JPS585038B2 - Method for producing dipeptide ester - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はジペプチドエステルの製造方法に関するもので
ある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing dipeptide esters.

ペプチドの誘導体が種々の生理活性を示すことは周知の
ことであり、その製造法についても種々の方法が知られ
ている。It is well known that peptide derivatives exhibit various physiological activities, and various methods for producing them are also known.

ペプチド鎖中に酸性アミノ酸残基を含むものについても
同様で、例えば甘味物質として知られているＬ−アスパ
ルチルフェニルアラニンメチルエステル等は通常そのア
ミン基をベンジルオキシカルボニル基などで保護した前
駆体から保護基を離脱させて得られる。The same applies to those containing acidic amino acid residues in the peptide chain; for example, L-aspartylphenylalanine methyl ester, which is known as a sweet substance, is usually protected from a precursor whose amine group is protected with a benzyloxycarbonyl group, etc. Obtained by eliminating the group.

この様な前駆体のジペプチドエステルを製造する方法と
してはアミノ基を保護した酸性アミノ酸の無水物とアミ
ノ酸のアルキルエステルを反応させる方法（特開昭４８
−６１４５１号、特開昭４８−７６８３５号など）が知
られている。A method for producing such a precursor dipeptide ester is a method in which an anhydride of an acidic amino acid with a protected amino group is reacted with an alkyl ester of an amino acid (Japanese Patent Laid-Open No. 48
-61451, JP-A-48-76835, etc.) are known.

本発明はアミノ基を保護したモノアミノジカルボン酸と
アミノ酸エステルから酵素反応を利用して上述したジペ
プチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物を生
成させ、これを分解してジペプチドエステルとするもの
である。The present invention utilizes an enzymatic reaction from a monoamino dicarboxylic acid with a protected amino group and an amino acid ester to produce an addition compound of the above-mentioned dipeptide ester and amino acid ester, which is then decomposed to form a dipeptide ester.

即ち本発明は一般式 で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
であるＮ−置換モノアミノジカルボン酸（式中Ｒ１は脂
肪族オキシカルボニル基、核置換基を有することのある
ベンジルオキシカルボニル基、ベンゾイル基、芳香族ス
ルフォニル基又は芳香族スルフィニル基であり、ｎは１
又は２である）と、一般式 で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
であるアミノ酸エステル（式中Ｒ２はメチル基、イソプ
ロピル基、イソブチル基、イソアミル基又はベンジル基
であり、Ｒ３は低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基又
はベンズヒドリルオキシ基である）とを水性媒体中蛋白
分解酵素の存在下で反応させて、一般式 で表わされる化合物（式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びｎは前
記同様の意味を表わす）を生成させ、これを反応液から
分離し、分離されたこの化合物を酸性水溶液と混合反応
させ、反応混合液を固液分離し、一般式 （式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びｎは前記同様の意味である
）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエステルを固相とし
て回収することを特徴とするジペプチドエステルの製造
方法を提供するものである。That is, the present invention is an N-substituted monoaminodicarboxylic acid represented by a general formula, at least a part of which is an L-type optical isomer (wherein R1 is an aliphatic oxycarbonyl group or has a nuclear substituent). a certain benzyloxycarbonyl group, benzoyl group, aromatic sulfonyl group or aromatic sulfinyl group, and n is 1
or 2), and an amino acid ester represented by the general formula, at least a part of which is an L-type optical isomer (wherein R2 is a methyl group, isopropyl group, isobutyl group, isoamyl group, or benzyl group) and R3 is a lower alkoxy group, benzyloxy group, or benzhydryloxy group) in the presence of a protease in an aqueous medium to form a compound represented by the general formula (in the formula R1, R2, R3 and n represent the same meaning as above), this is separated from the reaction solution, the separated compound is mixed and reacted with an acidic aqueous solution, the reaction mixture is separated into solid and liquid, and the general formula (in the formula R1 , R2, R3 and n have the same meanings as described above) is recovered as a solid phase.

本発明で一方の出発物質として用いる一般式（Ｉ）で表
わされるＮ−置換モノアミノジカルボン酸はアスパラギ
ン酸（一般式（Ｉ）中のｎが１のとき）又はグルタミン
酸（同様にｎが２のとき）の誘導体である。The N-substituted monoamino dicarboxylic acid represented by the general formula (I) used as one of the starting materials in the present invention is aspartic acid (when n in the general formula (I) is 1) or glutamic acid (similarly when n is 2). It is a derivative of

Ｒ１は第３級ブチルオキシカルボニル基 （（ＣＨ３）３Ｃ−０−ＣＯ−）、第３級アミルオキシ
カルボニル基（（ＣＨ３）２Ｃ（Ｃ２Ｈ５）−Ｏ−ＣＯ
−）の様な脂肪族オキシカルボニル基；ベンジルオキシ
カルボニル基（φ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−）若くはｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基（ｐ−ＣＨ３Ｏ−φ
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−）、３，５−ジメトキシベンジル
オキシカルボニル基（３，５−（ＣＨ３Ｏ）２−φ−Ｃ
Ｈ２−Ｏ−ＣＯ−）、２，４，６−トリメトキシベンジ
ルオキシカルボニル基（２゜４．６（ＣＨｓＯ）３−φ
−ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−）等のその核置換誘導体基：ベン
ゾイル基（φ−ＣＯ−）：ｐ−トルエンスルホニル基（
ｐ−ＣＨ３−φ−８Ｏ２−）等の芳香族スルホニル基；
又はｏ−ニトロスルフィニル基（ｏ−ＮＯ２−φ−８Ｏ
−）等の芳香族スルフィニル基である。R1 is a tertiary butyloxycarbonyl group ((CH3)3C-0-CO-), a tertiary amyloxycarbonyl group ((CH3)2C(C2H5)-O-CO
Aliphatic oxycarbonyl group such as -); benzyloxycarbonyl group (φ-CH2-O-CO-) or p-methoxybenzyloxycarbonyl group (p-CH3O-φ
-CH2-O-CO-), 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl group (3,5-(CH3O)2-φ-C
H2-O-CO-), 2,4,6-trimethoxybenzyloxycarbonyl group (2゜4.6(CHsO)3-φ
-CH2-O-CO-) and other nuclear substituted derivative groups thereof: Benzoyl group (φ-CO-): p-toluenesulfonyl group (
Aromatic sulfonyl groups such as p-CH3-φ-8O2-);
or o-nitrosulfinyl group (o-NO2-φ-8O
-) and other aromatic sulfinyl groups.

Ｒ１はアミノ基の保護基であるが、本発明が後述する様
に一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエス
テルの水又は酸性水溶液に対する溶解度の小さいことを
利用する工程を含むものであるから、一般式（５）で表
わされるＬＬ−型ジペプチドエステルの水溶性を大きく
増大させる様な置換基を持つものであってはならない。R1 is a protecting group for the amino group, and as described later, the present invention includes a step that utilizes the low solubility of the LL-type dipeptide ester represented by the general formula (IV) in water or an acidic aqueous solution. It must not contain any substituent that would significantly increase the water solubility of the LL-type dipeptide ester represented by general formula (5).

他方の出発物質である一般式（ＩＩ）で表わされるアミ
ノ酸エステルは、Ｒ１がメチル基のときはアラニンの、
イソプロピル基のときはバリンの、イソブチル基のとき
はロイシンの、イソアミル基のときはイソロイシンの、
またベンジル基のときはフェニルアラニンのそれぞれエ
ステルである。The other starting material, the amino acid ester represented by general formula (II), is alanine when R1 is a methyl group.
When it is an isopropyl group, it is valine, when it is an isobutyl group, it is leucine, and when it is an isoamyl group, it is isoleucine.
When it is a benzyl group, it is an ester of phenylalanine.

またＲ３はアルコール残基であって、メトキシ基（ＣＨ
３Ｏ−）、エトキシ基（Ｃ２Ｈ５Ｏ−）、プロポキシ基
（Ｃ３Ｈ７Ｏ−）、ブトキシ基（Ｃ４Ｈ９Ｏ−）などの
低級アルコキシ基；又はベンジルオキシ基である。Further, R3 is an alcohol residue, and is a methoxy group (CH
3O-), an ethoxy group (C2H5O-), a propoxy group (C3H7O-), a lower alkoxy group such as a butoxy group (C4H9O-); or a benzyloxy group.

一般式（１）で表わされる化合物及び一般式（ＩＶ）で
表わされるジペプチドエステルはアスパラギン酸又はグ
ルタミン酸の骨格を有するものであるが、これらの酸性
アミノ酸がそのカルボキシル基でペプチド結合するとき
一般式（■）又は（■）の様にアミン基に対してα位の
カルボキシル基で結合する場合と、β位又はγ位のカル
ボキシル基で結合する場合があるが、本明細書中ではジ
ペプチドエステル又はそのアミノ酸エステルとの付加化
合物については、特記しない限りα位のカルボキシル基
でペプチド結合した化合物を意味する。The compound represented by the general formula (1) and the dipeptide ester represented by the general formula (IV) have an aspartic acid or glutamic acid skeleton, but when these acidic amino acids are peptide-bonded with their carboxyl groups, the general formula ( There are cases where the bond is made with the carboxyl group at the α position to the amine group as in (■) or (■), and cases where the bond is made with the carboxyl group at the β or γ position, but in this specification, dipeptide ester or its An addition compound with an amino acid ester means a compound in which a peptide bond is formed at the carboxyl group at the α-position, unless otherwise specified.

