JPS584728A - Purification of alpha-1 antitrypsin - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発生起源からα−１＝抗トリプシンを単離す
る方法に関する。抗キモトリプシンのような他の好まし
いタンパク質も同様にして単離することができる。好ま
しいタンパク質には、安定化に関与しないジスルフィド
結合（α−１−抗トリプシン内のジスルフィド結合のよ
うに）を有するタンパク質、結合を破壊するために使用
される試薬に対し化学的に影響され易くない安定化ジス
ルフィド結合を有するタンパク質、及びジスルフィド結
合を有していないタンパク質が包含される。好ましい実
施態様において、本発明は、プールした人のプラズマか
ら得られたサブフラクションである、コンフラクション
ＩＶ　−Ｉ　（Ｃｏｈｎ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　ＩＶ−Ｉ
　）からα−１−抗トリプシンを単離する方法に関する
。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for isolating α-1=antitrypsin from developmental sources. Other preferred proteins such as anti-chymotrypsin can be isolated in a similar manner. Preferred proteins include those with disulfide bonds that are not involved in stabilization (such as the disulfide bond in alpha-1-antitrypsin) and are not chemically susceptible to the reagents used to break the bonds. Included are proteins with stabilizing disulfide bonds and proteins without disulfide bonds. In a preferred embodiment, the invention provides a subfraction obtained from pooled human plasma, Cohn fraction IV-I.
) relates to a method for isolating α-1-antitrypsin from

α−１−抗トリプシンは、人の血清におけるタンパク分
解酵素の主要な阻害剤である。α−１−抗トリプシンが
血清中に通常の人の１０〜１５％しかない、遺伝的に欠
乏している人が約７万〜８万人いる。これらの人々は肺
気腫に非常になりやすい。肺の損傷は、α−１−抗トリ
プシンの欠乏に帰因する不適当に規制される酵素の消化
作用から生じる。この他にも、敗血症、肺臓炎、呼吸機
能の減退、及びカーデイオパルモナリイバイパス（Ｃａ
ｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ　ｂｙｐａｓｓ　）等の急
性の臨床状態があり、これらにも、過度のタンパク質加
水分解が主要な原因であると思われる徴候がある。Alpha-1-antitrypsin is the major inhibitor of proteolytic enzymes in human serum. There are about 70,000 to 80,000 people who are genetically deficient in α-1-antitrypsin, which is only 10 to 15% of normal people. These people are highly susceptible to emphysema. Lung damage results from improperly regulated enzymatic digestive action due to a deficiency of alpha-1-antitrypsin. In addition, sepsis, pneumonitis, decreased respiratory function, and cardiopulmonary bypass (Ca
There are acute clinical conditions, such as rdiopulmonary bypass (rdiopulmonary bypass), in which there are indications that excessive protein hydrolysis appears to be the primary cause.

本発明は、これらの症状の処置に用いられる精製したα
−１−抗トリプシンの製造方法を提供するものである。The present invention provides purified α for use in the treatment of these conditions.
-1-A method for producing antitrypsin is provided.

本発明の方法は、目的生成物を、全体的に安価且つ簡単
で、再現性がある連続工程によって製造するものであり
、治療用として安全であると共に大規模な工業的処理に
も適用し得る、相対的に純粋な生成物を製造することが
できる。The process of the invention produces the desired product in a continuous process that is entirely cheap, simple, reproducible, safe for therapeutic use and applicable to large-scale industrial processing. , relatively pure products can be produced.

プレパラテイブバイオケミストリイ　５（４）、１９７
５、の５６３〜３４８頁にチャールズビー、クレザ−、
ラッキー　カリツク及びロバート　ファラッドによって
発表された１人のプラズマのコンフラクションＩＶ−Ｉ
からのα−１−抗トリプシンの単離及び特性」には、イ
オン交換、バイオスペシフィックアフィニティ（ｂｉｏ
ｓｐｅｃｉｆｉｃａｆｆｉｎｉｔｙ　）及びゲル排除ク
ロマトグラフ法を利用してプールした人のプラズマから
α−１−抗トリプシンを単離することが記載されている
。Preparative Biochemistry 5(4), 197
5, pp. 563-348, Charlesby, Kleser,
One Plasma Confusion IV-I Published by Lucky Karitsuk and Robert Farad
``Isolation and characterization of alpha-1-antitrypsin from
The isolation of α-1-antitrypsin from pooled human plasma using gel exclusion chromatography and specific affinity methods has been described.

