JPS58500998A - 腸内毒素生成原であるエシエリキア コリによつて起される下痢症を予防するための新規免疫原組成物 - Google Patents
腸内毒素生成原であるエシエリキア コリによつて起される下痢症を予防するための新規免疫原組成物Info
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- JPS58500998A JPS58500998A JP57502363A JP50236382A JPS58500998A JP S58500998 A JPS58500998 A JP S58500998A JP 57502363 A JP57502363 A JP 57502363A JP 50236382 A JP50236382 A JP 50236382A JP S58500998 A JPS58500998 A JP S58500998A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
名称 腸内毒素生成菌であるエシェリキア コリによって起される下痢症を予防
するための新規免疫原組成物
技術分野
本発明はエシェリキア コリ(Escherichia coli )の腸内毒
素生成原である菌株によって起される急性下痢症の免疫学的予防のために使用さ
れ得る新規の免疫原に関する。この新規免疫原は接合剤、典型的には水溶性カル
ボジイミド即ち/−エチル−3−(3−ツメチルアミノプロピル)カルボジイミ
ドの存在下の接合工程によるエシェリキア コリの熱安定性腸内肴累(エンテロ
トキシン)とエシェリキア コリの熱不安定性腸内毒素(完全ホロトキシン又は
この毒素のBサブユニット)との交差結合反応によって提供される。かようにし
て独自の新規の分子であって該分子中での夫々の毒素の栃性は者しく減弱される
がしかも熱不安定性毒素(又はその日サブユニット)はその抗原性を保持してい
て熱安定性毒素は該反応の機能として免疫原性を保有している該新規の分子が提
供される。この交差結合免疫原を用いる免疫処理は熱不安定性又は熱安定性の腸
内毒素を単独に又は双万共に産生するE、コリの菌株によって誘発さnる水性分
泌物に対する1乳動物の免役学的防衛を果す。
背景技術
エシェリキア コリの腸内毒素生成原困株(ETEC)了知]症はひろい見地か
らみて保健上の大きな課題である。
これらの微生物及びロタウィルス< rotavirus )は低開発熱帯諸国
に主として起る幼児の年間死亡数約千万の原因をなすと世界保健機構が推定する
児童の急性下痢症のΩつの主因をなすものである〔ブラック等の文献(Blac
k。
R,E、、 et al、 / 9 g /−oIncidence and
5everity ofrotavirus and Escherichia
coli diarrhea in ruralBangladesh、 L
ancet / : / ’l / −/ 4’ 3〕参照〕。エシェリキア
コリの腸内毒素生成菌は熱帯地方への旅行者(観光客)である温帯地方住民に起
る急性下痢症の主因をなし、温帯並びに熱帯地方に住む成人に起る特発性下痢症
の通常の原因をなし、又雛乳期の諸動物特に子羊及び子豚に起る屡々致命的な急
性下剤症の原因をなすことがら有畜農業上の大きな問題でもある。
ETEC株による下痢症発生の機構が明かとなった。経口摂取後に「菌は小腸中
心部の粘膜表面に付層する;この過程はプラスミドから誘導された特異的フィン
ブリエ抗原がσ語の表面上に存在する句会に増強される。該フィンブリエ抗原は
宿主に特異的であって人体起源の菌株における巣落化因子であるとされている〔
エバンス等の文献(Evans、 D+G、、 et ah / 97 g 、
New 5urface −associated heat −1abil
e colonization factorantigen (CFA/If
) produced by enterotoxigenicEscheri
chia col i of serogroups Q乙and Q g 。
Infect、 Immun、 、2 / : Is 3 g=乙グア蚕照〕。
人体起原のETECm体中には多重性で抗原的に異種であるフィンブリエ抗原が
存在しておシ、駅棟の病源性ETEC株の場合には特異的フィンブリエ抗原は検
出さtてぃなかった〔デュク等の文献及びレビン等の文献(Deuke、 R,
etal、 / 9 g /、5erotypes of attachmen
t pili ofenterotoxigenic Escherichia
coli 1solated fromhumans、 Infect、 I
mmun、 3.2: / 23 ’l −/ 2乙θand Levine、
M、 M、、 et al、 / 9 g O。
Hemagglutination and colonization fa
ctors inenterotoxigenic and enteropa
thogenic Escherichiacoli that cause
diarrhea、 J、 1nfec、 Dis、 / ’l / ニア 3
3−737)参照〕。該菌はこの環境下に増殖してシラスミドから誘導された。
2種類のエンテロトキシン(腸内毒素)即ち熱不安定性(LT)のトキシン及び
熱安定性(ST)のトキシンを夫々単独に又は−緒に生成する。
LT)キシンのホロトキシン(完全トキシン)は最近純粋型で単離され特性化さ
nた〔クレメンッ等の文献(Clements、 J、 D、、 et at、
/ 979. l5olation andcharacterizatio
n of homogeneous heat−labileenteroto
xins with high 5pecific activity fro
mEscherichia coli cultures、 Infect、
Immun、 2 ’l ニア乙0−769)参照〕。このものは5個の8サブ
ユニツト(小単位)(夫々のMW/、2.oooダルトン)及び/イ固のAサブ
ユニツ) (MW3/、300ダルトン)をIjfることがギル等(G11l、
D、M、 et at、 / 9 g /。
〜乙g、2.) によって報せら几た。HBサブユニット(複数)は腸粘腰表面
上の特異四GMlガシグ17オシド受容体に対してトキシンを付着させ、それに
よってAサブユニットを細胞へ透過さ−せる作用をなす。MAサシユニットは細
胞内のアデニレートサイクラーゼを刺激し、該アデニレートサイクラーゼは流体
と電解質類とを腸管腔中へ分泌させる作用を果す。E、コリのLT)キシンは作
