JPS586477B2 - 乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量用剤及び分別定量法 - Google Patents
乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量用剤及び分別定量法Info
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- JPS586477B2 JPS586477B2 JP53082979A JP8297978A JPS586477B2 JP S586477 B2 JPS586477 B2 JP S586477B2 JP 53082979 A JP53082979 A JP 53082979A JP 8297978 A JP8297978 A JP 8297978A JP S586477 B2 JPS586477 B2 JP S586477B2
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- ldh
- lactate dehydrogenase
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- isozyme
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は化合物1,6−ジヒドロニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドの利用に関するものである。
ンジヌクレオチドの利用に関するものである。
一般に、乳酸脱水素酵素(以下LDHと略称する)はピ
ルビン酸と乳酸の可逆反応を行う酵素でニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド(以下NADと略称する)を補
酵素として反応するものとして知られている。
ルビン酸と乳酸の可逆反応を行う酵素でニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド(以下NADと略称する)を補
酵素として反応するものとして知られている。
このLDHが人間体内にあって、健康な正常人の血清中
にはごく少量存在するだけであるが、悪性腫瘍、心筋硬
塞、肝炎などで著しく上昇し、また各種疾患の悪化、好
転などに伴って特徴的に変化するので、LDHの活性測
定は疾患の経過観察や、治療効果の判定に大いに役立っ
ているのである。
にはごく少量存在するだけであるが、悪性腫瘍、心筋硬
塞、肝炎などで著しく上昇し、また各種疾患の悪化、好
転などに伴って特徴的に変化するので、LDHの活性測
定は疾患の経過観察や、治療効果の判定に大いに役立っ
ているのである。
更に、人間のLDHにはH型(心筋型)およびM型(骨
格筋型)の2種の酵素(サブユニット)があり、通善の
状態ではこのサブユニットの4量体として存在する。
格筋型)の2種の酵素(サブユニット)があり、通善の
状態ではこのサブユニットの4量体として存在する。
サブユニットが2種類あるので4量体を作る組合わせは
5種類あり、これら5種類がLDHのアイソザイムとし
て存在している。
5種類あり、これら5種類がLDHのアイソザイムとし
て存在している。
血清中のLDHが上昇するのは疾患のある臓器からLD
Hが溶出されるためであり、肝炎の場合に血清中に溶出
するLDHは肝臓起源のM型アイソザイムが大部分を占
め、心筋硬塞の場合は心臓起源のH型アイソザイムが大
部分を占める。
Hが溶出されるためであり、肝炎の場合に血清中に溶出
するLDHは肝臓起源のM型アイソザイムが大部分を占
め、心筋硬塞の場合は心臓起源のH型アイソザイムが大
部分を占める。
従って血清中に溶出されるLDHのアイソザイムを電気
泳動等によって分別定量することにより、疾患のある臓
器を推定することができる。
泳動等によって分別定量することにより、疾患のある臓
器を推定することができる。
このようにLDHの活性測定は臨床診断に多用されるに
至っているが、従来の一般的LDH活性測定は、ピルビ
ン酸を基質とし、還元型NADを補酵素として、これら
を単に血清中に添加し、還元型NADの減少量を340
nmで測定して、LDHの全活性を測定していたに過ぎ
ない。
至っているが、従来の一般的LDH活性測定は、ピルビ
ン酸を基質とし、還元型NADを補酵素として、これら
を単に血清中に添加し、還元型NADの減少量を340
nmで測定して、LDHの全活性を測定していたに過ぎ
ない。
この方法では単にLDHの活性が高いか、低いかが測定
できるだけ、換言すれば、体のどこかに疾患があること
が予測できるだけで、体内のどの臓器に疾患があるかを
適確に知ることはできなかった。
できるだけ、換言すれば、体のどこかに疾患があること
が予測できるだけで、体内のどの臓器に疾患があるかを
適確に知ることはできなかった。
電気泳動法によってLDHのアイソザイムを分別定量し
、疾患のある臓器を知ることはできるが、この電気泳動
法はきわめて繁雑な手法により、長時間を必要とする等
