JPS588783A - Fluorescent chelate - Google Patents

Fluorescent chelate

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JPS588783A
JPS588783A JP11265382A JP11265382A JPS588783A JP S588783 A JPS588783 A JP S588783A JP 11265382 A JP11265382 A JP 11265382A JP 11265382 A JP11265382 A JP 11265382A JP S588783 A JPS588783 A JP S588783A
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fluorescence
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    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は螢光ギレート化合物、さらに詳しくは螢光性の
標識化した生理学的に活性な物質を含も特殊な結合試薬
の製造に有用な螢光ギレート（化合物）に関するもので
ある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to fluorescent gylate compounds, and more particularly to fluorescent gylate compounds useful in the preparation of specialized binding reagents containing fluorescently labeled physiologically active substances. It is something.

特殊の結合検定において感度は、一般に測定される被分
析物質のレベルが低いために、非常に重要なものである
。Sensitivity in specialized binding assays is of great importance due to the generally low levels of analyte being measured.

螢光分光学分析試験において分析されるべき螢光種を含
む試料はターダット螢光種の励起スペクトル内に既知の
分光分布の光で照射される。得られる螢光ターゲット分
子の特性発光スペクトルの強度が測定され、ターゲット
分子の数に関連づけられる。A sample containing a fluorescent species to be analyzed in a fluorescence spectroscopy test is illuminated with a known spectral distribution of light within the excitation spectrum of the TARDAT fluorescent species. The intensity of the resulting characteristic emission spectrum of the fluorescent target molecules is measured and related to the number of target molecules.

螢光分析試験の感度は、理論的には極めて高いけれども
、パックグラウンド螢光の存在によって制限される。パ
ックグラウンド信号レベルは試料においてたけでなく試
料を含む物質において競合する螢光物質から捕えられる
。これは、生物学的流体においてみられるような低濃度
の望ましいターダット螢光分子を含む試料と関連した種
の定量的測定において特に重要な問題である。多くの場
合望ましい感度を得るのに十分に（当業者に知られた適
当なり過及び他の技術によって）バックグラウンドを低
下させることは不可能である。The sensitivity of fluorometric tests, although theoretically very high, is limited by the presence of background fluorescence. Background signal levels are captured from competing fluorophores in the sample as well as in the material containing the sample. This is a particularly important problem in quantitative measurements of species associated with samples containing low concentrations of desirable TARDAT fluorescent molecules, such as those found in biological fluids. In many cases it is not possible to reduce the background sufficiently (by appropriate overshooting and other techniques known to those skilled in the art) to obtain the desired sensitivity.

時分割は興味のある特定の螢光信号を特定でないパック
グラウンド螢光から分離するという独立の手段を与える
。時分割はもし標識物がパックグラウンドよりもずっと
長生の螢光を有するならば、そしてもし長生の標識物が
短命のパックグラウンドの衰微に伴なって起る暗期間の
量測定できるようにその系が断続的な光源によって照明
されるならば可能である。そのような技術は***公開公
報第２６２８１５８号においてより詳細に記載されてい
る。Time division provides an independent means of separating specific fluorescent signals of interest from non-specific background fluorescent signals. Time-splitting is useful if the markers have much more long-lived fluorescence than the packground, and if the long-lived markers can measure the amount of dark period that occurs as the short-lived packground decays. is possible if the light source is illuminated by an intermittent light source. Such techniques are described in more detail in DE-A-2628158.

長生螢光（０１〜５ｍ５ｅｃ）のある種の希土類金属の
芳香族ジケトンキレート化合物、例えばユーロピウムベ
ンゾイルアセトネート及びユーロピウムベンゾイルトリ
フルオルアセトネートがある期間知られてきた。そのキ
レート剤は光を吸収しそれを金属イオンに伝達し螢光を
発する。***公開公報第２６２８１５８号は検定におい
て／Ｓツクグラウンド干渉を生ずる種のそれと比較した
時、発光が長生である螢光標識物の使用を通して螢光分
析免疫検定（ＦＩＡ　）における時分割の使用を記載し
ている。この公報はまたＦＩＡの技術の有用な議論及び
放射性免疫検定（ＲＩＡ　）のような他の免疫技術につ
いてその利点を与えている。Certain rare earth metal aromatic diketone chelate compounds of long-life fluorescence (01-5m5ec) have been known for some time, such as europium benzoylacetonate and europium benzoyl trifluoroacetonate. The chelating agent absorbs light and transmits it to metal ions, which emit fluorescence. DE 2628158 describes the use of time-sharing in a fluorometric immunoassay (FIA) through the use of a fluorescent label whose luminescence is long-lived when compared to that of a species that produces ground interference in the assay. are doing. This publication also provides a useful discussion of the technique of FIA and its benefits for other immunological techniques such as radioimmunoassay (RIA).

***公開公報第２６２８１５８号に記載された螢光免疫
試薬は少なくとも一つの免疫系の部分、すなわち希土類
キレートとし結合された」抗体（免疫体）又は抗原を含
んでなる。そのような「結合」は二つの方法： （１）最初、標識化、すなわち「Ｆｌｕｏｒｅａｃｅｎ
ｔＡｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　
ＴｈｅｉｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｊ　Ａ、　Ｋａｗ
ａｍｕｒａ、　　Ｅｄ、、　　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰ
ａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ＋　１９６９において記載されたように希土
類キレートを抗原に結合し、次いで抗体を結合された抗
原に添加しこれにより抗体と抗原が通常の型で結合する
ことによる、又は （２）抗体をキレートに化学的な基によって共有□ 結合きせることによる、 のうちの一つにおいて達成することができる。The fluorescent immunoreagents described in German Offenlegungsschrift No. 2,628,158 comprise at least one part of the immune system, ie an antibody (immunobody) or an antigen bound to a rare earth chelate. Such "conjugation" can be done in two ways: (1) first, by labeling, i.e. "Fluoreacen
tAntibody Techniques and
TheirApplication JA, Kaw
amura, Ed, UniversityP
ark Press, Baltimore, Mar.
yland+ 1969 and then adding the antibody to the bound antigen so that the antibody and antigen bind in the conventional manner; or (2) by coupling the antibody to the chelate by chemical This can be achieved in one of the following by creating a covalent □ bond by a radical.

***公開公報第２６２８１５８号において記載された型
の免疫試薬についての問題は水と接触した時、螢光標識
種、すなわち希土類キレートが冷却され、すなわちそｈ
らの螢光が消失するということである。以後「水安定性
」の問題として言及されるこの問題は螢光標識化免疫試
薬のための主な用途が血液及び血清のような水性の生物
学的流体の分析試験にあるため特に重大である。もし水
安定性をこれらの物質に与えることができるならそれら
はこれらの生物学的流体用の螢光標識物として有用であ
り、かくてパックグラウンドからの信号の時分割の使用
によって螢光免疫分析感度を増加せしめる。螢光キレー
トの「水安定性」は１０　　Ｍ　　　よりも大きい結合
定数（すかわち結合定数の７０ｇ１０が１０より大きい
）を示すものとしてここに規定される。この結合定数は
キレート剤のランタニド金属に対する結合を言及するも
のである。A problem with immunoreagents of the type described in DE 2628158 is that when in contact with water, the fluorescently labeled species, i.e. the rare earth chelate, cools, i.e.
This means that their fluorescence disappears. This problem, hereinafter referred to as the "water stability" problem, is particularly important because the primary use for fluorescently labeled immunoreagents is in analytical testing of aqueous biological fluids such as blood and serum. . If water stability could be imparted to these materials, they would be useful as fluorescent labels for these biological fluids, thus allowing fluorescent immunoassays to be performed by time-sharing use of the signal from the pack ground. Increases sensitivity. "Water stability" of a fluorescent chelate is defined herein as exhibiting a binding constant greater than 10 M (ie, a binding constant of 70g10 greater than 10). This binding constant refers to the binding of the chelating agent to the lanthanide metal.

さらに先に螢光測定用に使用された希土類キレートは発
光に対する低い量の収量、少量の検出可能々種を用いる
不十分な螢光に帰着する望ましく々い増感剤の吸光係数
、測定をして通常低いλｍａｘ範囲にある試料において
他の成分から妨害を受けせしめる低いλｍＦＬＸｓ不十
分な水溶性（大部分の生物学的流体は水である）、及び
低濃度におけるキレートの不十分な安定性のような望ま
しくない性質を有していた。Furthermore, rare earth chelates previously used for fluorescence measurements have low yields for luminescence, an undesirable extinction coefficient of the sensitizer, resulting in insufficient fluorescence with small amounts of detectable species. low λm FLXs in samples that are usually in the low λmax range due to insufficient aqueous solubility (most biological fluids are water) and insufficient stability of the chelate at low concentrations, leading to interference from other components. It had such undesirable properties.

本発明はランタニド金属とキレート剤を有する螢光キレ
ートであって、そのキレート剤はランタニド金属のそれ
よりも大きい三重環（ｔｒｉｐｌｅｔ　）エネルギーを
有する三重環増感剤である核及び少なくとも２つのへテ
ロ原子含有基及び三重項増感剤核の中にあるか又はに結
合されている第三のへテロ原子含有基又はヘテロ原子を
含み、前記２つのへテロ原子含有基の各々が三重項増感
剤核の別の炭素原子に結合され、それらのへテロ原子含
有基はそれらと前記第三のへテロ原子又はヘテロ原子含
有基がランタニド金属とキレート構造を形成するように
キレート剤の中に位置する螢光キレートを指向するもの
である。そのキレートは水溶性であり、８〜１０の範囲
のＰＨにおいて低濃度で安定であり、高感度であり、好
ましいモル吸光係数（１００００〜４００００）及び白
色光源の使用を可能にする好ましいλｍａｘ　ｓ例えば
３００ｎｍより大きい、好ましくは３３０＋ｙｎより大
きい、を有している。これらのキレートは１０　　Ｍ　
　より大きい結合定数を有する。よって本発明は抗原及
びホルモンのような生理学的に活性な物質を標識化する
高度に効果のある水安定性の螢光キレートの部類を提供
するものである。本発明はまたこれらの高度に有用な螢
光キレ−１を有する、抗原、酵素及びホルモンのような
新規な部類の特殊の結合試薬を提供する。The present invention is a fluorescent chelate having a lanthanide metal and a chelating agent, the chelating agent having a triplet ring energy greater than that of the lanthanide metal and at least two heterogeneous nuclei. an atom-containing group and a third heteroatom-containing group or heteroatom within or bonded to the triplet sensitizer nucleus, each of said two heteroatom-containing groups being a triplet sensitizer. bonded to another carbon atom of the agent nucleus, those heteroatom-containing groups are positioned within the chelating agent such that they and said third heteroatom or heteroatom-containing group form a chelate structure with the lanthanide metal. It is aimed at fluorescent chelates that The chelate is water soluble, stable at low concentrations in the pH range 8-10, highly sensitive, with a preferred molar extinction coefficient (10,000-40,000) and a preferred λmax that allows the use of white light sources, e.g. It has a wavelength of greater than 300 nm, preferably greater than 330+yn. These chelates are 10 M
have a larger binding constant. The present invention thus provides a class of highly effective, water-stable, fluorescent chelates for labeling physiologically active substances such as antigens and hormones. The present invention also provides a new class of specialized binding reagents, such as antigens, enzymes, and hormones, with these highly useful fluorescent molecules.

その試薬は螢光標識の抗原、ハプテン、抗体、植物レク
チン、炭水化物、ホルモン、酵素及び他のそのよう彦種
特異性物質を吸着又は共有結合することによって形成さ
れる。The reagents are formed by adsorbing or covalently binding fluorescently labeled antigens, haptens, antibodies, plant lectins, carbohydrates, hormones, enzymes, and other such species-specific substances.

一般にあるランタニド金属はここに記載されたキレート
に有用である。ここで有用なランタニド金属０例はユー
ロピウム及びテルビウムであり、５ｉｎｈａ、　Ｓ、Ｐ
、著、Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ　ｏｆ　Ｒａｒｅ　Ｅａｒｔ
ｈｓ。Certain lanthanide metals in general are useful in the chelates described herein. Examples of lanthanide metals useful here are europium and terbium, 5inha, S, P
, Author, Complexes of Rare Earth
hs.

Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９６６に記載され
ている。Pergamon Press, 1966.

キレート剤の核は必要な三重項エネルギーを有するある
三重項増感剤である。ここで有用な三重項増感剤の例は
ベンゾフェノン、プロピオフェノンルミヒラ−ケトン、
アセトフェノン、１，３，５−トリアセチルベンゼン、
イソブチロフェノン、１　、３−ジフェニル−２−７’
ロノぐノン、トリフェニルメチルフェニルケトン、１．
２−ジベンゾイルベンゼン、４　、４’−ジクロロベン
ゾフェノン、ｌ、４−シアセチルベンゼン、９−ベンゾ
イルフルオレン、ｐ−シアノベンゾフェノン、β−ナフ
チルフェニルケトン、２−アセトナフトン、α−ナフチ
ルフェニルケトン並びにビアセチル、ベンジル及び２，
３−ペンタンジオンのようなα、β−ノヶトンを含む１
−アセトナフトンのようなりトン；キサントン、チオキ
サントン、アントラキノン、α−ナフトフラ？ン、フラ
ビン、５．１２−ナフタセンキノン及びフルオレノンの
ようなケト芳香族化合物；ベンズアルデヒド、フェニル
グ（７） リオキサール、エチルフェニルグリオキサレート、２−
ナフトアルデヒド及び１−ナフトアルデヒドのようなア
ルデヒド；フルオレン、トリフェニレン、フェナントレ
ン、ナフタレン及びピレンのような線状もしくは溶融多
環式芳香族化合物；カルバソール、チルピリジン、フェ
ナントロリン、トリフェニルアミン、チアゾリン、特に
２−ベンゾイルメチレン−１−メチルナフト［１，２−
ｄ］チアゾリン、２−フロイルメチレン−１−メチルナ
ンド（１，２−ｄ：）チアゾリン、２−（シフ０イルメ
チレン）−１−メチルナフト［１，２−ｄ］チアゾリン
、１−メチル−２−テノイルメチレンナフト［：１，２
−ｄ：］チアゾリン及び２−（ジテノイルメチレン）−
１−メチルナンド（１，２−ｄ）チアゾリンのような２
−有機カルがニルチアゾリン、のような複素環式及び芳
香族窒素含有化合物；米国特許第２，７３２，３０１号
及び第４．１１，９，４６６号において記載されたよう
々チアゾリン化合物；並びに米国特許第４，１４７，５
５２号において記載されたよりなケトクマリンを含む。The core of the chelating agent is some triplet sensitizer with the required triplet energy. Examples of triplet sensitizers useful herein are benzophenone, propiophenone lumichler-ketone,
Acetophenone, 1,3,5-triacetylbenzene,
Isobutyrophenone, 1,3-diphenyl-2-7'
Lonogunone, triphenylmethyl phenyl ketone, 1.
2-dibenzoylbenzene, 4,4'-dichlorobenzophenone, l,4-cyacetylbenzene, 9-benzoylfluorene, p-cyanobenzophenone, β-naphthylphenyl ketone, 2-acetonaphtone, α-naphthylphenyl ketone and biacetyl, benzyl and 2,
1 containing α,β-nogatone such as 3-pentanedione
-Like acetonaphthone; xanthone, thioxanthone, anthraquinone, α-naphthofura? Keto aromatics such as 2-naphthacenequinone and fluorenone; benzaldehyde, phenylglyoxalate, 2-
Aldehydes such as naphthaldehyde and 1-naphthaldehyde; linear or fused polycyclic aromatic compounds such as fluorene, triphenylene, phenanthrene, naphthalene and pyrene; carbazole, tilpyridine, phenanthroline, triphenylamine, thiazoline, especially 2- Benzoylmethylene-1-methylnaphtho[1,2-
d] thiazoline, 2-furoylmethylene-1-methylnando(1,2-d:)thiazoline, 2-(sifylmethylene)-1-methylnaphtho[1,2-d]thiazoline, 1-methyl-2-te Noyl methylene naphtho[:1,2
-d:]thiazoline and 2-(ditenoylmethylene)-
2 such as 1-methylnando(1,2-d)thiazoline
- Heterocyclic and aromatic nitrogen-containing compounds such as organic carbonyl thiazoline; thiazoline compounds such as those described in U.S. Pat. Nos. 2,732,301 and 4,11,9,466; Patent No. 4,147,5
Contains more ketocoumarins as described in No. 52.

（８） ランタニド金属がユーロピウムである時、三重項エネル
ギーは少なくとも４７’ｋｃａＬでなければならず、も
しランタニド金属がテルビウムであるならば核の三重項
エネルギーは少なくとも５３ｋｃａｌでなければならな
い。(8) When the lanthanide metal is europium, the triplet energy must be at least 47'kcal; if the lanthanide metal is terbium, the nuclear triplet energy must be at least 53kcal.

キレート剤はまたそれらがランタニド金属と配位結合を
形成することができるようにキレート剤上に位置する少
なくとも２つのへテロ原子を含む基を有する。ランタニ
ド金属と配位結合を形成することができる基はニトリロ
ジアセテート、カルがキシ、ヒドロキシ、アルコキシ、
アミノ、アミド、カル？ニル、及びメルカプト基を含む
。これらの基はランタニド金属と基とのキレート化を可
能にするように核に付加される。Chelating agents also have at least two heteroatom-containing groups located on the chelating agent so that they can form coordinate bonds with the lanthanide metal. Groups that can form coordination bonds with lanthanide metals include nitrilodiacetate, carboxy, hydroxy, alkoxy,
Amino, amide, cal? Nyl, and mercapto groups. These groups are attached to the core to allow chelation of the group with the lanthanide metal.

好ましいキレート剤は構造； （式中 Ｒ２を共に有する２はランタニド金属のそれよりもより
大きい三重項エネルギーを有する三重項増感剤である置
換（例えば免疫試薬に結合されたウレイレン、チオウレ
イレン、カルブニルイミノもしくはイミノのような免疫
試薬を連結するために使用された基、又はクマリン基と
の）又は未置換の核を満たすのに必要な原子を表わし；
Ｒ２は（１）へテロ原子又は（２）少なくとも１個のへ
テロ原子をその中に有するアルキレン基又はそれらに付
加され念へテロ原子もしくはヘテロ原子を含む基であり
；そして Ｒ３及びＲ４はへテロ原子を含む基で同じか又は異々っ
たもので；Ｒ及びＲはう／タニド金属がＲ２に及びＲ３
もしくはＲ４か又はその両方のいずれかにキレートが可
能なようにＲ２に十分近接していて；ここでＲ２によっ
て表わされた炭素とへテロ原子の数は２０に等しいか又
はより小さい。）を有する。Preferred chelating agents have the structure: (substituted in which 2 with R2 is a triplet sensitizer with a triplet energy greater than that of the lanthanide metal, such as a ureylene, thioureylene, carbnylimino or represents the group used to link the immunoreagent, such as an imino, or with a coumarin group) or the atoms necessary to fill the unsubstituted nucleus;
R2 is (1) a heteroatom or (2) an alkylene group having at least one heteroatom therein or a heteroatom or group containing a heteroatom appended thereto; and R3 and R4 are Groups containing a terror atom, which may be the same or different;
or close enough to R2 to permit chelation to either R4 or both; wherein the number of carbons and heteroatoms represented by R2 is less than or equal to 20. ).

Ｒ２は窒素、酸素、硫黄、もしくはセレニウムのような
ヘテロ原子又は少なくとも１個のへテロ原子をその中に
有するアルキレン基又はそれらに付加されたヘテロ原子
もしくはヘテロ原子を含む基である。Ｒで表わされた全
原子数は２０に等しいか又はより小さい、かくてＲ２は
１個又はそれ以上のへテロ原子を含むことができる。Ｒ
２の例は−ＮＨ−１Ｏ１Ｓ、Ｓｓ、−Ｎ＝、 及びヘテロ原子又は１０個までの炭素原子を有するヘテ
ロ原子を含むアルキレン基である。さらにその例はカル
ボニル、ノカルポニル、チオカルぜニル、ヒドロキシメ
チレン、１．２−ノヒドロキシエチレン及び１．２−ジ
ヒドロキシビニレンである。R2 is a heteroatom such as nitrogen, oxygen, sulfur, or selenium, or an alkylene group having at least one heteroatom therein, or a heteroatom or a heteroatom-containing group appended thereto. The total number of atoms represented by R is less than or equal to 20, thus R2 can contain one or more heteroatoms. R
Examples of 2 are -NH-1O1S, Ss, -N=, and alkylene groups containing heteroatoms or heteroatoms with up to 10 carbon atoms. Further examples are carbonyl, nocarponyl, thiocarzenyl, hydroxymethylene, 1,2-nohydroxyethylene and 1,2-dihydroxyvinylene.

Ｒ３及びＲ４はＲ２に個々に隣接しているか又はＲ２か
ら移動した３個もしくはそれより少ない原子であるかの
いずれかであることが好ましい。Preferably, R3 and R4 are either individually adjacent to R2 or are three or fewer atoms displaced from R2.

ある好ましい当節態様においてランタニド金属はフェノ
ール性の水酸基に対してオルソの各位置に置換されたイ
ミノジアセテート基を有するフェノールとキレートする
。そのフェノールは未置換のものか又はアルコキシ、ア
ルキル、ハロゲンもしくはカルボニルのような種々の基
で置換されたものであり、所望によりもう一つの芳香族
基又は脂環式もしくは複素環式基に溶料される。特に構
造： （式中 Ｍは水素又はアンモニウムもしくはテトラメチルアンモ
ニウム、テトラエチルアンモニウム、もしくはベンジル
トリメチルアンモニウムのようなその誘導体、のような
カチオン、又はナトリウム、リチウム、カリウム、ルビ
ジウム、もしくはセシウムのようなアルカリ金属であり
；そしてＤは芳香族環を完成するに必要な原子を表わす
。）を有する化合物が好ましい。この芳香族環は前記の
ようにヒドロキシル基を有しなければならない。In certain preferred embodiments, the lanthanide metal chelates with a phenol having an iminodiacetate group substituted at each position ortho to the phenolic hydroxyl group. The phenol may be unsubstituted or substituted with various groups such as alkoxy, alkyl, halogen or carbonyl, optionally containing another aromatic group or an alicyclic or heterocyclic group. be done. In particular the structure: where M is a cation such as hydrogen or ammonium or a derivative thereof such as tetramethylammonium, tetraethylammonium, or benzyltrimethylammonium, or an alkali metal such as sodium, lithium, potassium, rubidium, or cesium. and D represents an atom necessary to complete the aromatic ring) is preferred. This aromatic ring must have a hydroxyl group as described above.

ようなカルがニル基を有さなければならず、ここでアル
キルは一般にメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペン
チル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル
、又はそれらの異性体のような１０までの炭素原子を含
み、Ａｒはフェニルのよう々アリールであり；又それは
好ましくはベンゼン（置換又は未置換）、ベンゾフェノ
ン、又はクマリン核を形成するためにカルボニル基を有
するビランのような４〜７個の炭素原子を含むもう一つ
の芳香族、脂環式、又は複素環式の項に対して２つの有
効位置において縮合されねばならない。Cal must have a nyl group, where alkyl generally has up to ten groups such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, or isomers thereof. containing carbon atoms, Ar is aryl, such as phenyl; and it preferably contains 4 to 7 carbon atoms, such as benzene (substituted or unsubstituted), benzophenone, or biran with a carbonyl group to form a coumarin nucleus. It must be fused at two available positions to another aromatic, cycloaliphatic, or heterocyclic term containing a carbon atom.