用上、構造上及び免役掌上ビブリオ コレラ(Vibri。
cholerae)が産生する毒素(コレラトキシン)と類似することに注目す
べきである。LT)キシンとコレラトキシン(CT)とは共に同型同数の、はと
んど同じ分子量のサブユニット(複数)を有し:該すブユニットは同じ作用を行
い、該LT)キシン及びCT)キシンはそれらのAサブユニット及びBサブユニ
ットの双方において共通の明確な抗原決定基を有する〔ホルムグレンの文献及び
クレメンツ等の文献(Holmgren、 J、、 / 9 g /。
Actions of cholera toxin and the pre
vention andtreatment of cholera、 Nat
ure 292 ’: ’I / 3−’l / 7and Clements
、 J、D、 et al、 / 97 g、 5hared anduniq
ue immunological determinants of ent
erotoxinsfrom Vibrio cholerae and Es
cherichia cot i 、\1nfec。
Immun、 、22 :り09−7 / 3)参照〕。更にLT)キシン又は
コレラトキシンを用いるラットの免疫処理はLTトキシンによる攻撃に対する予
防を達成する〔ピアスの文献及びクリブシュタインらの文y (Pierce、
N、F。
/、977. Protection against challenge
withEscherichia coli heat−labile ent
erotoxin byimmunization of rats with
cholera toxin−toxoid。
Infect、 Immun、 / g : 33 g −3’l / 、 a
ndKlipstein、 F、A、 et al、 / 9 g /、 Pr
otective affectof immunization of ra
ts with holotoxin or Bsubunit of Esc
herichia coli heat−labileenterotoxin
、 Infect、 Immun、3 / : / ’I ’I −/ 50
)参照〕。
人体起源の菌株から得られたE、コリの熱安定性トキシン(ST)が純粋型にお
いて最近特性化されたことはステイゾル等の文献(5taples、 S、J、
、 et al、、 / 9 g 00Purification and c
haracterization of heat−stableentero
toxin p’roduced bya 5train of E、col
ipathogenic for man、 J、 Biol、 Chem、、
135 : +17/A−ダ72))によシ報ぜられた通シである。ST)キシ
ンは約2,000ダルトンの分子量を有する。このトキシンが粘膜細胞表面にい
かにして付着するかは不確実でりるiれども細胞内に入シ込んだ場合には細胞内
の″グアニレート、サイクラーゼを刺激して流体分泌及び電解質分泌を起させる
。人体起源のETEC株の約20係はLT)キシンのみ(LT”/ST )を、
約60係はLT及びST)キシ/ノ双方(LT”/ST”) を、ソシテ約、2
0% 、id S Tトキシンのみ(LT :/ST+)Y産生する;こnらの
諸型のトキシンの夫々は急性下痢症乞起し得る。
E、コリのETEC株のiに対する汚染にもとづく下痢による広範囲の罹病率と
死亡率との5太に対する防止への最も実用的なアプローチは予防接種の方策によ
るものであった。3種の異る型のE、ユリ抗原が免疫原として有効であることが
判っており、こnらの免疫原はモデル実験においてETEC株の攻撃からの防衛
を果す。
(1)菌体抗原(通常は死菌の全菌体の形)を用いる免疫処理−は小腸内での菌
生育を減することによシ下痢を防止する:但しこの防止効果は相同性の菌体の血
清型のE。
コリに及ぶのみであって非相同性の血清型のE、コリには及ばず、こnらのうち
の/乙ll体は抗原的に不同の菌体細胞の血清型のE、コリであることがみとめ
られている〔グイの文献(Gay、 C,C,、/ 97 /、 Proble
ms ofimmunization in the control of
Escherichia coliinfection、 Ann−N、Y、
Acad、 Sci、 / 7乙:336−3’19)参照〕。
(11) 腸柘膜表面上に接着して集落を形成することを防止するだめの特異的
フィンブリエ抗原を用いる免疫処理も又下痢防止を果すが但しこの防止効果は抗
原量に異るフィンブリエ抗原をもつETEC株にまでは及ばないし〔モルガン等
の文献(Morgan、 R,L−、et at、、 /ソ7g。
1mmunization of suckling pigs agains
tenterotoxigenic Escherichia coli−in
duceddiarrheal disease by vaccinatin
g dams withpurifie69 g 7p or K99 pil
i : Protectioncorrelates with pilus
homoloqy of vaccine andchallenge、Inf
ect、Immun、 、!2 : 77 / −777)参照〕また動物及び
人のETEC株の中に多重性の抗原的に不同のフィンブリエ抗原の存在が検出さ
れている(上寿文献参照)。
(曲 E、コリのLTホロトキシンか又はその日すツユニットを用いる免疫処理
は抗毒素応答を起し、この抗毒素応答はトキシン自体による活性ある攻撃に対し
、及びLTトキシン(LT /ST )並びにLT及びSTトキシン(複数)(
LT+/ST”)を生成する生きている菌株に対し、防衛を果す〔クリブシュタ
イン等の文献(に1ipsteinF、A、 et al、、 /ワ79 、P
rotective effect ofactive immunizati
on with purified Escherichiacoli hea
t−labile enterotoxin in rats、 Infect
。
Immun、 23 : 592−599 and K11pstein、 F
、A、 etal、/ 9 g / 、 Protective effect
of immuniンationof rats with the hol
otoxin of B 5ubunit ofEscherichia co
li heat−labile enterotoxin、 Infect。
Immun、 3 / : / ’l ’I −/ 50 )参照〕。種々の血