の欠点があり、以前から簡便な測定法が望まれていた。
、疾患のある臓器を知ることはできるが、この電気泳動
法はきわめて繁雑な手法により、長時間を必要とする等
の欠点があり、以前から簡便な測定法が望まれていた。
本発明者らは、先にLDHアイソザイムの簡易な分別定
量法を求めて研究した結果、LDHの活性阻害物質を微
量添加して反応させれば、LDHは各アイソザイムによ
って活性阻害度が少しづつ異なり、この現象を利用する
ことによって各種の疾患を簡便に推定することが出来る
ことを見い出した。
量法を求めて研究した結果、LDHの活性阻害物質を微
量添加して反応させれば、LDHは各アイソザイムによ
って活性阻害度が少しづつ異なり、この現象を利用する
ことによって各種の疾患を簡便に推定することが出来る
ことを見い出した。
しかしこの現象を更に詳細に検討したところ、LDHの
活性阻害物質は一つの物質ではなく、二つの物質以上で
あり之等の阻害物質含量の変化によって阻害度の異なる
ことが分った。
活性阻害物質は一つの物質ではなく、二つの物質以上で
あり之等の阻害物質含量の変化によって阻害度の異なる
ことが分った。
本発明者らは、これらLDH活性阻害物質のなかからL
DHアイソザイム分別定量に最も有効な物質を単一物質
として単離し、次の式で示される化合物1,6−ジヒド
ロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであることを
確認し、本発明を完成するに至った。
DHアイソザイム分別定量に最も有効な物質を単一物質
として単離し、次の式で示される化合物1,6−ジヒド
ロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドであることを
確認し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は1,6−ジヒドロニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド(以下1,6−DHNADと略称する
)を単一物質としてLDHアイソザイム分別定量に使用
するとき、LDHアイソザイムに対して全く安定した一
定の阻害を示し、すぐれたLDHアイソザイム分別定量
法を完成するに至った。
ンジヌクレオチド(以下1,6−DHNADと略称する
)を単一物質としてLDHアイソザイム分別定量に使用
するとき、LDHアイソザイムに対して全く安定した一
定の阻害を示し、すぐれたLDHアイソザイム分別定量
法を完成するに至った。
この定量用剤は、ピルビン酸を基質とするLDH活性測
定に際し使用され、試料は1,6一DHNADにより阻
害を受けた状態のLDH活性を知り、一方1.6−DH
NADを含まない還元型NADのみで測定したLDHの
全活性を知り、両者の比を求めれば予めアイソザイムの
阻害度を求めておいた標準値と対比することによって、
試料中のアイソザイムを簡便に分別定量できることにな
る。
定に際し使用され、試料は1,6一DHNADにより阻
害を受けた状態のLDH活性を知り、一方1.6−DH
NADを含まない還元型NADのみで測定したLDHの
全活性を知り、両者の比を求めれば予めアイソザイムの
阻害度を求めておいた標準値と対比することによって、
試料中のアイソザイムを簡便に分別定量できることにな
る。
更に詳細に分別定量法を説明する。
LDHアイソザイムの混在するサンプルについて種々の
活性因子を次の表のように表記することにする。
活性因子を次の表のように表記することにする。
すなわちAH,AM,Aは活性測定の際に上記1,6−
DHNADを含有しない通常の反応液を用いた場合の活
性を表わし、A’H,A’M,A’はそれぞれ一定量の
上記1,6−DHNADを反応液中に共存させた場合の
LDH活性を表わす。
DHNADを含有しない通常の反応液を用いた場合の活
性を表わし、A’H,A’M,A’はそれぞれ一定量の
上記1,6−DHNADを反応液中に共存させた場合の
LDH活性を表わす。
また RH=AH/A
RM=AM/A
P =A’/A
PH=A’H/AH
PM=A’M/AMとすると、
PとRHの間に次のような関係が成立する。
R=A’/A
=(A’H+A’M)/A
−(PHAH+PMAM)/A
一PHRH+PMRM
=PHRH+PM−PMRH
一(PH−PM)RH+PM・・・・・・(I)一式こ
の関係は、第2図のノモグラフに示すように縦軸にPを
とり、横軸にRHをとるとP軸切片がPMで勾配が(P
H−PM)の直線で表わされる。
の関係は、第2図のノモグラフに示すように縦軸にPを
とり、横軸にRHをとるとP軸切片がPMで勾配が(P
H−PM)の直線で表わされる。
Pは1,6−DHNADを一定量添加した場合の活性比
であり、RHは全LDH活性中に占めるH型LDHの活
性である。
であり、RHは全LDH活性中に占めるH型LDHの活
性である。
これにより、活性阻害物質を含有しない反応液(反応液
1)及びある一定濃度の1,6−DHNADを含む反応
液(反応液2)と、あらかじめアイソザイムの組成のわ
かっている二種のLDHサンプルとを用いて標準線を作