芳香族環の例はフェニル、ナフチル等であり、所望によ
り好ましくはメチル、エチル、プロピル、もしくはブチ
ル又はそれらの異性体のような１〜４個の炭素原子を含
むアルキル；ヒト四キシ；フェニルのようなアリール；
　ＣＨＯのようなアルデヒ有効位置のいずれかに置換さ
れたものである。特に好ましい実施態様においてＤはベ
ンゾイル置換基のようなカルがニル置換基を有するフェ
＝／＋４２を形成するか又はそれはクマリン基を形成す
る。Examples of aromatic rings are phenyl, naphthyl, etc., optionally preferably alkyl containing 1 to 4 carbon atoms such as methyl, ethyl, propyl, or butyl or their isomers; aryl like;
An aldehyde substituted at any available position such as CHO. In a particularly preferred embodiment, D forms a phe =/+42 with a cal-nyl substituent, such as a benzoyl substituent, or it forms a coumarin group.

明細書を通して「アルキル」及び「アリール」という語
はそのアリール又はアルキルが所望によりメチル、エチ
ル、及びプロピルのような基で置換されている置換アル
キル及びアリールを含む。Throughout the specification, the terms "alkyl" and "aryl" include substituted alkyls and aryls in which the aryl or alkyl is optionally substituted with groups such as methyl, ethyl, and propyl.

本発明の好ましい実施態様は次の構造：Ｈ （式中 Ｍは水素、アンモニウム、もしくはアルカリ金属イオン
、又はその塩を水溶性たらしぬる何か他の適尚なカチオ
ンである。） を有する塩又は酸とランタニド金属とのキレートの形成
を伴なう。A preferred embodiment of the invention is a salt having the following structure: H where M is hydrogen, ammonium, or an alkali metal ion, or any other suitable cation that renders the salt water-soluble. or involves the formation of a chelate between an acid and a lanthanide metal.

もう一つの好ましい実施態様においてランタニド金属と
錯体を形成する有機化合物は次の構造二Ｈ ５ （式中 ルであり、 各Ｒ６は水素；メチル、エチル、プロピル、モジくはブ
チルのような１〜４個の炭素原子を有するアルキル；さ
らに置換もしくは置換されていないアリールもしくはア
ロイル；メトキシ及びゾロポキシのよう々アルコキシ；
又は臭素もしくは塩素のようなハロダンから独立に選ば
れる。）を有する。In another preferred embodiment, the organic compound complexed with the lanthanide metal has the following structure: alkyl having 4 carbon atoms; further substituted or unsubstituted aryl or aroyl; alkoxy, such as methoxy and zoropoxy;
or independently selected from halodane such as bromine or chlorine. ).

好ましいアロイルＲ５置換基は所望によりさらにアリー
ルもしくはアルキル基で、又はエステル、アミド、カル
バミド、チオカルバミド、イソシアネート、チオシアネ
ート、ハロダン、もしくはニトリル基で置換される。Preferred aroyl R5 substituents are optionally further substituted with aryl or alkyl groups, or with ester, amide, carbamide, thiocarbamide, isocyanate, thiocyanate, halodane, or nitrile groups.

Ｒ５が陰性（す々わち電子吸引）基とは他のものによっ
てクマリン環に付加されるある種の他のクマリン化合物
は、激しく螢光を発することが知られており、本発明の
実施には有用ではない。というのはこの螢光が可視スペ
クトルにおいて伴って起る螢光を有するユーロピウム又
はテルビウム錯体への励起エネルギーの移動を防ぐから
である。Certain other coumarin compounds in which R5 is attached to the coumarin ring by something other than a negative (i.e., electron-withdrawing) group are known to be highly fluorescent and are not suitable for the practice of this invention. is not useful. This is because this fluorescence prevents the transfer of excitation energy to europium or terbium complexes that have accompanying fluorescence in the visible spectrum.

希土類キレートを形成するために使用される有機の塩又
は酸は３００〜５００　ｎｍの範囲において吸収し、次
いでその励起エネルギーをランタニド金属に移動しなけ
ればならず、これにより可視スペクトルにおいて螢光を
発する。有用な錯体化する化合物の他の例は下記を含む
。The organic salt or acid used to form the rare earth chelate must absorb in the 300-500 nm range and then transfer its excitation energy to the lanthanide metal, thereby causing it to fluoresce in the visible spectrum. . Other examples of useful complexing compounds include:

Ｈ ＨＣ＝０ −０ Ｈ３ その錯体はランタニド金属とキレート剤のある比を含む
。好ましい実施態様においてはランタニド金属とキレー
ト剤のモル比は１：１〜２：１、最も好ましくは１：１
である。H HC=0 −0 H3 The complex contains a certain ratio of lanthanide metal and chelating agent. In preferred embodiments, the molar ratio of lanthanide metal to chelating agent is from 1:1 to 2:1, most preferably 1:1.
It is.

そのキレート剤は構造 の既知の化合物及びイミノジ酢酸もしくはそのエステル
とホルムアルデヒドとの間のマンニッヒ反応を行なうか
；又はブロモメチルもしくはメチレントシレート基のよ
うな活性メチレン基を有するの化合物とイミノジ酢酸エ
ステルとの間の求核置換反応をし、そして次いでそのエ
ステルを加水分解することによって製造される。The chelating agent can be a Mannich reaction between a compound of known structure and iminodiacetic acid or its ester and formaldehyde; or a compound having an active methylene group, such as a bromomethyl or methylene sylate group, and an iminodiacetic ester. and subsequent hydrolysis of the ester.

有用々化合物は下記を含む。Useful compounds include:

ランタニド金属とキレート剤はｐＨ７，５〜１０の水溶
液においてキレート剤の水溶液をランタニド金属塩と単
に混合することによって容易に錯体化される。ランタニ
ド、金属塩はＴｂＣｌ３・６Ｈ２０又はＥ　ｕ　Ｃｌ−
ｓ・６Ｈ２０のような塩素塩のようなある金属の水溶性
塩である。Lanthanide metals and chelating agents are readily complexed by simply mixing an aqueous solution of the chelating agent with a lanthanide metal salt in an aqueous solution at pH 7.5-10. Lanthanide, metal salt is TbCl3・6H20 or E u Cl−
Water-soluble salts of certain metals, such as chlorine salts such as s.6H20.

キレートは一般に８〜１１のＰＩ］、好ましくは８〜９
の水溶液において製造される。The chelate generally has a PI of 8 to 11], preferably 8 to 9
It is produced in an aqueous solution of

キレートは所望により最適な−を生ずるように燐酸塩及
び硼酸塩のよう々緩衝剤と混合される。Chelates are optionally mixed with buffering agents, such as phosphates and borates, to produce the optimum pH.

キレートは錯体に吸着又は共有結合（でよって結合する
ことによって種々の生理学的に活性な物質を標識づける
のに有用である。この型で標識づけられる生理学的に活
性な物質の中には酵素及びそれらの受媒質、抗原、すな
わち適当な条件下で特にある探知できる方法で抗体、炭
水化物、代謝産物、薬、他の薬物学的剤及びそれらの受
容体と反応することができるある物質、並びに他の結合
物質がある。特殊の結合検定試薬は米国特許第３．５５
７，５５５号、第３，８５３，９８７号、第４．１０８
，９７２号及び第４．２０５，０５８号において記載さ
れている。Chelates are useful for labeling a variety of physiologically active substances by adsorption or covalent attachment to complexes. Some physiologically active substances that can be labeled in this manner include enzymes and Their receptor medium, antigens, i.e. certain substances that can react with antibodies, carbohydrates, metabolites, drugs, other pharmaceutical agents and their receptors in a particularly detectable manner under appropriate conditions, and others. There are binding substances.Special binding assay reagents are described in U.S. Patent No. 3.55.
No. 7,555, No. 3,853,987, No. 4.108
, 972 and 4.205,058.

そのような生理学的に活性な物質の錯体に対する結合を
達成する技術は尚業者によく知られていて、その物質を
単に共に混合することを含む。Techniques for achieving the attachment of such physiologically active substances to the complex are well known to those skilled in the art and include simply mixing the substances together.

特殊結合検定方法においては、測定される分析物に構造
的な類似性を有する化合物が探知できる標識物に結合さ
れる。測定される分析物はここに配位子として言及され
、標識化された化合物は配位子アナローブとして言及さ
れる。特に配位子及び配位子アナローブを認識し、それ
らに結合する化合物は受容体として言及される。In specialized binding assay methods, a compound with structural similarity to the analyte to be measured is bound to a detectable label. The analyte being measured is referred to herein as a ligand, and the labeled compound is referred to as a ligand analog. In particular, compounds that recognize and bind to ligands and ligand analogs are referred to as receptors.

あるそのような型の検定を行なうのに配位子は受容体に
結合する配位子アナローブと競争して置かれる。未知の
濃度の配位子が標識化された配位子アナローブの測定さ
れた信号から推論される。To perform some such types of assays, a ligand is placed in competition with a ligand analog that binds to a receptor. An unknown concentration of ligand is inferred from the measured signal of the labeled ligand analog.

その反応は次のように進行する。The reaction proceeds as follows.

配位子＋（標識化された）配位子アナローブ土受容体＃
配位子／受容体′十配位子アナローグ／受容体 例証的々目的のために次の議論はある特定の型の特殊の
結合検定技術すなわち競争的な結合螢光免疫検定技術を
述べている。Ligand + (labeled) ligand analog receptor #
Ligand/Receptor' Decaligand Analog/Receptor For illustrative purposes, the following discussion describes one particular type of specialized binding assay technique, a competitive binding fluorescence immunoassay technique. .

この系は螢光標識で標識化された抗原、未標識の天然抗
原（試験試料において）及び特殊な抗体から々す、これ
ｒ（より未標識の抗原と抗体に結合する標識化された抗
原との間に競争が存在する。This system consists of an antigen labeled with a fluorescent label, an unlabeled natural antigen (in the test sample), and a specific antibody (in the test sample), and a labeled antigen that binds to the unlabeled antigen and the antibody. There is competition between.

系における試験試料からの未標識の抗原の濃度が大にな
ればなるほど抗体によって結合される標識化された抗原
はより少々くなる。もし標識化された抗原及び抗体の濃
度が一定で、未標識の抗原の量が変化するだけ々らば、
抗原−杭体錯体を残留する遊離抗原（標識及び未標識の
いずれも）から物理的に分離すること、及び遊離かもし
くは結合されたかのいずれかの標識化された抗原の螢光
を、同じ方法で処理されたある範囲の既知量の抗原によ
って与えられた値の標準曲線のプロットと比較すること
、によって未知の量の未標識の抗原を測定することが可
能である。The greater the concentration of unlabeled antigen from the test sample in the system, the less labeled antigen will be bound by the antibody. If the concentrations of labeled antigen and antibody are constant and the amount of unlabeled antigen varies only,
Physically separating the antigen-pile complex from the remaining free antigen (both labeled and unlabeled) and fluorescing the labeled antigen, either free or bound, in the same manner. It is possible to measure unknown amounts of unlabeled antigen by comparing to a standard curve plot of the values given by a range of known amounts of antigen treated.

好ましい螢光的に標識化された特殊の結合試薬は構造： （式中 Ｚ、ＲＳＲ，及びＲは前記のようなものでなエステル；
　−ＣＮＨ−１−Ｃ−Ｎ−のようなア２Ｈ５ ミド；５Ｏ２ＮＨ−１ＳＯ２Ｎ−のようなスルホアミ１ ド；−０−１−８−のようなエーテル；−Ｃ−１ｌ −Ｃ−のようなカルがニル；＝Ｎ−のようなニトリロ；
　−ＮＨ−のようなイミノの如き結合基であり、アリー
レン及びチオアリーレンのような付加的な有機結合原子
を含んでなるそれらの基を含み；ｐ及びｍは０又は１で
あり、ｎは１〜３であり、Ｒ１は抗原又はホルモンのよ
うな生理学的に活性な物質である。） を有するランタニド金属とキレート剤の錯体を含んでな
る。Preferred fluorescently labeled specialty binding reagents have the structure: ester, where Z, RSR, and R are as defined above;
Amides such as -CNH-1-C-N-; Sulfamides such as 5O2NH-1SO2N-; Ethers such as -0-1-8-; nitrilo; as in =N-;
linking groups such as imino, such as -NH-, including those groups comprising additional organic bonding atoms such as arylene and thioarylene; p and m are 0 or 1, and n is 1 ~3, and R1 is a physiologically active substance such as an antigen or a hormone. ) of a lanthanide metal and a chelating agent.