清型菌体抗原によって生成されるLT)キシンは抗原的に均質であるのでこのト
キシンを用いる免疫処理は該血清型菌体抗原又はフィンブリエ抗原であるにもか
かわらすすベてのLTトキンン住成菌株に対して防衛する〔クリブシュタイン等
の文献(K11pstein、 F−A、、 et al、 /9g/。
Immunization 、of rats with heat−1abi
le enterotoxinprovides uniform prote
ction against heterologousserotypes
of enterotoxigeni’c Escherichia coli
Infect、 1mmun、3.2 : / / 00− / / 0グ)参
照〕。
但しLT)キシン又けそのBサブユニットを用いる免疫処理はST)キシンのみ
(、LT−/ST+)を産生ずるETEC株に対して防衛することはない〔クリ
ブシュタイン等の上寿文献(K11pstein、 F、A、、 et al、
、 /979.)参照〕。
低分子量のST)キシンは非抗原性である;けれども最近になって牛、豚及び人
のETEC株からの純化されたSTの調製法が記載され、いくつかの研光にょ9
3丁トキシンがハプテン性であることが判った。大分子量の担体例、えば牛血清
アルブミン又は牛の免疫グロブリンGと複合された純化STを用いてしサギ又は
山羊を免疫させるとST)キシンに対する抗拗累を産生することが示され、これ
は幼獣マウス試験におけるST活性を中和する抗血清の該申和罷によって証明さ
れた〔フランツ寺の文献及びギアネラ等の文献(Frantz、、 J、C,、
et al、。
/ 9 g /、1mmunological properties of
Escherichiacoli heat−stable enteroto
xins: devejopment of aradioimmunoass
ay 5pecific for heat−stable entero−t
oxins with suckling rmuse activity、I
nfect。
1mmun、 33 : / 93− / 9 g、 and Giannel
la、 R,A、。
et at、、/ 9 g /、Development of aradio
immunoassay for Escherichia coli hea
t−stable enterotoxin: comparison wit
h the 5uckl ingmouse bioassay、Infect
、 1mmun、 、:j 3 : / g乙−/92)参照〕。更に豚の免疫
グロブリンに複合された半純化のST調製吻を用いるラットの免疫処理はST)
キシン又は1このSTトキンンを産生ずる生活菌株”を用いる活性ある攻撃に対
して防衛を果すが但しLT)キシン又はLT&生性の生活菌株に対して防衛を果
し得ないことを示した〔クリブシュタイン等の文献(に1ipstein、 F
、A、、 et at、、 / 9 g 2. Protection 1nr
ats immunized with Escherichia coli
heat−stableenterotoxin、 Infect、 1mmu
n、 3 ’l :乙37−乙39)参照〕。
上記のトキシンの諸型はE、コリのETEC株に対する免疫処理用のワクチンと
して使用され/gfない。LTボロトキシン自体(又はコレラトキシン)は人の
免役処理のための実用的凭投原ではない。こnVこはいくつかの理由かめる。即
ち第一にその免疫原の型はこfを人に投与した離合に有性ン保持しているのでそ
の稍呆許容さn4ない副作用(非′経口投与のときの筋肉及び皮Nの炎症並びに
縦口投与のと−の下痢)を起す。第二にはLTホロトキシン又はその日サブユニ
ットは上記のETEC株(ST)キシンを産生する)に対して何ら防衛を果さな
い〔クリブシュタイン等の文献(にl1pstein、 F、A、。
et al、 / q 79. Protective effect of
activeimmunization with purified Esc
herichia coli heat−labile enterotoxi
ns in rats、 Infect、 1mmun、 23 :!;92−
399)参照〕。該STトキシンも又急性下痢症の通常の要因をなす。STトキ
シンは有毒であるから実用的でない;それ−は非抗原性であってそれを免疫原と
なすために必要な大分子量の動物性タンパク質担体は人体への使用のために安全
ではない;そして該ST)キシンを用いる免疫処理はLT)キシンを産生するE
TEC株に対して防衛を果し侍すい。
従ってここに必要とされるワクチンは下記の諸条件を具える新規の抗原から成る
ワクチンである:即ち該抗原は(a) L Tか又はSTを産生するETEC株
に対し完投学的防衛を果し、(bl該仇原においてSTトキシンは免疫原を与え
、(C1この抗原を用いる免疫処理が悪い鉤作用を起さないように該抗原の毎性
は充分に語釈されるものでめシ、そして(d)該抗原はBサブユニット(単独で
又はLTホロトキシンの一部として)乞包含し、該Bサブユニットは腸粘膜表面
上の特異的受容個所への接層能にもとづき経口投与による免疫処理を増強して粘
膜#胞が長期にわたって免疫原に対し曝露されるようにするものである。
発明の開示
従って本発明の目的i、4LT又はSTY夫々単独に又は共に産生するE、コリ
の腸内毒素生成原の菌体によって起る急性下痢症に対する哺乳fIDJ物の免段
学的防衛を果丁ために有効であってしかも熱釜性である新規組成物の提供にある
。
本発明の他の1旧はETECにより誘発さnる急性下痢症の予防のための新規の
ワクチンの提供にある。
本発明の他の目的はLT又はSTを産生するETEC株に対して防衛するワクチ
ンの提供にある。
本発明のその他の目的はST及びLT(又はその日サブユニット)を組合せた組
成物であって該組成物においてST及びLTの夫々のトキシンの毒性が減ぜられ
ており、夫々の抗原性は保持さnており、そして特異的粘膜受容体に対するBサ
ブユニットの接着能が維持されぞいる該組成物の提供にある。
本発明に従えばエシェリキア コリの熱不安定性(LT)腸内毒素(ホロトキシ
ンが又はその日サブユニットの形における)或はコレラトキシン(ホロトキシン
か又はその日サブユニットの形における)と熱安定性(ST)腸内毒素とを退官
の接合剤の存在下に反応させる工程による生成物が提供される。単一の理論に支
持されてはいないけnども上記の工程による生成物1=LT分子又はC7分子及
びST分子の夫々に存在するカルボキシル基とアミノ基とを介して父差結合した