る一方、同様の方法で未知のLDHサンプルを測定し、
得られた活性比P(A’/A)を標準線にあてはめれば
、そのアイソザイム組成を分別定量することができる。
1)及びある一定濃度の1,6−DHNADを含む反応
液(反応液2)と、あらかじめアイソザイムの組成のわ
かっている二種のLDHサンプルとを用いて標準線を作
る一方、同様の方法で未知のLDHサンプルを測定し、
得られた活性比P(A’/A)を標準線にあてはめれば
、そのアイソザイム組成を分別定量することができる。
本発明のLDHアイソザイム分別定量法は阻害剤として
単一物質である1,6−DHNADのみを含有している
ために、他の阻害性混在物による阻害干渉を全く受ける
ことがなく、その定量値は信頼度のきわめて高いものと
なる。
単一物質である1,6−DHNADのみを含有している
ために、他の阻害性混在物による阻害干渉を全く受ける
ことがなく、その定量値は信頼度のきわめて高いものと
なる。
本発明の1 ,6−DHNADはNAD+をボロハイド
ライドによる化学的な還元あるいは還元型NADをアル
カリ性溶液中に2〜3週閘放置すると、かなりの量の1
.6−DHNADが生成するので、この溶液中のNAD
Hのみを酵素的に酸化後,DEAE−セルロースカラム
クロマトグラフイーに通して吸着させ、これを緩衝液で
洗滌し、酢酸ソーダ溶液によって溶離する等の方法によ
って得ることができる。
ライドによる化学的な還元あるいは還元型NADをアル
カリ性溶液中に2〜3週閘放置すると、かなりの量の1
.6−DHNADが生成するので、この溶液中のNAD
Hのみを酵素的に酸化後,DEAE−セルロースカラム
クロマトグラフイーに通して吸着させ、これを緩衝液で
洗滌し、酢酸ソーダ溶液によって溶離する等の方法によ
って得ることができる。
次に本発明の試験例及び実施例を示す。
試験例 1
0.05Mリン酸緩衝液(pH7.5 )に0.8mM
ピルビン酸ナトリウム0.2mM還元型NADを添加し
た反応液に上記の方法で得た1,6−DHNADO.1
4,0.81,0.90,1.20,4.80,7.6
μg/mlの濃度にそれぞれ添加し、各反応液を調整し
た。
ピルビン酸ナトリウム0.2mM還元型NADを添加し
た反応液に上記の方法で得た1,6−DHNADO.1
4,0.81,0.90,1.20,4.80,7.6
μg/mlの濃度にそれぞれ添加し、各反応液を調整し
た。
これに対して全心臓型LDH溶液と全筋肉型LDH溶液
を用意し、上記反応液をそれぞれ反応させ、それぞれの
LDHアイソエンザイムに対して阻害度の差の大きい1
,6−DHNADの濃度となるかを試験した。
を用意し、上記反応液をそれぞれ反応させ、それぞれの
LDHアイソエンザイムに対して阻害度の差の大きい1
,6−DHNADの濃度となるかを試験した。
LDHの活性は還元型NADが340nmで吸収があり
、酸化型NADが吸収がなくなるので、その差によって
残存活性を求めた。
、酸化型NADが吸収がなくなるので、その差によって
残存活性を求めた。
その結果は次の表に示されるが、阻害度の差は阻害剤/
還元型NAD=1/500〜1/20の範囲が望ましく
特に1/250〜1/32の範囲の濃度に混合されたL
DHアイソザイム分別定量用剤が最適であることが分る
。
還元型NAD=1/500〜1/20の範囲が望ましく
特に1/250〜1/32の範囲の濃度に混合されたL
DHアイソザイム分別定量用剤が最適であることが分る
。
試験例 2
0.05Mリン酸緩衝液(pH7.5)に0.8mMピ
ルビン酸ナトリウム、0.2mM還元型NAD,その1
/250の1,6−DHNADを混合し反応液とした。
ルビン酸ナトリウム、0.2mM還元型NAD,その1
/250の1,6−DHNADを混合し反応液とした。
これに対して、心臓型LDHと筋肉型LDHを変量組合
せて試料を作り、これを反応液で処理し、各組合せでど
のような阻害が現れるかをみた。
せて試料を作り、これを反応液で処理し、各組合せでど
のような阻害が現れるかをみた。
その結果は次の表に示されるが、本発明の分別定量用剤
は心臓型二筋肉型の組成を明確に定量できることが明ら
かである。
は心臓型二筋肉型の組成を明確に定量できることが明ら
かである。
実施例 1
(I) 還元型NADを20%水溶液としこれに1/
10N NaOH を添加し、pH12としこの溶液
を室温で3週間放置した。
10N NaOH を添加し、pH12としこの溶液
を室温で3週間放置した。
上記反応液中のNADHのみをADHとアセトアルデヒ
ドを用いてNAD+に酸化後10mMトリス酢酸バツフ
ァーで緩衝化したDEAEセルロースカラムに吸着させ
、同バッファーで洗滌し0〜0.2Mの酢酸ソーダ濃度
勾配溶出を行い、フラクションNo.50〜56に阻害
剤リッチな部分を得た。
ドを用いてNAD+に酸化後10mMトリス酢酸バツフ
ァーで緩衝化したDEAEセルロースカラムに吸着させ
、同バッファーで洗滌し0〜0.2Mの酢酸ソーダ濃度
勾配溶出を行い、フラクションNo.50〜56に阻害
剤リッチな部分を得た。
ここに得られた1 ,6−DHNADのNMRスペクト
