JPS58500737A - Method for isolating proteins from plant leaves - Google Patents
Method for isolating proteins from plant leavesInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 広い面においては、本発明は植物の葉から蛋白質の単離法に関する。別の面にお いては、本発明は植物の緑葉からりブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼ を得る方法に関する。別のさらに特別の面においては、氷見キシラーゼを得る方 法に関する。[Detailed description of the invention] In a broad aspect, the present invention relates to a method for isolating proteins from plant leaves. on another side According to the present invention, broth from green leaves of a plant is used as a xylase. Regarding how to get . In another more special aspect, how to obtain Himi xylase Regarding the law.
参照関連出願 本出願は１９７９年９月２４日提出の本出願者らの係属中の米国特許出願第７８ ，５０５号の一部継続出願であり、上記出願の記載を引用文献とする。Reference related applications This application is filed September 24, 1979, in our pending U.S. Patent Application No. 78. , No. 505, and the description of the above application is cited as a cited document.
背 景 たばこ、はうれんそう、大豆、こむぎ、綿、むらさきうまごやしを含め、ある種 の植物の多汁葉は固体１０〜２０チからなり、残りは水である。その部分のうち 、固体部分は水溶性部分と水不溶性部分とからなシ、後者は大部分業の繊維状構 造物質から成っている。background Certain species, including tobacco, canola, soybeans, wheat, cotton, and purple horseradish The succulent leaves of this plant consist of 10 to 20 pieces of solid matter, with the remainder being water. of that part , the solid part consists of a water-soluble part and a water-insoluble part, the latter being mostly a fibrous structure. It is made up of synthetic substances.
水溶性化合物は２群に分けることができる。１群は分子量が約１０．ＯＤＤを越 えない糖、ビタミン、アミノ酸およびその他の化合物のような比較的低分子量の 化合物を含む。第２の群は分子量が約３０，０００以上のほとんどもっばら蛋白 質である。Water-soluble compounds can be divided into two groups. Group 1 has a molecular weight of about 10. Beyond ODD relatively low molecular weight compounds such as sugars, vitamins, amino acids and other compounds that cannot be Contains compounds. The second group consists almost exclusively of proteins with molecular weights above about 30,000. It is quality.
この蛋白質は２両分に分けることができる。１画分は分子量が約３０．ＯＤＤ〜 １００．［１００の範囲である蛋白質の混合物を含む。この蛋白質は時々「画分 ２蛋白質」と呼ばれる。残りの画分は分子量約５５０，０００を有する単一蛋白 質からなシ、時々「画分１蛋白質」と呼ばれる。This protein can be divided into two parts. One fraction has a molecular weight of approximately 30. ODD~ 100. [Contains a mixture of proteins in the range of 100]. This protein is sometimes referred to as “fraction 2 protein. The remaining fraction consists of a single protein with a molecular weight of approximately 550,000. Because of its quality, it is sometimes called "fraction 1 protein."
画分１蛋白質は１９４７年にはじめて確認された。次の研究はこの蛋白質が光合 成に含まれる酵素であるという発見に導い、た。そのとき以来、多数の名前がつ けられてきた。これらのなかにはりブロース、１．５−二リン酸カルがキシラー ゼ、カルがキシディスムターゼ、リブロース１１５−ニリン酸カルがキシラーゼ 、リブロース１．５−二リン酸カルざキシラーゼ−オキシゲナーゼがある。Fraction 1 protein was first identified in 1947. The next study will focus on photosynthesis of this protein. This led to the discovery that it was an enzyme contained in Since then, many names have been added. I've been kicked. Among these, broth, 1,5-diphosphate cal is xylar Cal is xidimutase, ribulose 115-diphosphate cal is xylase , ribulose 1,5-diphosphate calxylase-oxygenase.
画分１蛋白質は葉の全蛋白質含量の２５％ｉでおよび葉の固体物質の１０係まで を構成できる。１９７０年にたばこの葉から結晶性画分１蛋白質を得ることがで きることが発見された。Fraction 1 protein accounts for 25% of the total protein content of leaves and up to 10% of the solid matter of leaves. can be configured. In 1970, it was possible to obtain crystalline fraction 1 protein from tobacco leaves. It was discovered that it can be done.
画分１蛋白質は純粋なときは無臭、無味、無色で、高い栄養価をもつ。これらの 性質から、および高純度で得られることから、画分１蛋白質は動物および人間に 対する食品補充物として潜在的に価値のある用途をもっと考えられる。人間の場 合、このような添加剤は高蛋白質またはその他の特別な食餌の１成分であること ができる。Fraction 1 protein is odorless, tasteless, and colorless when pure, and has high nutritional value. these Due to its nature and high purity, Fraction 1 proteins are suitable for use in animals and humans. Many more potentially valuable applications can be considered as food supplements. human place If so, such additives should be a component of high-protein or other special diets. Can be done.
たとえば、上記添加剤は腎臓病のため透析を必要とする人の食餌への補充物とし て提案されてきている。For example, these additives may be used as supplements to the diet of people who require dialysis due to kidney disease. have been proposed.
栽培植物中に比較的豊富にあるにもがかわらず、植物から画分１蛋白質を得るた めの当該技術で既知の方法は商業的に可能では々いから１画分１蛋白質は商業上 重要な製品ではない。Despite being relatively abundant in cultivated plants, it is difficult to obtain fraction 1 proteins from plants. Methods known in the art for this purpose are not commercially viable; Not an important product.
画分１蛋白質を単離するための三つの基本的方法が公表文献に記載されている。Three basic methods for isolating Fraction 1 proteins have been described in the published literature.
各公表の方法は植物の葉または葉と茎をノ４ルプにすることからはじまり、つい でノ臂ルゾから緑色ジュースをしぼる。細かい粒状の緑色顔料含有物質を含む緑 色ジュースをたとえば濾過または遠心分離によって澄明にして、液体から細かい 粒状固体物質を分離する。生成液体はかつ色である。Each published method begins by cutting the leaves or leaves and stems of the plant into no4rupu, and then Squeeze the green juice from your elbow. green containing finely granular green pigment-containing substances Color juices can be clarified, for example by filtration or centrifugation, to remove fines from liquid. Separate particulate solid material. The produced liquid is also colored.