分子であって、更にLT又はC7分子の鎖円粕合を含む分子である。従って本明
細曹の記載においてLT又はCTホロトキシンから成る群から選ばれた反応体と
STとの反応の工程による住放物は又差結合5T−LT又は5T−CTと杯さn
、STとBサブユニットとの反応による生成物は交差結付5T−13と称さnる
。
上記の交差結合分子(複数)は予防接種の方法において有効であって、該予防接
種の方法において本発明の組成1勿は本明細書中に参照されているクリブシュタ
イン等の文献(Kl 1pstei−n、 F、A−、et al、 / 9
g /。
Protective effect of immunization of
rats withthe holotoxin or B 5ubunit
of Escherichia coliheat−1abile ente
rotoxin、 Infect、 Immun、 3 / :1qty−−i
so)に報告されているような典型的な予防接種操作による一次免疫処理及びブ
ースター免疫処理(booster immunization、大量抗体産生
のための免疫処理)の双方のための適宜の助剤(アジュバント)の使用下に投与
さ扛る。本発明の組成物は人を含む踊乳動吻に対して有効である。
図面の簡単な説明
添付図面の第1図は各種の免疫原の抗原性の比較に用いられた酵素結合の免疫吸
着試験(ELISA)の方法と得られたデータとの図示であって交差結合LT−
3T調製物のLT抗原性とLT単独の抗原性との比較を示す。
第2図は未免疫化ラットにおける純化LT及びSTに対する分泌応答を測定して
得られたデータの図示である。
第3図は100//の分子比の半純化ST/LTからのST交差結合度に関する
EDAC対全毒累タンノクク質の比の効果の図1示であって反応時1間(rJ、
/g待時間最終的に得ら肛だ接合物(交差結合吻)の中に存在するSTの値を百
分率で示す。
第7図は放射性ヨウ素標識STによる追跡物質投与で測定さnた最f:交差結合
物の中に存在するST(百分率)に関する純化ST対しT又は純化ST対日サブ
ユニットの初期分子比の効果の図示であシ、EDAC/全タンパク質の比はl1
3//であって反応時間は/g待時間あった。
第5図はEDAC/全覆素タン・やり質比10//、ST/LT分子比100/
/を用いた場合の半純化STの交差結合度に関する交差結合反応時間の効果の図
示であって抗原性の値は100係の毒素に対応するように調整された訂正済みの
試料からみちびかれた。
発明を実施するための最良の形態
5丁及びLT又はCT(又はその日サブユニット)の毒素(複数)を用いるワク
チンの使用法はその発展のために夫々の毒素がその生物学的活性を戯じても適切
な免疫応答を刺1gするために元号な免疫原性を保有し続けることを必要とした
。この方式の中へ不適切な抗原を担体として導入することなく、1丁及びCT(
又はそれらのBサシユニット)をSTの免疫学的担体として選択したのでめる。
STは異る10種のアミノ酸から5y、D 、全部で7g個のアミノ酸残基な有
し、その3分のlは半シスチン(half−cystin )である。各分子ハ
/仙の担体に対して交差結合するために用いられる3個のアミノ基(2個のアス
・々ラギン残基、そのうちのl制はNH2−末端のアミノ酸)及び交差結合のた
めに用いられる7個のカルボキシル基(7個のグルタミン酸残基)を石する。L
Tは306個のアミノ酸残基(構造式A□B5と推定されるから族シフ33個の
交差結合可能のアミン基(大部分はリジン及びアルギニン中のイプシロンアミノ
基)と/49個のカルボキシル基(アスパラギン酸及びグルタミン酸として存在
する)とを有する。本発明はその基本的概念として交差結合可能カルがキシル基
と2個の分子上のアミン基(複数)とを介する交差結合ST及びLT又はCT(
或はそれらの8サブユニツト)並びに毒性減弱化の手段としてのし1分子又はC
T分子の領内結合を包含する。
接合された抗原の製造における交差結合用の接合剤としては水溶性カルボジイミ
ドが汎用されている。最有用の水溶性カルボッイミドは/−エチル−3−(3−
ツメチルアミノゾロビル)カルボッイミド(EDAC)及び/−シクロベキ/ル
ー3−C2−モルホリニル−ル〕カルがジイミド( MCD l )である。交
差結合ST−LT,ST−CT又はST−8の製造のための本発明の工程に適切
ないかなる接合剤をも使用し得る。上記の水溶性カルボジイミド(複数)が現在
のところ好適である。
下記の諸例と本発明の説明とにお(・て多数の文献が弓1用される。これらの文
献は本発明の記述の短縮化のために引用されるものである。
且
細形のLTホロトキシンはクレメンツ等の方法[ C’lements,J.
D. 、et al.、 / 9 7 9. Isolation andch
aracterization of homogen’eous heat−
Iabileenterotoxins with high specifi
c activity fromEscherichia coli cult
ures. lnfect. Immun. 2 ’l ニア乙0ー7乙?、f
rom E. coli strain 7 / / (FILT)。
a transformed K− / 、l derivative bea
ring LT gene(s)of the Ent plasmid fr
om porcine strain P 3 0 7 。
described by So, M.、 et at. / 9 7 g
。
Characterization of an Escherichia c
oli plasmidencoding for synthesis of
heat−1abile toxin:′Molecular clonin
g of the toxin determinant。
Infect. Immun.、2/ :’103−’II/)によって製造さ
れた。該トキシン調製物の均質性はポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって
確認された;その生物学的活性は組織培養法でのY−/腎細胞の活性化能の発現
(LT活性の標準的試験法)によシ証明され、その抗原均質性は山羊の単内子L
Tの高度免疫血清を用いる均質な単帯反応( single band rea
ction )における免疫拡散の発現によシ確認された。BサブユニットのL
Tホロトキシンカラの分別はクルメンツ等のクロマトグラフィによる方法( C
lements, J.D.、 et at. /ヲgo。
Properties of homogeneous heat−1abil
