JPS584915B2 - アデノシンジホスフェ−トを測定する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアデノシンジホスフエート（ＡＤＰ）を水溶液
中の酵素によって定量測定するための方法に関する。

生化学においては以前からＡＤＰの測定及びＡＤＰを生
成する反応の測定に大きな関心が持たれている。

ＡＤＰ形成はＡＴＰ変換の尺度、すなわち生体の中心的
なエネルギー運搬体の評価の尺度である。

しかし臨床化学においても心臓、肝臓及び腎臓の病気を
診断する際にＡＤＰ−測定が重要である。

ＡＤＰ生成反応の経過におけるＡＤＰ検出は生化学及び
臨床化学において同様に重要である。

本明細書においてピルバートキナーゼ及びクレアチンキ
ナーゼの検出を酵素測定と、かつクレアチニン及びグリ
セリン検出を代謝産物測定と名づける。

したがって生理的液体、例えば血清、組織、細菌で汚染
された水性物質又は他の水性液体中のＡＤＰの測定は大
きな実地的な意味を有する。

ＡＤＰの酵素による検出には３つの異なる方法が使用さ
れた。

第一の方法はＡＤＰをＰＥＰ（ホスホエノールピルベー
ト）及びＰＫ（ピルバートキナーゼ）でホスホリル化し
てＡＴＰとし、かつ先成するピルベートをＮＡＤＨ／Ｌ
ＤＨ（ラクタートデヒドロゲ゛ナーゼ）で検出する。

この力法は以前から公知であり、”ネーチュア（ Ｎａ
ｔｕｒｅ ）”誌（１７８巻、６３２頁。

１９５６年）に記載されている。

他の２方法も同様にＡＤＰを例えばクレアチンホスフエ
ート及びＣＫでホスホリル化し、かつ形成されるＡＴＰ
を検出することに基づく。

ＰＧＫニホスホグリセリンキナーゼ ＧＡＰＤＨ−グリセリンアルデヒドホスファートデヒド
ロゲナーゼ この反応も以前から公知であり、ＢＢＡ（ビオヒミカ・
工・ビオフイジ力・アクタ）″（第１巻、２９２頁。

１９４７年）に記載されていいる。

ＨＫ−へキソキナーゼ Ｇ−６−ＰＤＨニグルコース−６−ホスファートデヒド
ロゲナーゼ この反応は既に少なくとも１９５５年から使用され、例
えば“メソツヅ・オブ・エンチーム（ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆ Ｅ ｎｚｙｍ ） ” （第２巻、４９７頁
。

コーンベルク（ Ａ − Ｋｏｍ ｂｅｒｇ ）著〕に
記載されている。

ところでこれらの方法はその使用を困難にする、あるい
は高い費用につかせる種々の欠点を持っている。

Ａによる検出はＡＴＰからＡＤＰを生成する反応の指示
系として用いるのに原則的には適し、かつその目的には
成功したのだが、ＮＡＤＨ吸光の減少が認められる。

かかる試験では測定技術的な理由からＮＡＤＨで限定さ
れた初期吸光が存在し得るにすぎない。

その結果使用される指示酵素ＬＤＨがその基質ＮＡＤＨ
で飽和されず、したがってその最犬の反応速度が得られ
ない。

これを酵素の投入量を高めることにより調整しなくては
ならない。

これは非経済的であるのみならず、他の障害的な酵素活
性が試験系中に大きな程度で入り込む危険も包含する。

もう一つの欠点は、完全な変換が始まる前に高いＡＤＰ
濃度でＮＡＤＨが既に消費される可能性から生じる。

その場合には誤って低い値が測定される。

力法Ｂのより重大な欠点は、先行の指示反応の原理によ
り一定量のＡＤＰが化学量論的に算定可能なＮＡＤＨ形
成の原因となるのであるが、整数の化学量論的数量が存
在しないので、計算がきわめて複雑であることである。

その上に、ＡＴＰの存在が平衡の付加的な変化の原因と
なり、このことが計算を更に困難にする。

したがってこの方法は実地では殆ど使用されていない。

更には後続のホルマザン反応による測定シグナルの強化
が可能ではない。

方法Ｃは前記の欠点を持たない。

その代わりに他の２つの欠点を持つ。

方法Ｃは、ＡＤＰをホスホリル化してＡＴＰにし、次い
でこのＡＴＰを検出することより成るので、この方法が
組合せ試験でＡＴＰから形成されるＡＤＰを検出するの
には適当ではないことは明白である。

