JPS585191A - Purification of kallikrein - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To purify the titled substance simply in high yield, by treating a solution of raw kallikrein with an insoluble type kallikrein antibody, adsorbing it on the antibody, washing the antibody, eluting kallikrein with an alkali aqueous solution. CONSTITUTION:An antibody obtained by immunizing an animal against kallikrein having the desired purity is chemically linked to an insoluble type carrier such as agarose, dextran, etc. by covalent bond, to prepare an insoluble type kallikrein antibody. A solution of raw kallikrein obtained from a well-known kallikrein-containing raw material such as urine, blood, etc. of an animal by a well-known method is treated with the insoluble type kallikrein antibody, so that kallikrein is specifically adsorbed on it. The antibody is washed to remove impurities, and kallikrein is eluted with an alkali aqueous solution such as 0.2M aqueous solution of Na2CO3, etc. Thus, high-purity kallikrein can be obtained in high yield.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はカリクレインの精製方法に関する・さらに評Ｗ
ＡＫは、本発明は不溶型カリクレイン抗体を用いること
によってカリクレインを簡単に高純＆に精製する方法に
関する。[Detailed Description of the Invention] The present invention relates to a method for purifying kallikrein and further evaluation W
AK: The present invention relates to a method for easily purifying kallikrein to a high degree of purity by using an insoluble kallikrein antibody.

カリクレインは動物の尿、血清、唾液、汗。Kallikrein is derived from animal urine, serum, saliva, and sweat.

涙、＊下線、膵臓、副性腺、腎臓などの生体内に広く分
布している蛋白分解酵素である。It is a proteolytic enzyme that is widely distributed in living organisms such as lacrimal glands, *underlined, pancreas, accessory sex glands, and kidneys.

またカリクレインは血漿中のキニノーゲンから活性ペプ
チドキニン管遊離させるキニン遊離酵素であり、近年、
儲濃器系疾患の治療剤として重要てあ）、臨床的に広く
用いられている。In addition, kallikrein is a kinin-releasing enzyme that releases the active peptide kinin from kininogen in plasma.
It is important as a therapeutic agent for cardiovascular diseases) and is widely used clinically.

カリクレインの精製法としては、従来、硫安塩析、溶媒
沈殿、カチオン及びアニオン交換体を用いたイオン交換
クロマト、電気泳動法、１また阻害剤を利用するアフィ
ニティークロマトグラフィーを行う方法等があるが、こ
れらの方法にカリクレインと交雑蛋白との分離除来が困
難であり％異性に欠け、またかなりの時間と労力を要す
るという欠点【有している。Conventional methods for purifying kallikrein include ammonium sulfate salting out, solvent precipitation, ion exchange chromatography using cation and anion exchangers, electrophoresis, and affinity chromatography using inhibitors. These methods have the disadvantages that it is difficult to separate and remove kallikrein and hybrid proteins, lack % isomerism, and require considerable time and effort.

竣近ではこうした精製方法に代わって不溶■カリクレイ
ン抗体管用いたカリクレインの精製法が適用されつつあ
る。Near completion, a method for purifying kallikrein using an insoluble kallikrein antibody tube is being applied instead of this purification method.

しかしながら、不溶型カリクレイン抗体を用いる精製法
は抗原〜抗体反応の特異性を利用するため、その抗原−
抗体複合体の結合力が彊く、従来、溶離には線素及び塩
酸グアニジン等の変性溶離剤を用いざるｔ得なかつた。However, since the purification method using insoluble kallikrein antibodies utilizes the specificity of the antigen-antibody reaction, the antigen-antibody
Since the binding strength of the antibody complex is strong, conventionally it has been necessary to use a denatured eluent such as a wire or guanidine hydrochloride for elution.