e enterotoxinfrom Escherichia coli、I
nfect、Immun、、2 ワ : q /−97)に従った。
ST)キシンは人体起源のL T、、’S T+株であるE、コリ菌株/gD
(0’12:C37)及びテキサス(Texas)l13.2(07g :H/
、2)から産生されたものであってステイゾル等の方法(5taples、 S
、 J、 et al、 /9g0゜Purification and ch
aracterization of heat−stableenterot
oxin produced by a 5train of E、colip
athogenic for man、 J、 Biol 、 Chem、 2
33 ニゲ7/乙−1l−72/)によって細形にされた。この方法は下記の諸
工程から成る=(1)培養F液→(2)アムベルライト(Amberl ite
) X A D −,2によるクロマトグラフィ→(3)アセトンによる沈澱
化→(4)第1回セファデクス(5ephadex) G −25によるクロマ
トグラフ (−+(5)[)EAEセファクリル(5ephacryl )によ
るりC17トグラフイ→(6)第ユ回セファデクスG−,25によるクロマトグ
ラフィ→(7)薄層クロマトグラフィ。夫々の製造工程から得られた諸試製品の
活性をギアネラの方法(Giannel l a。
R,A、、 / 97乙、Suckling mouse model for
detectionof heat−stable Escherichia
coli enterotoxin。
Characteristics of the model、 Infect
、 1mmun+/ 41:qS−ヲ9)の通シ幼獣マウス試験によシ測定した
。
測定値を幼獣マウス単位即ち腸内/胴体内の重量比≧0.0g3を与える青紫重
量として定義さnる単位で表′わす。児全に純粋なST(工程7によシ得られる
)は/μり当シ2Sθマウス単位を含有していた;このSTをウサギ及び山羊の
行異的筒度免反抗血清の調製のため及び放射性ヨードを用いる研究のために使用
した。半純化ST(工程夕の後に得られる)は/μy当シ/g5マウス単位を含
■していた;これを接合(交差結合)研究及び免疫処理研究に使用した。
トキシン調製物及びその接合物の濃度をロウソイ法(Lowry、 O,H,、
et al、 / 93 /、Proteinmeasurement wit
h the Folin phenol reagent、 J。
Biol、 Chem、 /ワ3:、2乙5−、2’75)によるタンtPり′
質含有量で表す。トキシンに関するモル幽量はLTホロトキシンについては9/
、’l!;0ダルトン、Bサブユニットについては57.4100ダルトン及び
5丁トキシンについては2,000ダルトンの既知文献記載の数値に′もとうカ
ルボジイミド反応を用いて1丁トキシンとST)キシンとを又差結合させたが該
反応の使用は・ぐラミングルによシ一般的に述べられている( Bauming
er、 S、 et al。
/ 9 g O,The use of carbod口m1des in t
hepreparation’of immunizing conjugat
es、 p、 / k / −15ワ、In S、P、 Colowick a
nd N、O,Kaplan (ed、)。
Methods in enzymoloqy、 AcademiCPress
、 New York)。
特に記載しない限シを合剤はl−エチル−3−(3−ツメチルアミノゾロピル)
カルボジイミド(EDAC)であつた。交差結合された5T−LT組Fi、物に
/−シクロへキシル−3−〔2−モルホリニル−+111−エチル〕カルボジイ
ミド(MC,DI)の使用の地方法によっても製造され得るがこ扛は特にEDA
Cの使用によらなくても他の諸方ことを示すものである。各糧組成→勿の評価の
だめの交差結合操作の詳細及び−交差結合における変数〔例えばトキシン(複数
)の比、接合順序、EDAC使用量、pH1温度及び反応時間〕を下文に示す。
夫々の場合において接合反応完了の後に寮合すを分子量/2.000の除去袋(
cutoff 、bag)即ち接合物を保持するが未接合ST又は接合剤(即ち
EDAC)を保持しない除去袋の使用下に水に対し徹底的に透析した。最終的に
得られた接合葡中のST存在童はLT又はBサブユニットを添加した当初のタン
パク質量を越えるタンパク質増量によって示された。
トキシン及び交差結合LT−3Tの毒性及び抗原性に関する試験
交差結合5T−LT組厄吻の夫々についてST及びLTの毒性並びに抗原性に関
して試験した結果と未接合のトキシンによって得られた同様の試験の結果とを比
較した。その成績を未接合トキシンに比する交差結合組成物の希釈倍数の変化△
で示すか又は百分率減少で示す。
(a)LTの播性はサック等の記載の方法(5ack、 D、A。
et al、 / 973. Te5t for enterotoxigen
icEscherichia coli using Y −/ adrena
l cells inminiculture−Infect、 Immun、
/ / : 33 ’l −336)を用いるY−/腎細胞組織培養による組
織培養中の被検試料の1−次的なコ倍希釈の試験により測定さnた。該測定はア
デニレートサイクラーゼを刺激するトキシンの能力を測定するものであるから従
って腸粘膜が水及び電解質を分泌するようにさぜる訴導能を測定するものである
。
(b)LTの抗原性はクリブシュタイン等の文献(Klipstein、 F、
A、 et al、 / q g /、 Protective effect
of immunization of rats with the hol
otoxin or Bsubunit of Escherichia co
li heat−1abile enterotoxin、 ′Infect、
Immun、 3 / : / ’l ’l −/ 30 )記載の方法を用
いる酵素結合免疫吸着試験(ELISA)により試験された。基質としてのp−
ニトロフェニルホスフェートを用いると九にアルカリホスファターゼに接合させ
たウサギ抗血清を山羊に対して用いることにより山羊の高度免疫血清対純化LT
(力価/ : 102,000)に関して被検試料の順次2倍希釈拗を直接に試
験した。接合吻対禾接会LTの活性比は乙00の元学苦度即ちODを与える投与
量例えば第7図に例示の投与tからみちびかnlこの場合に交差結合L T−S
Tの抗原性は/、グ倍減じた。
(c)STの視性は前掲文献(Ginnella、 R,A、 / 97乙)記