ＤＨＥＷパブリケーション＋（ＮＩＨ）　７８−１４２
２、の５２６〜３８８頁にアレン　ビー、コヘン及びハ
ロルド　ジエームスによって発表された「可能な治療剤
とし°Ｃのα−１−抗トリプシンの評価」には、α−１
−抗トリプシンの単離方法とその可能な治療上の用途が
記載されている。DHEW Publication + (NIH) 78-142
2, pages 526-388 of ``Evaluation of α-1-antitrypsin as a potential therapeutic agent'' by Allenby, Cohen, and Harold James.
- Methods for the isolation of anti-trypsin and its possible therapeutic uses are described.

アナリテイカル　バイオケミストリイ　８１（１９７７
）、の５３６〜５４５頁にシー、−ビー、ローレル、エ
バトウーリン及ヒフ　−ル。Analytical Biochemistry 81 (1977
), pp. 536-545, by C. B., Laurel, Evatholin, and Hifl.

ビー、パイウォーターによって発表された［セファロー
ズ結合したチオール化合物を用いてプラズマのタンパク
質を分離する、チオール−ジスルフィド交換クロマトグ
ラフ法」、及びヨーロピアン　ジャーナルバイオケミス
トリイ　５７（１９５７）、の１０７〜１１３頁にシー
、−ビー、ローレル、ジエイ、ピアス、ニー、パーソン
及びエフ、トウーリンによって発表された［チオール−
ジスルフィド交換によるプラズマからのα−１−抗トリ
プシンの精製」にニ゛、α−１−抗トリプシン内のジス
ルフィド結合を利用した、クロマトグラフ法によるα−
１−抗トリプシ／の精製が開示されている。"A Thiol-Disulfide Exchange Chromatography Method for the Separation of Plasma Proteins Using Sepharose-bound Thiol Compounds" published by B., Piwater, European Journal Biochemistry 57 (1957), pp. 107-113. [thiol-
Purification of α-1-antitrypsin from plasma by disulfide exchange”.
The purification of 1-antitrypsi/ is disclosed.

ジャーナル　ラボラトリ　クリニカル　メディカル１９
７９年１２月、８２６〜８３１頁にジョンエイ、ピアス
及びビビアナ　ジー、イラテイオによって発表された［
ジチオエリトリトールを用いて等′畦的に焦点を合わせ
ることによって同定する、改良された抗トリプシンフエ
ノタイプの同定−」には、等電的に焦点を合わせること
によって抗トリプノンフエノタイプ（Ａｎｔｉｔｒｙｐ
ｓｉｎＰｈｅｎｏｔｙｐｅｓ　）を同定するために、ジ
チオトレトール及びジチオエリトリトールを使用するこ
とがｄ己載されている。Journal Laboratory Clinical Medical 19
Published in December 1979, pp. 826-831 by John A., Pierce and Bibiana G., Illateio [
Improved Identification of Antitrypsin Phenotypes by Isoelectrically Focusing Using Dithioerythritol.
The use of dithiothretol and dithioerythritol to identify P. sinPhenotypes has been described.

本発明は、血液プラズマのタンパク質の混合物の溶液か
らα−１−抗トリプシンを、下記の＜＆）、（ｂ）及び
（ｃ）工程により単離することを特徴とする、α−１−
抗トリプシンの単離方法を提供するものである。The present invention is characterized in that α-1-antitrypsin is isolated from a solution of a mixture of blood plasma proteins by the following steps <&), (b) and (c).
A method for isolating anti-trypsin is provided.

（ａ）上記タンパク質を不安定化するに足る、上記タン
パク胃内のジスルフィド結合を破壊する。(a) Breaking disulfide bonds in the protein stomach sufficient to destabilize the protein.

（ｂ）不安定化したタンパク質を沈澱させる。(b) Precipitate the destabilized protein.

（ｃ）そして、上記溶液から非沈澱のα−１−抗トリプ
シンを回収する。(c) Then, non-precipitated α-1-antitrypsin is recovered from the solution.