（Ｂｌｏ＠ｈ＠ｍ、Ｊ、１８９，１５３−１５９．１９
８０および特開１１８５６−５０９５参照） ＋ＩＣ）結１これらの溶離ｇＫより、蛋白質の柳ａｔ変
化せしめ、溶出工程中でのカリクレインの失活は回避で
きず、また、溶出後、ただちにこれらの溶離剤として用
いた試ｖｓｔｒｉｋ＊することが必要であった。(Blo@h@m, J, 189, 153-159.19
80 and Japanese Patent Publication No. 11856-5095) +IC) Conclusion 1 These elution gKs cause the protein to change to Yanagi, and the deactivation of kallikrein during the elution process cannot be avoided, and these eluents should be used immediately after elution. It was necessary to use vstrik* as a test.

本発ＷＡ＠は不溶型カリクレイン抗体を用いるカリクレ
インの端一方法について種々検討の結果、不溶型カリク
レイン抗体吸着物ｔアルカリ性水溶液で溶出することに
よプ、約９５％の回収率で、しかも高純度でかつ安定な
カリクレイン溶出液を取得する方法を見出した。As a result of various studies on methods for producing kallikrein using insoluble kallikrein antibodies, this WA@ has a recovery rate of approximately 95% and high purity by elution with an alkaline aqueous solution of insoluble kallikrein antibody adsorbents. We have discovered a method to obtain a stable kallikrein eluate.

本発明においては、まず目的とする純度のカリクレイン
を動物に免疫することによりて得た抗体を不溶性担体と
化学的に共有結合させて不溶型カリクレイン抗体を調整
する。不溶性担体としては不活性であり、疎であり、不
溶性であろ担体、例えばアガロース、ガラスピーズ、デ
キストラン、ポリアクリルアミド等を用いることがで古
、前記抗体とは公知の方法で化学的に共有結合させて不
溶型カリクレイン抗体管調整することができる。In the present invention, first, an insoluble kallikrein antibody is prepared by chemically covalently bonding an antibody obtained by immunizing an animal with kallikrein of a desired purity to an insoluble carrier. As the insoluble carrier, inert, sparse, and insoluble carriers such as agarose, glass beads, dextran, polyacrylamide, etc. can be used. Insoluble kallikrein antibody tubes can be prepared.

このような不溶型カリクレイン抗体を用いて粗製カリク
レイン溶液管処理することによシ、カリクレインを特異
的に吸着せしめたのち、洗浄によって不純物を完全Ｋ１
１ｌＩ＊シ、ついでアルカリ性水溶液、好ましくは０　
、２ＭＮ　Ｊ　ＣＯ＠水溶液により、カリクレイン管溶
離させることによって、高純度なカリクレイン【高収率
で得ることができる。By treating a crude kallikrein solution tube using such an insoluble kallikrein antibody, kallikrein is specifically adsorbed, and impurities are completely removed by washing.
1lI*, then an alkaline aqueous solution, preferably 0
, 2MN J CO@aqueous solution, by elution through a kallikrein tube, high purity kallikrein [can be obtained in high yield].

本発明で用いる粗製カリクレインは人會含む動物の尿、
血液、膵臓等の公知のカリクレイン含有原料から公知の
方法で調製することかで富る。The crude kallikrein used in the present invention includes animal urine, including human
It can be prepared by a known method from known kallikrein-containing raw materials such as blood and pancreas.

本発明書らは、カリクレインが溶液中、酸性側では不安
定であるが、アルカリ性側では比較的安定である事ｔａ
出し、その特性【利用し、木精製法ｔＳ立した。すなわ
ち、本発明で用いる溶出液、例えば０．２ＭＮａ、Ｃｏ
＠水溶液（ＰＨ１１，０〜１１　、５）中でｒｉ２５℃
で３時間処理１１４９フ襲以上の活性を残存することが
見出されている０さらに、本発明で用いるアルカリ性水
溶液は不溶性担体−抗体結合に何ら影響管与えず、ＰＨ
８付近の適当な緩衝液で再生することによ′す１半未久
的に繰り返し使用が可能であり、その吸着容量、活性回
収率及び純度に変化１ＪＦ−えることはない。The present inventors have shown that kallikrein is unstable in solution on the acidic side, but relatively stable on the alkaline side.
The wood refining method was established by utilizing its properties. That is, the eluent used in the present invention, for example, 0.2M Na, Co
@ri25℃ in aqueous solution (PH11,0~11,5)
It has been found that the alkaline aqueous solution used in the present invention has no effect on the insoluble carrier-antibody binding, and the PH
It can be used repeatedly for an indefinite period of time by regenerating it with an appropriate buffer solution of about 80%, and there is no change in its adsorption capacity, activity recovery rate, or purity.

