showing the PH stability of the present NAD(P)-CDH at 37°C. It is a figure showing thermal stability. Figure 5 shows Alcaligenes sp, N114 FERM-
30℃ of NAD(P)-CDH produced by Psho 6216
Fig. 6 is a diagram showing the optimum pH for this NAD.
FIG. 8 is a diagram showing the optimum temperature of [F]-CDH, and FIG. 8 is a diagram showing the thermal stability of the present NAD[F]-CDH. Figure 1 7 8 9 H Figure 2 Figure 8 Temperature Figure 4 Temperature D t 7 15 9 10 11H Figure 7 Temperature Figure 8 Temperature Procedure Correction Form (Method) % Formula %! , Indication of the case 1986 Patent Application No. 186184 2, Name of the invention Method for quantifying cholesterol using NAD(P)-dependent cholesterol dehydrogenase and its quantitative reagent 3, Relationship with the person making the amendment Patent Applicant address: 6, Nishiki-chome 2-7, Naka-ku, Nagoya, Aichi Prefecture, page 29, line 7 of the statement of contents of the amendment, after "...is a diagram showing the optimum pH," the following Add a sentence. [Figure 7 shows the p of this NAD(P)-CDH at 37°C.
It is a diagram showing H stability,

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、ＮＡＤ［Ｆ］依存性コレステロール脱水素酵素を使
用することを特徴とするコレステロールの定量法。 ２、好気的条件下で生育する微生物の培養物から得られ
るＮＡ’Ｄ［Ｆ］依存性コレステロール脱水４素酵素を
使用する特許請求の範囲第１項記載のコレステロールの
定量法０ ３、好気的条件下で生育する微生物がノカルジア属、ア
ルカリ土類金属、プロテウス属の少くとも１種以上であ
る特許請求の範囲第２項記載のコレステロールの定量法
。 ４、　ノカルジア属に属する菌株がノカルシアｓｐ、　
Ｎｈ　Ｃｈ　２−１　（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓＰ、　ｈ
　Ｃｈ２−１　）ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｉｋ６２１７である特
許請求の範囲第３項記載のコレステロールの定量法。 ５、　アルカリ土類金属に属する菌株がアルカリゲネス
ｓｐ、　ｈ　４　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓｐ、　
Ｎ＆１４　）ＦＥＲＭ−Ｐ　Ｉ’１ｈ６２１６である特
許請求の範囲第３項記載のコレステロールの定量法。 ６、プロテウス属に属する菌株がプロテウス・ブルガリ
スＩＡＭ１０２５（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕ１ｇａｒｉｓ
ＩＡＭ１０２５）である特許請求の範囲第３項記載のコ
レステロールの定量法。 ７、ＮＡＤ［Ｆ］依存性コレステロール脱水素酵素、Ｎ
ＡＤ又はＮＡＤＰを含有するか又はそれらから成ること
を特徴とするコレステロールの定量用試薬。 ８、好、気的条件下で生育する微生物の培養物から得ら
れるＮＡＤ［Ｆ］依存性コレステロール脱水素酵素を含
有する特許請求の範囲第７項記載のコレステロールの定
量用試薬０ ９、好気的条件下で生育する微生物がノカルジア属、ア
ルカリ土類金属、プロテウス属の少くとも１種以上であ
る特許請求の範囲第８項記載のコレステロールの定量用
試薬。 １０．　　ノカルジア属に属する菌株がノカルジアｓｐ
、　Ｎｏ　Ｃｈ　２−１　（Ｎｏｃａｒｄｉａ　８ｐ、
　Ｎｈ　Ｃｈ　２−１　）ＦＥＲＭ−Ｐ　ＩＶ＆１６２
１７である特許請求の範囲第９項記載のコレステロール
の定量用試薬。 １１、　　アルカリ土類金属に属する菌株がアルカリゲ
ネスｓｐ、　Ｎｏ　４　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｓ
ｐ、　Ｉｊｈ　４　）ＦＥＲＭ−Ｐ　ＩＶ＆１６２１６
である特許請求の範囲第９項記載のコレステロールの定
量用試薬。 １２、　　プロ、テラス属に属する菌株がプロテウス・
ブルガリスＩ　ＡＭＩ　０２５　（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖ
ｕｌｇａｒｉ　ｓＩＡＭ１０２５）である特許請求の範
囲第９項記載のコレステロールの定量用試薬。[Claims] 1. A method for quantifying cholesterol, which is characterized by using NAD[F]-dependent cholesterol dehydrogenase. 2. Method for quantifying cholesterol according to claim 1, which uses NA'D[F]-dependent cholesterol dehydrogenase obtained from a culture of microorganisms grown under aerobic conditions. 3. The method for quantifying cholesterol according to claim 2, wherein the microorganism that grows under atmospheric conditions is at least one species of the genus Nocardia, alkaline earth metals, and Proteus. 4. The strain belonging to the genus Nocardia is Nocardia sp.
Nh Ch 2-1 (Nocardia sP, h
Ch2-1) The method for quantifying cholesterol according to claim 3, which is FERM-P Ik6217. 5. Bacterial strains belonging to alkaline earth metals are Alcaligenes sp, h4 (Alcaligenes sp,
N&14) The method for quantifying cholesterol according to claim 3, which is FERM-P I'1h6216. 6. The strain belonging to the genus Proteus is Proteus vulgaris IAM1025 (Proteus vulgaris IAM1025).
IAM1025) The method for quantifying cholesterol according to claim 3. 7. NAD[F]-dependent cholesterol dehydrogenase, N
A reagent for quantifying cholesterol, characterized in that it contains or consists of AD or NADP. 8. Reagent for quantifying cholesterol according to claim 7, which contains NAD[F]-dependent cholesterol dehydrogenase obtained from a culture of a microorganism grown under favorable, atmospheric conditions. 9. Aerobic 9. The reagent for quantifying cholesterol according to claim 8, wherein the microorganism that grows under the following conditions is at least one species of the genus Nocardia, alkaline earth metals, and Proteus. 10. A strain belonging to the genus Nocardia is Nocardia sp.
, No Ch 2-1 (Nocardia 8p,
Nh Ch 2-1) FERM-P IV&162
17. The cholesterol quantitative reagent according to claim 9, which is No. 17. 11. The bacterial strain belonging to alkaline earth metals is Alcaligenes sp, No. 4 (Alcaligenes sp.
p, Ijh 4) FERM-P IV&16216
A reagent for quantifying cholesterol according to claim 9. 12. The bacterial strain belonging to the genus Proteus is Proteus.
Vulgaris I AMI 025 (Proteus v
10. The reagent for quantifying cholesterol according to claim 9, which is sIAM1025).