前記のようにいったん製造された場合、螢光標識された
生理学的に活性な種は螢光の特殊の結合検定、特に***
公開公報筒２，６２８，１５８号にお亀ρで記載された
パックグラウンドから識別する信号を特別に検出する一
時的な分割を利用するもの、に有用である。この時分割
されたモード（すなわち、一時的分割）において試料は
断続的な様式で励起され、情報は他の螢光源が衰微しに
時を除いて、長生の螢光標識物がまだ強く発する時、暗
サイクルの間のみ受は入れられる。不連続の励起が・や
ルスレーザーを含み、連続励起ビームを機械的に細断し
、試料を励起ビームにおいて及びから移動する種々の方
法で達成される。さらに不連続の励起は試料による大量
のエネルギーの吸収なしに高い輻射力の使用を可能にし
、サンプルの光劣化の可能性を減少する利点を有する。Once produced as described above, the fluorescently labeled physiologically active species can be used in specific fluorescent binding assays, in particular the packs described in German Offical Publication No. 2,628,158. It is useful for those that utilize temporal division to specifically detect signals that are distinguished from ground. In this time-split mode (i.e., temporal splitting), the sample is excited in an intermittent manner and information is transmitted except when the other fluorescent sources have faded and when the long-lived fluorescent label is still strongly emitting. , acceptance is only accepted during the dark cycle. Discontinuous excitation can be accomplished in a variety of ways, including a lasing laser, mechanically chopping a continuous excitation beam, and moving the sample in and out of the excitation beam. Furthermore, discontinuous excitation allows the use of high radiation powers without absorption of large amounts of energy by the sample, which has the advantage of reducing the possibility of photodegradation of the sample.

ここに記載された特殊の結合試薬が効用を見い出すその
ような螢光の特殊の結合検定技術の例は米国特許第３，
９９８，９４３号、第４，０２０，１５１号、第３，９
３９，３５０号、第４，２２０，４５０号及び第３，９
０１，６５４号において記載されている。Examples of such fluorescent specialized binding assay techniques in which the specialized binding reagents described herein find utility are provided in U.S. Pat.
No. 998,943, No. 4,020,151, No. 3,9
No. 39,350, No. 4,220,450 and No. 3,9
No. 01,654.

特に好ましい螢光的に標識化した特殊の結合試薬は次の
構造のものを含む。Particularly preferred fluorescently labeled specialty binding reagents include those of the following structure.

好ましい実施態様では特殊な結合検定は米国特許第４，
２５８，００１号において記載されているよう々乾式の
分析要素において行々われる。この実施態様ではその要
素は支持体及び高分子のビーズからなる拡散／試薬層及
び所望により表示層を含む。たいていその拡散層は試薬
層から分離している。拡散、試薬及び表示層は所望によ
り高分子ビーズ構造を含む。試薬層の高分子ビーズはそ
れらの表面に吸着された抗体のような受容体を有する。In a preferred embodiment, the specialized binding assay is described in U.S. Pat.
No. 258,001, in a dry analytical element as described in No. 258,001. In this embodiment, the element includes a support and a diffusion/reagent layer consisting of polymeric beads and, optionally, an indicator layer. Usually the diffusion layer is separate from the reagent layer. The diffusion, reagent and display layers optionally include polymeric bead structures. The polymeric beads of the reagent layer have receptors, such as antibodies, adsorbed to their surface.

キレート標識物は特定の反応が試料湿潤の前に起るのを
防ぐ方法で試薬層の上、下又は中に置かれるか又はそれ
は試料と共に又はに伴なって要素上に点滴する。標識化
された配位子アナローブが配位子受容体錯体の形成にお
いて試料中の未知量の配位子と競争するために続いて湿
潤しながら要素を透過することがただ必要である。検定
は存在する遊離した標識化配位子アナローブの量又は結
合された標識化配位子アナローブ受容体の量を螢光測定
することによって行なわれる。The chelating label may be placed on top of, below, or within the reagent layer in a manner that prevents specific reactions from occurring prior to sample wetting, or it may be dripped onto the element with or in conjunction with the sample. It is only necessary for the labeled ligand analog to pass through the element with subsequent wetting in order to compete with the unknown amount of ligand in the sample in the formation of the ligand-acceptor complex. Assays are performed by fluorescence measurement of the amount of free labeled ligand analog present or the amount of bound labeled ligand analog receptor.

以下の実施例により本発明の好ましい実施態様を説明す
るが、本発明をこれらの実施例に限定するものではない
。The following examples illustrate preferred embodiments of the invention, but are not intended to limit the invention to these examples.

例１： ｐＨ９に帰着する硼酸塩緩衝剤を含む水溶液における等
モル量のＴｂＣ４５，６Ｈ２０をＧ、　Ｓｃｈｗａｒｚ
ｅｎｂａｃｈら、　Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｉｍ、　Ａｃｔａ
、　３５＃　１７８５（１９５２）に記載された方法に
よって製造された構造：０■ Ｈ３ を有する化合物と混合することによって錯体を形成した
。３７係の水性のホルムアルデヒド溶液（３５，６、ｌ
ｉ＋、　０．４４モル）を１０〜２０℃テ９０ｍ１のＨ
２Ｏ及び８８ｍ１の濃縮された水性ＮａＯＨ中のｐ−ク
レゾール（２１，６ｇ、０２０モル）及びイミノーゾ酢
酸（５６，０ｇ、０．４２モル）の溶液に満願した。得
られる混合物を６０〜７０℃で２時間加熱し、次いで８
６ｍ１の濃ＨＣ１で中和した。溶剤を真空中で除去し、
残留物を１２００ｍ１のエタノール中において加熱した
。不溶性の物質を濾過によって除去し、溶剤容積を６０
０ｍ１まで減少し冷却した。沈澱した塩をν過によって
除去し、Ｐ液を白色粉末（９９係）として７９．９の２
，６−ピスＣＮ、Ｎ−ビス（カルぎキシメチル）アミノ
メチルクー４−メチルフェノールを与える乾燥度まで蒸
発させた。生成物をエタノールから再結晶化した。等モ
ル量の生成物とＰＬ（９の水性の硼酸塩緩衝剤中のＴｂ
Ｃ／−３・６Ｈ２０を混合することによって錯体を形成
した。その溶液が長波長ＵＶランプ（３６６ｎｍにλｍ
ａｘを有するＵＶＬ　−２１型ブラツク　レイ　ランｆ
）で励起された時あざやかな緑色の発光を示した。Example 1: Equimolar amounts of TbC45,6H20 in an aqueous solution containing a borate buffer resulting in a pH of 9, Schwarz
enbach et al., He1v, Chim, Acta
, 35# 1785 (1952), the complex was formed by mixing with a compound having the structure: 0. 37 aqueous formaldehyde solution (35,6, l
i+, 0.44 mol) in 90 ml of H at 10-20℃
A solution of p-cresol (21.6 g, 0.20 mol) and iminozoacetic acid (56.0 g, 0.42 mol) in 20 and 88 ml of concentrated aqueous NaOH was prepared. The resulting mixture was heated at 60-70°C for 2 hours, then 8
Neutralized with 6 ml of concentrated HCl. Remove the solvent in vacuo,
The residue was heated in 1200ml ethanol. Insoluble material was removed by filtration and the solvent volume was reduced to 60
The volume was reduced to 0 ml and cooled. The precipitated salt was removed by ν filtration, and the P solution was converted into a white powder (99%) in 79.9 part 2.
,6-pisCN,N-bis(cargoxymethyl)aminomethyl was evaporated to dryness to give 4-methylphenol. The product was recrystallized from ethanol. Equimolar amounts of product and PL (Tb in aqueous borate buffer of 9)
The complex was formed by mixing C/-3.6H20. The solution was exposed to a long wavelength UV lamp (λm at 366 nm).
UVL-21 type black ray run f with ax
) showed bright green luminescence when excited.

例２： ９Ｉの水酸化ナトリウムを含む６０ｍ１の水中の９．９
．９　（０，０５モル）のｐ−ヒドロキシベンゾフェノ
ンと１３．７　、ｌｉ’　（０，１モル）のイミノジ酢
酸の攪拌された溶液に８．９．ｌｉ’の３７チ水性ホル
ムアルデヒド溶液をゆっくり添加した。その混合物を攪
拌し、５時間還流し、次いで室温まで冷却し、２Ｎの塩
酸でＰＨ２まで持っていった。形成された固体を収集し
、水で洗浄し、風乾した。その生成物を５００ｍ１の９
０ｑ６エチルアルコールから再結晶化し、５．９．９の
白色から淡紅色の固体を２つの収穫において与えた。Example 2: 9.9 in 60 ml of water containing 9I of sodium hydroxide
．． 9 (0.05 mol) of p-hydroxybenzophenone and 13.7, li' (0.1 mol) of iminodiacetic acid to a stirred solution of 8.9. A solution of 37% of li' in aqueous formaldehyde was added slowly. The mixture was stirred and refluxed for 5 hours, then cooled to room temperature and brought to pH 2 with 2N hydrochloric acid. The solid that formed was collected, washed with water, and air dried. 500ml of the product
Recrystallization from 0q6 ethyl alcohol gave 5.9.9 white to pink solid in two crops.

Ｃ２３Ｈ２４Ｎ２０１ｏ−Ｈ２Ｏに対する分析計算値：
Ｃ、５４，５；Ｈｒ　５．２　；Ｎ　ｒ　５．５実験値
：　Ｃｒ　５４゜５　；Ｉ（、４，８；Ｎ　、　６．１
ＵＶスペクトル（ｐＨ９の硼酸塩緩衝剤）λｍａｘ３２
０ｎｍ、ｇ１．６ＸＩＱ’ 前記化合物とｐＨ９の硼酸塩緩衝剤中のＥ　ｕ　ＣＺ　
ｓ・６Ｈ２０又はＴｂＣ！３・６Ｈ２０との正確に等モ
ルの混合物は長波長紫外線ランプで励起された時鮮かな
赤色（Ｅｕ”３）又は緑色（Ｔｂ　＋　３　）の螢光を
示した。Analytical calculation values for C23H24N201o-H2O:
C, 54,5; Hr 5.2; N r 5.5 Experimental value: Cr 54°5; I(, 4,8; N, 6.1
UV spectrum (borate buffer at pH 9) λmax 32
0 nm, g 1.6XIQ' E u CZ in borate buffer at pH 9 with the above compound
s・6H20 or TbC! Exactly equimolar mixtures with 3.6H20 exhibited bright red (Eu''3) or green (Tb+3) fluorescence when excited with a long wavelength ultraviolet lamp.

前記ユーロピウムキレート溶液からの発光強度をＦａｒ
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ノファランドス啄クトロフルオりメーターにおける濃度
の関数として試験した。データはユーロピウムキレート
におけるｌｏ−５〜１０−’Ｍの濃度の対数の関数とし
ての発光の対数において直線的な減少を示した。λ＝　
３２０　ｔｎで励起されたｐＩ（８，５の硼酸塩緩衝剤
における１０−６Ｍ溶液のＥｕ＋３　錯体に対する螢光
量子収量（φ）はＯ，Ｏ’　０３であった。Ｔｂ＋３に
ついての同様な溶液はφ＝０．１０を有した。水中にお
けるＥｕ＋３及びＴｂ＋３　　に対するこの配位子の結
合定数のｔｏｇｌｏの値はそれぞれ１６．７０±０．１
２Ｍ″″１及び１６７８十０．１１Ｍ−’であった。The emission intensity from the europium chelate solution is Far
Tests were conducted as a function of concentration in a Nofarands chromofluorometer sold by Rand Instrument Company. The data showed a linear decrease in the log of the emission as a function of the log of the concentration from lo-5 to 10-'M in the europium chelate. λ=
The fluorescence quantum yield (φ) for the Eu+3 complex of a 10-6 M solution in a borate buffer of pI (8,5) excited at 320 tn was O,O'03.A similar solution for Tb+3 was φ= The toglo values of the binding constants of this ligand for Eu+3 and Tb+3 in water were 16.70±0.1, respectively.
2M''''1 and 1678 0.11M-'.