画分１蛋白質単離のための記載の第１の方法は、分子濾過によってかっ色ジュー ス中の低分子量化合物から部分分離すると同時に、画分１蛋白質を濃縮すること を伴なった。細孔が画分１蛋白質を通すことなく一層小さい分子を通すモレキュ ラーシープを使い、小分子がその細孔を通過するようにかっ色ジュースを加圧下 に置いた。The first method described for Fraction 1 protein isolation is to isolate the brown juice by molecular filtration. fraction 1 protein is partially separated from low molecular weight compounds in the fraction 1 protein. accompanied by. A molecule whose pores do not allow fraction 1 proteins to pass through, but allow smaller molecules to pass through. Using a lar sheep, the brown juice is heated under pressure so that small molecules pass through its pores. I placed it on.
画分１蛋白質を含む溶液を約５ に濃縮し、透析して溶液中の小分子をさらに除 去した。コロジオン型透析袋を使い透析を行なった。上記袋の細孔は画分１蛋白 質の通過を許さないが、一層小さい分子を袋を通し水中に逃した。透析中′１画 分１蛋白質の結晶が生成した。画分１蛋白質を単離するため開発された第２の方 法は、葉から得られたかっ色ジュースをセファデックスクロマトグラフィーカラ ムを通すことを伴なった。セファデックδは重合糖の水不溶性の微視的ビードか らなっている。分離を行なうためセファデックスＧ−２５またはＧ−５０が使わ れた。適当なビードを選択すると、一層大きな分子を排除して小分子がビードの 構造の内部に浸透することを可能にする。それ故、一層大きい分子はしつか多充 填されたセファデックスビード間の隙間の液体中にのみ見出される。この隙間空 間は「空げき容積」と呼ばれる。The solution containing Fraction 1 protein is concentrated to approximately 5% and dialyzed to further remove small molecules in the solution. I left. Dialysis was performed using a collodion-type dialysis bag. The pores of the bag above are fraction 1 proteins. It did not allow any particles to pass through, but allowed smaller molecules to escape through the bag and into the water. '1 stroke during dialysis 1 protein crystal was formed. A second method developed to isolate fraction 1 proteins The brown juice obtained from the leaves is subjected to Sephadex chromatography. It involved passing through the system. Is Sephadec δ a water-insoluble microscopic bead of polymerized sugar? It is becoming more and more. Sephadex G-25 or G-50 is used to perform the separation. It was. Choosing a suitable bead will allow small molecules to fill the bead, excluding larger molecules. Allows to penetrate inside the structure. Therefore, larger molecules are more abundant. It is found only in the liquid in the interstices between filled Sephadex beads. this gap The space between them is called the ``empty volume''.
有効な分離を達成するためには、かっ色ジュースの容積はビードの全容積の約２ ５憾を越えることはでき々い。To achieve effective separation, the volume of brown juice should be approximately 2 of the total volume of the bead. It is impossible to exceed 5 regrets.
ビードをまず緩衝液と平衡にさせ、ついで同一緩衝液を含むかっ色ジュースの所 定容積をセファデックスカラムの頂部に層にしておく。The beads are first equilibrated with a buffer and then placed in a brown juice containing the same buffer. A fixed volume is layered on top of the Sephadex column.
このかつ免液を緩衝溶液を使ってカラムから溶出する。This liquid is eluted from the column using a buffer solution.
ジュースがカラムを下方に動くにつれ、小分子はビードの内部へ浸透するから小 分子の通過は遅延される。他方。As the juice moves down the column, small molecules permeate into the interior of the bead. Passage of molecules is delayed. On the other hand.
大きな画分１の分子はビード間の隙間によ〕形成された迷路を通りカラムを一層 はやい速度で下方に動き、透明かっ色溶液としてカラムから出る。しかし、溶出 は該溶液を少なくとも２倍希釈する。一層小さい分子の除去は画分１蛋白質の分 子のまわシの環境を変えて、結晶化に導びく。The large fraction 1 molecules pass through the labyrinth formed by the gaps between the beads and move further up the column. It moves downwards at a rapid rate and exits the column as a clear brown solution. However, elution dilute the solution at least twice. Removal of smaller molecules is for fraction 1 proteins. Change the child's environment and lead it to crystallization.
最も新しく記載の方法は上記のようにセファデックスＧ−２５カラムを通しかっ 色ジュースを一過させる。たばこ以外の全植物の抽出の場合のように、画分１蛋 白質が結晶化しないときは、溶液が３０〜５０％飽和まで硫殿し、これを遠心分 離により集める。分離後、沈殿が析出した容量よりも少ない容量の緩衝液に沈殿 を再溶解し。The most recently described method uses a Sephadex G-25 column as described above. Strain the color juice. Fraction 1 protein, as in the case of whole plant extractions other than tobacco. If the white matter does not crystallize, the solution is sulfated to 30-50% saturation and centrifuged. Collect by separation. After separation, the precipitate is precipitated in a volume of buffer less than the volume in which it was precipitated. Re-dissolve.
これにポリエチレングリコール８憾を添加する。この混合物をシリカグルを含む 別の開放皿忙隣接した開放皿に入れ、二つの皿を密閉容器に閉じ込める。水が蛋 白質溶液から徐々に蒸発し、シリカグルによシ吸収される。時上記の従来の当該 技術の方法は時間を浪費し、費用がかかるか、またはその両者であることは当業 者には明らかである。しかし１本出願人の係属中の米国特許出願第７８．５０５ 号において１葉をノ４ルグに変換し、ノヤルプの液体部分を蛋白質を変性させる 温度以下の温度に加熱し、ついで液体部分を画分１蛋白質、すなわちリブロース １，５−ニリン酸カルがキシラーゼが結晶化する温度に冷す工程からなる画分１ 蛋白質の簡単な単離法が記載されている。Add 8 ml of polyethylene glycol to this. This mixture contains silica glu Place another open dish into an adjacent open dish and seal the two dishes in an airtight container. water is stagnant It gradually evaporates from the white matter solution and is absorbed by silica glue. When the above conventional applicable It is known in the art that technical methods are time consuming and/or expensive. It is obvious to those who However, one applicant's pending U.S. Patent Application No. 78.505 In No. 1, one leaf is converted to No4rug, and the liquid part of Noyalp is denatured to protein. The liquid portion is then heated to a temperature below the Fraction 1 consists of cooling 1,5-diphosphate to a temperature at which xylase crystallizes. A simple method for protein isolation is described.