下記で詳説されるように、ＡＴＰからＡＤＰを生成する
多数の反応を測定することが重要である。

しかしこの検出には常に同一の指示系を使用するように
しなければならない。

それというのも産生バッチを大きくすればするほど、必
要とする酵素及び試薬をそれだけ有利に産生することが
できるからである。

更に測定をＵＶ一光で実施するのは基本的には不利であ
る、それというのもＵＶ一光中で測定するための装置は
可視光中の測定のための装置よりも常に著しく高価であ
るからである。

したがって本発明の課題は、公知方法の欠点を持たない
、ＡＤＰの測定方法を見出すことである。

特に本発明の目的は、短かい測定時間と吸収増加又は酵
素測定の際には１分当りの吸収増加のある恒温保持のみ
とを必要とし、より簡単な光度測定装置を利用し得るた
めに可視光線中での測定を可能にし、かつ同時にＡＴＰ
からＡＤＰを生成する種々の反応に適用することのでき
る方法を見出すことである。

該課題は本発明によりキナーゼを用いて該キナーゼに対
するホスホリル化された基質の存在でＡＴＰ及び脱ホス
ホリル化された基質の形成下にホスホリル化することに
より水溶液中のアデンシンジホスフエート（ＡＤＰ）を
酵素によって定量測定する方法により解決され、該方法
は脱ホスホリル化された基質を、場合によりもう一つの
助反応を介在させ、デヒドロゲナーゼの存在でＮＡＤ（
Ｐ）と反応させ、かつ形成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを直接
測定するか又は電子逓伝体の存在でホルマザンの形成下
にテトラゾリウム塩と反応させ、かつホルマザンを測定
することより成る。

したがって本発明による方法の基本思想はＮＡＤＨが消
費される反応と関連する従来の方汐法と異なり、逆にＮ
ＡＤ又はＮＡＤＰを還元してＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰ
Ｈにする反応と関連することである。

本発明の方法に関して多数の実施形が可能である。

それというのも数種のかかる反応は定量的な反応経過と
組合わせ可能であることが判明したからである。

しかしながらＡＤＰをホスホリル化してＡＴＰとする第
一反応の燐を含まない基質を直接ＮＡＤ又はＮＡＤＰ及
びデヒドロゲナーゼと反応させることは必ずしも可能で
はない。

かかる場合には助反応、特に脱カルボキシル化反応、ア
ミノ基転移反応又はヘキソース又はペントースとのカッ
プリングを介在させなければならない。

同様に形成されるＮＡＤ（Ｐ）を直接測定せず、色素に
変えるのが屡々有利であり、その際好適なテトラゾリウ
ム塩と電子逓伝体、例えばジアホラーゼの存在で反応さ
せて相応する着色したホルマザンとし、かつ得られる色
を測定する。

好適なテトラゾリウム塩及び電子逓伝体は当業者には公
知である。

ここでは単に例えば次のものを挙げる：３−（４．５−
ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフエニルテトラ
ゾリウムブロミド、ニトロブルー、テトラゾリウムクロ
リド及び２−（ｐ−ヨードフエニル） − ３ − （
ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニルーテトラソリウム
クロリド。

本発明の方法の優れた実施形によれば、ガラクトースキ
ナーゼ及びガラクトースデヒドロゲナーゼを用いて次の
式により明らかである反応順序で実施される： Ｇａｌ−１−ｐ＝ガラクトース−１−ホスフエートＧａ
ｌ−キナーセ゛＝ガラクトースーキナーゼＧａｌ−ＤＨ
＝ガラクトースーデヒドロゲナーゼこれらの式は以前か
ら公知である〔゜゛バイオケミカル・ジャーナル（ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｊ− ） ”第４４巻、４６０頁（１９
４９年）及び０ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリ（ＪＬＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ−）’一第２２７巻
、７４５頁（１９５７年）〕。

しかしながら意想外にも前記の反応を相互にかつＡＴＰ
からＡＤＰを形成する反応と組合せることができること
が判明した。

これにより形成されるＮＡＤＨによる吸収増加がＡＤＰ
の量の尺度となり、組合わされる、ＡＴＰからＡＤＰを
形成する反応で酵素活性を測定する場合には形成される
ＮＡＤＨによる単位時間当りの吸収増加が目的の酵素活
性の尺度となる。