載の幼獣マウス試験によシ測定された。この測定値は未希釈のSTのマウス単位
に比する交差結合抗原のマウス単位の減少値として記載さnる。
(d)STの抗原性は6ダブルサンドインチ(double−sandwich
) ” E L I S Aによシ評価さねだが該法において仮構試料のコ倍
順次希釈物を、2種の異る高度免疫血清対ST(これらは山羊及びウサギ対ST
に生成されたものである)の中間に存在させた;これらの抗血清対ST)キシン
の抗体力価は/ : /3/、000であった。LT抗原性に関する記載の方法
と同様の方法で接合物の抗原性の値をSTと比較した。
ラットの免疫処理及び攻撃
ラットを免疫処理してからクリゾシュタイン等の詳細記載の操作法(K11ps
tein、 F、A、 et at、 / 9 g /。
Protective effect of immunization of
rats withthe ho)lotoxin or B 5ubuni
t of Escherichia coliheat−labil’e en
terotoxin、 Infect、 1mmun、 3 / : /’l’
1−/汐0)を用いて攻撃した。−人免疫処理のために完全フロインドアジュバ
ントを腹腔内に用い非経口的に免疫処理した。胃の酸性の除去のためにシメチジ
ン[cimetidi’ne;商標名タガメソト(Tagamet )の下にス
ミス、クリン及び71/7チ社(hith、Kl ine & FrenchC
o、・、 Ph1ladelphia、 Pa、)から販売されティる〕を経口
投与してからコ時間後に胃内管を介してブースター免疫処理を施した。
免疫処理されたラットを攻撃するためにLT)キシン及びSTトキシンを用いる
と共にLTのみ(LT+/ST)を産生ずるE、コリの生活菌PB2jfig株
、LTと5T(LT /ST )を産生ずるH1Qダ07株、及びSTのみ(L
T−/ST )を産生ずるテギサスグ32株を用いた未免疫処理動物に最高分泌
量を産生させる量で被検試料の夫々を投与した。夫々のデータは3頭の動物の試
験によって得られた。試験結果は同様な攻撃を受けた未免疫処理動物について得
られた値と対比する免疫処理動物における分泌減少百分率の平均値上平均標準誤
差[SEM)として示される。免疫処理動物におけるSO係以上の分泌減少は免
疫処理ラットにおける分泌量と未免疫処理対照ラットにおける分泌量との間の統
計学的に有意(p<0.00/)な差を表す。
最初の諸研究(これについてのデータは原特許出願明細書の第2表にまとめられ
ている)はEDAC対全トキシンタンパク質の重重比が4を左//の場合にST
とLTとの有意の交差結合を与えると共に減少されたLTi性C>100θ倍)
及びST毒性(>100倍)を与え、しかも強度の抗原性を保持すること、ただ
しEDAC/トキシンの比率がo、11ts/iの場合にはこの成績が達成され
ないことを示した。
交差結合度の極大値を与えるのに必要なEDAC対トキシトキシン比率なN’t
Hに決定するためにST/LTの最初の分子比100//をEDAC対トキシン
タンパク質の比(これを2//〜200//に変化させる)と対応して反応させ
た。この反応をpH7,0,20℃の下に反応時間として/g待時間要して行っ
た。これらの諸結果を第3図に示すがこれはこれらの諸条件下で、EDAC/)
キシンの比がおよそ’l !;//のところでST対しTの最EDACの1oo
vu2及び反応時間1時間を用いる接合条件下でST/LT比(重量基準)を増
すと最終接合物中のSTの比率は増大した。得られたデータを第1表に示す。
これらの諸観察の確認のためにハンター(Hunter、 R。
/97θ、5tandardization of the chlorami
ne−Tmethod of protein 1odination、 Pr
oc、 Soc、 Exp、 Biol。
Med、)のクロラミンT法に従い純化STを無担体の1125で標識した。S
T/LT又はS”17Bのモル比を///〜コθθ//に変えなからST の標
識投与量を用いEDAC/)キシンタンi4り質の比4.5 / /の条件下で
グ℃に/g時間接合反応を行った。これらの結果を第7図に示す。
交差結合5T−LT:初期のST/LT比を順次に高めるともとの混合物へ加え
られて接合物中に保持されていたSTの百分率は直線的に増し、その結果最終接
合物のST比率を順次に増す。初期のS T/L Tモル比の100/lを用い
ると最終接合物は96憾のST(モルで表す)を含有していた。
交差結合5T−8:初期のST/B比を順次に高めると接合物中のSTの比率は
直線的に増す。初期のST/Bモル比の/2左//を用いると最終接合物は97
係のST(モルで表す)を含有して(、・た。
(C) 接合工程の時間の影響
EDAC/)キシンタンパク質の比の’I!;//を用い/g待時間接合反応を
行うと7時間の接合反応の場合よJもLT )キシンの毒性を有意に大きく減じ
た。LT及びSTの抗原性は接合反応順序をLT+ST十EDACとした場合に
1g時間の反■6によシ認めらnる程度に減することはないけれども他の接合反
応順序の離合に抗原性は中等度に減する。得られたデータを第2表に示す。
6
追加の諸研究においてS T/L T比を100//とし及びEDAC/)キシ
ンタンパク質の比をlO:/とし、L T + S T + EDACの添加順
序の下での接合混合物を用いpH7,0及び+’Oの下で接合時間を変えた場合
の影響を評価した。第左図に総括して示される通り接合反応時間を2〜192時
間の範囲で増加させるとLTに対するSTの結合量が漸次増加したが、この場合
に接合されたトキシンの抗原性を有意に希釈させることはなかった。
カルデジイミドの70θ〜を用いる/g待時間接合の条件下でEDAC及びMC
D lは共に減少された毒性及び持続性の抗原性の特性をもつ交差結合5T−1
7分子を生成した。EDACを用いて生成させた交差結合分子は毒性を大きく減
すると共に永続性の抗原性を有する。
得られたデータを第3表に示す。
(e) コレラトキシンを用いるSTの接合E、コリのSTとLT又はそのBサ
ブユニットとの交差結合に使用される条件と同じ接合条件の下でE、コリのST
、!:CTホロトキシン(又はその日サブユニット)とを接合させ得る。STト
キシン対CTホロトキシン又はその日サブユニットの接合は同様の態様を伴う。
既述の通、りCT トキシンとLT)キシンとは構造的にも免疫学的にも相似で
ある。−例としてST/CTモル比100/l及びEDAC/全接合物比10/
/を用いて/g時間反応させると3’1重量係(モル表示で9g%)のSTを有