発明の要約 本出願人の係属中の米国特許出願第７８，５０５号に記載の発明以来、緑葉植物 の葉からりブロース１，５−二リン酸カル？キシラーゼを単離する一層簡単な一 層有効さ方法が発見された。この点に関ル、当該方法の必須部分とはじめには考 えられていた加熱工程を大抵の場合はふけることが発見された。この改良法によ ると１葉かわち約ｐＨ５，０で起る等電点よ９上の値までの範囲の値に調節する ことによって、リブロース１，５−ニリン酸カル？キシラーゼを結晶形で得る。Summary of the invention Since the invention described in applicant's pending U.S. Patent Application No. 78,505, green leafy plants Leaf broth 1,5-diphosphate Cal? An even easier way to isolate xylase A layer effectiveness method was discovered. In this regard, the essential parts of the method and the It has been discovered that in most cases the heating process that was available is not allowed. This improved method Then, the value is adjusted to a value within the range of 9 points above the isoelectric point, which occurs at one leaf or about pH 5.0. By this, ribulose 1,5-diphosphate cal? The xylase is obtained in crystalline form.
不溶物質を分離後、液体を好ましくは常温以下に冷しながら放置して、画分１蛋 白質を結晶化させる。・ｐＨが減少すると、すなわち等電点近くになると、結晶 化が一層容易に起こることが一般に認め・られた。After separating the insoluble substances, the liquid is left to cool, preferably below room temperature, to separate the fraction 1 protein. Crystallizes white matter.・When the pH decreases, that is, when it approaches the isoelectric point, crystals It was generally accepted that the process of change occurred more easily.
本発明の目的は画分１蛋白質の改良単離法を提供するにある。It is an object of the present invention to provide an improved method for isolating Fraction 1 proteins.
他の目的は高い収率と純度で画分１蛋白質を得ることである。Another objective is to obtain Fraction 1 protein in high yield and purity.
これらの目的およびその他の目的を本発明によシ遂行する方式を１次の発明の詳 細な説明で記載する。The manner in which these and other objects are achieved by the present invention will be described in detail below. Describe in detail.
発明の詳細な説明 多種類の葉からりブロース１，５−ニリン酸カルがキシラーゼおよび低分子量蛋 白質の単離に本発明の方法を使用できる。しかし、たばこの葉、４１１Ｆに未熟 たばこの葉は特に高い蛋白質源であるから、本発明の方法にこのような葉を使う のが好ましい。したがって１本発明を特にたばこからのりブロース１，５−ニリ ン酸カルがキシラーゼの単離に関し記載する。Detailed description of the invention Various types of leaf broth 1,5-diphosphoric acid are useful for xylase and low molecular weight proteins. The method of the invention can be used to isolate white matter. However, tobacco leaves are unripe at 411F. Since tobacco leaves are a particularly high source of protein, such leaves are used in the method of the invention. is preferable. Therefore, the present invention is particularly applicable to 1,5-nitric acid paste broth from tobacco. The authors describe the isolation of xylase.
たばこ植物から葉を離した後１葉または小さい植物が葉温である場合は葉と茎と を粉砕し、破砕し、または他の方法でｉ４ルプに小さくシ、固体から葉の液体部 分を遊離さす。好ましくは、パルプにする工程は還元剤の存在で実施する。この 点に関し、パルプにする工程は葉中に存在するフェノールオキシダーゼ酵素を葉 の蛋白質と接触させる。これは蛋白質の一次構造の一部分を構成するチロシンの ような芳香族アミノ酸の醇化をまねく。この酸化はかつ色になることにより目で わかるように蛋白質を変性し、その水溶解度を下げる。還元剤は事実この酸化を 抑制する酸化防止剤として作用する。After removing the leaves from the tobacco plant, remove the leaves and stems if one leaf or small plants are still warm. Grind, crush, or otherwise reduce the liquid portion of the leaves from the solid to smaller pieces. Release the minutes. Preferably, the pulping step is carried out in the presence of a reducing agent. this Regarding this point, the pulping process removes the phenol oxidase enzyme present in the leaves. protein. This is due to tyrosine, which forms part of the protein's primary structure. This leads to the enrichment of aromatic amino acids such as This oxidation is visible to the eye due to its color. As you can see, it denatures the protein and reduces its aqueous solubility. Reducing agents actually reduce this oxidation Acts as an inhibitory antioxidant.
本発明で使うのに現在好ましい還元剤は２−メルカプトエタノールである。この ものは揮発性で、下記のさらに処理中蒸発して、単離物質中にほとんどまたは全 く残留物を残さないからである。しかし、その他の還元剤も使用できる。このな かにはメタ重亜硫酸ナトリウムおよびジチオトレイトールのような試薬がある。A currently preferred reducing agent for use in the present invention is 2-mercaptoethanol. this They are volatile and evaporate during further processing, leaving little or all of the material in the isolated material. This is because it leaves no residue. However, other reducing agents can also be used. This one Crab has reagents such as sodium metabisulfite and dithiothreitol.
たとえあっても、これらの試薬の残留物の分離は常法を使い行なえる。酸化を制 御するのに十分な還元剤の量はたとえば選んだ試薬に依存し変化できる。２−メ ルカプトエタノールの場合は、望ましくない酸化を有効に抑制することは、処理 する植物物質１ｋ１１当シ該液体試薬約５−を使って達成できる。Separation of residuals of these reagents, if any, can be accomplished using conventional methods. Controls oxidation The amount of reducing agent sufficient to control can vary depending on, for example, the reagents chosen. 2-Me In the case of lucaptoethanol, the effective suppression of undesired oxidation is This can be achieved using about 500 ml of the liquid reagent of 1 k11 of the plant material.