かかる組合せは、２０年以上も昔から任意の方法により
ＡＤＰを測定することが探求され、かつ反応も久しく知
られていたことから明らかであるように、従来は可能で
あると思われていなかった。

特に有利には電子逓伝体の存在でテトラゾリウム塩を用
いて着色ホルマザンの同時形成下に、形成されたＮＡＤ
Ｈの逆酸化をする反応を更に後接続する。

ホルマザンは可視光線中で容易に測定することができる
。

この反応は次の式に相当する： 電子逓伝体としては前記のジアホラーゼが優れている。

しかし当業者に公知の他の電子逓伝体も使用することが
できる。

その際特にフエナジンメトスルフエート（ＰＭＳ）及び
フエナントロリンメトスルホネートがきわめて好適であ
ると示された。

テトラゾリウム塩としては前記のＭＴＴが優れている。

しかし他のテトラゾリウム塩も使用することができる。

良好な結果は特にニトロブルーテトラゾリウムクロリド
（ＮＥＴ）及び２一（ｐ−ヨードフエニル）−３−（ｐ
−ニトロフエニル）−５フエニルーテトラツリウムクロ
リド（ＩＮＴ）を用いても達成される。

テトラゾリウム塩の選択は形成されるホルマザン色素の
溶解性を考慮して行なう。

ホルマザン色素が小さな溶解性を持つ場合には高いＡＤ
Ｐ一濃度で色素の沈澱が起る場合があり、これは測定困
難に導く。

このことから本発明方法をホルマザン色素の測定下に実
施する際には有利に色素の溶解性挙動を改良する界面活
性剤を添加する。

好適な界面活性剤の例はデソキシコール酸、サポニン、
アルキルアリールーポリエチレングリコールエステル及
びエーテル、ソルビタンエステル、例えばソルビマクロ
ゴロエート、ポリエチレングリコールラウリルエーテル
等である。

界面活性剤の濃度は試験中で一般に０．３〜３％である
。

許容可能な変動範囲 緩衝液の種類は重要ではない。

例えばトリス緩衝液、トラ（ＴＲＡ）緩衝液、イミダゾ
ール緩衝液、サクシネート緩衝液、グリシン緩衝液、グ
リシクルグリシン緩衝液が好適である。

緩衝液濃度 ０．００５〜０．５モル／ｌｐＨ
６〜１０．５ Ｇａｌ−キナーゼ ０．１〜２０Ｕ／ＴｒＬｌＧａｌ
−ＤＨ ０．０５ 〜２０Ｕ／ｍｌ本発明の下
記に記載する他の実施形はホルマザン形成と組合せるこ
とができる。

これらの反応のいくつかでは組合せる方が平衡の理由か
ら有利でさえある。

次に他の実施形を記載する。Ｆ−ＤＨ＝ホルマートーデ
ヒドロゲナーゼ許容し得る変動範囲 緩衝液及びその濃度については実施形Ｄの記載が該当す
る。

ｐＨ ６。

θ〜１０．０ホルマートキナーゼ゛０．０５〜５０Ｕ／
ｒＩＬｌホルマート−ＤＨ ０．１〜１００Ｕ／ｍｌ許
容し得る変動範囲 緩衝液の種類及び濃度：実施形Ｄの記載が該当 ｐＨ ４．５〜７．５ＰＫ
０．０ ５〜５ ０Ｕ／ｍｌＡｌ− ＤＨ
０．０ ５ 〜５ ０Ｕ／ｍＪＰｙｒ−Ｄ
Ｃ ０．０ ５〜５ ０Ｕ／ｍ１本発明による
方法の次の実施形が特に優れている。

ＧＰＴ グルタマートーピルバートトランスアミナー
ゼ゛ α一ＫＧ−α−ケトグルタレート ＳＳ−ＡＩ−ＤＨ−サクシネートセミアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ 許容し得る変動範囲 緩衝液及びその濃度については実施形Ｄの記載が該当 ｐＨ ６、０〜１０．５ ＰＫ ，ＧＯＴ ，ＧＡＢ−ＧＴ ，ＳＳ−ＡＩ 一Ｄ
Ｈそれぞれ０．０５〜５０Ｕ／ｍｌ 最後に次の実施形も同様に優れている。