ｔたその溶離剤は安価でその後の脱塩及び廃棄が非常に
容易であると−う利点１に有している。Another advantage of this eluent is that it is inexpensive and subsequent desalination and disposal are very easy.

以上の点より不溶型カリクレイン抗体による溶離剤とし
てアルカリ性溶液【用いるカリフレ１ンＯ精製法は従来
方法に比して非常に優れているといえる。From the above points, it can be said that the Kaliphrein O purification method using an alkaline solution as an eluent using an insoluble kallikrein antibody is extremely superior to conventional methods.

次に実施例【挙げて本発明管説明するが、本発明はこれ
らの具体例により限定されるものではない。Next, the present invention will be explained with reference to Examples, but the present invention is not limited to these specific examples.

る、これ會濾過し、濾液管限外濾過器によって濃縮して
全量１０００−とする。この濃縮液【抗カリクレイン抗
体を固定化したセファローズ４Ｂのカラム（２００ｓｇ
）に流下し、吸着（１時間〕させた後、０．１５Ｍ塩化
ナトリウム【含む０．０５　Ｍリン酸緩衝液によ）充分
洗浄する６次に０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液で溶出し、
これをセファデックスＧ−２５により脱塩後、凍結乾燥
する。This was filtered and concentrated using a filtrate tube ultrafilter to a total volume of 1,000 ml. This concentrated solution [Sepharose 4B column with immobilized anti-kallikrein antibody (200sg
), adsorbed (for 1 hour), washed thoroughly with 0.15 M sodium chloride (containing 0.05 M phosphate buffer), and then eluted with 0.2 M sodium carbonate solution.
This is desalted using Sephadex G-25 and then freeze-dried.

このｌ１ＢＩ珊によって表ＩＫ示される如く、比活性は
１０４倍上昇し、活性回収率は９４襲であったの 表１ 実施例２゜ 部分精製ヒト尿中カリクレイン溶液５０〇−（０，１５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝液Ｐ
Ｈ８，０を抗カリタレイン抗体【固定したセファローズ
４Ｂ（Ｄ鵞うム（２００ｍｇ）Ｋ滝下し、吸着（約３０
分）させた後、０．１５Ｍ塩化ナトリウム會含む０．０
５　Ｍ　）リス塩酸緩衝液ＰＨ８，０で充分洗浄後、０
．２Ｍ炭酸す）　ＩＪウム溶液で溶出し、これｔセファ
デックスＧ−２！ｌにより脱塩後、凍結乾燥する・ 仁の４６理によって表２に示す如く、比活性は約８倍上
昇し、活性回収率は９７％であった。As shown in Table IK, this l1BI coral increased the specific activity by 104 times, and the activity recovery rate was 94 times.
0.05M) Lis-HCl buffer containing M sodium chloride P
H8,0 was added to anti-kalitarein antibody [immobilized Sepharose 4B (200 mg)] and adsorbed (approximately 30 mg).
minutes), then add 0.15M sodium chloride solution.
5M) After thorough washing with Lis-HCl buffer pH 8.0,
．． Elute with 2M carbonic acid solution and Sephadex G-2! As shown in Table 2, the specific activity increased about 8 times and the activity recovery rate was 97%.