本発明では、まず一般式（Ｉ）で表わされ、少なくとも
その一部はＬ−型の光学異性体であるＮ−置換アミノジ
カルボン酸と一般式（■）で表わされ、少なくともその
一部はＬ−型の光学異性体であるアミノ酸エステルとを
水性媒体中蛋白分解酵素の存在下で反応させて一般式（
■）で表わされる化合物を生成析出させこれを分離する
。In the present invention, first, it is represented by general formula (I), at least a part of which is represented by an N-substituted amino dicarboxylic acid which is an L-type optical isomer, and at least a part of which is represented by general formula (■). is reacted with an amino acid ester, which is an optical isomer of the L-form, in the presence of a protease in an aqueous medium to form the general formula (
(2) The compound represented by (2) is formed and separated.

一般式（■）で表わされる化合物は一般式側で表わされ
るＬＬ−型ジペプチドエステルと一般式（ＩＩ）で表わ
されるアミノ酸エステルとの付加化合物である。The compound represented by the general formula (■) is an addition compound of the LL-type dipeptide ester represented by the general formula and the amino acid ester represented by the general formula (II).

この反応は特開昭５３−９２７２９号公報中に開示され
ている条件下で行なうことができる。This reaction can be carried out under the conditions disclosed in JP-A-53-92729.

即ち水性媒体として最も適当なものは水溶液であり、反
応はこれらの水性媒体中蛋白分解酵素が酵素活性を示す
液性で行なわれる。That is, the most suitable aqueous medium is an aqueous solution, and the reaction is carried out in such aqueous medium that the protease exhibits enzymatic activity.

蛋白分解酵素として最も適当なものは、サーモライシン
、サモアーゼ、放線菌起源の中性プロテアーゼ、プロリ
シン、コラゲナーゼ、クロタルス、アトロツクス、プロ
テアーゼ等の金属プロテアーゼであり、その場合、反応
はｐＨ約５ないし約８の範囲内で行なうのが好ましい。The most suitable proteolytic enzymes are metalloproteases such as thermolysin, samoase, neutral protease of Streptomyces origin, prolysin, collagenase, Crotalus, atrox, and protease, in which case the reaction is carried out at a pH of about 5 to about 8. It is preferable to operate within this range.

一般式（Ｉ）で表わされるＮ−置換アミノジカルボン酸
の光学異性体のうち、反応に関与するのはＬ一体だけで
あり、Ｄ一体はこれに関与しない。Among the optical isomers of the N-substituted amino dicarboxylic acid represented by the general formula (I), only L is involved in the reaction, and D is not involved.

しかし後者はこの反応を妨害しないので、出発原料とし
てＤＬ一体の様なり一体を含むものを使用してよい。However, since the latter does not interfere with this reaction, a starting material such as DL monochrome may be used as a starting material.

一般式（ＩＩ）で表わされるアミノ酸エステルとしては
フェニルアラニンのメチル又はエチルエステルの様な低
級アルキルエステルを典型的なものとして例示すること
ができる。A typical example of the amino acid ester represented by the general formula (II) is a lower alkyl ester such as methyl or ethyl ester of phenylalanine.

一般式（ｎ）で表わされるアミノ酸エステルの光学異性
体のうちペプチド結合形成反応に関与するのはＬ一体の
みであるが、Ｄ一体、Ｌ一体ともに生成するジペプチエ
ステルと結合して一般式（１）で表わされる化合物を形
成することができる。Among the optical isomers of the amino acid ester represented by the general formula (n), only the L monomer is involved in the peptide bond formation reaction, but both the D monomer and the L monomer combine with the dipeptiester produced, and the general formula ( A compound represented by 1) can be formed.

従って原料としてＤ一体を含むアミノ酸エステルを用い
るとＬＬ−型の一般式（ＩＶ）で表わされるジペプチド
エステルと、Ｄ−型又はＤ−型とＬ−型との混合型の一
般式（■）で表わされるアミノ酸エステルとの付加化合
物である、一般式（■）で表わされる化合物が生成する
。Therefore, when an amino acid ester containing D-unit is used as a raw material, a dipeptide ester of the LL-type represented by general formula (IV) and a D-type or a mixed type of D-type and L-type dipeptide ester (■) are obtained. A compound represented by the general formula (■), which is an addition compound with the represented amino acid ester, is produced.

その他の反応条件は酵素反応における慣用の条件を採用
してよい。Other reaction conditions may be those commonly used in enzymatic reactions.

一般式（■）で表わされる化合物と反応させる酸性水溶
液の酸性成分としては無機酸又は有機酸を用いる。An inorganic acid or an organic acid is used as the acidic component of the acidic aqueous solution to be reacted with the compound represented by the general formula (■).

無機酸の例としては塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸等
を挙げることができる。Examples of inorganic acids include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.

有機酸の例としてはギ酸、酢酸、クエン酸、トルエンス
ルホン酸等を挙げることができる。Examples of organic acids include formic acid, acetic acid, citric acid, toluenesulfonic acid, and the like.

これらの酸性成分の濃度には格別の限定はないので、後
述する酸性成分及び酸性水溶液の各使用量から他律的に
定めてよい。Since there is no particular limitation on the concentration of these acidic components, it may be determined heteronomously from the usage amounts of the acidic component and the acidic aqueous solution, which will be described later.

一般式（■）で表わされる化合物に対する酸性水溶液の
酸性成分の使用量は、この工程が一般式（■）で表わさ
れる化合物の、一般式（ＩＩ）で表わされるアミノ酸エ
ステルの部分を酸性成分によって電離させ、その塩の水
溶液とするものであるから、化学量論量又はそれ以上、
即ち一般式（■）で表わされる化合物１モルに対して１
ないし１００当量、好ましくは１ないし２０当量、最も
好ましくは１ないし１０当量程度である。The amount of the acidic component to be used in the acidic aqueous solution for the compound represented by the general formula (■) is as follows. Since it is ionized and made into an aqueous solution of the salt, stoichiometric amount or more,
That is, 1 mole of the compound represented by the general formula (■)
The amount is about 1 to 100 equivalents, preferably 1 to 20 equivalents, most preferably 1 to 10 equivalents.

しかし目的により、一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−
型ジペプチドエステルは必ずしもそれ程の高純度を必要
としない場合もあり得るので、その様な場合は化学量論
量以下の量、例えば化合物一般式（■）で表わされる１
モルに対して０．５当量などの様に、を用いることを妨
げるものでない。However, depending on the purpose, LL-
There may be cases in which the dipeptide ester does not necessarily require such high purity, so in such cases, it may be necessary to use a less than stoichiometric amount, for example, 1 expressed by the compound general formula (■).
This does not preclude using, for example, 0.5 equivalent per mole.

目的によっては一般式（１）で表わされる化合物１モル
に対して０．８当量程度の量用いれば実際上充分である
ことも多い。Depending on the purpose, it is often actually sufficient to use an amount of about 0.8 equivalent per mole of the compound represented by the general formula (1).

一般式（■）で表わされる化合物に対する酸性水溶液の
使用量は、本発明の方法が、得られる一般式（ＩＶ）で
表わされるＬＬ−型のジペプチドエステルを固体成分と
して分離するものであるから、これが少なくとも固相と
して存在し得る程度以内で用いる必要がある。The amount of the acidic aqueous solution to be used for the compound represented by the general formula (■) is determined by the following: since the method of the present invention separates the obtained LL-type dipeptide ester represented by the general formula (IV) as a solid component, It is necessary to use this to the extent that it can exist at least as a solid phase.

しかし一般式（５）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエ
ステルは水や酸性水溶液に対する溶解度が小さい（Ｎ−
ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルの場合、２５℃での溶解
度；０．０２８ｇ／１００ｇ水及び０．０１７ｇ／１０
０ｇ稀塩酸水溶液（１０−２Ｍ））ので可成多量でも実
施が可能である。However, the LL-type dipeptide ester represented by general formula (5) has low solubility in water and acidic aqueous solutions (N-
For benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, solubility at 25°C: 0.028 g/100 g water and 0.017 g/10
0g dilute aqueous hydrochloric acid solution (10-2M)), it can be carried out even with a relatively large amount.

また本発明の方法が出発物質を酸性水溶液と接触させて
固液分離可能な状態とするものであるから、これが少な
過ぎるのも好ましくない具体的には一般式（■）で表わ
される化合物１重量部に対して１．５ないし５０重量部
程度、好ましくは２ないし１０重量部である。Furthermore, since the method of the present invention involves contacting the starting material with an acidic aqueous solution to bring it into a state in which solid-liquid separation is possible, it is also undesirable for the starting material to be too small. Specifically, 1 weight of the compound represented by the general formula (■) The amount is about 1.5 to 50 parts by weight, preferably 2 to 10 parts by weight.

本発明の方法において一般式（■）で表わされる化合物
１と酸性水溶液とを混合反応させるときの温度は通常０
ないし１００℃、好ましくは５ないし８０℃である。In the method of the present invention, the temperature at which the compound 1 represented by the general formula (■) and an acidic aqueous solution are mixed and reacted is usually 0.
The temperature is from 5 to 100°C, preferably from 5 to 80°C.

一般式（■）で表わされる化合物の分解反応は撹拌が十
分であれば、通常１０分以内程度で終結する。The decomposition reaction of the compound represented by the general formula (■) is usually completed within about 10 minutes if stirring is sufficient.

但し保護基Ｒ１又はＲ３が比較的加水分解され易い基、
例えばｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基の様な
場合は、これらの基の離脱を起さない様、反応時間及び
反応温度に注意する必要がある。However, the protecting group R1 or R3 is a group that is relatively easily hydrolyzed,
For example, in the case of p-methoxybenzyloxycarbonyl groups, care must be taken in the reaction time and reaction temperature so as not to cause separation of these groups.