ＮＤＰＫ ヌクレオシドジホスファートキナーゼ許容
し得る変動範囲 緩衝液の種類及び濃度は実施形Ｄの記載が該当．ｐＨ
６〜１０．５ ＵＤＰＧ Ｏ．０ １〜１ ５Ｕ／ｍｌ
ＮＤＰＫ １〜５０Ｕ／ＴＬｌサツカ
ロースーＳｙｎｔ． ０．０５ 〜ＩＯＵ／ｍｌ実施
形の実施の詳細は下記の実施例で記載す．る。

既述した様に本発明の方法はＡＴＰからＡＤＰを形成す
る反応に対して特に有利である。

次の表に本発明を適用することのできる、測定すべきＡ
ＤＰをＡＴＰから形成する酵素及び基質の例を挙げる。

実施例で詳説するが、この場合にも組合せた反応を挙げ
ることができる。

酵素も記載の基質もそれぞれ本発明により測定可能であ
る。

個々にどの本発明による方法を適用すベきかは、証明す
べき反応に本質的には左右されない。

表１ 酵素 （ＥＣ屑） 基質 ヘキソキナーゼ ２．７．１．Ｉ ＡＴＰ／ヘキソ
ースダルコキナーゼ ２・７・１・２ ＡＴＰ／グレ
コースｆ フルクトキナーゼ ２・７・１．４ ＡＴＰ／フルク
トースガ゛ラクトキナーセ゛ ２・７・１・６ ＡＴ
Ｐ／ガラクトースマンノキナーゼ゛ ２．７．１．７
ＡＴＰ／マンノースグ）レコサミンキナ ２．７．
１．８ ＡＴＰ／２−アミノー２一一ゼ゛
デソキシーＤ−クラレコース
ホスホグ）レコキナ ２．７．１．１０ ＡＴＰ／グ＞
Ｌ／：ｌ−スー１一一ゼ゛ Ｐ ホスホフルクトキナ ２．７．１．１１ ＡＴＰ／フル
クトース−６一ゼ ーＰ ク゛）レコノキサー〜ビ ２．７．１．１２ ＡＴ
Ｐ／Ｄ−ク）レコネートアデノシンキナービ ２．７．
１．２０ ＡＴＰ／’７’デノシンＮＡＤ キナーゼ， ２．７．１．２３ ＡＴＰ／Ｎ
ＡＤグリセリンキナーゼ゛ ２．７．１．３０ ＡＴＰ
／ク刃セリングリセラートキナ− ２．７．１．３１
ＡＴＰ／ク刃セレートゼ コリンキナーゼ゛ ２．７．１．３２ ＡＴＰ／コ
リンピＬ／／＋−トキナーゼ２．７．１．４０ ＡＴＰ
／ビルベートク゛）レクロノキナーゼ ２．７．１．４
３ ＡＴＰ／クラレクロネートガラクトロノキナ−
２．７．１．４４ ＡＴＰ／ガラクトロネートゼ゛ アラビノキナーゼ ２．７．１．５４ ＡＴＰ／アラ
ビノースマニトールキナ− ２．７．１．５７ ＡＴＰ
／マンニットセ゛ イノシンキナーゼ ２．７．１．７３ ＡＴＰ／イノシ
ンアセタートキナー ２．７．２．Ｉ ＡＴＰ／アセ
テートゼ カルバマートキナ２．７．２．２ ＡＴＰ／ＮＨ３／
Ｃｏ２一ゼ アスパラートキナ ２．７．２．４ ＡＴＰ／アスパ
レートーゼ カルバモイルホス ファートジンタ− ２．７．２．５ ２ＡＴＰ／ＮＨ３
／ＣＯ２ゼ ／Ｈ２０酵素
（ＥＣ／１６） 基質 ？ルマートキナーゼ ２．７．２．６ ＡＴＰ／ホル
メートカルバモイルホスフ ２．７．２．９ ２ＡＴ
Ｐ／グルタミンアートジンターゼ ／ＣＯ
／Ｈ２０グアニジノアセタ− ２．７．３．Ｉ ＡＴ