する接合物を生成する。5T(501)の抗原性とCT C3/4)の抗原性と
が反応生成物中に保持される。
(2)最適の交差結合ワクチン及びその効果上述の観察の結果からSTとLT又
はその日サブユニットとの交差結合の最適条件はS T/L T又はST/Bの
初期モル比は100// 、 E D A C/全全トキシンタンノブ質比は/
θ//(重量基準)及び接合反応時間はグ℃で96・時間と決定さ扛た。
(a) 交差結合5T−LTワクチン二上記の接合条件を用いて製造された交差
結合5T−LT免疫原の性質を第11表に示す。
第 ダ 表
交差結合5T−LTワクチンの性質
(注)(a)接合物の濃度を各トキシンのioo<に相当させるように調整した
(b) 未訂正ワクチンについての直接測定値免疫処理:上記のワクチンを腹腔
内注射/回ft / 000Tg及び経口大量2回投与量、2300μs とし
て投与することによシラットを免疫処理した。経口免疫用のものは全部で約/1
1.5−θST抗原単位(投与量X抗原性)及び2.!;!;OLT抗原単位を
含有していた。第3表に示す通シこの免疫処理の紹果LT)キシンとSTトキシ
ンとの双方及びこれらのトキシンを産生ずる生活細菌に対して有意の防御を達成
した。
(b) 交差結合S T −Bワクチン二上文中の最適接合条件を用いて製造さ
れた交差結合5T−8サブユニツトワクチンの性質を第乙表に示す。
交差結合5T−8サブユニツトワクチンの性質(a)(a)Bサブユニットに対
し高度免疫抗血清を用いELISAによシ測定した値
免疫処理:第6表に示す性質にもとづき交差結合5T−Bサブユニットワクチン
は全経口投与量s、oooμyの中にBサブユニット抗原単位2./!;0及び
ST抗原単位/、100を含有していた。この投与量を用いてラットを免疫処理
したところLTi生性の生活菌株PB2.!;g(LT /ST )C!;、2
±24分泌減少)又はST産生性生活菌株テキサス4を左コ(LT /ST )
C62±14分泌減少)に対し強度の防御を達成した。
(3)交差結合ワクチンへの合成STの利用本明細誉記載のE、コリの餉内毒素
生成原の菌の生育様から得られたトキシンの純化によってみちびかれたST(生
物学的ST)の接合にもとづき、又はアミノ酸シンセサイザーによって生成され
た合成STの接合にもとづき、交差結合5T−LT又は5T−8サブユニツトの
新規の抗原を創製することができる。生育中の菌株/gDから得られる純化され
た生物学的S T (5taples et al。
/ 9 g O,Purification and Characteriz
ation ofheat−stable enterotoxin prod
uced by a 5train of E。
coli pathogenic for man、J、日io1.Chern
−、! 53 :l17/乙−1172/)を構成する7g種のアミノ酸の結合
順序はチャン及びギアネラ(Chan and Giannella。
/ 9 g / +Am1no acid 5equence of heat
−stableenterotoxin produced by Esche
richia coli pathogenicfor man、J、Biol
、Chem、23 乙 ニア74t4t−77116)によって述べられている
。この結合順序を用いて合成8丁がホウトy (Dr、 Richard Ho
ughten、 5crippsC11nic and Re5earch F
oundation、 La Jol la、 Ca1i−fornia)によ
って調製された。この合成ST)キシンが生物学的STと生物学的及び免疫学的
に同一であることは幼獣マウス試験における、又は精すツされたラットの回腸係
蹄における流体分泌発現能にもとづき、及び幼獣マウス試験における合成ST及
び生物学的STの分泌効果を高度免疫ウサギ抗血清対生物学的STが中1口する
能力にもとづき、証明された。
合成STと8サブユニツトとを接合させる反応においてEDAC/全タンノぞり
質比/、左//、ST/Bサブユツトのモル比!;0//、及び反応14間とし
て75時間を使用した。第7表に示さ扛る通シこのワクチンの性質は第6表に示
された交差結合塗物学的5T−8ワクチンの性質と実用上同じである。
(注)(a)高度免疫血清対日サブユニットを用いるELISAによる測定値
生物学的5T−8サブユニツトワクチンについて上述されたのと同じ技法及び同
じ投与量によシ合成5T−8サブユニットワクチンを用いてラットを免疫処理し
たところLTトキシン及びST)キシン並にこれらのトキシンを産生ずる生活菌
株に対し18gg表に示す通シの有慧の防御を達成した。
上記の観察結果は生育細菌から純化によシ導か扛、又は合成的に調製されたST
)キシンとLT)キシン又はCT)キシン(ホロトキシン或はその日サブユニッ
ト)とをカルがジイミドの存在下に接合させると新規の分子即ち交差結合S T
−L ’T及び5T−CT (又は交差結合5T−8サブユニット)を与える
こと、この新規分子は減弱された毒性をもつと共に夫々の成分としてのトキシン
類に関して継続的抗原性並びにST)キシンに関する獲得された免疫原性をもつ
ことを示している。EDACは最有効の接合剤であるけれども本発明者の観察に
よれば交差結合はこの接合剤について特異的ではない。インビトロの研究におい
て下記の諸変数ハ交差結合工程に影響を及ぼすことが示さnた:接合工程順序、
使用のカルボジイミドの濃度、使用のST対しT(又はその日サブユニット)の
比、及び反応時間。最適交差結合反応はり6係(モル基準)のSTを含む分子を
生成し、該交差結合したトキシン(複数)の毒性は未接合トキシンの毒性の<0
./!S%にまで減じたがしかもその抗原性はELISA試験で測定すると>g
o優に保持されていた。
同様の接合条件の下でST)キシンとLTエンテロトキシンのBサブユニットと
を、又はCTとを、交差結合させると均等の性質を示す。こnらの分子の免疫原
としての刃部IはLT)キシン又はSTトキシン自体又はこれらのトキシン類を
産生する生活細菌を夫々単独で又は併用して免疫処理ラットを攻撃した場合に該
分子カニ強度の防御を果す事実によって証明された。
接合物中のST対しT(又はその日サブユニット)の比は接合反応条件を変える
ことによシ分子内LTホロトキシン又はBサブユニットの交差結合の程度を変化
させることにもとづき変えられ得る。かようにして得られた5T−LT (又は
5T−8サブユニツト)接合物はその分子の生物学的毒性が大幅に減ぜられ、L
T(又はその日サブユニット)はその抗原性を保持し、そしてSTは反応の関数