表２ 実施例３ 部分精製カリクレイン溶液２００ａｇ　（０，１５Ｍ塩
化ナトリウムを含む０．０５Ｍりン酸緩衝液ＰＨ８，０
）を抗カリクレイン抗体を固定化したガラスピーズのカ
ラム（２００ｓｄ）Ｋ流下し、吸着（約１０分）徒、０
．１５　Ｍ塩化ナトリウム【含むリン酸緩衝液ＰＨ８，
０で充分洗浄後、Ｑ、２Ｍ炭酸ナトリウム溶液で溶出し
、これをセファデックスＧ−２５により脱塩後、凍結乾
燥する・この処理によって表３に示す如く、比活性は７
．５倍上昇し、活性回収率は８５襲であった。Table 2 Example 3 Partially purified kallikrein solution 200ag (0.05M phosphate buffer containing 0.15M sodium chloride PH8.0
) was passed through a glass beads column (200 sd) immobilized with anti-kallikrein antibody, and adsorption (about 10 minutes) was carried out.
．． 15 M sodium chloride [containing phosphate buffer pH8,
After thorough washing with 0 and Q, eluted with 2M sodium carbonate solution, desalted with Sephadex G-25 and lyophilized. As shown in Table 3, this treatment resulted in a specific activity of 7.
．． It increased by 5 times, and the active recovery rate was 85 times.

表３ 実施例４ 部分精製カリクレイン溶液Ｉｓ　ＯＯｇＩｔ（０，１５
アローズ４Ｂのカラム（２００ｍ）に流下し、吸着（約
３０分）させた後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムｉ含む０
．０５　Ｍ　リン階緩働液ＰＨ８，０で充分洗浄後０．
１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ＰＨ１１，５
）で溶出し、−に７アデツクスＧ−２５にまり脱環後凍
結乾燥する。Table 3 Example 4 Partially purified kallikrein solution Is OOgIt (0,15
After flowing down to a column (200 m) of Arrows 4B and adsorbing (about 30 minutes),
．． 05 M After thorough washing with phosphorus slowing solution PH8.0.
1M glycine-sodium hydroxide buffer (PH11,5
), and the sample is eluted with 7 Adex G-25 and lyophilized after decyclization.

この処理によって表４に示す如く、比活性は７．３倍上
昇し、活性回収率は８０襲であった。As shown in Table 4, this treatment increased the specific activity by 7.3 times and the activity recovery rate was 80 times.

表４ 実施例５ バンクレアチン１００ｆｔ冷水１０００１００Ｏ濁し、
約２時間攪拌抽出し、５０００回転１０分間達心分離稜
、上清を集め、０．ＩＮ水酸化ナトリウムでＰＨ８，Ｏ
Ｋ調節した後、抗カリクレイン抗体を固定したセファロ
ーズ４Ｂカラム（２００−）に流下し、吸着（約５０分
）場せた後０．１５Ｍ塩化ナトリウム【含もリン酸緩衝
液ＰＨ８，０で充分洗浄後、０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶
液で溶出し、セファデックスＧ−２５により脱塩後、凍
結乾燥する。この処理によって表５に示す如く、比活性
は３７００倍上昇し、活性回収率は９６襲であった。Table 4 Example 5 Bank creatin 100ft cold water 1000100O cloudy,
Extract with stirring for about 2 hours, rotate at 5,000 rpm for 10 minutes, collect the supernatant, and collect the supernatant. PH8,O with IN sodium hydroxide
After adjusting K, it was applied to a Sepharose 4B column (200-) on which anti-kallikrein antibody was immobilized, and after adsorption (about 50 minutes), 0.15M sodium chloride (including phosphate buffer pH 8.0 was sufficient). After washing, it is eluted with 0.2M sodium carbonate solution, desalted with Sephadex G-25, and then freeze-dried. As shown in Table 5, this treatment increased the specific activity by 3,700 times, and the activity recovery rate was 96 times.

表５ 実施例６ 豚膵ｌ１ｌＩＦＩＡ末１０ｏ９から実施例５と同様の操
作によって得た抽出液ｔＯ，ＩＮ水酸化ナトリウムテＰ
Ｈ８，０Ｋｌ１１節した稜、抗カリクレイン抗体を固定
化した竜７アローＸ４Ｂｔｙ’）ム（２００−）に流下
し、吸着（約５０分）さぜた螢、０．１Ｍグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液Ｐ）Ｉｌｌｉで溶出し、セファデ
ックスＧ−２５により脱塩後、凍結乾燥する。Table 5 Example 6 Extract solution tO, IN sodium hydroxide teP obtained from pig pancreas l1lIFIA terminal 10o9 by the same procedure as in Example 5
H8,0Kl11-articulated ridge, firefly that was flowed down to Ryu7 Arrow X4Bty')mu (200-) immobilized with anti-kallikrein antibody and mixed with adsorption (approximately 50 minutes), 0.1M glycine-sodium hydroxide buffer. P) Elute with Illi, desalt with Sephadex G-25, and freeze-dry.