Ｐ／グアニジンアトキナーゼ セテ
ートクレアチンキナーゼ ２．７．３．２ ＡＴＰ／
クイアチンアルギニンキナーゼ ２．７．３．３ ＡＴ
Ｐ／Ｌ−アルギニンアンモニアキナーゼ ２．７．３．
８ ＡＴＰ／ＮＨ３ポリホスファートキ ２．７．４
．Ｉ ＡＴＰ／（ホスフエナーゼ
ート） アデニラートキナー ２．７．４．３ ＡＴＰ／ＡＭ
Ｐゼ゛ ヌクレオシドモノホ ２．７．４．４ ＡＴＰ／ヌク
レオシドスファートキナーゼ゛ モノホスフ
エートヌクレオシドホスフ ２．７．４．５ ＡＴＰ
／ヌクレオシドアートキナーゼ ジホス
フエートグアニラートキナ− ２．７．４．６ ＡＴ
Ｐ／ＧＭＰゼ シチジラートキナ− ２．７．４．１４ＡＴＰ／ＣＭＰ
ゼ サクシニルーＣｏＡ− ６．２．１．５ ＡＴＰ／サ
クシネートジンテターゼ ／ＣｏＡ グルタリルーＣｏＡ ６．２．１．６ ＡＴＰ／グ
ルタレートージンテターゼ ／ＣｏＡ マリルーＣｏＡ−ジ ６．２．１．９ ＡＴＰ／マレ
ート／ンテターゼ ＣｏＡ ク）レタミンージンテタ ６．３．１．２ ＡＴＰ／
グ）レタメ一一トーゼ ／ＮＨ
３ アスパラギンージン ６．３．１．４ ＡＴＰ／アス
パルテーテターゼ ト／ＮＨ３
γ−グルタミル・−シ ６．３．２．２ ＡＴＰ／グ
ルタメートステインージンテタ ／システイ
ンーゼ グ）レタチオンージン ６．３．２．３ ＡＴＰ／γ
−グ）レクミルテターゼ −
システイン／グリ〃Ｄ−アラニルアラニ ６．３．２．
４ ＡＴＰ／２Ｄ−アラニンージンテターゼ
ン 尿素カルボキシラー’６．３．４．６ ＡＴＰ／尿素
／ＣＯ２ゼ ピルバートカルボキ ６．４．１．１ ＡＴＰ／ピル
ベート／シラーゼ Ｈ２０／Ｃ０２酵素
（ＥＣ廃） 基質 ５′−ヌクレオシ ３．１．３．５ ＡＴＰ／Ａ
ＳＮ／ダーゼ ＮＨ
３／ク゛）レクメートアデノシンデア ３．５．４．４
ＡＴＰ／ＡＳＮ／ミナーゼ
■ＳＮ／ＮＨ３／−ク゛）レタメート 本発明の方法において、キナーゼ、該キナーゼに対する
、ＡＴＰ以外のホスホリル化された基質及び緩街液を含
有する、ＡＤＰを測定するための試薬が使用され、該試
薬は脱ホスホリル化された形状の前記基質に対して又は
そのアミノ基転移された、脱カルボキシル化された、又
はヘキソース添加された生成物に対して特異的なデヒド
ロゲナーゼ及ひＮＡＤ（Ｐ）を包含することより成る。

該試薬は付加的にテトラゾリウム塩及び好適な電子逓伝
体並びに場合により界面活性剤又は／及びＡＴＰからＡ
ＤＰを形成するための系並びにその都度使用される酵素
により必要とされる塩を含有していてよい。

ＡＴＰからＡＤＰを形成するための系はＡＴＰとその都
度ＡＤＰ形成下に測定し得る、ＡＴＰに対して特異的な
キナーゼとから、又は該キナーゼの活性の測定に使用す
る場合にはＡＴＰと該キナーゼの第二の基質とから成る
。