ラムは第1図に示す通りである。
ラムは第1図に示す通りである。
(■)次に還元型NADに対し、その1/125の1,
6−DHNADを添加しLDHアイソザイム分別定量用
剤とした。
6−DHNADを添加しLDHアイソザイム分別定量用
剤とした。
実施例 2
サンプルとして精製された豚LDH1(サブユニニット
:HHHH)(ベーリンガー社製)、豚LDH5 (サ
ブユニット:MMMM)(ベーリン.ガー社製)及びこ
れらを次の表のような比率で混合したものを用いた。
:HHHH)(ベーリンガー社製)、豚LDH5 (サ
ブユニット:MMMM)(ベーリン.ガー社製)及びこ
れらを次の表のような比率で混合したものを用いた。
反応液は0.05Mリン酸緩衝液(pH7.5),1m
M EDTA,0.16mM NADH及び0.3
mMピルビン酸ナトリウムを含む反応液(反応液1)お
よび反応液1に1,6−DHNADを2.6μg/ml
添加したもの(反応液2)を用いた。
M EDTA,0.16mM NADH及び0.3
mMピルビン酸ナトリウムを含む反応液(反応液1)お
よび反応液1に1,6−DHNADを2.6μg/ml
添加したもの(反応液2)を用いた。
前記反応液それぞれ3mlに対し、上の表に示すような
酵素標品(蛋白100μg/ml)を5μl加え、25
℃で反応を開始し、340nmの吸収の減少を分光々度
計により測定した。
酵素標品(蛋白100μg/ml)を5μl加え、25
℃で反応を開始し、340nmの吸収の減少を分光々度
計により測定した。
結果を第3図の白丸で示す。
これは豚LDH1(H型100%)及び豚LDH5(M
型100%)とから(I)式によって求めたノモグラフ
(図中の直線)とよく一致した。
型100%)とから(I)式によって求めたノモグラフ
(図中の直線)とよく一致した。
第1図は1 ,6−DHNADのNMRスペクトルで第
2図はLDH活性阻害度から心臓型アイソザイムの分率
を求めるノモグラフである。 第3図はアイソザイム組成の既知の種々のサンプルに1
,6−DHNADを作用させた時と作用させない時の活
性比Pを求め、心臓型アインザイムの分率に対してプロ
ットしたグラフである。
2図はLDH活性阻害度から心臓型アイソザイムの分率
を求めるノモグラフである。 第3図はアイソザイム組成の既知の種々のサンプルに1
,6−DHNADを作用させた時と作用させない時の活
性比Pを求め、心臓型アインザイムの分率に対してプロ
ットしたグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 1,6−ジヒドロニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドを含有する乳酸脱水素酵素アイソザイム分別定量用剤
。 2 ピルビン酸を基質とし、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドを補酵素とする乳酸脱水素酵素活性
の測定において、1,6−ジヒドロニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドを共存して測定した乳酸脱水素酵素
活性と、否共存で測定した乳酸脱水素酵素活性との比を
求めることを特徴とする乳酸脱水素酵素アイソザイムの
分別定量法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP53082979A JPS586477B2 (ja) | 1978-07-10 | 1978-07-10 | 乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量用剤及び分別定量法 |
US06/054,416 US4258131A (en) | 1978-07-10 | 1979-07-03 | Method of fractional quantitative determination of isoenzyme of lactic dehydrogenase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP53082979A JPS586477B2 (ja) | 1978-07-10 | 1978-07-10 | 乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量用剤及び分別定量法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS559763A JPS559763A (en) | 1980-01-23 |
JPS586477B2 true JPS586477B2 (ja) | 1983-02-04 |
Family
ID=13789324
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP53082979A Expired JPS586477B2 (ja) | 1978-07-10 | 1978-07-10 | 乳酸脱水素酵素アイソザイムの分別定量用剤及び分別定量法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4258131A (ja) |