植物物質の液体部分は画分１を含む植物蛋白質および溶解形のその他の固体を含 んでいる。ノ４ルゾの固体部分は粗い容易に分離される物質および液体から分離 困難な細かい粒状の緑色顔料含有物質を含んでいる。粗い物質は葉物質をパルプ に変換した後すばやく液体部分から分離するのが好ましい。たとえば、チーズ布 を使う簡単な濾過がこの分離を達成する。これを行なったとき、なお細かい粒状 の緑色顔料含有物質を含んでいる液体部分を必要なときは酸で、好ましくは塩酸 で処理して、ｐＨを望ましい範囲内に、すなわち約ｐＨ６，０から液体部分中の 蛋白質が変性しそれによって無定形塊として析出する等電点近くだがそれ以上の 点までの範囲内にする。この塊は画分１と画分２の蛋白質物質の両者を含んでい る。The liquid portion of the plant material contains plant proteins, including fraction 1, and other solids in dissolved form. I'm reading. The solid part of the 4-ruzo is separated from coarse, easily separated substances and liquids. Contains difficult, finely granular green pigment-containing substances. Coarse material pulps leaf material It is preferable to separate it from the liquid part quickly after conversion. For example, cheese cloth A simple filtration using . When this is done, even fine grains If necessary, the liquid portion containing the green pigment-containing material is treated with an acid, preferably hydrochloric acid. in the liquid portion to bring the pH within the desired range, i.e. from about pH 6.0 to Near the isoelectric point, but above, where the protein denatures and thereby precipitates as an amorphous mass. Within the range up to the point. This mass contains both fraction 1 and fraction 2 protein material. Ru.
蛋白質の等電点は約ｐＨ’５．０である。そこで、本発明に従いｐＨを調節すべ き実際的下限は約ｐＨ５，３である。液体を酸性にした後、粗い物質の分離を実 施できる。The isoelectric point of proteins is approximately pH'5.0. Therefore, it is necessary to adjust the pH according to the present invention. The practical lower limit is approximately pH 5.3. After acidifying the liquid, separation of coarse substances is carried out. It can be done.
リン酸および硫酸を含めその他の鉱酸も使用できる。Other mineral acids can also be used, including phosphoric and sulfuric acids.
たばこの葉ノ４ルゾの液体部分のｐＨは植物の年令に従い変化することがわかっ た。著しく若い植物、すなわち約１２インチ高さ以下の植物の場合は、 ｐＨは 約６．０以上の範囲である。植物が成熟するにつれ、液体部分のｐＨは下がシ、 すなわち液体部分は当然一層酸性である。It was found that the pH of the liquid part of tobacco leaves changes depending on the age of the plant. Ta. For very young plants, less than about 12 inches tall, the pH is It is in the range of about 6.0 or more. As the plant matures, the pH of the liquid part decreases; That is, the liquid part is naturally more acidic.
たとえば、１８〜２４インチの範囲の高さの植物からの液体のｐＨは約５．７で あ゛シ、一方２４〜３６インチの植物から得られた液体部分は約５．３のｐＨを 有していたＯ 最上の結果を得るためには、゛好ましくは液体のｐＨ−＋ を約５．４〜５．８ の範囲に、最も好ましくは約５．４〜５．６のｐＨに調節する。ｐＨが約５．８ 以上であると、結晶化は低ｐＨよシも著しく遅い速度で起る。これに対比し、ｐ Ｈを約５．４以下に調節すると、得られる画分１蛋白質は望ましい物質を失なっ ている。ｐＨを等電点近くに調節すると、画分１蛋白質にその変性で生じるもの と類似の変化を起すと考えられる。たとえば、約５．４以下のｐＨで液体から結 晶化する画分１蛋白質を再溶解することは一層困難である。For example, the pH of liquid from plants ranging from 18 to 24 inches in height is approximately 5.7. Yes, while the liquid portion obtained from 24-36 inch plants has a pH of about 5.3. O had For best results, the pH of the liquid is preferably about 5.4 to 5.8. , most preferably to a pH of about 5.4 to 5.6. pH is about 5.8 Above this, crystallization occurs at a significantly slower rate than at low pH. In contrast, p By adjusting H to below about 5.4, the resulting Fraction 1 protein will not lose desirable substances. ing. When the pH is adjusted to near the isoelectric point, fraction 1 proteins undergo denaturation. It is thought that similar changes occur. For example, at a pH of about 5.4 or less, It is more difficult to redissolve fraction 1 proteins that crystallize.
ｐＨを好ましい臘囲内５．４〜５．６に調節することによって、細かい粒状緑色 物質は一部分凝固するのでその分離が容易になることも見出された。植物葉緑素 を含むこの物質は適当な方法で分離できるが、遠心分離が便利で好ましい方法で ある。By adjusting the pH to within the preferred range of 5.4-5.6, fine granular green It has also been found that the material partially solidifies, thereby facilitating its separation. plant chlorophyll This substance, which contains be.
ある場合には、特に一層成熟した植物からのｉ４ルプ物質の場合には、または約 ５．６以上のｐＨを使うときは。In some cases, especially in the case of i4p material from more mature plants, or about When using a pH of 5.6 or higher.
容易に分離するために細かい粒状緑色物質を含む混合物を加熱する必要があシ得 る。加熱工程は細かい粒状物質を上記のように遠心分離によシ分離できる程度壕 で凝固する効果を有する。It may be necessary to heat the mixture containing the fine granular green material in order to separate it easily Ru. The heating process is heated to a depth that allows fine particulate matter to be separated by centrifugation as described above. It has a coagulating effect.
緑色の細かい粒状物質の分離を容易にするため、全ノ４ルプを加熱できる。しか し、粗い物質を除去後桟るノ４ルノ部分を加熱することが好ましい。The entire tube can be heated to facilitate separation of the green fine particulate material. deer However, it is preferable to heat the remaining portion after removing the coarse material.
加熱工程は蛋白質が熱のみによシ変性する温度以下の温度で実施する必要がある 。そこで、一般には加熱工程は約５２℃以下で実施すべきである。はぼこの温度 で加熱すると蛋白質の沈殿を生じるからである。パルプを約４８℃（１１８Ｔ） で多くて約１５分加熱することによできるが、一層長い加熱時間を必要とする。The heating process must be performed at a temperature below the temperature at which the protein is denatured by heat alone. . Therefore, the heating step should generally be carried out at a temperature below about 52°C. The temperature of the sky This is because heating at high temperatures will cause protein precipitation. Pulp at about 48℃ (118T) Although it can be done by heating for at most about 15 minutes, it requires a longer heating time.