本発明による試薬は無水の親液化された形状で又は即使
用可能な水溶液で存在し得る。

特別な実施形では好適なキャリャ上に含浸されて又は装
入されて試験体として存在していてもよい。

下記の実施例では次の省略形を使用する：Ａｌ−ＤＨ
アルデヒドデヒドロゲナーゼホルマート−ＤＨ
ホルマートデヒドロゲナーゼＧＰＴ グ
ルタマートーピルバートトランスアミナーゼ ＧＡＢ−ＧＴ γ−アミノブチラートーα−ケト
グルタラートトランスアミナーゼ ＳＳ−ＡＩ−ＤＨ サクシナートセミアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼ ＧＯＴ グルタマートーオキサルアセター
トトランスアミナーゼ ＮＤＰＫ ヌクレオシド−５−ジホスファー
トキナーゼ ＵＴＰ ウリジン−５−トリホスフェート
ＡＤＰ アデノシン−５−ジホスフエート
ＡＴＰ アデノシン−５′一トリホスフエ
ートＰＥＰ ホスフェノールピルベートＰ
Ｋ ピルバートキナーゼＮＡＤ
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ＮＡＤＨ ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、還元型 ＮＡＤＰ ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフエート ＮＡＤＰＨ ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフエート、還元型 ＣＫ クレアチンキナーゼＭＴＴ
３−（ ４ｔ ５−ジメチルチアゾリル−２）
−２，５−ジフエニルテトラ ゾ刃ウムブロミド Ｇａｌ−１−Ｐ Ｄ−ガラクトース−１−ホスフエ
ート Ｇａｌ−キナーゼ ガラクトースキナーゼＧａｌ−ＤＨ
ガ゛ラクトースデヒドロゲ゛ナーゼ゛ＵＤＰ
Ｇ−ＤＨ ウリジン−５７−ジホスホーグリコース
デヒドロゲナーゼ Ｐｙｒ−ＤＣ ピルバートデカルボキラーゼＡ
ＤＡ アデソシンデアミダーゼ次に実施例
につき本発明を詳説する。

例Ｉ Ｇａｐ−キナーゼを用いてＮＡＤＨ形成下にＡＤＰの測
定 温度２５℃、測定波長３６５ｎｍ， クベット１儒、
試験容量２．０２ｍｌ を混合し、次いで で開始し、混合し、恒温保持し、吸光増加の停止後盲検
の吸光に対十る検体の吸光を測定する。

検体のＡＤＰ一含量が差から次式により得られる。

ＡＤＰ（ミリモル／ｌ）＝△Ｅ・２９．７１例２ ＰＫ／ピルバートＤＣを用いてＮＡＤＨ形成下にＡＤＰ
の測定 温度２５℃、測定波長３ ６ ５ ｎｍ、試験容量２ｍ
ｌ、クベット１ｃｍ。

を混合し、次いで で開始し、混合し、恒温保持し、吸光増加の停止後盲検
に吸光に対する検体の吸光を測定する。

ＡＤＰ含量は式： ＡＤＰ（ミリモル／ｌ）＝△Ｅ・２９．７１例３ ホルマートキナーゼを用いてＮＡＤＨ形成下にＡＤＰの
測定 測定温度２５℃、測定波長３６５ｎｍ，クベット１ｃｍ
、試験容量２．０２ｍｌ を混合し、次いで で開始し、混合し、恒温保持し、吸光増加の停止後盲検
値に対する検体の吸光を測定する。

ＡＤＰの含量は式： ＡＤＰ（ミリモル／ｌ）＝△Ｅ・２９．７１により計算
する。

例４ ＧＰＴ ，ＧＡＢ−ＧＴ及びＳＳ−ＡＩ−ＤＨを用いて
ＮＡＤＰＨ形成下にＡＤＰの測定 測定温度２５°Ｃ、測定波長３６５ｎｍ、クベット１ｃ
ｍ，試験容量２．２２ｍｌ を混合し、恒温保持し、 で開始し、混合し、吸光増加の停止を待つ。

検体と盲検の吸光の差からＡＤＰの含量を計算する。

ＡＤＰ（ミリモル／ｌ）＝△Ｅ・３０．２９例５ ホルマザン形成下のクレアチニンの測定 測定温度２５℃、測炬波長５ ７ ６ ｎｍ ，クベッ
ト１ｃｍ、試験容量２． ５ ｍｌ を混合し、次いで で開始し、１５分恒温保持し、吸光増加の終結後盲検値
に対する検体の吸光を測定し、クレアチニン含量を式： クレアチニン（ミリモル／ｌ）＝△Ｅ・２．９９４によ
り計算する。