一般式（■）で表わされる化合物は固体であるが酸性水
溶液との接触によって分解されて、一般式（ＩＶ）で表
わされるＬＬ−型ジペプチドエステルと、一般式（Ｉ）
で表わされるアミノ酸エステルの酸性成分との塩となる
。Although the compound represented by the general formula (■) is solid, it is decomposed by contact with an acidic aqueous solution to form an LL-type dipeptide ester represented by the general formula (IV) and a compound represented by the general formula (I).
It becomes a salt with an acidic component of an amino acid ester represented by

一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエステ
ルは前述した様に酸性水溶液に対する溶解度が小さいの
でその実質的部分が固相として存在する。As mentioned above, the LL-type dipeptide ester represented by the general formula (IV) has low solubility in an acidic aqueous solution, so that a substantial portion thereof exists as a solid phase.

一方アミノ酸エステルの塩は酸性水溶液によく溶解する
ので液相中に溶は込む。On the other hand, salts of amino acid esters dissolve well in acidic aqueous solutions, so they dissolve into the liquid phase.

こうして反応系は一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−型
ジペプチドエステルの固相とアミノ酸エステルの塩の水
溶液（勿論過剰の酸性成分を含むことがあり得るが）の
混合系となる。In this way, the reaction system becomes a mixed system of the solid phase of the LL-type dipeptide ester represented by the general formula (IV) and the aqueous solution of the salt of the amino acid ester (although it may of course contain an excess of acidic components).

得られた混合系を固液分離すれば目的物である一般式（
ＩＶ）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエステルが固相
として得られる。If the resulting mixed system is subjected to solid-liquid separation, the desired product, the general formula (
The LL-type dipeptide ester represented by IV) is obtained as a solid phase.

固液分離は慣用の方法、例えば濾過、遠心沈降等で行な
うことができる。Solid-liquid separation can be carried out by conventional methods such as filtration and centrifugal sedimentation.

液相からは慣用の方法、例えばこれを濃縮してアミノ酸
エステルを塩の形で晶出させるとか、或は液相をアルカ
リ性とした後、適当な有機溶媒で抽出する等の方法によ
ってアミノ酸エステルを回収することができる。The amino acid ester is extracted from the liquid phase by a conventional method, such as concentrating it to crystallize the amino acid ester in the form of a salt, or making the liquid phase alkaline and then extracting it with a suitable organic solvent. It can be recovered.

本発明で得られる一般式（ＩＶ）で表わされるＬＬ−型
ジペプチドエステルはペプチド合成での中間体としてそ
れ自体有用であるが、そのアミン基の保護基Ｒ１を離脱
させて得られるジペプチドエステルも亦有用な化合物で
ある。The LL-type dipeptide ester represented by the general formula (IV) obtained in the present invention is itself useful as an intermediate in peptide synthesis, but the dipeptide ester obtained by removing the protecting group R1 of the amine group is also useful. It is a useful compound.

例えばすでに述べた様にＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルは甘味剤として有用であるが
、その他のものもペプチド合成のフラグメント等として
用いることができる。For example, as already mentioned, L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester is useful as a sweetening agent, but others can also be used as fragments for peptide synthesis.

本発明の方法によれば、極めて温和な条件下で、容易に
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）で表わされる化合物から、一
般式（■）で表わされる有用なジペプチドを製造するこ
とができる。According to the method of the present invention, the useful dipeptide represented by the general formula (■) can be easily produced from the compounds represented by the general formulas (I) and (II) under extremely mild conditions.

実施例 １ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸５
．３４ｇ（２０ミリモル）及びＬ−フェニルアラニンメ
チルエステル７．５３ｇ（４２ミリモル）を内容積約１
００ｍ１のフラスコにとり、水７０ｍ１を加えて溶解す
るとｐＨ６，２〜６．３の溶液となった。Example 1 N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid 5
．． 34 g (20 mmol) and 7.53 g (42 mmol) of L-phenylalanine methyl ester with an internal volume of about 1
The mixture was placed in a 00 ml flask, and 70 ml of water was added to dissolve it, resulting in a solution with a pH of 6.2 to 6.3.

この溶液にサーモライシン２００ｍｇを加えて、３８な
いし４０℃で４時間かきまぜた。200 mg of thermolysin was added to this solution and stirred at 38 to 40°C for 4 hours.

析出した沈殿を濾集し、水７０ｍ１で洗った後乾燥し融
点１１７ないし１２０℃を示す結晶１０．１１ｇを得た
。The deposited precipitate was collected by filtration, washed with 70 ml of water, and dried to obtain 10.11 g of crystals having a melting point of 117 to 120°C.

この物質は以下のことからＮ−ベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエ
ステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの１：
１付加化合物であることが確認された。This substance is a combination of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and L-phenylalanine methyl ester from the following:
It was confirmed that it was a 1-addition compound.

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；１２０ないし１２４℃ 〔α〕■；＋７．２（Ｃ＝１、メタノール）元素分析； 赤外吸収スペクトルは ３．２６０ｃｍ−１にＮ−Ｈ伸縮に、３，０００〜３．
２００ｃｍ−１にＣ−Ｈ伸縮に、１，７４０ｃｍ−１に
工ステルのＣ＝Ｏに、１，７２０ｃｍ−１にウレタンの
Ｃ＝０に、１，６６０ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１
，６３０ｃｍ−１にカルボキシレートに、１，５４０ｃ
ｍ−１にアミド第■吸収に、１，４３０及び１，４５０
ｃｍ−１にＣ−Ｈ変角に、１，３９０ｃｍ−１にカルボ
キシレートに、１．２２０〜１，２９０ｃｍ−１にＣ−
０−Ｃ伸縮及びアミド第１吸収に 角に、７４０及び６９５ｃｍ−１にモノ置換ベンゼン環
面外変角に、それぞれ由来する吸収がみられるまた核磁
気共鳴スペクトルはδ：２．７５ｐｐｍ，３．０２ｐｐ
ｍ，３．６１ｐｐｍ，３．７ｐｐｍ，４．４〜４．８ｐ
ｐｍ，５．０５ｐｐｍ５、８２ｐｐｍ、及び７．３ｐｐ
ｍに特徴がある。That is, the physical properties and elemental analysis results of the product obtained by recrystallizing this product from a mixed solvent of ethyl acetate and n-hexane are as follows: Melting point: 120 to 124°C [α] ■: +7.2 (C=1, methanol ) Elemental analysis; Infrared absorption spectrum shows N-H stretching at 3.260 cm-1 and 3,000-3.
C-H stretching at 200 cm-1, C=O of ester at 1,740 cm-1, C=0 of urethane at 1,720 cm-1, amide first absorption at 1,660 cm-1, 1
, 630 cm −1 to carboxylate, 1,540 c
1,430 and 1,450 for amide No. 1 absorption in m-1
C-H bending angle at cm-1, carboxylate at 1,390 cm-1, and C-H at 1.220-1,290 cm-1.
Absorptions originating from the 0-C stretching and amide first absorption angles, and from monosubstituted benzene ring out-of-plane bending angles at 740 and 695 cm-1, respectively, are seen.The nuclear magnetic resonance spectrum has δ: 2.75 ppm, 3. 02pp
m, 3.61ppm, 3.7ppm, 4.4-4.8p
pm, 5.05ppm5, 82ppm, and 7.3ppm
m has characteristics.

更にまたこの物質を塩酸等の強酸で処理した後酢酸エチ
ル等の有機溶剤で抽出し溶媒を蒸発させるとＮ−ペンジ
ルオキシカルボニルーＬーアスパルチルーＬ−フェニル
アラニンメチルエステルが得られる。Furthermore, when this substance is treated with a strong acid such as hydrochloric acid, extracted with an organic solvent such as ethyl acetate, and the solvent is evaporated, N-penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester is obtained.

こうして得られたＮ−ペンジルオキシカルボニルーＬー
アスパルチルーＬ−フェニルアラニンメチルエステルと
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物１
００ｇ（１．６５ミリモル）を内容積約３０ｍｌのフラ
スコにとり、水２ｍｌおよび塩酸（１Ｎ）２０ｐｐを加
えて、室温で１０分間かきまぜた。Addition compound 1 of thus obtained N-penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and L-phenylalanine methyl ester
00 g (1.65 mmol) was placed in a flask with an internal volume of about 30 ml, 2 ml of water and 20 pp of hydrochloric acid (1N) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes.

得られたスラリーを濾過し、水４ｍｌで洗ってから乾燥
し、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル
−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルの結晶０．７２
ｇを得た（収率９８．８％）。The resulting slurry was filtered, washed with 4 ml of water, and dried to give 0.72 kg of crystals of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester.
g (yield 98.8%).

この物質の確認は高速液体クロマトグラフ法によって標
準品と比較する等の方法によって行なった。Confirmation of this substance was performed by comparing it with a standard product using high performance liquid chromatography.

また同法による純度は１００％であった。高速液体クロ
マトグラフ分析の測定装置及び測定条件は下記の通りで
ある。The purity determined by the same method was 100%. The measurement device and measurement conditions for high performance liquid chromatography analysis are as follows.

この条件等は実施例２以下でも同様である。These conditions are the same in Example 2 and subsequent examples.