例３： ２５ゴのメタノール中における１、６４　！ｊ（０，０
２モル）の３７部水性ホルムアルデヒドの溶液に３．２
２．９（０，０２モル）のジメチルイミノジ酢酸を添加
した。その溶液をロータリーエ・々ボレーターにおいて
減圧下で濃縮した。メタノール（２５ＴＬｌ）をその残
留物に添加し溶液を再び濃縮した。Example 3: 1,64 in 25g of methanol! j(0,0
3.2 mol) in a solution of 37 parts aqueous formaldehyde
2.9 (0.02 mol) of dimethyliminodiacetic acid were added. The solution was concentrated under reduced pressure in a rotary evaporator. Methanol (25 TLl) was added to the residue and the solution was concentrated again.

残留オイル２．６ｆｌ（０，０１モル）の３−ベンゾイ
ル−７−ヒドロキシクマリン、次いテ４　ｍｌのＮ−メ
チルモルホリンを添加した。その混合物を１１５℃で３
時間攪拌しカから加熱し、次いでロータリーエバポレー
ターにおいて減圧下で濃縮した。得られる濃縮オイルを
最小量のＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、乾燥したシリカゲルの
カラムに適用した。2.6 fl (0.01 mol) of 3-benzoyl-7-hydroxycoumarin were added to the residual oil, followed by 4 ml of N-methylmorpholine. The mixture was heated to 115°C for 3
The mixture was stirred and heated for an hour and then concentrated under reduced pressure on a rotary evaporator. The resulting concentrated oil was dissolved in a minimum amount of CH2Cl2 and applied to a dry silica gel column.

そのカラムを１＝４の酢酸エヂル：ＣＨ２Ｃ４２で溶離
した。最初の黄色帯の単一付加物は棄てた。第二番目の
黄色帯を収集した。減圧下での溶剤の除去は１．６９の
望ましい生成物を結晶化を引き起すことができない黄色
オイルとして与えた。The column was eluted with 1=4 ethyl acetate:CH2C42. The first yellow band single adduct was discarded. A second yellow band was collected. Removal of the solvent under reduced pressure gave the desired product of 1.69 as a yellow oil that could not induce crystallization.

２０ｍ１の酢酸中における１、５．！９　（，００２７
％ル）の前記テトラエステルの溶液に０．６．９　（０
，００３モル）の酢酸第二銅−水塩、次いで１０ｍ１の
水を添加した。その混合物を攪拌し窒素下で２時間還流
した。反応を室温まで冷却し、塩酸で約ｐ）Ｉ２までも
っていった。攪拌しながらその混合物を硫化水素ガスで
飽和し、１５分放置せしめた。沈澱した硫化銅を珪藻土
パッドを通しての吸引濾過によって除去した。透明な橙
褐色のＰ液をロータリーエバポレーターにおいて減圧下
で濃縮した。その残留物を２５係の水を含む熱エタノー
ル中に溶解し、次いで最終的に５℃で数時間冷却せしめ
た。固体を収集し、水で洗浄し、真空乾燥して０，３Ｉ
の生成物を与えた。ＵＶスペクトル（ｐｌ−１９の硼酸
緩衝剤）λｍａｘ３９６ｎｍ、ε２７０００゜Ｃ２６Ｈ
２４Ｎ２０１２に対する分析計算値：Ｃ，５６，１；Ｉ
（、４，３；Ｎ　、　　５．０゜ 実験値：Ｃ，５５，６；Ｈ，４，２；Ｎ、４．６゜正確
に等モル量の前記化合物とｐＨ９の硼酸塩緩衝剤におけ
るＦ、ｕ　Ｃ２３・６Ｈ２０は長波長紫外線ランプで励
起された時鮮かが赤色の発光を示した。1,5. in 20 ml of acetic acid. ! 9 (,0027
0.6.9% of the tetraester in a solution of 0.6.9%
,003 mol) of cupric acetate hydrate and then 10 ml of water were added. The mixture was stirred and refluxed under nitrogen for 2 hours. The reaction was cooled to room temperature and brought up to about p)I2 with hydrochloric acid. The mixture was saturated with hydrogen sulfide gas while stirring and allowed to stand for 15 minutes. Precipitated copper sulfide was removed by suction filtration through a pad of diatomaceous earth. The clear orange-brown P solution was concentrated under reduced pressure on a rotary evaporator. The residue was dissolved in hot ethanol containing 25 parts of water and finally cooled to 5° C. for several hours. The solid was collected, washed with water and dried in vacuo to give 0,3I
gave a product of UV spectrum (borate buffer of pl-19) λmax 396nm, ε27000°C26H
Analysis calculation value for 24N2012: C,56,1;I
(,4,3;N,5.0° Experimental value: C,55,6;H,4,2;N,4.6°F in borate buffer at pH 9 with exactly equimolar amounts of said compound. , uC23.6H20 exhibited bright red luminescence when excited with a long wavelength ultraviolet lamp.

前記ユーロピウムキレート溶液からの発光強度をファラ
ンドスペクトロフルオリメーターにおける濃度の関数と
して試験した。そのデータはユーロピウムキレートにお
ける１０〜１０　　Ｍの濃度の関数として発光における
減少を示した。The emission intensity from the europium chelate solution was tested as a function of concentration in a Farrand spectrofluorimeter. The data showed a decrease in luminescence as a function of concentration from 10 to 10 M in europium chelate.

λｍａＸ発光　５９３　ｎｍ　、　　６１４　ｎｍ　、
　　６５２　ｎｍ　。λmax emission 593 nm, 614 nm,
652 nm.

７０１　ｎｍ　、　　５６０〜８００　ｎｍにわたる発
光量子収量＝４．５％ ５１４　ｎｍにおける発光量子収量−３，７係水中にお
けるＥｕ　　及びＴｂ　　とこの配合子の結合定数に対
する＆ｇ１ｏの値はそれぞれ１６．２６±０．２３Ｍ−
１及び１６．３５±０．２１Ｍ−１であった。701 nm, Emission quantum yield over 560-800 nm = 4.5% Emission quantum yield at 514 nm - 3,7 The value of &g1o for the binding constant of this combination with Eu and Tb in suspended water is 16.26 ± 0, respectively .23M-
1 and 16.35±0.21 M−1.

以下余白 例４： ２．４−ジヒドロキシ−３，５−ビス−（Ｎ、Ｎ−ジ（
エトキシカルボニルメチル）−アミノメチル〕ベンズア
ルデヒド の製造 ５０Ｔ／Ｌｌのエタノール中における８、２．９（０，
１モル）の３７’％水性ホルムアルデヒドに１８．１’
（０，１モル）のジエチルイミノジアセテートを添加し
た。その混合物を四−タリーエバポレーターにおいて減
圧下で濃縮した。追加的な５０ｍＪのエタノールを添加
し、混合物を再び乾燥まで濃縮した。得られるオイルに
６．９　、！ｉ’　（０，０５モル）の固体２　、４−
ジヒドロキシベンズアルデヒドを添加した。その混合物
を攪拌し、１２０℃で３時間加熱し、次いで精製せずに
使用した。Below is a blank example 4: 2,4-dihydroxy-3,5-bis-(N,N-di(
Preparation of ethoxycarbonylmethyl)-aminomethyl]benzaldehyde 8,2.9(0,
1 mol) of 37'% aqueous formaldehyde to 18.1'
(0.1 mol) of diethyliminodiacetate was added. The mixture was concentrated under reduced pressure in a four-tally evaporator. An additional 50 mJ of ethanol was added and the mixture was again concentrated to dryness. 6.9 for the resulting oil! i' (0,05 mol) of solid 2,4-
Dihydroxybenzaldehyde was added. The mixture was stirred and heated at 120° C. for 3 hours and then used without purification.

前記をジメチルイミノジアセテートを用いて同じ結果と
共に繰り返した。The above was repeated using dimethyliminodiacetate with the same results.

例５： ３−（４−ニトロベンゾイル）−７−ヒトロキシー６．
８−ビス（Ｎ、Ｎ−ジ（カルがキシメチル）−アミノメ
チルコクマリン の製造 前記例４の粗アルデヒド（０，０５モル）に１１．８５
９（０，０５モル）のエチル４−ニトロベンゾイルアセ
テート、次いで１００ｍ１のエタノールを添加した。１
−のエタノール中における３０〜の酢酸と４２ｍ９のピ
ペリジンの溶液を添加し、その混合物を攪拌し、１６時
間還流した。この時間の後反応生成物をロータリーエバ
ポレーターにおいて濃縮した。得られるオイルを最小量
のＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、シリカダル乾燥カラムに適
用した。そのカラムを１５０：８５０の酢酸エチル：Ｃ
Ｆ２Ｃｌ２で溶離した。最初流れる無色の不純物と第二
番目に流れる暗黄色の不純物を棄てた。Example 5: 3-(4-nitrobenzoyl)-7-hydroxy6.
Preparation of 8-bis(N,N-di(cargoxymethyl)-aminomethylcocoumarin) To the crude aldehyde of Example 4 (0.05 mol) was added 11.85
9 (0.05 mol) of ethyl 4-nitrobenzoyl acetate and then 100 ml of ethanol were added. 1
A solution of 30 to 42 m of piperidine in ethanol was added and the mixture was stirred and refluxed for 16 hours. After this time the reaction product was concentrated on a rotary evaporator. The resulting oil was dissolved in a minimum amount of CH2Cl2 and applied to a silica dal drying column. The column was washed with 150:850 ethyl acetate:C
Eluted with F2Cl2. The first flowing colorless impurity and the second flowing dark yellow impurity were discarded.

より遅く移動する淡黄色生成物帯を収集し、溶剤を減圧
下で除去した。得られるオイルをＮＭＲ及び質量スペク
トルによって分析し直接使用した。収量、１４．３Ｎ。The slower moving pale yellow product band was collected and the solvent was removed under reduced pressure. The resulting oil was analyzed by NMR and mass spectroscopy and used directly. Yield, 14.3N.

７５ｍ１の酢酸中における前記節で形成された２、６７
、ｌＯ，００３７５モル）のテトラエステルに１．０＃
（０，００５モル）の酢酸第一銅−水塩、次いで２５ｍ
７！の水を添加した。その混合物を攪拌し、窒素下で２
時間還流した。反応を室温まで冷却し、塩酸で約Ｐ１１
２までもりていりた。それから過剰の硫化水素ガスを攪
拌された溶液の中へ通過させ、その混合物を３０分放置
せしめた。沈澱した硫化銅を珪藻土・七ッドを通しての
吸引涙過によって除去した。そのν液をロータリーエバ
ポレーターにおいて真空下で乾燥まで濃縮した。残留物
を５０ｍ１の水ですりつぶした。固体を収集し水でよく
洗浄し乾燥した。収量、１．２．！ｉ＋、サンプルを５
０係の熱い水性エタノールに溶解した。その混合物を固
体が形成されるまで減圧下で濃縮した。2,67 formed at the above node in 75ml of acetic acid
, 10,00375 mol) of tetraester
(0,005 mol) of cuprous acetate hydrate, then 25 m
7! of water was added. The mixture was stirred and under nitrogen
Refluxed for an hour. The reaction was cooled to room temperature and diluted with hydrochloric acid to approx.
It went up to 2. Excess hydrogen sulfide gas was then passed into the stirred solution and the mixture was allowed to stand for 30 minutes. The precipitated copper sulfide was removed by suction filtration through diatomaceous earth Sevenad. The ν liquid was concentrated to dryness under vacuum in a rotary evaporator. The residue was triturated with 50 ml of water. The solid was collected, washed well with water and dried. Yield, 1.2. ! i+, sample 5
Dissolved in hot aqueous ethanol. The mixture was concentrated under reduced pressure until a solid formed.