「不安定化」という用語は、相対的な意味で用いられて
お９、処理される溶液に対するタンパク質の溶解度に関
係する。不安定化したタンパク質は、単離されたタンパ
ク質（好ましい実施態様においてはα−１−抗トリプシ
ン）より溶解度が小さい。従って、不安定化したタンパ
ク質は、後述するように、溶液条件の適当な調整によっ
て選択的に沈澱させることができる。The term "destabilization" is used in a relative sense and relates to the solubility of the protein in the solution being treated. The destabilized protein has less solubility than the isolated protein (alpha-1-antitrypsin in a preferred embodiment). Therefore, destabilized proteins can be selectively precipitated by appropriate adjustment of solution conditions, as described below.

この相対的な不安定性を得るために、存在する全てのジ
スルフィド結合を破壊する必要はないであろう。本発明
の方法は、目的とする選択的沈澱物を得るのに足る数の
ジスルフィド結合を破壊することを意図する。It may not be necessary to break all disulfide bonds present to obtain this relative instability. The method of the invention is intended to break a sufficient number of disulfide bonds to obtain the desired selective precipitate.

好ましい実施態様においては、上澄み液からα−１−抗
トリプシンを回収する前に、先ず沈澱したタンパク質を
分離する。タンパク質内のジスルフィド結合を還元する
には十分な還元力を有するが、タンパク質の分断の原因
となる、ペプタイド結合等のような他のタンパク質の結
合を還元することはない、好ましい眩元剤を効果的な濃
度で用いてジスルフィド結合を適当に破壊する。本発明
において用いられる典型的な還元剤は、２−メルカプト
エタノールのようなモノチオール類、メルカルト酢酸、
及びシスティ／である。好ましい非チオール還元剤とし
ては、例えば水素化硼素ナトリウムが挙げられる。In a preferred embodiment, the precipitated proteins are first separated before recovering alpha-1-antitrypsin from the supernatant. A desirable glaring agent that has sufficient reducing power to reduce disulfide bonds within proteins, but does not reduce other protein bonds such as peptide bonds that cause protein fragmentation. be used at appropriate concentrations to break disulfide bonds appropriately. Typical reducing agents used in the present invention include monothiols such as 2-mercaptoethanol, mercaltoacetic acid,
and sisti/. Preferred non-thiol reducing agents include, for example, sodium borohydride.

還元剤としては、ジチオトレトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉ−ｔｏｌ　）若しくはその立体異性体であるジチ
オエリトリトール（ｄｉｔｈｉｏｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ
）のようなジチオールが好ましい。As a reducing agent, dithiothretol (dithioth
rei-tol) or its stereoisomer dithioerythritol (dithioerythritol)
) are preferred.

本発明においては、ジスルフィド基をスルフヒドリルに
置元した環構造を形成するのに、ジチオール類が特に効
果的である。この環形成は、好適なエントロピー効果に
よって反応を完結させる。従って、立体的に好適なジチ
オール類は、約０．０１Ｍ若しくはそれ以上の＃度、通
常約０゜０３〜０．１Ｍの濃度で使用することができる
。In the present invention, dithiols are particularly effective in forming a ring structure in which a disulfide group is substituted with a sulfhydryl. This ring formation completes the reaction due to favorable entropic effects. Thus, sterically suitable dithiols can be used at concentrations of about 0.01M or more, usually about 0.03M to 0.1M.

モノチオール類のようなやや効果の劣る還元剤は、最小
成約０．１Ｍの濃度、通常約０．５〜１．５Ｍの濃度が
要求される。Less effective reducing agents, such as monothiols, require a minimum concentration of about 0.1M, usually about 0.5-1.5M.

タンパク質溶液は好ましくはｐＨを約６．０〜８．５に
緩衝剤で調整される。好ましい緩衝剤としてはホスフェ
ート及びトリスが挙げられる。The protein solution is preferably buffered to a pH of about 6.0-8.5. Preferred buffers include phosphate and Tris.