測定装置及び条件 高速液体クロマトグラフ装置；東洋曹達工業株式会社製
（ＴＳＫ−ＨＬＣ８０１） カラム 内径７．５ｍｍ×長さ３０ｃｍ 充填剤 デンプン系ゲル粒径５μ、東洋曹達工業株式会
社製 （ＴＳＫ−ＧＥＬ ＬＳ１７０） 溶離液 ０．５％酢酸ナトリウム水溶液 流 速 ０．８ｍｌ／ｍｉｎ 圧損失２０Ｋｇ／ｃｍ２ 測定温度 室温 検出器 示差屈折率 また得られた結晶を酢酸エチルに溶解し、これにｎ−ヘ
キサンを加えて再結晶した。Measuring device and conditions High performance liquid chromatography device; manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd. (TSK-HLC801) Column Inner diameter 7.5 mm x length 30 cm Packing material Starch gel particle size 5μ, manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd. (TSK-GEL LS170) ) Eluent 0.5% sodium acetate aqueous solution Flow rate 0.8 ml/min Pressure loss 20 Kg/cm2 Measurement temperature Room temperature detector Differential refractive index The obtained crystals were dissolved in ethyl acetate, and n-hexane was added thereto. Recrystallized.

このものの物性及び元素分析結果は、 融 点；１２１〜１２４℃ 〔α〕■；−１５．４（Ｃ＝１、メタノール）元素分析 であり赤外吸収スペクトルも標準品と一致した。The physical properties and elemental analysis results of this substance are as follows: Melting point: 121-124℃ [α] ■; -15.4 (C=1, methanol) elemental analysis The infrared absorption spectrum also matched that of the standard product.

実施例 ２ 実施例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ
−フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物１．
００ｇ（１．６５ミリモル）を内容積３０ｍｌのフラス
コにとり、水２ｍｌおよび塩酸（ＩＮ）１．３２ｐｐを
加えて、室温で１０分間かきまぜた。Example 2 N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester obtained in Example 1 and L
- Addition compound with phenylalanine methyl ester 1.
00 g (1.65 mmol) was placed in a flask with an internal volume of 30 ml, 2 ml of water and 1.32 pp of hydrochloric acid (IN) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes.

以下実施例１と同様に処理して融点１００ないし１２６
℃を示す微細な柱状晶０．７０ｇを得た（Ｎ〜ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステル含有量９６．８％）。Thereafter, it was treated in the same manner as in Example 1, and the melting point was 100 to 126.
0.70 g of fine columnar crystals having a temperature of 0.70 °C were obtained (N~benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester content: 96.8%).

実施例 ３ Ｎ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸０
．５３４ｇ（２ミリモル）およびＤＬ−フェニルアラニ
ンメチルエステル塩酸塩０．８６３ｇ（４ミリモル）を
内容積約３０ｍｌのフラスコにとり、水１０ｍｌを加え
て溶解し、アンモニア水（７重量％）でｐＨ６．０に調
整した。Example 3 N-penzyloxycarbonyl-L-aspartic acid 0
．． 534 g (2 mmol) and 0.863 g (4 mmol) of DL-phenylalanine methyl ester hydrochloride were placed in a flask with an internal volume of approximately 30 ml, dissolved by adding 10 ml of water, and adjusted to pH 6.0 with aqueous ammonia (7% by weight). did.

この溶液にサーモライシン５０ｍｌを加え、３８ないし
４０℃で一夜振とうした。50 ml of thermolysin was added to this solution, and the mixture was shaken at 38 to 40°C overnight.

析出した沈殿を濾集し、水１０ｍｌで洗った後乾燥して
融点１２０ないし１２６℃を示す結晶０．９０ｇを得た
。The deposited precipitate was collected by filtration, washed with 10 ml of water, and dried to obtain 0.90 g of crystals having a melting point of 120 to 126°C.

この結晶の一部を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒か
ら再結晶したものは融点１２８ないし１３４℃で、〔α
〕■；ー６．３（Ｃ＝１、メタノール）を示す他はＮ−
ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルとＬ−フェニルアラニン
メチルエステルとの１：１付加化合物と実質的に同一の
赤外吸収スペクトル及び核磁気共鳴スペクトルを示す。A part of this crystal was recrystallized from a mixed solvent of ethyl acetate and n-hexane and had a melting point of 128 to 134°C.
]■; -6.3 (C=1, methanol), otherwise N-
It shows substantially the same infrared absorption spectrum and nuclear magnetic resonance spectrum as a 1:1 addition compound of penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and L-phenylalanine methyl ester.

また酸分解によってＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
とＤ−フェニルアラニンメチルエステルとを１：１の割
合で与える。Also, by acid decomposition, N-benzyloxycarbonyl-L
-Aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and D-phenylalanine methyl ester are provided in a 1:1 ratio.

元素分析の結果は： であった。The results of elemental analysis are: Met.

これらのことから得られた結晶はＮ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステルとＤ−フェニルアラニンメチルエステルと
の１：１付加化合物であることが確認された。It was confirmed that the obtained crystals were a 1:1 addition compound of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and D-phenylalanine methyl ester.

こうして得た付加化合物の結晶０．５０５’（０，８２
ミリモル）に水４７７２７！とクエン酸０．２６ｒを加
えて室温で１０分間かきまぜた。Crystals of the addition compound thus obtained 0.505' (0.82
mmol) to water 47727! and 0.26 r of citric acid were added and stirred at room temperature for 10 minutes.

以下実施例１と同様に処理してＮ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ −フェニルアラニンメ
チルエステルの結晶０．３５ｒを得た（純度１００％、
収率９９．３％）。Thereafter, the same treatment as in Example 1 was carried out to obtain 0.35r crystals of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (purity 100%,
Yield 99.3%).

実施例 ４ 実施例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパル ルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの
付加化合物０．５０Ｓ’（０．８２ミＩＪモル）を内容
積３０ｒＩｌｌのフラスコにとり、水４ゴ及びｐ −ト
ルエンスルホン酸・ｌ水和物０．２４Ｆ（１．２ミリモ
ル）を加えて、実施例１に準じて反応を行なｔｚ）Ｎ−
ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルの結晶０．３３Ｆを得た
（純度１００％、収率９３．６％実施例 ５ 内容積約３０ゴのフラスコにギ酸（８５％）０、４ ５
ｆｔ（ ８．２ミリモル）と水８−をとり、これに実
施例１で得たＮ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−
フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物０．５
Ｏ ｒ（ ０．８ ２ ：： １７モル）を加えて、
室温で２０分間かきまぜた後瀘過し、水１０ｒｒｌＩ！
で洗浄し、乾燥した。Example 4 0.50S' (0.82 mmol) of the addition compound of N-benzyloxycarbonyl-L-asparyl ester and L-phenylalanine methyl ester obtained in Example 1 was placed in a flask with an internal volume of 30ml, and water was added. A reaction was carried out according to Example 1 by adding 0.24 F (1.2 mmol) of p-toluenesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid l hydrate (tz)N-
0.33F crystals of penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester were obtained (purity 100%, yield 93.6%) Example 5 Formic acid (85%) was added to a flask with an internal volume of about 30 g. , 4 5
ft (8.2 mmol) and water were added, and N-penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester obtained in Example 1 and L-
Addition compound with phenylalanine methyl ester 0.5
Add O r (0.8 2 :: 17 mol),
Stir at room temperature for 20 minutes, filter, and add 10rrl of water!
Washed and dried.

Ｎ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステルの白色結晶０．３１
２ｒを得た（純度１００％、収率８８．６％）。N-penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L
-White crystals of phenylalanine methyl ester 0.31
2r was obtained (purity 100%, yield 88.6%).

実施例 ６ 内容積約３０１ｎｌのフラスコに氷酢酸０．４７Ｓ’（
８．２ １で得たＮ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラ
チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステルとの付加化合物０．５０ｇ
（０．８２ミリモル）を加えて、室温で３０分間かきま
ぜた後炉過し、水１０ｍｌで洗浄し、乾燥した。Example 6 Glacial acetic acid 0.47S' (
8.2 0.50 g of addition compound of N-penzyloxycarbonyl-L-asparatyl-L-phenylalanine methyl ester obtained in 1 and L-phenylalanine methyl ester
(0.82 mmol) was added, stirred at room temperature for 30 minutes, filtered, washed with 10 ml of water, and dried.

Ｎ−ペンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ
−フェニルアラニンメチルエステルの白色結晶０．３０
１を得た（純度１００％、収率８７．２％）。N-penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L
-White crystals of phenylalanine methyl ester 0.30
1 was obtained (purity 100%, yield 87.2%).

実施例 ７ 実施例１で得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ
−フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物１．
００ｇ（１．６５ミリモル）を内容積３０ｍｌのフラス
コにとり、水２ｍｌおよび塩酸（１Ｎ）２．０ｍｌ（２
．０ミリモル）を加えて、６０℃で３分間かきまぜた。Example 7 N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester obtained in Example 1 and L
- Addition compound with phenylalanine methyl ester 1.
00 g (1.65 mmol) was placed in a flask with an internal volume of 30 ml, and 2 ml of water and 2.0 ml (2
．． 0 mmol) and stirred at 60°C for 3 minutes.

以下実施例１と同様に処理してＮ−ペンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルの結晶０．３５ｇを得た（純度１００％、収
率１００％）。Thereafter, the same procedure as in Example 1 was carried out to obtain 0.35 g of crystals of N-penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester (purity 100%, yield 100%).

実施例 ８ Ｎ−Ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ア
スパラギン酸０．５９４ｇ（２ミリモル）及びＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステル塩酸塩０、８６０ｇ（４ミ
リモル）を内容積約３０ｍｌのフラスコにとり、水酸化
ナトリウム溶液（ＩＮ）を加えて溶解し、ｐＨ６．０に
調整した。Example 8 0.594 g (2 mmol) of N-P-methoxy-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid and 0.860 g (4 mmol) of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride were placed in a flask with an internal volume of about 30 ml, and hydroxylated. A sodium solution (IN) was added to dissolve and adjust the pH to 6.0.