固体を収集し冷水で洗浄し、乾燥した。The solid was collected, washed with cold water, and dried.

Ｃ２６Ｈ２３Ｎ３０，４・Ｈ２Ｏに対する分析計算値：
Ｃ１５０，４；Ｈ、４，１；Ｎ　、　６．８゜実験値：
Ｃ，５０，８；Ｈ，４，１；Ｎ、６．４水性の重炭酸す
）　ＩＪウム溶液における前記キレート剤の触媒的な還
元は相当するアミン化合物を与えた。Analytical calculation values for C26H23N30,4.H2O:
C150,4; H, 4,1; N, 6.8° Experimental value:
C,50,8; H,4,1;N,6.4 Catalytic reduction of the chelating agent in aqueous bicarbonate solution gave the corresponding amine compound.

例６： 前記例３において記載された１０　　Ｍの濃度のユーロ
ピウムキレートを含む素溶液を硼酸塩緩衝剤（ｐＨ８，
５）で表ＩＫ示される濃度まで稀釈した。Example 6: A raw solution containing europium chelate at a concentration of 10 M as described in Example 3 above was added to a borate buffer (pH 8,
5) was diluted to the concentration shown in Table IK.

１０マイクロリツトルの各濃度のアリコートを次の方法
において製造された分析要素上に点滴した。Aliquots of 10 microliters of each concentration were dropped onto analytical elements manufactured in the following manner.

ブリカーブネートフィルム支持体をオパルブミン、カル
ボキシメチルセルロース（０，１９ｇ／ｍ”　）、全溶
融重量に基づいて０．０５係のＺｏｎｙｌ　ＦＳＮ（デ
ーポンから得た非イオン系の螢光界面活性剤）、通常の
家兎の血清（０，８３１／／ｍ２）　、ポリ（ｎ−ブチ
ルアクリレート−ＣＯ−スチレン−ＣＯ−２−アクリル
アミド−２−メチルフロ、ｆンスルホン酸）（重量比７
０：２０：１０）（２，２５ｙ／ｙｎ２）及びｐＨ８，
５０Ｈ３ＢＯ３・Ｋ（４緩衝剤で吸着された、ポリ（ス
チレン−〇〇−メタアクリル酸）（ｆｆｔ量比９８　：
　２　）　（７５，Ｏ、！９／ｍ”　）から々るミクロ
ビーズ層でコートした。The bricarbanate film support was coated with opalbumin, carboxymethyl cellulose (0.19 g/m''), Zonyl FSN (a non-ionic fluorescent surfactant obtained from Depon) at a factor of 0.05 based on total melt weight, typically Rabbit serum (0,831//m2), poly(n-butyl acrylate-CO-styrene-CO-2-acrylamido-2-methylfuro, fsulfonic acid) (weight ratio 7
0:20:10) (2,25y/yn2) and pH 8,
50H3BO3・K(4) Adsorbed with buffer, poly(styrene-〇〇-methacrylic acid) (fft amount ratio 98:
2) Coated with a layer of microbeads from (75,0,!9/m").

それからその要素をＷｒａｔｔａｎ　１８Ａ　　フィル
クーを有するフルオリメーターを使用して、励起３００
−４００　ｎｍ及び発光６２０　ｎｍで、ｐＨ８及びｐ
Ｈ９，１８で評価した。The element was then subjected to an excitation of 300 nm using a fluorimeter with a Wrattan 18A filter.
-400 nm and emission 620 nm, pH 8 and p
Evaluation was made on H9 and H18.

下記表において示された結果は得られた螢光信号がサン
プルにおけるユーロピウムキレートの濃度の関数である
ことを説明している。・々ツクグラウンド螢光は５０　
ｍＶであった。The results shown in the table below illustrate that the fluorescence signal obtained is a function of the concentration of europium chelate in the sample.・Tsuku ground fluorescence is 50
It was mV.

以下余白 表　　■ ”０−７８　　　　　４００−４５０　ｍＶｌｏ−６８
４５００ｍＶ ｌｏ　　　８　　４０　Ｖ １０”−８９，１８６０ｍＶ ｌｏ””　　　　　９．１８　　　　２５０　ｍＶｌｏ
−’　　　　　９．１８　　　　２．Ｉ　Ｖｌｏ−”、
　　　　９・１８　　　　２０　Ｖ例７： 例３において記載されたように製造されたテルビウム化
合物を例６の方法で試験した。その結果ヲ５５０　ｎｍ
で測定されマイクロアンペア（μＡ）で与えられた螢光
を有する表Ｈに示す。Margin table below ■ ”0-78 400-450 mVlo-68
4500mV lo 8 40 V 10"-89, 1860mV lo"" 9.18 250 mVlo
-' 9.18 2. I Vlo-”,
9.18 20 V Example 7: The terbium compound prepared as described in Example 3 was tested in the manner of Example 6. As a result, 550 nm
Table H with the fluorescence measured in microamperes (μA) given in Table H.

表■ Ｔｂキレートの濃度（Ｍ）　　ｐ±　Ｅｍ５５０１ｍに
おける螢光（麩）１０−５８．０　　　　　１１．１ １０”　　　　　８．０　　　　　　１．４１１０”−
７８，００，２７ １０＝　　　　　８．０　　　　　　０．０４１０”　
　　　　８．０　　　　　　０．０５例８： ユーロピウムと３，５−ビス（Ｎ、Ｎ−ビス（カルブキ
シ−メチル）アミノメチル）　＋　４７−（Ｎ′−〔４
−〔４−ヒドロキシ−３，５−シイオドフェノキシ）−
３，５−シイオド−β−メトキシカルツクニル−フェネ
チル〕−チオウレイド）−４−メトキシベンゾフェノン
との錯体。Table ■ Concentration of Tb chelate (M) p± Fluorescence (fu) at Em5501m 10-58.0 11.1 10" 8.0 1.4110"-
78,00,27 10= 8.0 0.0410”
8.0 0.05 Example 8: Europium and 3,5-bis(N,N-bis(carboxy-methyl)aminomethyl) + 47-(N'-[4
-[4-Hydroxy-3,5-cyodophenoxy)-
Complex with 3,5-thiodo-β-methoxycalcunyl-phenethyl]-thioureido)-4-methoxybenzophenone.

キレート剤の製造のための総合図式は次のとおりである
。The overall scheme for the production of chelating agents is as follows.

２ Ｂｒ　　　　ＯＣＨ３Ｂｒ ３ ■ １ ２）闇、Ｔ４０ＣＨ３，Ｅｔ３Ｎ （ここでＮＨ２Ｔ４０ＣＨ３は ０ＣＨ。2 Br OCH3Br 3 ■ 1 2) Darkness, T40CH3, Et3N (Here, NH2T40CH3 is 0CH.

３．５−ツメチル−４−ヒドロキシ−４′−二トロ２５
０ｍＬ（７）ニトロベンゼン中におけるｐ−ニトロベン
ゾイルクロリド（７６，１，、Ｆ、　０．４１．０モル
）の攪拌された溶液に８２．９のＡｔＣ１３（０，６２
モル）を添加した。この混合物に２５０ｍ１のニトロベ
ンゼン中における５０ｇの２，６−シメチルフエノール
（０，４１モル）の溶液を４５分間にわたって満願し、
得られる混合物を室温で１６時間攪拌した。その反応物
を２１の３俤ＨＣ１と氷の中へ注ぎ、（ＣＨ３ＣＨ２）
２０で３×１１の（すなわちｌｌづつのジエチルエーテ
ルで３回）抽出をした。結合されたエーテル層を１１の
飽和Ｎａ　ＨＣＯ３で洗浄し、次いで１０４　ＮａＯＨ
で２×１１の抽出をした。結合された塩基性抽出物を濃
ＨＣ１で酸性にし白色沈澱物を与えた；濾過後ＣＨ３０
ＶＨ２０からの再結晶化により薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）　、ＩＲ，質量スペクトル、ＮＭＲ、及び元
素分析、融点１８２．５〜１、８４．５による所望の生
成物に一致した３７ｇ（３，３，％）の白色粉末を与え
た。3.5-tmethyl-4-hydroxy-4'-nitro 25
To a stirred solution of p-nitrobenzoyl chloride (76,1,,F, 0.41.0 mol) in 0 mL (7) nitrobenzene was added 82.9 of AtC13 (0,62
mol) was added. A solution of 50 g of 2,6-dimethylphenol (0.41 mol) in 250 ml of nitrobenzene was added to this mixture over a period of 45 minutes,
The resulting mixture was stirred at room temperature for 16 hours. Pour the reaction into ice with 3 liters of 21 HC1 (CH3CH2)
Extractions were performed 3×11 (ie, 3 times with 1 liter each of diethyl ether) at 20°C. The combined ether layers were washed with 11 saturated NaHCO3, then 104 NaOH
A 2x11 extraction was performed. The combined basic extracts were acidified with concentrated HCl to give a white precipitate; after filtration CH30
Recrystallization from VH20 yielded 37 g (3,3, %) of white powder.

Ｃ１５Ｈ４３ＮＯ４・Ｈ２０ニ対する分析計算値：ｃ。Analytical calculation value for C15H43NO4・H20: c.

６２．２７；Ｈ，５，２４；Ｎ、４．８４゜実験値：Ｃ
，６２，３４：Ｔ（，５，３］　；Ｎ、４．７６゜２５
０ｍ１のアセトン中において化合物１（１５，０，９，
５５，４ミリモル）、Ｋ２ＣＯ２（２０，ＯＦ％０．１
．４５モル）及ヒｃＨ３Ｉ（３０ｍ１ｓ　０．４８　％
ル）を含む溶液を６時間還流した。その溶剤を蒸発させ
て、残留物をＣＨ２Ｃ４２と水の間で分配した。有機層
をＮａ　２　Ｓ　Ｏ４を通して乾燥Ｌ、沖過し蒸発させ
て黄白色粉末を残した。−２０℃でのＣＨ３０Ｈ／石油
エーテルからの再結晶は１４．９Ｆの白色結晶（９４係
）を与えた。その物質をＮＭＲＳＴＬＣ，質量ス被りト
ル、ＩＲ，及び元素分析、融点１３１〜１３２．５℃に
よって特性づけた。62.27; H, 5,24; N, 4.84° Experimental value: C
,62,34:T(,5,3];N,4.76°25
Compound 1 (15,0,9,
55.4 mmol), K2CO2 (20, OF% 0.1
．． 45 mol) and HcH3I (30mls 0.48%
The solution containing 100 ml of 100 ml was refluxed for 6 hours. The solvent was evaporated and the residue was partitioned between CH2C42 and water. The organic layer was dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated to leave a pale yellow powder. Recrystallization from CH30H/petroleum ether at -20°C gave 14.9F white crystals (factor 94). The material was characterized by NMRSTLC, mass spectrometry, IR, and elemental analysis, melting point 131-132.5°C.

Ｃ１６Ｈ１５ＮＯ４に対する分析計算値：Ｃ，６７，３
５；Ｈ，５，３］、；Ｎ、４．９１゜ 実験値：Ｃ，６７，５４；Ｔ（，５，３８；Ｎ、４．８
７゜以下余白 ３．５−ビスブロモメチル−４−メトキシ−４′−モス
クシニイミド（５，０，！７，２８ミリモル）の混合物
をラジカル開始剤として約５０ｍｇのジベンゾイルペル
オキシドをもった２５０ｍ１のＣＣｌ２においてＮ２下
で１時間還流した。反応物を室温まで冷却し１ｏｏｍｌ
！のＣＨ２Ｃｌ２を添加した。Ｐ退後水性のチオ硫酸す
）　ＩＪウムで炉液を抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４を
通して乾燥し、沖過及び溶剤除去は白色粉末を残した。Analysis calculation value for C16H15NO4: C,67,3
5; H, 5, 3], ; N, 4.91° Experimental value: C, 67, 54; T (, 5, 38; N, 4.8
7° or less margin 3.250 ml of CCl2 with a mixture of 5-bisbromomethyl-4-methoxy-4'-mosuccinimide (5,0,!7,28 mmol) as a radical initiator and about 50 mg of dibenzoyl peroxide. Refluxed for 1 hour under N2. Cool the reaction to room temperature and add 1ooml
! of CH2Cl2 was added. After P withdrawal, the filtrate was extracted with aqueous thiosulfate and the organic layer was dried over Na2SO4, filtered and solvent removed leaving a white powder.