反応条件は最適にしたクレアチニン測定により決める。

ＡＤＰ測定の本発明による適用には例４の記載が該当す
る。

例６ ＮＡＤＰＨ形成下にＣＫの測定 測定温度２５゜Ｃ、測定波長３６５ｎｍ、クベット１ｃ
ｍ、試験容量２．２ｍｌ を混合し、２分恒温保持し、次いで各１分後に△Ｅを読
み取り、かつ検体中のＣＫ一量を式二Ｃ Ｋ （ Ｕ／
ｍｌ） ＝△Ｅ ／分−３．１４３により計算する。

反応条件は最適にしたクレアチンキナーゼ測定により決
められる。

ＡＤＰ測定の本発明による適用には例４の記載が該当す
る。

例７ ＮＡＤＨ形成下のＡＤＰの測定 測定温度２５℃、測定波長３ ６ ５ ｎｍ、クベント
１ｃｍ、試験容量１．６ｍｌ を混合し、マイクロクベット中にピペットで入れる。

を混合し、吸光増加の停止後盲検値に対する検体の吸光
を測定し、かつＡＤＰ含量を次の式：ＡＤＰ （ ミ
リモノレ／ｌ ）△Ｅ ・ ２．３５３により計算す
る。

許容可能な変動範囲： 緩衝液の種類及び濃度二例１参照 ｐ Ｈ ６．０〜１０．５ＵＤＰＧ
−ＤＨ ０．０１〜１５Ｕ／ｍｇＮＤＰＫ
０．２〜５０Ｕ／ＴｒＬｌサツカロース
ジンテターゼ ０．０５〜１０Ｕ／Ｔｔｌ例８ ＮＡＤＨ形成下のクレアチニンの測定 測定温度２５℃、測定波長３６５ｎｍ，マイクロクベッ
ト１ｃｍ、試験容量１．５５ｍｌ試薬混合物の製造 を混合し、ピペットでマイクロクベット中に入れる。

吸光増加の停止後盲検の吸光に対する検体の吸光を測定
し、かつ試料のクレアチニン含量を式：クレアチニン（
ミリモル／ｌ）二△Ｅ・９．１２により計算する。

反応条件は最適にしたクレアチニン測定により決められ
る。

ＡＤＰ測定の本発明による適用についてに例７の記載が
該当する。

例９ ＮＡＤＨ形成下のアンモニアの測定 測定温度２５℃、測定波長３ ６ ５ ｎｍ、マイクロ
クベット１ｃｍ、試験容量１．６ｍｌ 使用される酵素は十分にアンモニウムイオンを除くべき
である。

試薬混合物の製造： 混合し、ピペットでマイクロクベット中に入れる。

吸光増加の停止後盲検の吸光に対する検体の吸光を測定
し、かつ試料のアンモニア含量を式：アンモニア（ミリ
モル／ｌ）二△Ｅ・２．２５３により算定する。

許容可能な変動範囲 緩衝液の種類及び濃度二例１参照 ｐＨ ６．９〜７．８ＵＤＰＧ−Ｄ
Ｈ ０．０２ 〜１５ Ｕ／ｍｌサツカロ
ースジンテターゼｏ．ｉ〜１０ Ｕ／ｒａｌＮＤＰＫ
Ｏ．２ 〜５ ０ Ｕ／ｍｌグ
ルタミンジンテター−Ｍ Ｏ．０ ２ 〜１０ Ｕ
／ｍｌ例１０ ＮＡＤＨ形成下のアンモニアの測定 測定はカルバマートキナーゼ〔例えばストレプトコカス
・ファエカリス（ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａ
ｅｃａ−１ｉｓ）から〕を用いても実施することができ
る。

測定温度３７℃、測定波長３６５ｎｍ、マイクロクベッ
ト１ｃｍ、試験容量１、６ｍｌ 試薬混合物の製造： 混合し、マイクロクベット中にピペットで入れる。

３７℃で約２０分放置する。

吸光増加の停止後盲検の吸光に対する検体の吸光を測定
する。

アンモニア含量ハ式：アンモニア（ミリモル／ｌ）＝△
Ｅ・４．７０６たより計算する。

例１１ ＮＡＤＰＨ形成下のＮＨ３の測定 測定温度２５℃、測定波長３ ６ ５ ｎｍ、１ ｃｍ
−クベット、試験容量２．２５ｍｌ 混合し、前反応を経過させ、 で開始し、混合し、約２０分恒温保持し、吸光増加の終
結後検体の吸光を盲検値に対して測定し、ＮＨ３含量を
式： ＮＨ３（ミリモル／ｌ）二△Ｅ・ ３．２１４により計
算する。