JP (1) | JPS586477B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6149338U (ja) * | 1984-09-04 | 1986-04-02 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5982398A (ja) * | 1982-11-01 | 1984-05-12 | Toyobo Co Ltd | 補酵素の安定化法 |
US4558007A (en) * | 1983-06-17 | 1985-12-10 | Health Research, Inc. (Roswell Park Divison) | Process for detecting LDHk isozyme activity in human serum for use as a diagnostic aid and for monitoring response to cancer therapy |
US4654301A (en) * | 1983-06-17 | 1987-03-31 | Health Research, Inc. (Roswell Park Division) | Process for detecting LDHk isozyme activity in human serum for use as a diagnostic aid and for monitoring response to cancer therapy |
US5364765A (en) * | 1987-05-28 | 1994-11-15 | Abbott William A | Method and reagent system for assaying isoenzyme profiles |
US5158873A (en) * | 1987-05-28 | 1992-10-27 | Abbott Laboratories | Method and reagent for determining LD-1 isoenzyme |
US20030228621A1 (en) * | 2002-05-24 | 2003-12-11 | Yong Qin | Common ligand universal enzyme assay and compositions for use therein |
WO2006065967A2 (en) * | 2004-12-15 | 2006-06-22 | General Atomics | Allosteric enzyme coupled immunoassay (aecia) |
CN114381494B (zh) * | 2021-12-01 | 2023-12-22 | 天津中成佳益生物科技有限公司 | 一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂及检测方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4003975A (en) * | 1975-12-08 | 1977-01-18 | Union Carbide Corporation | Solvent extraction of copper values using dihydroxy azoarenes |
US4006061A (en) * | 1975-12-29 | 1977-02-01 | Monsanto Company | Lactate dehydrogenase determination method |
US4080263A (en) * | 1976-08-11 | 1978-03-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the rapid quantitative determination of lactate or alanine |
-
1978
- 1978-07-10 JP JP53082979A patent/JPS586477B2/ja not_active Expired
-
1979
- 1979-07-03 US US06/054,416 patent/US4258131A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6149338U (ja) * | 1984-09-04 | 1986-04-02 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS559763A (en) | 1980-01-23 |
US4258131A (en) | 1981-03-24 |
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