本出願人の係属中の米国特許第７８．５０５号に記載のように、熱処理を連続式 でまたはバッチ式で実施できる。そこで、パッチ法では、ノヤルノを容器に入れ 、パルプの部分または少なくともその液体部分が蛋白質が変性する温度まで加熱 されない条件下でノ９ルゾに熱を伝導する。上記のように、好ましくはパルプを ５０±１℃に約１５〜約２０分加熱する。The heat treatment is carried out in a continuous manner, as described in applicant's co-pending U.S. Pat. No. 78,505. It can be carried out manually or batchwise. Therefore, in the patch method, Noyaruno is placed in a container. , heating a portion of the pulp, or at least its liquid portion, to a temperature at which the proteins denature. conducts heat to No9Ruso under conditions where it is not As above, preferably pulp Heat to 50±1°C for about 15 to about 20 minutes.
連続法では、・ヤルプの特定容量が５０±１℃に約１５〜約２０分熱交換にょシ 加熱されるような温度に加熱された液体に浸漬したコイルを通し下洛にかくはん することなくパルプをポンプ送シし、ついで・ぐルプの温１１ｔ−下げるため５ ０℃以下の温度の液体と接触しているコイルを通しポンプ送りする。In the continuous method, the specific capacity of the jar is heated to 50±1°C for about 15 to 20 minutes during heat exchange. A coil is immersed in a liquid heated to such a temperature that it is passed through a coil and stirred into the lower part. In order to pump the pulp without heating, and then lower the temperature of the pulp by 11t, It is pumped through a coil that is in contact with a liquid at a temperature below 0°C.
細かい粒状物質を凝固さすための上記のようなｉ４ルゾの加熱は、単にｐＨを調 節するよりも一層有効である。Heating the i4Luso as described above to coagulate fine particulate matter simply adjusts the pH. It is even more effective than clauses.
しかし、細かい粒状物質・を除去するため必要な場合にだけ加熱法を使うべきで ある。加熱は画分１蛋白質の結晶化が起る時間を長くし、ある場合には得られる 蛋白質の量を減らす実際的効果を有するからである。However, heating methods should only be used when necessary to remove fine particulate matter. be. Heating increases the time for crystallization of fraction 1 proteins to occur, and in some cases This is because it has the practical effect of reducing the amount of protein.
示したように、凝固後たとえば遠心分離によって液体部分から細かい粒状物質を 分離できる。得られる上澄液体はかっ色ジュースである。このジュースを結晶化 が起る温度に、ふつうは室温またはそれよシ低い温度で貯蔵し、画分１蛋白質の 結晶を得る。かっ色ジュースを約８℃に冷却することにより特に良好な結果が得 られた。必要な最大貯蔵時間は多くて約１６時間である。１６時間を越える貯蔵 はふつう収率を改善しないことを経験した。As shown, fine particulate matter is removed from the liquid part after solidification, for example by centrifugation. Can be separated. The resulting supernatant liquid is a brown juice. crystallize this juice Fraction 1 proteins are stored at a temperature at which Obtain crystals. Particularly good results have been obtained by cooling the brown juice to about 8°C. It was done. The maximum storage time required is at most about 16 hours. Storage for over 16 hours It has been experienced that this generally does not improve yield.
結晶化したりブロース１，５−ニリン酸カルボキシラーゼを濾過または遠心分離 （３０００ＰＰＭ、５分）によシ上澄液から分離する。Crystallize or broth 1,5-diphosphate carboxylase by filtration or centrifugation. (3000 PPM, 5 minutes) and separate from the supernatant.
リブロース１．５−ニリン酸カルボキシラーゼの結晶形は従来の当該技術の方法 を使って得られる３形態とは異なっている。形態！結晶は十二面体形を有し、モ レキュラーシーブまたはセファデックスクロマトグラフィーを使う上記方法によ り製造される。形態旺結晶は極度に薄い板形を有し、著しく特別な条件下でのみ またＸ線結晶学研究のためにはごく少Ｉでしか製造されていない。The crystal form of ribulose 1,5-diphosphate carboxylase was obtained by the conventional method of the art. This is different from the three forms obtained using . form! The crystal has a dodecahedral shape, and The above method using regular sieve or Sephadex chromatography manufactured by Morphophilic crystals have an extremely thin plate shape and can only be formed under very special conditions. In addition, only a small amount of I is produced for X-ray crystallography research.
形態■結晶は四角肉離であり、上記の＠酸アンモニウムおよびＩリエチレングリ コール処理により製造される。Morphology: The crystals are rectangular and separated from the above-mentioned ammonium acid and I-lyethylene glycol. Manufactured by coal processing.
これに対比し、ここに記載の方法で製造された画分１蛋白質結晶は、当該技術で 既知の他の三つの結晶形と異なシ第４の形態をとる。そこで１本発明の方法を使 うと、顕微鏡検査によシ明らかな六角形をもつ画分１蛋白質結晶Ａ％高収率で高 純度で得られる。In contrast, fraction 1 protein crystals produced by the method described herein are It has a fourth crystal form that is different from the other three known crystal forms. Therefore, one method of the present invention is used. Fraction 1 protein crystals with a hexagonal shape evident by microscopic examination showed a high yield of A%. Obtained in purity.