この処理によって表６に示す如く、比活性は実施例７ 豚生膵臓５０１＋１−ミンチし、水１！５００５ｇ管加
え、自己消化させて抽出する。この抽出液管濾過して濾
液を取り、ｃｔ′Ｌを０．ＩＮ水酸化ナトリウムでＰＨ
８，０に調節した後、抗カリクレイン抗体を固定化した
ガラスピーズのカラムに流下し、吸着（約７０分）させ
た後、０．２Ｍ炭−ナトリウムにより溶出し、セファデ
ックスＧ　−２５により脱環後、凍結乾燥する。As a result of this treatment, the specific activity was determined as shown in Table 6.Example 7 501+1-minced raw pig pancreas was added to a tube of 15,005 g of water, and extracted by autolysis. This extract tube was filtered to collect the filtrate, and the ct'L was 0. pH with IN sodium hydroxide
After adjusting the temperature to 8.0, the anti-kallikrein antibody was poured onto a column of immobilized glass beads, adsorbed (about 70 minutes), eluted with 0.2M charcoal-sodium, and desorbed with Sephadex G-25. After ringing, freeze dry.

この処理によって表７に示す如く、比活性は３５００倍
上昇し、活性回収率は８５′ｓであった・ Ｑ抗カリクレイン塾抗体固定化セファローズ４Ｂの調節
例 ＣＮＢｒ　活性化セファローズ４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍｅ
ｉａＦｉｎ＠Ｃｈ＠ｍ１ｃａｌｓ社製）　１００　ｆｌ
　ｔ　１ｍＭＭ（：ｔにて洗浄　ｍ＊管行ない、Ｏ，３
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液ＰＨ８，３中で１．５９の抗カリクレイン抗体と結
合させ、室温で２時間攪拌し、未反応の活性基１１Ｍの
エタノールアミンＰＨ８，０てブロッキング（２時間）
する。次に上記の炭酸水素ナトリウム緩衝液によｐブロ
ッキング試ａｔ−洗浄し、抗カリクレイン抗体固電化セ
ファローズ４Ｂとする。By this treatment, as shown in Table 7, the specific activity increased 3500 times and the activity recovery rate was 85's. Example of preparation of Q anti-Kallikrein antibody-immobilized Sepharose 4B CNBr Activated Sepharose 4 B (Pharme
iaFin@Ch@m1cals) 100 fl
t 1mMM (wash with t m* tube, O, 3
Coupled with 1.59 anti-kallikrein antibody in 0.1 M sodium bicarbonate buffer PH 8.3 containing M sodium chloride, stirred for 2 hours at room temperature, and blocked unreacted active groups with 11 M ethanolamine PH 8.0. (2 hours)
do. Next, it is washed with the above-mentioned sodium bicarbonate buffer for p-blocking assay to obtain anti-kallikrein antibody-immobilized Sepharose 4B.