として免疫原性を獲得している点で、独自である。
産業上の利用可能性
使用に際し本発明の新規の免疫原はこれを投与対象、即ち動物又は人に対し種々
の方法で投与し得る。例えば該方法には無毒性のアジュバント例えばミョウバン
沈澱物と共に用いる非経口的(皮下)投与法、又は胃液作用を減じ又は除去した
後に用いらnる経口投与法、或は胃液による不活化に対抗して抗原を保護する製
薬学的形状゛(例えば保護用カプセル若しくは微小球)における投与法が包含さ
れる。
既述の諸成績は本発明の新規の交差結合5T−LT(又は5T−Bサブユニット
)組成物の有効量を投与することによって患者を治療することの証明を与えるも
のである。
本発明の他の特徴的態様はエシェリキアコリ又はビプリオコレレの熱不安定性エ
ンテロトキシン(ホロトキシン又はその日サブユニット)が常用の大分子量タン
zeり質の代シに担体として使用され得ることの発見である。
即ち本発明に従い比較的低分子量のトキシンを交差結合させ得る新規の担体が提
供さnる。この新規父差結合物のLT又はCT部分(又はその日サブユニット)
は共に担体でもあシ且つ抗原でもめる。両者のトキシンは既述の通シそれらの結
合形の場合にその毒性が著しく減ぜられているがしかも双方共に抗原として作用
する。Bサブユニット(サブユニット単独又はホロトキシンの一部分として)は
腸粘膜表面上の特異的なGMエ 受容体に接着することによシ抗原と粘膜との間
の緊密で持続的な接触を保たせるBサブユニットの特性にもとづき経口用ワクチ
ンとしてのこの抗原の価値を増大させる。Bサブユニット(J1独又はLT或は
CTホロトキシンの一部として)の該経口的免疫処理効果の増大化の性質は5T
−LT又は5T−8サブユニツト(この場合にBサグユニットは担体としても抗
原としても作用する)の新規の又差結合物の一部分の性質として記載さ扛だけれ
どもLT又はコレラトキシンのBサブユニットのこの独自の性質はST以外の他
の抗原のための担体として特に使用されて経口月ワクチンとして投与され罠とき
の効果を増大するために40用されるのである。
本発明は接合剤、アジュ・マント及び反応条件の特別な諸例に関して記載された
けれども本発明の技術範囲を逸脱することなく他の均等の組成物及び反応条件を
使用し得るものである。本明細曹はST)キシンとE、コリのLTホロトキシン
又はその日サブユニットとを交差結合させることによる新規抗原の提供の例示を
主として記載した。コレラトキシンのホロトキシン及ヒソのB、fブユニット並
びにE、コリのL’Tホロトキシン及びその日サブユニットの相互間の構造的、
機能的及び完投学的近似性は本明細書記載の諸性質を有する類似の新規抗原がE
、コリST)キシンとコレラトキシンのホロトキシン又はその日サブユニットと
の交差結合によっても創製されることを明示するものである。
冷加抗原(P9)
槍唯−寓フ噌
LT(一対するSTの交を刹P釦良1:関するEDAC,対 仝要素タンパク黄
の北−〃呆EDAC: 夕]1悼脅11北(!量比)第3図
第4図
文S整介反爬略葡(hr)
第5図
Claims (1)
- 1.熱安定性(ST)エンテロトキシンとエシェリキアコリの熱不安定性(LT )エンテロトキシン、該熱不安定性(LT)エンテロトキシンの8サブユニツト 、シン及び該コレラトキシン(CT)ホロトキシンの8サツユニツトから成る群 から選ばれる反応体とを適切な接合剤の存在下で反応させることによ)製造され た生成物を包含することを特徴とする下痢症に対する噌乳動物の免疫処理のため の組成物。 2、熱不安定性エンテロトキシン又は熱安定性エンテロトキシンを一単独に又は 双方共に産生ずる相同性及び非相同性の菌体細胞の血清型のエシェリキアコリ株 によって起される下痢症の予防のための免疫処理に使用される有効で無毒性の抗 原の提供のために逝切な゛アノユパントと組合せらnfcことを特徴とする請求 の範囲第1項に記載の組成物゛。 3、反応混合物におけるST対対反鉢体モル比が少くともS一対/であることを 特徴とする請求の範囲第1項に記載の組、底物。 4、接合剤が水溶性カルがジイミド又はその他の有効な接合剤であることを特徴 とする諸本の範囲第1項に記゛載の組成物。 5、 カルがジイミドがl−エチル−3−(3−ジメチルする請求の範囲第9項 に記載の組成物。 6、反応を1時間以上継続させることを特徴とする請求の範囲i/項に記載のm l1X、物。 7、腸内毒素原性のエシェリキアコリ株による下痢症の免疫学的予防に使用され る有効な抗原の提供のために適切なアジュバントと組合せられたことを特徴とす る請求の範囲第3項に記載の組成物。 8、アジュバントがフロイントの完全アジュバント又はその他の適宜のアジュバ ント例えばミョウiNンであることを特徴とする請求の範囲第1項に記載の組成 物。 9、反応体が熱不安定性(LT)エンテロトキシンであることを特徴とする請求 の範囲第1項に記載の組成物。 10、反応体が熱不安定性(LT)エンテロトキシンのBサブユニットであるこ とを特徴とする請求の範囲第1項に記載の組成物。 11、 反応体がコレラトキシン(CT)のホロトキシンであることを特徴とす る請求の範囲第1項に記載の組成物。 12、反応体がコレラトキシン(CT)ホロトキシンのBサブユニットであるこ とを特徴とする請求の範囲第1項に記載の組成物。 13、請求の範囲第1項に記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする腸 内毒素原性のエシェリキアコリ株による下痢症に対する踊乳動物の免疫処理方法 。 14、組成物を非経口的に投与することを特徴とする特許の範囲第/3項に記載 の方法。 150組成物を経口的に投与することを特徴とする請求の範囲第73項に記載の 方法。 16、反応体が熱不安定性(LT)エンテロトキシン又はその日サブユニットで あることを特徴とする請求の範囲第13項に記載の方法。 17、反応体がコレラトキシン(CT)ホロトキシン又はその日サブユニットで あることを特徴とする請求の範囲第13項に記載の方法。 18、@乳動物が人であることを特徴とする請求の範囲第13項に記載の方法。 19、抗原と結合さnる担体がエシェリキアコリの熱不安定性、(L、:+T )エンテロトキシンのBサブユニット又はコレラトキシン(CT)の8サブユニ ツトであることを特徴とする抗原の経口投与のための担体の使用。
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1982
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