この粉末を（ＣＨ２Ｃ４２）２０テ３×５０ｍ１のすり
つぶしをし、ＴＬＣが３の成分を含むことを示した５、
７．！７の白色粉末を残した。ＮＭＲ及び質量スペクト
ルは不純物の存在を確認したが、物質の大部分は所望の
生成物であった。This powder was ground (CH2C42) 20Te3 x 50ml and TLC showed that it contained the ingredients 3, 5,
7. ! 7 white powder remained. NMR and mass spec confirmed the presence of impurities, but most of the material was the desired product.

化合物性（２゜０，９，４．５ミリモル）とジ−ターシ
ャリ−ブチルイミノジアセテート（２，１，９，０ミリ
モル）の溶液ヲ２００　ｍｌのテトラヒドロフランにお
いて室温で６０時間攪拌した。溶剤を除去し残りの黄色
オイルをＣＨ２Ｃｌ２と高度に精製された水から得られ
た冷水性のに２ＣＯ３との間で分配した。有機層をＮａ
２ＳＯ４を通して乾燥し、ｐ過し蒸発させて４５．９の
黄色オイルを残した。溶離剤としてＣＨ２Ｃ４２を有す
る分取グル透過カラムを出発物質及び岸−付加物から所
望の生成物を分離するために使用した。得られる黄色オ
イル（１，５ｙ１４３係）は結晶化せしめることができ
＆＜、ＴＬＣ。A solution of compound (2.0.9.4.5 mmol) and di-tert-butyliminodiacetate (2.1.9.0 mmol) was stirred in 200 ml of tetrahydrofuran at room temperature for 60 hours. The solvent was removed and the remaining yellow oil was partitioned between CH2Cl2 and cold aqueous CO3 obtained from highly purified water. organic layer with Na
Dry over 2SO4, p filter and evaporate leaving a 45.9 yellow oil. A preparative gel permeation column with CH2C42 as the eluent was used to separate the desired product from the starting material and the adduct. The resulting yellow oil (1,5y143) can be crystallized by TLC.

電界脱着（ｆｉｅｌｄ　ｄｅａｏｒｐｔｉｏｎ　）質量
スにクトル、ＮＭＲｌ及びＩＲによって特性づけな。Field desorption is characterized by mass spectrometry, NMRl and IR.

ニトロテトラエステル±（３，０ｇ、３．９　ミｌＪ％
ル）を５０ｐｓｉの初期の水素圧でＰａｒｒ振とぅ機に
おける１００ｍ９の１．　Ｏ％　Ｐｄ／Ｃを有する５０
ｍＡ！ノＣＨ３０Ｈにおいて２，５時間還元した。ＴＬ
Ｃは定量的な還元を示ｌ−た。その混合物を珪藻土を通
して沖過し蒸発させて黄色のオイルを残し、それは化合
物土用に使用された方法によってダル透過クロマトグラ
フィーにより精製された。このようにして得られた黄色
ガラスは正しいＮＭＲ，ＩＲおよび電界脱着質量スペク
トル挙動を有しな。Nitrotetraester ± (3.0 g, 3.9 milJ%
100 m9 in a Parr shaker at an initial hydrogen pressure of 50 psi. 50 with O% Pd/C
mA! The mixture was reduced in CH30H for 2.5 hours. T.L.
C showed quantitative reduction. The mixture was filtered through diatomaceous earth and evaporated to leave a yellow oil, which was purified by dull permeation chromatography by the method used for compound earth. The yellow glass thus obtained has correct NMR, IR and field desorption mass spectral behavior.

トリエチルアミン（１，２８１ｎ１１９．２ミリモル）
と共にテトラエステルアミンΣ（１，，７，９，２，３
ミリモル〕を４０ｍ１の乾燥テトラヒドロフラン（Ｔ’
ＨＦ　）に溶解し、次いで１０ｍ１の乾燥ＴＨＦ中のチ
オホスケ９ン（０，１７５ｍｌ、　２．３　ミ！Ｊモル
）ｔ−満願した。その反応を２時間進行せしめ、その後
溶剤を除去し、黄橙色オイルを得た。そのオイルを６０
ｍ１の乾ｉＮ、Ｎ−−２メチルボルムアミド（ＤＭＦ　
）に溶解し、２０　ｍｌＤＭＦ中におけるＬ−チロキシ
ンメチルエステルヒドロクロリド（１，９，９，２，３
ミリモル）とトリエチルアミン（０，３２ｍ／。Triethylamine (1,281n119.2 mmol)
and tetraester amine Σ(1,,7,9,2,3
mmol] in 40 ml of dry tetrahydrofuran (T'
HF) and then thiophoskene (0,175 ml, 2.3 mmol) in 10 ml of dry THF. The reaction was allowed to proceed for 2 hours, after which the solvent was removed to yield a yellow-orange oil. 60% of that oil
m1 dry iN, N--2 methylborumamide (DMF
) and L-thyroxine methyl ester hydrochloride (1,9,9,2,3
mmol) and triethylamine (0.32 m/.

２．３ミリモル）の溶液を一部分に添加した。反応物を
Ｎ２下で１時間攪拌し、次いで３５０ｍ１の■■２０に
注いだ。エーテル抽出後エーテル層を引続いて３００ｍ
１分の純水で３回洗浄し、Ｎａ　２　Ｓ　Ｏ４を通して
乾燥し、沖過し、そして蒸発させて３．１ｇの橙白色の
泡を与えた。この物質はグル透過クロマトグラフィーに
よって精製され、橙白色の泡として１．３Ｉの所望の生
成物を与えた。その生成物をさらにＴＬＣｌＮＭＲｌ及
び電界脱着質量スペクトルによって特性づけな。2.3 mmol) was added in one portion. The reaction was stirred under N2 for 1 hour and then poured into 350 ml of ■■20. After the ether extraction, the ether layer was continued for 300 m.
Washed three times with 1 min of pure water, dried over Na 2 SO 4 , filtered and evaporated to give 3.1 g of an orange-white foam. This material was purified by gel permeation chromatography to give 1.3I of the desired product as an orange-white foam. The product was further characterized by TLClNMRl and field desorption mass spectra.

テトラエステル６　（０，５Ｆ、　０．３ミリモル）を
１５ｍ１のＣＦ３ＣＯ２Ｈに溶解し、乾燥管を反応７ラ
スコに結合させて室温で１６時間攪拌した。溶剤を真空
で除去し橙色の泡を残した。ＣＦ２Ｃｌ２による泡のす
りつぶしは定量的な収量の黄橙色粉末を生成した。電界
脱着質量スペクトルはｍ／ｅ（質量／負荷比）１３５０
で親イオンを示し、そのＩＲは生成物と一致している。Tetraester 6 (0.5F, 0.3 mmol) was dissolved in 15 ml of CF3CO2H, a drying tube was attached to the Reaction 7 flask and stirred for 16 hours at room temperature. The solvent was removed in vacuo leaving an orange foam. Trituration of the foam with CF2Cl2 produced a quantitative yield of a yellow-orange powder. The field desorption mass spectrum is m/e (mass/load ratio) 1350
indicates the parent ion, whose IR is consistent with the product.

Ｃ４１Ｈ３８■４Ｎ４０１４Ｓに対する分析計算値：Ｃ
、３６，５；Ｈ，２，８；Ｎｌ　４．１　；Ｓ　、　２
．４゜実験値：Ｃ，３６４；Ｉ（１２，８；Ｎ、３．７
；Ｓ、２．７゜１当量の前記化合物と２尚量のｐＨ８，
５の緩衝剤中のＥ　ｕ　Ｃｌ３・６Ｈ２０は長波長紫外
線下で弱い螢光を示し、独特の朱色発光を与えた。螢光
強度とキレート濃度との間の直線関係はＶａｒｉａｎ　
Ｓ　Ｆ　３３０スペクトロフルオリメーターで１０　と
１０　　Ｍ及びλｅｘ””３２０　ｎｍ　、　　λｅｍ
＝６１４　ｎｍの間で示された。１当量の化合物ヱと２
当量のｐＨ８，５の硼酸塩緩衝剤中のＴｂＣ２３・６Ｈ
２０は長波長紫外線下で強い螢光を示した。このキレー
トはまた螢光強度と１０−５Ｍと５×１０−”Ｍ　の間
のキレート濃度との間に直線関係を有した。Analysis calculation value for C41H38■4N4014S: C
, 36,5; H, 2, 8; Nl 4.1; S, 2
．． 4° Experimental value: C, 364; I (12,8; N, 3.7
;S, 2.7° 1 equivalent of the above compound and 2 equivalents of pH 8,
E u Cl 3 .6H20 in the buffer of No. 5 showed weak fluorescence under long wavelength ultraviolet light and gave a unique vermilion luminescence. The linear relationship between fluorescence intensity and chelate concentration is Varian
10 and 10 M and λex””320 nm, λem on an SF 330 spectrofluorimeter.
=614 nm. 1 equivalent of compound ヱ and 2
TbC23.6H in equivalent pH 8.5 borate buffer
No. 20 showed strong fluorescence under long wavelength ultraviolet light. This chelate also had a linear relationship between fluorescence intensity and chelate concentration between 10@-5 M and 5.times.10@-"M.

交叉反応性は抗体が未標識の抗原と比較していかによく
標識化された抗原を認識するかを反映するものである。Cross-reactivity reflects how well an antibody recognizes labeled antigen compared to unlabeled antigen.

既知の技術によって測定されたような抗原のユーロピウ
ムキレートの交叉反応性は放射性標識化チロキシン及び
チロキシン抗体に対して７５ｑ６であった。The cross-reactivity of the europium chelate of the antigen, as determined by known techniques, was 75q6 with radiolabeled thyroxine and thyroxine antibodies.

例９： ３．５−ビス［Ｎ、Ｎ−ビス（カルボキシメチル）アミ
ノメチルクー４−ヒドロキシ−３′−（４−（４−ヒド
ロキシ−３，５−シイオドフェノキシ）−３，５−シイ
オド−β−エトキシカル？ニルフェネチル〕ベンゾフェ
ノンとユーロピウムの錯体 この例のキレート剤の製造のための総合図は次のとおり
である。Example 9: 3,5-bis[N,N-bis(carboxymethyl)aminomethylcou 4-hydroxy-3'-(4-(4-hydroxy-3,5-shiodophenoxy)-3,5-shiodo -β-Ethoxylic?nylphenethyl]benzophenone and europium complex The general scheme for the preparation of the chelating agent of this example is as follows.

＊ＥＥＤＱ＝１−カルブ５トキシー１−エトキシ−１，
２−ジヒドロキノリン（１６） この化合物を米国特許第３，５３１，４３５号（Ｃｈｅ
ｍ、　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　７４　＋　　４２８３Ｖ（
１９７１）　）に記載された方法によって製造した。１
０ｍ１のテトラクロロエタン中に２６．３．９のアニソ
ール（０，２４モル）と４６．９の３−カルがメトキシ
ベンゾイルクロリド（０，２３モル）を含む溶液を１０
０ｍ１のテトラクロロエタン中の６５．９　ＡｔＣ４３
（０，４９モル）の攪拌された溶液に０℃で１時間にわ
たって流加した。その混合物を室温まで到らせしめ１４
時間攪拌した。それから温度を７５〜８０℃まで上げ、
３２ＩＩのｋｔｃｔ３（０，２４モル）を３０分間にわ
たって添加した。その温度を４５分間保持し、次いでそ
の溶液を氷と６４ｍ１の濃塩酸の混合物の中へ注いだ。*EEDQ=1-carb5toxy-1-ethoxy-1,
2-Dihydroquinoline (16) This compound was described in US Pat. No. 3,531,435 (Che
m, Abstracts 74 + 4283V (
1971)). 1
A solution containing 26.3.9 of anisole (0.24 mol) and 46.9 of 3-cal methoxybenzoyl chloride (0.23 mol) in 0 ml of tetrachloroethane
65.9 AtC43 in 0ml of tetrachloroethane
(0.49 mol) at 0° C. over 1 hour. Let the mixture reach room temperature14
Stir for hours. Then increase the temperature to 75-80℃,
32II of ktct3 (0.24 mol) was added over 30 minutes. The temperature was maintained for 45 minutes and then the solution was poured into a mixture of ice and 64 ml of concentrated hydrochloric acid.