この溶液にサーモライシン５０ｍｇを加え、３８ないし
４０℃で一夜間振とうした。50 mg of thermolysin was added to this solution and shaken overnight at 38 to 40°C.

析出した沈殿を濾集し、水１０ｍｌで洗った後乾燥し、
融点６８ないし７４℃を示す結晶０．９２８ｇを得た。The deposited precipitate was collected by filtration, washed with 10 ml of water, and dried.
0.928 g of crystals with a melting point of 68-74°C were obtained.

この物質は以下のことがらＮ−ｐ−メトキシ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエ
ステルとの１：１付加化合物であることが確認された。This substance was confirmed to be a 1:1 addition compound of N-p-methoxy-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and L-phenylalanine methyl ester.

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；７２ないし７６℃ 〔α〕■；＋６．５（Ｃ＝１、メタノール）赤外吸収ス
ペクトルは第１図に示す様に、３．２８０ｃｍ−１にＮ
−Ｈ伸縮に、３，０２０及び２．９３０ｃｍ−１にＣ−
Ｈ伸縮に、１，７３５ｃｍ−１にエステルのＣ＝Ｏに、
１，７００ｃｍ−１にウレタンのＣ＝０に、１，６４０
ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１．５００〜１，５４０
ｃｍ−１にアミド第■吸収に、１．４３５ｃｍ−１にＣ
−Ｈ変角に、１，３８０ｃｍ−１にカルボキシレートに
、１，２１０〜１，２４０ｃｍ−１にＣ−０−Ｃ伸縮及
びアミド第■吸収に、１，０３０ｃｍ−１にフェニル面
内変角に６９０，７４０及び８１０ｃｍ−１にフェニル
面外変角にそれぞれ由来する吸収が見られる。That is, the physical properties and elemental analysis results of this product obtained by recrystallizing it from a mixed solvent of ethyl acetate and n-hexane are as follows: Melting point: 72 to 76°C [α] ■: +6.5 (C=1, methanol ) As shown in Figure 1, the infrared absorption spectrum is N at 3.280 cm-1.
-H expansion and contraction, C- at 3,020 and 2.930 cm-1
H stretching, C=O of ester at 1,735 cm-1,
C=0 of urethane at 1,700 cm-1, 1,640
amide first absorption in cm-1, 1.500 to 1,540
Amide No. 2 absorption at cm-1, C at 1.435 cm-1
-H bending, carboxylate at 1,380 cm-1, C-0-C stretching and amide absorption from 1,210 to 1,240 cm-1, phenyl in-plane bending at 1,030 cm-1 At 690, 740, and 810 cm-1, absorptions derived from the phenyl out-of-plane bending angle are observed, respectively.

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１） ２．７ｐｐｍ（２Ｈ） ；（２）３．１ｐｐｍ
（４Ｈ）；（３） ３．６ｐｐｍ（３Ｈ）及び３．７ｐ
ｐｍ（３Ｈ）：（４） ３．８ｐｐｍ（３Ｈ） ；（５
）４．０ｐｐｍ（１Ｈ）；（６） ４．５ｐｐｍ（１Ｈ
） ；（７）４．８ｐｐｍ（１Ｈ）；（８） ５．０ｐ
ｐｍ（２Ｈ） ；（９）５．６５ｐｐｍ（３Ｈ）；（１
０） ５．６５ｐｐｍ（１Ｈ）；（１１）６．２ｐｐｍ
（１Ｈ）；及び（１２） ６．８〜７．３ｐｐｍ（１４
Ｈ）に特徴があり、これらは下式のそれぞれ相当する番
号のプロトンに帰属させることができる。The nuclear magnetic resonance spectrum has a δ value of (1) 2.7 ppm (2H); (2) 3.1 ppm
(4H); (3) 3.6ppm (3H) and 3.7p
pm(3H):(4) 3.8ppm(3H);(5
) 4.0ppm (1H); (6) 4.5ppm (1H
); (7) 4.8ppm (1H); (8) 5.0p
pm (2H); (9) 5.65 ppm (3H); (1
0) 5.65ppm (1H); (11) 6.2ppm
(1H); and (12) 6.8-7.3ppm (14
H) has characteristics, and these can be attributed to the protons with the corresponding numbers in the formula below.

こうして得られたＮ−ｐ−メトキシ−ベンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメ
チルエステルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルと
の付加化合物０．５００ｇ（０，７８４ミリモル）を内
容積約３０ｍ１のフラスコにとり、水２ｍｌ及び塩酸（
１Ｎ）０．９４ｍ１（０，９４ミリモル）を加えて、６
０℃で３分間かきまぜた。0.500 g (0,784 mmol) of the thus obtained addition compound of N-p-methoxy-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and L-phenylalanine methyl ester was placed in a flask with an internal volume of about 30 m1. , 2 ml of water and hydrochloric acid (
Add 0.94 ml (0.94 mmol) of 6
Stir for 3 minutes at 0°C.

得られたスラリーを濾過し、水６ｍｌで洗浄した後乾燥
し、０．３２ｇの結晶を得た。The resulting slurry was filtered, washed with 6 ml of water, and then dried to obtain 0.32 g of crystals.

この結晶は以下のことからＮ−ｐ−メトキシ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルア
ラニンメチルエステルであることが確認された。This crystal was confirmed to be Np-methoxy-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester from the following.

（純度１００％、収率８９．１％）即ち、この結晶を酢
酸エチルに溶解し、これにｎ−ヘキサンを加えて再結晶
して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；１２８〜１３０℃ 〔α〕■；−１５，１（Ｃ＝１ メタノール）赤外吸収
スペクトルは第２図に示す様に、３．２８０ｃｍ−１に
Ｎ−Ｈ伸縮に、２，９３０及び３．０２０ｃｍ−１にＣ
−Ｈ伸縮に、１，７３５ｃｍ−１にエステルのＣ＝Ｏに
、１，７００ｃｍ−１にウレタンのＣ＝Ｏに、１，６５
０ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１．５１０〜１，５４
０ｃｍ−１にアミド第■吸収に、１．４４０ｃｍ−１に
Ｃ−Ｈ変角に、１，２２０〜１，２７０ｃｍ−１にＣ−
０−Ｃ伸縮及びアミド第■吸収に、１．０３０及び１，
０５０ｃｍ−１にフェニル面内変角に、６９０及び８１
０ｃｍ−１にフェニル面外変角にそれぞれ由来する特徴
がある。(Purity 100%, yield 89.1%) That is, the physical properties and elemental analysis results of the product obtained by dissolving this crystal in ethyl acetate and recrystallizing it by adding n-hexane are as follows: Melting point: 128 ~130℃ [α] ■; -15,1 (C=1 methanol) Infrared absorption spectrum is as shown in Figure 2, with N-H stretching at 3.280 cm-1, 2,930 and 3.020 cm -1 to C
-H stretching, ester C=O at 1,735 cm-1, urethane C=O at 1,700 cm-1, 1,65
Amide first absorption at 0 cm-1, 1.510 to 1,54
Amide first absorption at 0 cm-1, C-H bending at 1.440 cm-1, C-
0-C stretching and amide No. 2 absorption, 1.030 and 1,
690 and 81 for phenyl in-plane bending angle at 050 cm-1
There are features at 0 cm −1 that are derived from the phenyl out-of-plane bending angle.

また核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１） ２．８ｐｐｍ（２Ｈ）；（２） ３．０ｐｐｍ
（２Ｈ）；（３） ３．６ｐｐｍ（３Ｈ）；（４） ３
．８ｐｐｍ（３Ｈ）；（５） ４．５ｐｐｍ（１Ｈ）；
（６） ４．８ｐｐｍ（１Ｈ）；（７） ５．０ｐｐｍ
（２Ｈ）；（８） ６．０ｐｐｍ（１Ｈ）；（９） ６
．６ｐｐｍ（１Ｈ）；（１０） ６．６ｐｐｍ（１Ｈ）
；（１１） ６．８〜７．３ｐｐｍ（９Ｈ）に特徴があ
り、これらは下式のそれぞれ相当する番号のプロトンに
帰属させることができる。In addition, the nuclear magnetic resonance spectrum has a δ value of (1) 2.8 ppm (2H); (2) 3.0 ppm
(2H); (3) 3.6ppm (3H); (4) 3
．． 8ppm (3H); (5) 4.5ppm (1H);
(6) 4.8ppm (1H); (7) 5.0ppm
(2H); (8) 6.0ppm (1H); (9) 6
．． 6ppm (1H); (10) 6.6ppm (1H)
(11) It is characterized by 6.8 to 7.3 ppm (9H), and these can be attributed to the protons of the corresponding numbers in the following formula.

こうして得たＮ−ｐ−メトキシベンジルカルボニル−Ｌ
−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル
０．２重量部をアセトン２重量部に溶解し、塩酸（４Ｎ
）１重量部を加えて湯浴上で１．５時間おだやかに環流
させたところ完全に分解し、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステル、Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステル及びアニスアルコールを主成分とする溶
液となった。Thus obtained N-p-methoxybenzylcarbonyl-L
-Dissolve 0.2 parts by weight of aspartyl-L-phenylalanine methyl ester in 2 parts by weight of acetone, and dissolve hydrochloric acid (4N
) 1 part by weight was added and gently refluxed for 1.5 hours on a hot water bath, resulting in complete decomposition, resulting in a solution containing L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester, L-phenylalanine methyl ester, and anise alcohol as main components. It became.

この溶液からＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン
メチルエステルを得た。L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester was obtained from this solution.