０　抗カリクレイン抗体固定化ガラスピーズＯ調整径２
■のガラスピーズｚｏｏｐｔ十分に水洗した後、１５０
℃にて２４時間乾燥する。そのｖｋ２％ｒ−アミノプロ
ピルトリエトキシシラン−アセトン溶液２０〇−管加え
、４５℃にて２４時間還流する。次にビーズ【水洗１１
１１１グルタルアルデヒド２００ｍｔ加え４℃にて２４
時間振とうする・ そのｖｋ５０　ｖａＭ　　リン酸緩衝液ＰＨ７，ＯＫて
洗浄し、同緩衝液２００ｍｇ、抗カリクレイン抗体１４
０１９を添加し、４℃にて２４時間振とうする・次いで
０．１Ｍ炭醗ナトリウムに溶解した５０ｍＭエタノール
アミン２００ｍｔ添加し、４℃で２４時間振とうする・ このビーズを５０ｍＭ酢酸緩衝液ＰＩ（５，０で十分洗
浄徒、０．９％塩化ナトリウム、　　０．０５％アジ化
ナトリウム、０．３％牛血清アルブミン及び０．６襲ト
リトンＸ−４０５を含む５０　ｍ　Ｍ　トリス−塩酸緩
衝液ＰＨ５，０中に４℃にて保存する。0 Anti-kallikrein antibody immobilized glass beads O adjusted diameter 2
■ After washing the glass peas zoopt thoroughly with water,
Dry at ℃ for 24 hours. Add the vk 2% r-aminopropyltriethoxysilane-acetone solution to a 200-liter tube, and reflux at 45°C for 24 hours. Next, beads [Washing 11]
Add 200 mt of 111 glutaraldehyde and hold at 4℃ for 24 hours.
Shake for an hour, wash with vk50 vaM phosphate buffer PH7, OK, wash with 200 mg of the same buffer, anti-kallikrein antibody 14
019 and shaken at 4°C for 24 hours. Then, 200mt of 50mM ethanolamine dissolved in 0.1M sodium carbonate was added and shaken at 4°C for 24 hours. The beads were mixed with 50mM acetate buffer PI ( Wash thoroughly with 5.0 mM Tris-HCl buffer PH5 containing 0.9% sodium chloride, 0.05% sodium azide, 0.3% bovine serum albumin, and 0.6% Triton X-405. , 0 at 4°C.

Ｐｒｏ−Ｐｈ＊−Ａｒｇ−ＭＣム活性測定法グロリルー
フェニルアラニルーアルギニンー４−メチル−クマリル
−７−アミドを基質とし、加藤らの方法（Ｊ　、　Ｂｉ
ｏｃｈ＠ｍ、　８７．１１２７−１１３２．１９８０）
に基づいて行なった。Pro-Ph*-Arg-MC activity measurement method Using glorylphenylalanyl-arginine-4-methyl-coumaryl-7-amide as a substrate, the method of Kato et al. (J, Bi
och@m, 87.1127-1132.1980)
This was done based on.

０．２−００．１５　Ｍ塩化ナトリウム管台ｔｒＯ，１
ｖトリス壌酸緩衝液ＰＨ８，０Ｋ　１０＾１の試料を加
え、３７℃５分間のブレインキ晶ベートの俵、１０ｍＭ
　Ｐｒｏ−Ｐｈ＊−ムｒｇ−ｍｃＡ溶液管加え、６０分
間の酵素反応を行なう。0.2-00.15 M sodium chloride tube stand trO, 1
v Add a sample of Tris-sodate buffer PH8.
Add a Pro-Ph*-murg-mcA solution tube and perform an enzyme reaction for 60 minutes.

０．１Ｍ　Ｉｖｉｌ緩１１１１ＰＨ４，５ｔ−２，５ｍ
　加、ｔ、反応を停止し、励起波長３８０ｎ■、螢光波
長４４０ｎｍにおける螢光管測定する。0.1M Ivil loose 1111PH4,5t-2,5m
1. Stop the reaction and measure using a fluorescent tube at an excitation wavelength of 380 nm and a fluorescence wavelength of 440 nm.

カリクレイン活性は１分間当）１μモルの４−メチル−
クマリン−ツーアミンを遊離する酵素量管１ｕｎｌｔと
した０ 特許出脂人　杉　浦　　衛Kallikrein activity is 1 μmol of 4-methyl-
1 unit of enzyme tube to release coumarin-toamine 0 Patent extractor Mamoru Sugiura

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] 入　粗製カリクレイン溶液管不溶型カリクレイン抗体で
処理してカリクレインを特異的に吸着せしめ、吸着物を
洗浄したのち、溶離剤としてアルカリ性水溶液！用いて
カリクレイン管溶離すること管特徴とするカリクレイン
の精製法。Enter crude kallikrein solution tube Treat with insoluble kallikrein antibody to specifically adsorb kallikrein, wash the adsorbed material, and then use an alkaline aqueous solution as the eluent! A purification method for kallikrein characterized by elution using a kallikrein tube.