食塩（Ｎａα）を含む水に再溶解する形態Ｉ結晶に対比し、六角形結晶は未溶解 で残るが、結晶を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨ７，５またはそれよシ高 いｐＨに調節した水に懸濁すると一般に溶液になる。かっ色ジュースが当然５． ３のｐＨを有する着しく成熟した植物、すなわち高さ２４〜３６インチの植物か ら得られた蛋白質は水（ＮａＯＨの添加によりｐＨ８，５） に再溶解できない 。再溶解した画分１蛋白質を緩衝液に対し透析しく３回％Ｉ）８７．５）、つい でセファデックスカラムを通すと、再結晶するが、形態！結晶となる。In contrast to Form I crystals, which redissolve in water containing common salt (Naα), hexagonal crystals remain undissolved. The remaining crystals are diluted with sodium hydroxide (NaOH) to pH 7.5 or higher. When suspended in water adjusted to a low pH, it generally becomes a solution. Naturally, the brown juice is 5. A well-grown, mature plant, i.e., a plant 24 to 36 inches tall, with a pH of 3. The protein obtained cannot be redissolved in water (pH 8.5 due to the addition of NaOH). . The redissolved fraction 1 protein was dialyzed 3 times against buffer at %I) 87.5) and then When passed through a Sephadex column, it recrystallizes, but the form! Becomes a crystal.
かっ色ジュースから得られる画分１結晶は、汚染物を除くため水洗することによ シ典利に精製できる。また遠心分離によシ上澄液から結晶の分離が最もよく達成 される。５分間の低速遠心分離（３，ＯＯＯＲＰＭ）で足りる。Fraction 1 crystals obtained from brown juice are washed with water to remove contaminants. It can be refined to a high degree. Separation of crystals from the supernatant is best achieved by centrifugation. be done. Low speed centrifugation (3, OOORPM) for 5 minutes is sufficient.
画分１蛋白質のこの結晶化法はかっ色ジュースから上記蛋白質を実質上完全に除 去する。得られる上澄液は画分２蛋白質、その他の可溶性固体、およびあったと しても未結晶化画分１蛋白質を含んでいる。等電点以下に、すなわちｐＨ，５、 ０以下に酸性にすることによって１画分２蛋白質を上澄液から除去できる。これ は溶液中の蛋白質を沈殿させる。塩酸またはその他の適当な酸の添加によシｐＨ を約４．０〜４．５に調節することにより、蛋白質の最高収率が得られる。得ら れる沈殿を遠心分離（３０００ＲＰＭ、５分）によシ集めることができる。This method of crystallization of Fraction 1 proteins virtually completely removes the proteins from the brown juice. leave The resulting supernatant contains Fraction 2 protein, other soluble solids, and However, the uncrystallized fraction 1 contains protein. Below the isoelectric point, i.e. pH, 5, Fraction 1 and 2 proteins can be removed from the supernatant by acidifying the supernatant to below 0. this precipitates proteins in solution. pH by addition of hydrochloric acid or other suitable acid The highest yield of protein is obtained by adjusting the ratio to about 4.0-4.5. Obtained The resulting precipitate can be collected by centrifugation (3000 RPM, 5 minutes).
沈殿を水洗し、ふたたび遠心分離によ）集めるときは、汚染物を除去できる。Contaminants can be removed when the precipitate is collected (washed with water and then centrifuged again).
葉を刈入れ、これを／４′−ルノに変換しく粉砕、破砕、ｔたはその他の適当な 方法によることができる）、ｐＨを調節し、必要ならば加熱工程を行ない、液体 部分から固体物質を分離する間の時間経過は、できるだけ刈入れ後すぐに遂行す る必要がある。これらの工程の遂行における遅延は得られるリゾロース１，５− ニリン酸カルがキシラーゼの収率を下げる。そこで、葉を刈入れる場所またはそ の付近でこれらの操作を行なうのが好ましい。Harvest the leaves and crush, crush, crush or other suitable methods to convert them into /4'-luno. method), adjust the pH, perform a heating step if necessary, and The time lapse during the separation of solid material from the parts should be carried out as soon as possible after harvesting. It is necessary to The delay in carrying out these steps is due to the resulting lysolose 1,5- Cal diphosphate reduces the yield of xylase. Therefore, the place where leaves are harvested or It is preferable to perform these operations near .
次の実施例は本発明のさらに詳細を示す。The following examples provide further details of the invention.
実施例１ 型ＮＣ９５のたばこ植物を作物当９０．５平方フィートの作物密度で、１８〜２ ４インチの高さに達するまで栽培した。葉が濃緑色となるように該植物を栽培し た。Example 1 Tobacco plants of type NC95 were grown at a crop density of 90.5 square feet per crop of 18 to 2 The plants were grown until they reached a height of 4 inches. The plant is cultivated so that the leaves are dark green. Ta.
植物の全空気中部分を刈入れ、１ガロンの大きさのウオーリングプレンダーに導 入するのに十分小さい片に切断した。プレンダーの羽根を水約２００ｍで蔽った 。（ウォーリングプレンダーは羽根を液体中に沈めなければ植物物質を砕解しな い。しかし、リーラディスイッチグレーターのような他の装置では、水の添加は 不必要である。）刈シ入れた植物物質から得られた粗く切シ刻んだ茎と葉の１１ ℃ｇパッチを、２−メルカプトエタノール５−と共に水に添加し、滑らかなパル プにまで配合した。濃いホットターキノぐターのコンシスチンシーを有する得ら れた・ぐルテは約１．２ｔの容量からなっていた。・やルデ中の粗い物質を８イ ンチ直径の３２メツシユふるい上に支持された２ ４／２０メツシユチーズ布の ２層の上にあけた。Trim all the aerial parts of the plant and direct it into a 1 gallon sized wall splender. cut into pieces small enough to fit. Covered Plender's wings with about 200 meters of water. . (Walling splendors require the blades to be submerged in liquid to break up plant material.) stomach. However, in other devices such as the Leeladiswitch grater, the addition of water is It's unnecessary. ) 11 of coarsely chopped stems and leaves obtained from harvested plant material The °Cg patch was added to water with 2-mercaptoethanol 5- to form a smooth pulp. It has even been added to the liquid. The product has the consistency of a thick hot turkey powder. The tank had a capacity of approximately 1.2 tons.・Remove the coarse material in the Rude by 8 steps. of 24/20 mesh cheese cloth supported on a 32 inch diameter 32 mesh sieve. I opened it on top of the second layer.
上記ふるいは捕集フラスコ内へ流出する大きなＦ斗のなかに置かれていた。The sieve was placed in a large funnel that drained into the collection flask.