実施例 ９ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミン酸０．
５６２ｇ（２ミリモル）及びＬ−フェニルアラニンメチ
ルエステル塩酸塩０．８６０ｇ（４ミリモル）を内容積
約３０ｍ１のフラスコにとり水酸化す ６、０に調整した。Example 9 N-benzyloxycarbonyl-L-glutamic acid 0.
562 g (2 mmol) and 0.860 g (4 mmol) of L-phenylalanine methyl ester hydrochloride were placed in a flask having an internal volume of about 30 ml and adjusted to 6,0 hydroxide.

この溶液にサーモライシン５０■を加え、３８ないし４
０℃で一夜聞損とうした。Add 50μ of thermolysin to this solution,
I lost hearing all night at 0℃.

析出した沈殿を濾集し、水１０ｍｌで洗った後乾燥し、
融点８０ないし８５℃を示す結晶０．５１０ｇを得た。The deposited precipitate was collected by filtration, washed with 10 ml of water, and dried.
0.510 g of crystals having a melting point of 80-85°C were obtained.

この物質は以下のことがらＮ−ペンジルオキシカルボニ
ルーＬーグルタミルーＬ−フェニルアラニンメチルエス
テルとＬ−フェニルアラニンメチルエステルとの１：１
付加化合物であることが確認された。This substance is composed of N-penzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanine methyl ester and L-phenylalanine methyl ester in a 1:1 ratio.
It was confirmed that it was an addition compound.

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−へキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は： 融 点；９２ないし９７℃ 〔α〕■；０．１（Ｃ＝１、メタノール〕元素分析； 赤外吸収スペクトルは第３図に示す様に、３、３４０ｃ
ｍ−１にＮ−Ｈ伸縮に、２，９５０及び３、０３０ｃｍ
−１にＣ−Ｈ伸縮に、１，７３０及び１、７４５ｃｍ−
１にエステルのＣ＝Ｏに、１，６９０ｃｍ−１にウレタ
ンのＣ＝Ｏに、１，６６０ｃｍ−１にアミド第Ｉ吸収に
、１，６２０ｃｍ−１にカルボキシレートに、１、５３
０ｃｍ−１にアミド第■吸収に、１，４４０ｃｍ−１に
Ｃ−Ｈ変角に、１，４０５ｃｍ−１にカルボキシレート
に、１，２４０〜１，３１０ｃｍ−１にＣ−Ｏ−Ｃ伸縮
及びアミド第１吸収に、１，０５０ｃｍ−１にフェニル
面内変角に、７００及び７５０ｃｍ−１にフェニル面外
変角にそれぞれ由来する特徴がある。That is, the physical properties and elemental analysis results of this product obtained by recrystallizing it from a mixed solvent of ethyl acetate and n-hexane are as follows: Melting point: 92 to 97°C [α] ■: 0.1 (C=1, Methanol] Elemental analysis; Infrared absorption spectrum is 3,340c as shown in Figure 3.
m-1 for N-H expansion and contraction, 2,950 and 3,030 cm
-1 to C-H expansion and contraction, 1,730 and 1,745 cm-
1 to C=O of ester, 1,690 cm to C=O of urethane, 1,660 cm to amide I absorption, 1,620 cm to carboxylate, 1,53
Amide first absorption at 0 cm-1, C-H bending at 1,440 cm-1, carboxylate at 1,405 cm-1, and C-O-C stretching and contraction from 1,240 to 1,310 cm-1. There are features originating from the amide first absorption, from the phenyl in-plane bending at 1,050 cm-1, and from the phenyl out-of-plane bending at 700 and 750 cm-1.

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１）２．０ｐｐｍ（２Ｈ）；（２）２．３ｐｐｍ（２
Ｈ）；（３）３．０ｐｐｍ（４Ｈ）；（４）３．６ｐｐ
ｍ（３Ｈ）及び３、７ｐｐｍ（３Ｈ）；（５）３．８ｐ
ｐｍ（１Ｈ）；（６）４．３ｐｐｍ（１Ｈ）；（７）４
．８ｐｐｍ（１Ｈ）；（８）５．０ｐｐｍ（２Ｈ）；（
９）５．８ｐｐｍ（３Ｈ）；（１０）５．８ｐｐｍ（１
Ｈ）；（１１）７．２ｐｐｍ（１Ｈ）；（１２）７．２
ｐｐｍ（１０Ｈ）；（１３）７．３ｐｐｍ（５Ｈ）に特
徴があり、これらは下式のそれぞれ相当する番号のプロ
トンに帰属させることができる。Nuclear magnetic resonance spectra have δ values of (1) 2.0 ppm (2H); (2) 2.3 ppm (2H);
H); (3) 3.0ppm (4H); (4) 3.6pp
m (3H) and 3,7ppm (3H); (5) 3.8p
pm (1H); (6) 4.3ppm (1H); (7) 4
．． 8ppm (1H); (8) 5.0ppm (2H); (
9) 5.8ppm (3H); (10) 5.8ppm (1
H); (11) 7.2 ppm (1H); (12) 7.2
It is characterized by ppm (10H); (13)7.3ppm (5H), and these can be assigned to the protons of the corresponding numbers in the following formula.

こうして得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グル
タミル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−フ
ェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物０．１０
０ｇを内容積約１５ｍ１の試験管中で塩酸（０，１４Ｎ
）２．３ｍ１（０，３２ミリモルにかきまぜながら加え
、室温で１５分間攪拌を継続した。Addition compound of N-benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanine methyl ester and L-phenylalanine methyl ester thus obtained 0.10
0g in a test tube with an internal volume of approximately 15ml.
) 2.3 ml (0.32 mmol) were added with stirring and stirring was continued for 15 minutes at room temperature.

生成した白色不溶物を濾過し、水３ｍｌで洗浄後乾燥し
たところ０．６８３ｇの結晶を得た。The produced white insoluble matter was filtered, washed with 3 ml of water, and dried to obtain 0.683 g of crystals.

この物は以下のことがらＮ−ベンジルオキシカルボニル
−Ｌ−グルタミル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステ
ルであることが確認された（純度１００％、収率９５．
８％）。This product was confirmed to be N-benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanine methyl ester (purity 100%, yield 95.
8%).

即ちこの結晶を酢酸エチルに溶解し、これにｎ−ヘキサ
ンを加えて再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は
： 融 点；９７ないし９９℃ 〔α〕■；−１１，０（Ｃ＝１、メタノール）元素分析
； 赤外吸収スペクトルは第４図に示す様に、３．３００ｃ
ｍ−１にＮ−Ｈ伸縮に、２，９３０及び３．０３０ｃｍ
−１にＣ−Ｈ伸縮に、１，７３５ｃｍ−１にエステルの
Ｃ＝Ｏに、１，６９０ｃｍ−１にウレタンのＣ＝Ｏに、
１，６５０ｃｍ−１にアミド第１吸収に、１．５３０ｃ
ｍ−１にアミド第■吸収に、１，４４０ｃｍ−１にＯ−
Ｈ変角に１，２２０〜１，２８０ｃｍ−１にＣ−０−Ｃ
伸縮及びアミド第■吸収に、１，０５０ｃｍ−１にフェ
ニル面内変角に、６９５及び７３５ｃｍ−１にフェニル
面外変角にそれぞれ由来する特徴がある。That is, the physical properties and elemental analysis results of the product obtained by dissolving this crystal in ethyl acetate and recrystallizing it by adding n-hexane are as follows: Melting point: 97 to 99°C [α] ■; -11,0 ( C=1, methanol) elemental analysis; Infrared absorption spectrum is 3.300c as shown in Figure 4.
m-1 to N-H stretch, 2,930 and 3.030 cm
-1 for C-H expansion and contraction, 1,735 cm-1 for ester C=O, 1,690 cm-1 for urethane C=O,
Amide first absorption at 1,650cm-1, 1.530c
Amide No. 2 absorption at m-1, O- at 1,440 cm-1
C-0-C at 1,220 to 1,280 cm-1 in H bending angle
There are characteristics originating from the stretching and amide 1st absorption, the in-plane phenyl bending angle at 1,050 cm-1, and the out-of-plane phenyl bending angles at 695 and 735 cm-1.

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１）２．０ｐｐｍ（２Ｈ）；（２）２．４ｐｐｍ（２
Ｈ）；（３）３．１ｐｐｍ（２Ｈ）；（４）３．７ｐｐ
ｍ（３Ｈ）；（５）４．３ｐｐｍ（１Ｈ）；（６）４．
８ｐｐｍ（１Ｈ）；（７）５．１ｐｐｍ（２Ｈ）；（８
）５．９ｐｐｍ（１Ｈ）；（９）７．２ｐｐｍ（１Ｈ）
；（１０）７．２ｐｐｍ（５Ｈ）；（１１）７．３ｐｐ
ｍ（５Ｈ）；（１２）８．１ｐｐｍ（１Ｈ）；に特徴が
あり、これらは次式のそれぞれ相当する番号のプロトン
に帰属させることができる：こうして得たＮ−ベンジル
オキシカルボニル−Ｌ−グル ステルは水素還元によってＬ−グルタミル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステルとすることができた。Nuclear magnetic resonance spectra have δ values of (1) 2.0 ppm (2H); (2) 2.4 ppm (2H);
H); (3) 3.1 ppm (2H); (4) 3.7 ppm
m (3H); (5) 4.3 ppm (1H); (6) 4.
8ppm (1H); (7) 5.1ppm (2H); (8
) 5.9ppm (1H); (9) 7.2ppm (1H)
(10) 7.2ppm (5H); (11) 7.3pp
m (5H); (12) 8.1 ppm (1H); these can be assigned to the protons of the respective corresponding numbers in the following formula: N-benzyloxycarbonyl-L-glucester thus obtained could be converted into L-glutamyl-L-phenylalanine methyl ester by hydrogen reduction.