下部の相を除去し水洗した。テトラクロロエタンを水蒸
気蒸留によって除去し、固体褐色の残留物を残し、それ
を収集しテトラヒドロフラン及びトルエンから再結晶化
した。この中間体と水性ＮａＯＨとのケン化は酸性化後
白色粉末（１６，５Ｆ、２９係）：ｍｐ２４０〜２４１
℃（１１ｔ、２４０〜２４１℃）として所望の生成物を
与えた。The lower phase was removed and washed with water. Tetrachloroethane was removed by steam distillation, leaving a solid brown residue that was collected and recrystallized from tetrahydrofuran and toluene. After saponification of this intermediate with aqueous NaOH, white powder (16,5F, section 29): mp240-241
(11t, 240-241°C) to give the desired product.

Ｃ１４Ｈ１ｏＯ４に対する分析計算値：ｃ、６９．４；
Ｈ，４，２゜ 実験値：Ｃ，６９，５；Ｈ，４，４゜ ５０ｍ１のイソブチルアルコール中における５、２２．
９　（０，０６モル）のモルホリンと１．８ｇ（０，０
６モル）のｉ＋ラホルムアルデヒドの混合物を窒素下で
透明な溶液が得られるまで還流した。Analytical calculation for C14H1oO4: c, 69.4;
H,4,2° Experimental value: C,69,5; H,4,4°5,22.
9 (0.06 mol) of morpholine and 1.8 g (0.0
A mixture of 6 mol) of i+la formaldehyde was refluxed under nitrogen until a clear solution was obtained.

この溶液に４．８　Ｆ　（（１０２モル）の３−カル？
キシー４′−ヒドロキシベンゾフェノン（ｉ６）を添加
し、還流を３時間続けた。その溶液を減圧蒸留し、ゴム
状残留物をエーテルで数回攪拌し、精製されていない９
５９の固体を与えた。This solution contains 4.8 F ((102 mol) of 3-cal?
X-4'-hydroxybenzophenone (i6) was added and reflux was continued for 3 hours. The solution was distilled under reduced pressure, the gummy residue was stirred several times with ether, and the purified 9
Yielded 59 solids.

９．５９の１１及び７５ｍ１の無水酢酸の混合物を２４
時間還流し、過剰の無水酢酸を真空下で除去した。残留
物を水で攪拌し、固体を収集し乾燥した；収量８．５ｇ
の薄層クロマトグラフィー（シリカダル；塩化メチ１７
９１％メタノール）は１８の中に存在する約１０係のよ
り速く移動するモノアセトキシメチル誘導体を示す。9. A mixture of 11 of 59 and 75 ml of acetic anhydride was added to 24
After refluxing for an hour, excess acetic anhydride was removed under vacuum. The residue was stirred with water and the solid was collected and dried; yield 8.5 g.
Thin layer chromatography (silica dal; Methyl chloride 17
91% methanol) represents about 10 times the faster migrating monoacetoxymethyl derivative present in 18.

、酢酸中における２ｇの１８．２０ｍ１の塩化メチレン
及び５ｍｌの３１係臭化水素酸の溶液を一昼夜攪拌し、
３ｍｌの無水酢酸を添加し、その溶液を乾燥まで蒸発さ
せた。その残留物を５ｔｉｌｌの方法（Ｗ、Ｃ，５ｔｉ
ｌｌ、　Ｍ、Ｋａｈｎ＆Ａ、Ｍｉｔｒａ、　Ｊ　Ｏｒｇ
Ｃｈｅｍ、４３．２９２３　（１９７８））を用いて１
：１ノＣＨ３ＣＯ２Ｃ２Ｈ５／ｃＨ２Ｃｔ２テ溶離すル
シリカクル上でクロマトグラフし、ＮＭＲによって測定
された０５６ｇの精製した１９を力えた。, a solution of 2 g of 18.20 ml of methylene chloride and 5 ml of 31 hydrobromic acid in acetic acid was stirred overnight,
3ml of acetic anhydride was added and the solution was evaporated to dryness. The residue was prepared using the method of 5till (W,C,5ti
ll, M., Kahn & A., Mitra, J.Org.
Chem, 43.2923 (1978))
056 g of purified 19 was chromatographed on a silica column eluting with: 1 NO CH3CO2C2H5/cH2Ct2 and determined by NMR.

１５ｍ１の乾燥テトラヒドロフラン中における４　６０
７！（１，０７ミリモル）の１９，５２１１％’（２，
１４ミリモル〕のｔ−ブチルイミノジアセテート、及び
２１６ｍ９Ｃ２，１４ミリモル）のトリエチルアミンの
溶液をアルゴン下で２日間攪拌した。460 in 15ml dry tetrahydrofuran
7! (1,07 mmol) 19,5211%'(2,
A solution of t-butyliminodiacetate (14 mmol) and triethylamine (216m9C2, 14 mmol) was stirred for 2 days under argon.

その反応混合物を濾過し、トリエチルアミンヒドロプロ
ミドを除去した。Ｐ液を乾燥まで蒸発させ、９００ηの
２０を与えた。The reaction mixture was filtered to remove triethylamine hydropromide. The P solution was evaporated to dryness giving 900 η of 20.

以下余白 ４−アセトキシ−３，５−ビスＣＮ’、Ｎ−ビス（２１
） ２０ｍｌの乾燥テトラヒドロフラン中における９００ｍ
９の２０と０．２６５！９（１−，０７ミリモル）の１
−カルブエトキシ−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキ
ノリン（ＥＥＤＱ　）の混合物を３０分間攪拌し、０．
８５　Ｆ　（１，，０７ミリモル）のチロキシンのメチ
ルエステルを添加した。その混合物を一昼夜攪拌した。The following margins are 4-acetoxy-3,5-bisCN', N-bis(21
) 900 m in 20 ml dry tetrahydrofuran
20 of 9 and 1 of 0.265!9 (1-,07 mmol)
The mixture of -carbuethoxy-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline (EEDQ) was stirred for 30 minutes and 0.
85 F (1,07 mmol) of thyroxine methyl ester was added. The mixture was stirred overnight.

その反応混合物を溶剤としてテトラヒドロフランを使用
するダル透過クロマトグラフイーによって精製し、構造
２１に一致したＮＭＲス波ク波層トルした６３０ｍｇの
物質を与えた。The reaction mixture was purified by dull permeation chromatography using tetrahydrofuran as the solvent to give 630 mg of material with NMR spectra consistent with structure 21.

ネチル〕ベンゾフェノン（２２） ５ｍｌのトリフルオロ酢酸中における６３０ｍｇの２１
の溶液を一昼夜攪拌し次いで水で稀釈した。Netyl]benzophenone (22) 630 mg of 21 in 5 ml of trifluoroacetic acid
The solution was stirred overnight and then diluted with water.

分離された固体を収集し乾燥した；収量５５０ｍｇ。The separated solid was collected and dried; yield 550 mg.

電界脱着質量スペクトルは２２　（ｍ／ｅ　１３０５　
）が存在すること、捷タチロキシンのメチルエステルが
酸に加水分解されるある種の物質を示した。The field desorption mass spectrum is 22 (m/e 1305
), the methyl ester of tathyroxine was shown to be a type of substance that can be hydrolyzed to acid.

１当量の２２に加えｆ？：、２当量のＥｕ　Ｃｔ３’　
６Ｈ２０はＰＨ８，５の硼酸塩緩衝剤に溶解し長波長紫
外線下に試験された時適度に螢光を示した。キレート濃
度に対する螢光強度の直線プロットがこの化合物に対し
て１０−５と１０−’Ｍの間で形成された。すべての螢
光測定をＶａｒｉａｎ　Ｓ　Ｆ　３３０ス被クトロフル
オリメーターで行なった。1 equivalent of 22 plus f? :, 2 equivalents of Eu Ct3'
6H20 was moderately fluorescent when dissolved in borate buffer at pH 8.5 and tested under long wavelength ultraviolet light. A linear plot of fluorescence intensity versus chelate concentration was generated for this compound between 10-5 and 10-'M. All fluorescence measurements were performed on a Varian SF 330 fluorometer.

２２のユーロピウムキレートは放射性標識化チロキシン
及びチロキシン抗体に対して８０係の交叉反応性を有し
た。The 22 europium chelates had a cross-reactivity of 80 to radiolabeled thyroxine and thyroxine antibodies.

例１０〜１６ 次のキレート剤とのユーロピウム及びテルビウム錯体を
硼酸塩緩衝剤中のＥ　ｕ　Ｃｌ−３・６Ｈ２０及びＴｂ
Ｃｌ３・６Ｈ２０を用いて例９のように製造した：０ｌ
−１ （６５） − ｃＱ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
Ｑロ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ロベ
　　　　　　　　　　　　　　　　汽ｎ口 （６６） 例１０〜１６の錯体は螢光を示し、コントロールＡ、Ｂ
及びＣのそれは螢光を示さなかった。コントロールＡ、
Ｂ及びＣの錯体をさらにグリシンアセテート緩衝剤、燐
酸塩緩衝剤及び重炭酸ナトリウム緩衝剤において試験し
、ＥｕＣ４３・６Ｈ２０又はＴｂＣ１，・６Ｈ２０のい
ずれでも螢光を示さなかった。Examples 10-16 Europium and terbium complexes with the following chelating agents: EuCl-3.6H20 and Tb in borate buffers
Prepared as in Example 9 using Cl3.6H20: 0l
−1 (65) −cQ
Qlo Robe Steam n Mouth (66) The complexes of Examples 10 to 16 exhibited fluorescence, Controls A and B
and that of C showed no fluorescence. control A,
Complexes of B and C were further tested in glycine acetate, phosphate, and sodium bicarbonate buffers and showed no fluorescence with either EuC43.6H20 or TbC1.6H20.

特許出願人 イーストマンコダック　カン、ｆニー 特許出願代理人 弁理士　　青　木　　　朗 弁理士　西舘和之 弁理士　内田幸男 弁理士　　山　口　昭　之 （６７）patent applicant Eastman Kodak kung, f-knee patent application agent Patent attorney Akira Aoki Patent Attorney Kazuyuki Nishitate Patent attorney Yukio Uchida Patent attorney Akira Yamaguchi (67)

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １、　ランタニド金属とキレート剤の螢光キレートであ
って、キレート剤はランタニド金属のそれより大きい三
重項エネルギーを有する三重項増感剤である核及び少な
くとも２つのへテロ原子含有基及び三重項増感剤核の中
にあるか又はに結合している第三のへテロ原子含有基又
はペテロ原子を含み、前記２つのへテロ原子含有基の各
々が三重項増感剤核の別の炭素原子に結合され、それら
のへテロ原子含有基はそれらと前記第三のへテロ原子又
はペテロ原子含有基がランタニド金属とキレート構造を
形成するようにキレート剤の中に位置する螢光キレート
。1. A fluorescent chelate of a lanthanide metal and a chelating agent, the chelating agent comprising a nucleus that is a triplet sensitizer with a triplet energy greater than that of the lanthanide metal and at least two heteroatom-containing groups and a triplet sensitizer. a third heteroatom-containing group or petroatom in or attached to the sensitizer nucleus, each of said two heteroatom-containing groups being another carbon atom of the triplet sensitizer nucleus; and the heteroatom-containing groups are located in the chelating agent such that they and said third heteroatom or peteroatom-containing group form a chelate structure with the lanthanide metal.
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