許容可能な変動範囲： 緩衝液の種類及び濃度：燐酸塩緩衝液、 サクシネート緩衝液、イミダゾール緩衝液、条件付きで
トリス緩衝液及びＴＲＡ緩衝液：ｐＨ ６．８〜７．
８ ＰＫ ，ＧＰＴ ，ＧＡＢ−ＧＴ ， ＳＳ −ＤＨ
：各Ｏ．０５〜５ｏＵＡｒＬｌ グルタミンジンテターゼ：０．０２〜１０Ｕ／ｍｌ例１
２ ＮＡＤＰＨ形成下の５′−ヌクレオチダーゼの測定 測定温度２５℃、測定波長３６５ｎｍ１ｃＩ１ｌ−クベ
ット、試験容量２．２５ｍｌ 混合し、約１０分恒温保持し、次いで、 ＡＭＰ ８０ミリモル／ｉ １０．０５ １−１
１．ｓミリモル／ｌで開始する。

５′−ヌクレオチオダーゼ（ Ｕ／ｍｌ）一△Ｅ／分・
６．４３許容可能な変動範囲： 緩衝液二燐酸塩、サクシネート ｐＨ ６．８〜７．３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ キナーゼを用いて該キナーゼに対する、ホスホリル
   化された基質の存在でＡＴＰと脱ホスホリル化された基
   質の形成下にホスホリル化することにより水溶液中でア
   デノシンジホスフエートを酵素で定量測定する方法にお
   いて、脱ホスホリル化された基質を、必要によりもう一
   つの助反応の介在下に、デヒドロゲナーゼの存在でＮＡ
   Ｄ（Ｐ）と反応させ、かつ形成されるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
   直接測定するか又は電子逓伝体の存在でホルマザンの形
   成下に反応させ、かつホルマザンを測定することを特徴
   とする、アデノシンジホスフエートを測定する方法。 ２ 脱ホスホリル化された基質としてガラクトース、ホ
   ルメート、ピルベート又はヌクレオシドジホスフエート
   を使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 介在される助反応として脱カルボキシル化、アミノ
   基転移又はヘキソース添加を使用する、特許請求の範囲
   第１項又は第２項記載の方法。 ４ ＡＤＰを ａ）ガラクトキナーゼ及びガラクトースー１−ホスフエ
   ートと反応させ、かつ形成されるガラクトースを用いて
   ＮＡＤをガラクトースデヒドロゲナーゼの存在で還元し
   、又は ｂ） ホルマートキナーゼ及びホルミルホスフエート
   と反応させ、かつ形成されるホルメートを用いてホルマ
   ートデヒドロゲナーゼの存在てＮＡＤを還元し、又は Ｃ）ピルバートキナーゼ及びホスホエノールピルベート
   と反応させ、形成されるピルベートをピルバートデカル
   ボキシラーゼで脱カルボキシル化し、かつ形成されるア
   セトアルデヒド及びアルデヒドデヒドロゲナーゼを用い
   てＮＡＤを還元し、又は ｄ） ｃ）により形成されるピルベートをグルタメー
   ト及びグルタマートーピルバートトランスアミナーゼを
   用いてアミノ基転移させてアラニン及びα−ケトグルタ
   レートにし、該α−ケトグルタレートをγ−アミノブチ
   レート及びγ−アミノブチラートトランスアミナーゼを
   用いてグルタメート及びサクシネートセミアルデヒドＣ
   こ変え、かつ該サクシネートセミアルデヒドをサクシナ
   ートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼと一緒にＮＡＤＰ
   の還元に使用し、又は ｅ）ＵＴＰ及びヌクレオシドジホスファートキナーゼと
   反応させ、形成されるＵＤＰをサツカロース及びサツカ
   ロースジンテターゼを用いてフラクトース及びウリジン
   ジホスフエートグルコースに変え、かつ該ウリジンジホ
   スフエートグルコースとウリジンジホスファートグルコ
   ースデヒドロゲナーゼを用いてＮＡＤを還元する特許請
   求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。