また加水分解によってＮ−ペンジルオキシカルボニル−
Ｌ−グルタミル−Ｌ−フェニルアラニンとすることがで
きた。Also, by hydrolysis, N-penzyloxycarbonyl-
It was possible to obtain L-glutamyl-L-phenylalanine.

比較例 Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩０、６８６
ｇ（３．１２ミリモル）を内容積１００ｍｌのフラスコ
にとり、水２５ｍを加えて溶解し、水冷かつ撹拌下に水
酸化ナトリウム水溶液（２Ｎ）を加えてｐＨを７．５と
し、更に攪拌を継続しながらかつ水酸化ナトリウム水溶
液（２Ｎ）の添加によってｐＨを７．０乃至７．５に保
ちながら、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパ
ラギン酸無水物０．３６０ｇ（１．４４ミリモル）を除
々に加えた。Comparative example L-phenylalanine methyl ester hydrochloride 0,686
g (3.12 mmol) was placed in a flask with an internal volume of 100 ml, 25 ml of water was added to dissolve it, and while cooling with water and stirring, an aqueous sodium hydroxide solution (2N) was added to adjust the pH to 7.5, and the stirring was continued. 0.360 g (1.44 mmol) of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic anhydride was gradually added while maintaining the pH at 7.0 to 7.5 by adding an aqueous sodium hydroxide solution (2N). Ta.

添加後更に２時間攪拌を続けたのち反応液に塩酸（１Ｎ
）を加えてｐＨ６とした。After the addition, stirring was continued for another 2 hours, and then hydrochloric acid (1N
) was added to adjust the pH to 6.

生成した白色沈殿を濾葉し、水５０ｍｌで洗った後乾燥
してＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル
フェニルアランメチルエステル（Ｎ−ペンジルオキシカ
ルボニル−Ｌ−アスパルチル−（Ｃα）−Ｌ−フェニル
アラニンメチルエステル８６％及びＮ−ペンジルオキシ
カルボニル−Ｌ−アスパルチル−（Ｃβ）一Ｌーフエニ
ルアラニンメチルエステル１４％よりなる）とＬ−フェ
ニルアラニンメチルエステルとの１：１付加化合物（融
点１０８乃至１１５℃）０．４１６ｇを得た。The generated white precipitate was filtered, washed with 50 ml of water, and dried to give N-benzyloxycarbonyl-L-aspartylphenylalane methyl ester (N-penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-(Cα)-L- 1:1 addition compound of L-phenylalanine methyl ester (consisting of 86% phenylalanine methyl ester and 14% N-penzyloxycarbonyl-L-aspartyl-(Cβ)-L-phenylalanine methyl ester) (melting point 108 to 115° C.) 0.416 g was obtained.

尚反応の際相当量のＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−アスパルチル−（Ｃβ）−Ｌ−フェニルアラニンメチ
ルエステルが生成したが、その大部分は濾過洗浄の際濾
洗液の方に残った。During the reaction, a considerable amount of N-benzyloxycarbonyl-L
-Aspartyl-(Cβ)-L-phenylalanine methyl ester was produced, but most of it remained in the filtrate and washing liquid during filtration and washing.

こうして得たＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アス
パルチル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステルとＬ−
フェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物０．２
００ｇ（０．３２９ミリモル）を内容積的１２−のビー
カー中で塩酸（０．４Ｎ）１、７ミリ（０．７ミリモル
）にかきまぜながら加え、室温で１５分間攪拌を継続し
た。The thus obtained N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester and L-
Addition compound with phenylalanine methyl ester 0.2
00 g (0.329 mmol) was added to 1.7 mm (0.7 mmol) of hydrochloric acid (0.4N) in a 12-volume beaker with stirring, and stirring was continued for 15 minutes at room temperature.

生成した白色不溶物を濾過し、水３ｍｌで洗浄後乾燥し
てＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−
Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｎ−ベンジルオ
キシカルボニル−Ｌ−アスパルチル−（Ｃβ）−Ｌ−フ
ェニルアラニンメチルエステルを１７％含む）の結晶（
融点１１０乃至１１８℃）０．１３６ｇを得た（収率９
６．３％）。The produced white insoluble matter was filtered, washed with 3 ml of water, and dried to give N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-
Crystals of L-phenylalanine methyl ester (containing 17% N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-(Cβ)-L-phenylalanine methyl ester) (
Melting point 110-118°C) 0.136g was obtained (yield 9
6.3%).

実施例 １０ Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン酸０
．５４３ｇ（２ミリモル）及びＬ−フェニルアラニンエ
チルエステル塩酸塩０．９１８ｍｇ（４ミリモル）を内
容積的３０ｍｌのフラスコにとり、水５ｍｌを加えて溶
解し、水酸化す （４Ｎ）を加えてｐＨを６に調整した。Example 10 N-benzyloxycarbonyl-L-aspartic acid 0
．． 543 g (2 mmol) and 0.918 mg (4 mmol) of L-phenylalanine ethyl ester hydrochloride were placed in a 30 ml flask, 5 ml of water was added to dissolve it, and hydroxide (4N) was added to adjust the pH to 6. It was adjusted.

この溶液にサーモライシン５０ｍｇを加え、３８ないし
４０℃で一夜聞損とうした。50 mg of thermolysin was added to this solution, and the mixture was left at 38 to 40° C. overnight.

析出した沈殿を濾葉し、水３０ｍｌで水洗後乾燥し、融
点８５ないし９０℃を示す結晶０．９１３ｇを得た。The deposited precipitate was filtered, washed with 30 ml of water, and dried to obtain 0.913 g of crystals having a melting point of 85 to 90°C.

この物質は以下のことがらＮ−ベンジルオキシカルボニ
ル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエ
ステルとＬ−フェニルアラニンエチルエステルとの１：
１付加化合物であることが確認された。This substance is composed of N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine ethyl ester and L-phenylalanine ethyl ester:
It was confirmed that it was a 1-addition compound.

即ち、この物を酢酸エチル−ｎ−ヘキサン混合溶媒から
再結晶して得た物の物性及び元素分析結果は：融 点
；９３ないし９５℃ 〔α〕■；＋６．０（Ｃ＝１、メタノール）元素分析： 赤外吸収スペクトルは第５図に示す様に３，３００ｃｍ
−１にＮ−Ｈ伸縮に、２，９００ないし３，０５０にＣ
−Ｈ伸縮に、１，７１０ないし１，７４０ｃｍ−１にエ
ステルのＣ＝Ｏ及びウレタンのＣ＝０に、１，６４０ｃ
ｍ−１にアミド第Ｉ吸収に、１，５８５ｃｍ−１にカル
ボキシレートに、１，５２０ｃｍ−１にアミド第■吸収
に、１、４４０ｃｍ−１にＣ−Ｈ変角に、１，３８０ｃ
ｍ−１にカルボキシレートに、１，２００および１，２
７０ｃｍ−１にＣ−Ｏ−Ｃ伸縮およびアミド第Ｉ吸収に
、１、０５５ｃｍ−１にフェニル面内変角に、７００。That is, the physical properties and elemental analysis results of this product obtained by recrystallizing it from a mixed solvent of ethyl acetate and n-hexane are: Melting point: 93 to 95°C [α] ■: +6.0 (C=1, methanol ) Elemental analysis: The infrared absorption spectrum is at 3,300 cm as shown in Figure 5.
-1 to N-H expansion and contraction, 2,900 to 3,050 to C
-H stretching, C=O of ester from 1,710 to 1,740 cm-1 and C=0 of urethane, 1,640 c
Amide I absorption at m-1, carboxylate at 1,585 cm-1, amide II absorption at 1,520 cm-1, C-H bending at 1,440 cm-1, 1,380 c
m-1 to carboxylate, 1,200 and 1,2
700 for C-O-C stretching and amide I absorption at 70 cm and phenyl in-plane bending at 1,055 cm.

７３０および７５０ｃｍ−１にフェニル面外変角にそれ
ぞれ由来する吸収が見られる。Absorptions originating from phenyl out-of-plane bending are seen at 730 and 750 cm-1, respectively.

核磁気共鳴スペクトルはδ値で （１）１．１ｐｐｍ（６Ｈ）；（２）２．７ｐｐｍ（２
Ｈ）；（３）３．０ｐｐｍ（４Ｈ）；（４）４．０ｐｐ
ｍ（４Ｈ）；（５）４．１ｐｐｍ（１Ｈ）；（６）４．
５ｐｐｍ（１Ｈ）；（７）４．７ｐｐｍ（１Ｈ）；（８
）５．０ｐｐｍ（２Ｈ）；（９）６．２ｐｐｍ（１Ｈ）
；（１０）６．７ｐｐｍ（３Ｈ）；（１１）７．２ｐｐ
ｍ（１Ｈ）；（１２）７．２ｐｐｍ（１０Ｈ）及び（１
３）７．３ｐｐｍ（５Ｈ）； に特徴があり、これらは下式のそれぞれ相当する番号の
プロトンに帰属させることができる。Nuclear magnetic resonance spectra have δ values of (1) 1.1 ppm (6H); (2) 2.7 ppm (2
H); (3) 3.0 ppm (4H); (4) 4.0 ppm
m (4H); (5) 4.1 ppm (1H); (6) 4.
5ppm (1H); (7) 4.7ppm (1H); (8
) 5.0ppm (2H); (9) 6.2ppm (1H)
(10) 6.7ppm (3H); (11) 7.2pp
m(1H); (12)7.2ppm(10H) and (1
3) 7.3 ppm (5H); These characteristics can be attributed to the protons of the corresponding numbers in the following formula.