このように処理し、パルプ１．２ｔから緑色顔料含有 −物質を含む液体約１． Ｏｔが得られた。この「、緑色ジュース」は異なる調製物において約５．７〜５ ．９のｐＨを有していた。Processed in this way, from 1.2 t of pulp approximately 1.2 t of liquid containing green pigment-containing material is extracted. Ot was obtained. This "green juice" in different preparations is about 5.7-5 ．． It had a pH of 9.
この緑色ジュースを各々５００−の等しい試料に分割した。１試料を２５℃に保 ち、他の試料は５０℃に１０分加熱した。ついで両試料をペックマン超遠心機で ／８．ＯＯＯＲＰＭのＲ−２１回転子で５０分同時に遠心分離した。この高い遠 心力は全ての緑色を沈殿として除去し、透明な「かっ色ジュース」を残した。か っ色ジュースの各試料、すなわち加熱試料と加熱してな匠試料を等しい部分に分 割し、一つを８℃で貯蔵し、他を２５℃で放置した。各試料から画分１蛋白質の 等しい量が結晶化した。結晶化はすべての場合２６時間以内に完結したが、かっ 色ジュースを冷凍した場合結晶が一層迅速にあられれた。この実施例はりブロー ス１１５−二リン酸カルがキシラーゼの結晶を得るのに、液体部分の加熱は必須 ではなかったことを示している。This green juice was divided into 500 equal samples each. 1 sample kept at 25℃ The other samples were heated to 50°C for 10 minutes. Both samples were then placed in a Peckman ultracentrifuge. /8. They were simultaneously centrifuged for 50 minutes in an OOORPM R-21 rotor. This high distance Shinryoku removed all the green color as a precipitate, leaving behind a clear "brown juice." mosquito Divide each sample of dark juice into equal parts, i.e. heated sample and unheated sample. One was stored at 8°C and the other was left at 25°C. of fraction 1 protein from each sample. Equal amounts crystallized. Crystallization was completed within 26 hours in all cases, but in Crystals formed more quickly when the colored juice was frozen. This example beam blow Heating of the liquid part is essential to obtain crystals of xylase from Cal 115-diphosphate. It shows that it was not.
実施例２ 実施例１の操作を使い、高さ１８〜２４インチのたばこ植物からｐＨ５−７を有 する緑色ジュースを得た。こノ緑色ジュースを二つの等しい部分に分割した。一 つの部分のｐＨを水酸化ナトリウムを使いｐＨ，６，２に調節した。両部会を５ ０℃に１０分加熱して、適当な遠心分物質を除去後、かっ色ジュースの２試料を ８℃で貯蔵した。数時間以内に、ｐＨ’ ５ 、７のかっ色・ジュースでは結晶 があられれた。ｐＨ６，２を有する試料では２４時間後でさえ結晶はあられれな かった。同様の実験で、ｐＨ５，３を有する高さ２４〜３６インチのたばこ植物 から得られたかっ色ジュースは３０分以内に結晶を生じ、結晶が最初にあられれ た後３時間以内に完全な結晶化が起った。しかし、得られた画分１蛋白質はｐＨ ８〜８．５で再溶解しなかった。かつ免液がｐ）１５．８である高さ１８〜２４ インチのたばこ植物を使った別の実験で、画分１蛋白質の結晶は１２時間ではあ られれなかった。結晶化は１６時間以内に完結した。これらのデータから画分１ 蛋白質の結晶の生成は一層低いｐＨで一層迅速に起ることがわかる。Example 2 Using the procedure of Example 1, tobacco plants with a pH of 5-7 were grown from 18 to 24 inches tall. I got green juice. Divide this green juice into two equal parts. one The pH of the two parts was adjusted to pH 6.2 using sodium hydroxide. Both subcommittees 5 Two samples of brown juice were heated to 0°C for 10 minutes to remove the appropriate centrifuged material. Stored at 8°C. Within a few hours, crystals form in brown-colored juices with a pH of 5 and 7. Hail! No crystals were formed even after 24 hours in the sample with pH 6.2. won. In a similar experiment, tobacco plants 24 to 36 inches tall with a pH of 5.3 The brown juice obtained from Complete crystallization occurred within 3 hours. However, the fraction 1 protein obtained was It did not re-dissolve at 8-8.5. and height 18-24 with liquid immunity p) 15.8 In another experiment using inch tobacco plants, fraction 1 protein crystals did not form within 12 hours. I couldn't do it. Crystallization was completed within 16 hours. From these data, fraction 1 It can be seen that the formation of protein crystals occurs more rapidly at lower pH.
実施例６ 実施例１の方法を使い、１２インチ以下の高さの著しく若いたばこ植物から緑色 ジュースを得た。こうして得たジュースは１）Ｈ６，０を有していた。得られた 全ジュースを二つの等しい部分に分割し、各部分をさらに処理するために四つの 等しい試料にさらに分割した。ｐＨ６，０を有するもとの部分の各々から１試料 を対照として使った。各部分からの１試料を塩酸で処理してｐＨ−＋５．８にし 、別のものをｐＨ５，６に調節し、別のものをｐＨ５，４に調節した。一つの部 分の４試料を５０℃に１０分加熱゛した。これらの４試料および他の部分からの ４試料を遠心分離して細かい粒状の緑色物質を分離した。Example 6 Using the method of Example 1, green tobacco plants are grown from very young tobacco plants less than 12 inches tall. Got the juice. The juice thus obtained had 1) H6,0; obtained Divide the whole juice into two equal parts and divide each part into four parts for further processing. Subdivided into equal samples. One sample from each of the original parts with pH 6.0 was used as a control. One sample from each portion was treated with hydrochloric acid to pH −+5.8. , another adjusted to pH 5,6 and another adjusted to pH 5,4. one part Four samples were heated to 50°C for 10 minutes. From these four samples and other parts 4 samples were centrifuged to separate the fine granular green material.
全試料を８℃で放置して画分１蛋白質の結晶を生成させた。結晶が最初にあられ れた時間を記録し、結晶化が完結したとき、得られた結晶の量を記録した。かっ 色ジュースを分光測光的に分析し、かっ色ジュースを汚染している微粉砕緑色粒 状物質の量を測定した。結果を次の第１表に示す。All samples were left at 8°C to form fraction 1 protein crystals. crystals first hail The amount of crystals obtained was recorded when the crystallization was completed. Kaa Spectrophotometric analysis of colored juice reveals finely ground green particles contaminating brown juice The amount of the substance was measured. The results are shown in Table 1 below.
加熱せず ６．０ ８ １０ ６ ５．８ ６ ５ ’ ６ ５．６ ３ １ ６ ５．４ ３．、 ０ ’ ６ ５０℃に加熱 ６．０ ’４８ ０ ３５．８ ４８ ０’ ３ ５．６ １６ ０ ５ ５．４ ３ ０ に れらのデータから、画分１蛋白質の結晶化を起すのに加熱は必要ではなくて、事 実大抵の場合結晶化速度を遅らせ、得られる蛋白質の量を減らすことがさらにわ かる。ｐＨを下ける効果は結晶化が起る速度を明らかに増すことである。さらに 、試料の加熱は細かい粒状の緑色物質の分離を容易にしたが、ｐｉ−１を５．４ 〜５．６に調節すると未加熱試料でも緑色物質の完全な分離が起った。Without heating 6.0 8 10 6 5.8 6 5’6 5.6 3 1 6 5.4 3. , 0’6 Heat to 50℃ 6.0'48 0 35.8 48 0'3 5.6 16 0 5 5.4 to 30 These data indicate that heating is not necessary to cause fraction 1 protein crystallization; In fact, in most cases it is even more likely to slow down the crystallization rate and reduce the amount of protein obtained. Karu. The effect of lowering the pH is to clearly increase the rate at which crystallization occurs. moreover , heating the sample facilitated the separation of the fine granular green material, but the pi-1 was reduced to 5.4 When adjusted to ~5.6, complete separation of the green material occurred even in the unheated sample.
緑色ジュースおよび画分１蛋白質の結晶化後のかっ色ジュースの分析遠心分離か ら得られたシュリーラン模様を比較することによシ、ｐＨを望む範囲に調節した 緑色ジュースからの画分１蛋白質の分離効率を決定した。前者は２本のよく分離 したピークを示し、その一つは画分１蛋白質に相当し、他は画分２蛋白質に相当 する。後者では、画分２蛋白質に相当する単一のピークのみ観察される。分析遠 心分離法は画分１蛋白質の０’、１ｍｙ／−程度の少量を検出できるから、結晶 化完結後は、溶液中に残っている画分１蛋白質の濃度は１チ以下であると確信を もって言える。これに対比し、セファデックスカラムを使う従来の当該技術のク ロマトグラフィー法から得られた母液は、画分２蛋白質のほかに、未結晶化画分 １蛋白質約３０チを含んでいた。Analytical centrifugation of green juice and brown juice after crystallization of fraction 1 proteins The pH was adjusted to the desired range by comparing the schlieran patterns obtained from the The separation efficiency of fraction 1 protein from green juice was determined. The former has two well-separated One of the peaks corresponds to fraction 1 protein and the other corresponds to fraction 2 protein. do. In the latter, only a single peak corresponding to fraction 2 protein is observed. analysis distance Since the heart separation method can detect small amounts of fraction 1 protein as small as 0' and 1 my/-, After completion of the reaction, be sure that the concentration of Fraction 1 protein remaining in the solution is less than 1%. I can definitely say that. In contrast, conventional techniques using Sephadex columns The mother liquor obtained from the chromatography method contains fraction 2 protein as well as the uncrystallized fraction. It contained about 30 grams of protein per serving.
上記から、本発明は植物物質から蛋白質、特に画分１蛋白質を得る便利な方法を 提供することがわかる。こうして、本発明の方法は従来の当該技術の方法で必要 としたような費用のかかる精巧な分、子濾過およびセファデックスカラムの必要 性を回避する。さらに、還元剤および液体のｐＨの調節に使う酸以外の化学試薬 を必要としない。還元剤が２−メルカゾトエタノールの場合は、両分加熱工程中 追出される。該液体をうすめる必要がないから、画分２蛋白質の回収も簡単であ る。最後に、液体部分から画分２蛋白質および未結晶化画分１蛋白質の除去後、 液体部分は従来の当該技術の方法で得られる残留物を使う場合よりも一層経済的 に回収できる価値ある低分子量化合物をなお含んでいる。これらは天然形で未希 釈だからである。これに対比し、従来の当該技術の方法で得られた残留物はその 方法で使われる化学薬品により汚染されてお９、また画分１蛋白質の分離中希釈 されており、さらに回収を複雑にする。本改良法はまた大抵の場合本出願人の係 属中の米国特許出願第７８．５０５号に記載の加熱工程を使うことを不必要とす る。From the above, the present invention provides a convenient method for obtaining proteins, especially fraction 1 proteins, from plant materials. You can see what we offer. Thus, the method of the present invention does not require the prior art methods of the art. Requires expensive and sophisticated separations such as microfiltration and Sephadex columns Avoid sex. Additionally, reducing agents and chemical reagents other than acids used to adjust the pH of liquids. does not require. When the reducing agent is 2-mercazotoethanol, both parts are heated during the heating process. be kicked out. Since there is no need to dilute the liquid, recovery of fraction 2 protein is also easy. Ru. Finally, after removing fraction 2 protein and uncrystallized fraction 1 protein from the liquid part, The liquid part is more economical than using the residue obtained by the conventional methods of the art. It still contains valuable low molecular weight compounds that can be recovered. These are rare in their natural form. This is because it is an interpretation. In contrast, the residue obtained by the conventional method of the art is Fraction 9 is contaminated by chemicals used in the method and is also diluted during separation of fraction 1 proteins. This further complicates recovery. The improved method also applies to applicants in most cases. It is unnecessary to use the heating process described in U.S. patent application Ser. No. 78,505. Ru.
本発明を現在好ましい具体化に関して記載してきた。The invention has been described in terms of presently preferred embodiments.
しかし、本発明の上記記載から、請求の範囲によってのみ限定される本発明の範 囲から離れることなく当該方法の変形が可能なことは当業者には明らかである。However, from the above description of the invention, it is clear that the scope of the invention is limited only by the claims. It will be obvious to those skilled in the art that variations in the method are possible without departing from the scope.
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