こうして得られたＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−
アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルと
Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルとの付加化合物０
．１２５ｇ（０，１９７ミリモル）を内容積約３０ｍ１
のフラスコにとり、水２ｍｌ及び塩酸（１Ｎ）０．２４
ｍ１（０，２４ミリモル）を加えて、室温で３０分間か
きまぜた。N-benzyloxycarbonyl-L- thus obtained
Addition compound of aspartyl-L-phenylalanine ethyl ester and L-phenylalanine ethyl ester 0
．． 125 g (0,197 mmol) with an internal volume of approximately 30 m1
into a flask, add 2 ml of water and 0.24 mL of hydrochloric acid (1N).
m1 (0.24 mmol) was added and stirred for 30 minutes at room temperature.

得られたスラリーを濾過し、水５ｍｌで洗浄した後乾燥
し、０．０８０７ｇの結晶を得た。The resulting slurry was filtered, washed with 5 ml of water, and then dried to obtain 0.0807 g of crystals.

この結晶はＮ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アスパ
ルチル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルで（純度
１００％、収率９２．６％）、これを酢酸エチル−ｎ−
ヘキサン混合溶媒から再結晶して得た物は：融 点：
１２８ないし１３５℃ 〔α〕■；−１７．３（Ｃ＝１、メタノール）元素分析
値； を与えた。This crystal is N-benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanine ethyl ester (purity 100%, yield 92.6%), which is converted into ethyl acetate-n-
The product obtained by recrystallization from a hexane mixed solvent has: Melting point:
128 to 135°C [α]■; -17.3 (C=1, methanol) elemental analysis value; was given.

その赤外吸収スペクトルは、３，３００ｃｍ−１゜２．
９００〜３，１００ｃｍ−１，１，７３０ｃｍ−１，１
，６９０ｃｍ−１，１，６５５ｃｍ−１，１，５３０ｃ
ｍ−１，１，４４０ｃｍ−１１，２００〜１，２８０ｃ
ｍ−１，１，０３０ｃｍ−１，６９０ｃｍ−１及び７４
０ｃｍ−１に特徴があった。Its infrared absorption spectrum is 3,300 cm-1°2.
900~3,100cm-1,1,730cm-1,1
,690cm-1,1,655cm-1,1,530c
m-1, 1,440cm-11,200~1,280c
m-1, 1,030 cm-1,690 cm-1 and 74
There was a characteristic at 0 cm-1.

また核磁気共鳴スペクトルはδ値で１．ｌｐｐｍ、２．
８ｐｐｍ、３．０ｐｐｍ。In addition, the nuclear magnetic resonance spectrum has a δ value of 1. lppm, 2.
8ppm, 3.0ppm.

４、ｌｐｐｍ、４．６１ｐｐｍ、４．８ｐｐｍ、５．ｌ
ｐｐｍ、６．０ｐｐｍ、７．ｌｐｐｍ、７．３ｐｐｍ及
び９．６ｐｐｍに特徴があった。4, lppm, 4.61ppm, 4.8ppm, 5. l
ppm, 6.0ppm, 7. There were characteristics at lppm, 7.3ppm and 9.6ppm.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図、第３図及び第５図は本発明の方法で中間体とし
て経由する化合物の赤外吸収スペクトルを示す図であり
、第２図及び第４図は本発明の方法で得られる化合物の
赤外吸収スペクトルを示す図である。Figures 1, 3 and 5 are diagrams showing infrared absorption spectra of compounds passed through as intermediates in the method of the present invention, and Figures 2 and 4 are diagrams showing the infrared absorption spectra of compounds obtained by the method of the present invention. It is a figure showing an infrared absorption spectrum of.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ 一般式（１） で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
であるＮ−置換モノアミノジカルボン酸（式中Ｒ８は脂
肪族オキシカルボニル基、核置換基を有することのある
ベンジルオキシカルボニル基、ベンゾイル基、芳香族ス
ルフォニル基又は芳香族スルフィニル基であり、ｎは１
又は２である）と、一般式（Ｉ） で表わされ、少なくともその一部はＬ−型の光学異性体
であるアミノ酸エステル（式中Ｒ２はメチル基、イソプ
ロピル基、イソブチル基、イソアミル基又はベンジル基
であり、Ｒ３は低級アルコキシ基、ベンジルオキシ基又
はベンズヒドリルオキシ基である）とを水性媒体中蛋白
分解酵素の存在下で反応させて、一般式（１） で表わされる化合物（式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒａ及びｎは前
記同様の意味を表わす）を生成させ、これを反応液から
分離し、分離されたこの化合物を酸性水溶液と混合反応
させ、反応混合液を固液分離し、一般式（５） （式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びｎは前記同様の意味である
）で表わされるＬＬ−型ジペプチドエステルを固相とし
て回収することを特徴とするジペプチドエステルの製造
方法。 ２ Ｒ１がベンジルオキシカルボニル基であり、Ｒ２が
ベンジル基であり、Ｒ３がメトキシ基でありｎが１であ
る特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３ Ｒ１がｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル基
であり、Ｒ２がベンジル基であり、Ｒ３が低級アルコキ
シ基であり、ｎが１である特許請求の範囲第１項記載の
製造方法。 ４ Ｒ１がベンジルオキシカルボニル基であり、Ｒ２が
ベンジル基であり、Ｒ３がメトキシ基でありｎが２であ
る特許請求の範囲第１項記載の製造方造。 ５ 水性媒体中、蛋白分解酵素の存在下で行なう反応で
用いる水性媒体及び蛋白分解酵素が、それぞれ水溶液及
び金属プロテアーゼであり、その反応をｐＨ５乃至８で
行なう特許請求の範囲第１項ないし第４項のいずれかの
項記載の製造方法。 ６ 一般式（ｎ）で表わされるアミノ酸エステルがＬ一
体であり、一般式（１）中の がＬ−型である特許請求の範囲第１項ないし第５項のい
ずれかの項記載の製造方法。 ７ 一般式（ｎ）で表わされるアミノ酸エステルがＤＬ
一体であり、一般式（１）中の がＤ−型又はＤ−型とＬ−型との混合型である特許請求
の範囲第１項ないし第５項のいずれかの項記載の製造方
法。 ８ 酸性水溶液の酸性成分が無機酸である特許請求の範
囲第１項ないし第７項のいずれかの項記載の製造方法。 ９ 酸性水溶液の酸性成分が有機酸である特許請求の範
囲第１項ないし第７項のいずれかの項記載の製造方法。 １０ 酸性水溶液の酸性成分の使用量が一般式（ＩＩＩ
）で表わされる化合物１モルに対して１ないし１０当量
である特許請求の範囲第１項ないし第９項のいずれかの
項記載の製造方法。 １１ 酸性水溶液の使用量が一般式（１）で表わされる
化合物１重量部に対して２ないし１０重量部である特許
請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれかの項記載の
製造方法。[Scope of Claims] 1 N-substituted monoaminodicarboxylic acid represented by general formula (1), at least a part of which is an L-type optical isomer (in the formula, R8 is an aliphatic oxycarbonyl group, a nuclear A benzyloxycarbonyl group, benzoyl group, aromatic sulfonyl group, or aromatic sulfinyl group that may have a substituent, and n is 1
or 2), and an amino acid ester represented by the general formula (I), at least a part of which is an L-type optical isomer (wherein R2 is a methyl group, isopropyl group, isobutyl group, isoamyl group or benzyl group, and R3 is a lower alkoxy group, benzyloxy group, or benzhydryloxy group) in the presence of a protease in an aqueous medium to form a compound represented by general formula (1) (formula in which R1, R2, Ra and n represent the same meanings as above) is separated from the reaction solution, the separated compound is mixed and reacted with an acidic aqueous solution, and the reaction mixture is separated into solid and liquid, A method for producing a dipeptide ester, which comprises recovering an LL-type dipeptide ester represented by the general formula (5) (wherein R1, R2, R3 and n have the same meanings as above) as a solid phase. 2. The manufacturing method according to claim 1, wherein R1 is a benzyloxycarbonyl group, R2 is a benzyl group, R3 is a methoxy group, and n is 1. 3. The manufacturing method according to claim 1, wherein R1 is a p-methoxy-benzyloxycarbonyl group, R2 is a benzyl group, R3 is a lower alkoxy group, and n is 1. 4. The manufacturing method according to claim 1, wherein R1 is a benzyloxycarbonyl group, R2 is a benzyl group, R3 is a methoxy group, and n is 2. 5. Claims 1 to 4, wherein the aqueous medium and protease used in the reaction carried out in the presence of a protease in an aqueous medium are an aqueous solution and a metalloprotease, respectively, and the reaction is carried out at a pH of 5 to 8. The manufacturing method described in any of the paragraphs. 6. The production method according to any one of claims 1 to 5, wherein the amino acid ester represented by general formula (n) is L-type, and the amino acid ester in general formula (1) is L-type. . 7 The amino acid ester represented by the general formula (n) is DL
The manufacturing method according to any one of claims 1 to 5, wherein the compound in general formula (1) is a D-type or a mixed type of a D-type and an L-type. 8. The manufacturing method according to any one of claims 1 to 7, wherein the acidic component of the acidic aqueous solution is an inorganic acid. 9. The manufacturing method according to any one of claims 1 to 7, wherein the acidic component of the acidic aqueous solution is an organic acid. 10 The amount of the acidic component used in the acidic aqueous solution is determined by the general formula (III
) The manufacturing method according to any one of claims 1 to 9, wherein the amount is 1 to 10 equivalents per mole of the compound represented by. 11. The manufacturing method according to any one of claims 1 to 10, wherein the amount of the acidic aqueous solution used is 2 to 10 parts by weight per 1 part by weight of the compound represented by formula (1).