ｐＨが上記範囲より高い場合、タンパク質はあまり安定
化されなくなるが、望むならば上記範囲より高いｐＨで
も本発明の方法を実施することができる。ｐＨが約６よ
り低い場合、α−１−抗トリプシンは変性し凝集する傾
向があるため通常あまシ満足し得る結果が得られない。If the pH is higher than the above range, the protein will be less stabilized, but the method of the invention can be practiced at a pH higher than the above range if desired. If the pH is lower than about 6, alpha-1-antitrypsin tends to denature and aggregate, and generally unsatisfactory results are obtained.

タンパク質沈澱工程において、タンパク質の溶解度を低
下せしめる試薬としては、例えば、ホリエチレングリコ
ール、エチルアルコールのようなアルコール類、グアニ
ジン及び尿素などを利用し得る。好ましい実施態様にお
いては、タンパク質は、タンパク質を沈澱式せるのに典
型的に使用されている塩類、好ましくは硫酸塩のような
２価の塩を十分に加えることによって塩析させる。次い
で、沈澱したタンパク質は遠　。In the protein precipitation step, examples of reagents that can be used to reduce protein solubility include polyethylene glycol, alcohols such as ethyl alcohol, guanidine, and urea. In a preferred embodiment, the protein is salted out by adding sufficient salts typically used to precipitate proteins, preferably divalent salts such as sulfates. The precipitated proteins are then separated.

心分離のような適当な手段によって上澄み液から分離さ
れる。It is separated from the supernatant by suitable means such as heart separation.

α−１−抗トリプシンは、後述するような、いくつかあ
る方法のうちの何れかによって上澄み液から回収される
。空胴ファイバーを用いた限外Ｃ過は、多くの場合まず
まずの結果を与える。今までのところ、厳良の結果は、
特にＤＥＡＥ−セルロースカラムを用いたクロマトグラ
フ分離法によって得られたが、他のイオン交換樹脂ある
いは他のクロマトグラフ法（ゲルト過、ヒドロキシアパ
タイト、免疫吸着剤（ｉｍｍｕｎｏａｄａｏｒ−ｂａｎ
ｔ）、シバクロンブルーを含有する親和性カラム、コン
カナバリンＡ、ＤＮＡなど）も使用することができる、
クロマトグラフのカラムと、α−１＝抗トリプシンが他
のタンパク質より強固に結合する、ｐＨ及びイオン濃度
を包含する溶媒条件とを選択することによって、カラム
の結合能力を超えるタンパク質濃度を導入することがで
きる。α−１−抗トリプシンはカラムに結会し、それよ
り弱い結合のタンパク質はカラムを通過する。そして、
α−１−抗トリプシンは、適当なさらに強い溶媒で溶離
することかできる。α-1-antitrypsin is recovered from the supernatant by any of several methods, as described below. Ultra-C filtration using hollow fibers often gives acceptable results. So far, the results have been
In particular, it was obtained by chromatographic separation methods using DEAE-cellulose columns, but also by other ion exchange resins or other chromatographic methods (gel filtration, hydroxyapatite, immunoadaor-ban).
t), affinity columns containing cibacron blue, concanavalin A, DNA, etc.) can also be used.
Introducing a protein concentration that exceeds the binding capacity of the column by choosing a chromatographic column and solvent conditions, including pH and ionic concentration, such that α-1=antitrypsin binds more tightly than other proteins. I can do it. α-1-antitrypsin binds to the column and weaker bound proteins pass through the column. and,
α-1-antitrypsin can be eluted with a suitable stronger solvent.

本発明の方法は、他の方法では不可能な、カラムの上方
へ多量のタンパク質を充てんすることを可能にする。The method of the invention allows loading large amounts of protein to the top of the column, which is not possible with other methods.

本発明の方法は、最もよく知られたプラズマタンパク質
に存在するジスルフィド結合を利用する場合に特に効果
的である。ジチオトレトールのような還元剤は、他の変
性剤が存在しない場合でもこれらのタンパク胃内のジス
ルフィド結合の多くを還元する。ジスルフィド結合の主
要な作用はタンパク質の構造を安定化することである。The methods of the invention are particularly effective when utilizing disulfide bonds present in most well-known plasma proteins. Reducing agents such as dithiothretol reduce many of the disulfide bonds in these protein stomachs even in the absence of other denaturing agents. The primary function of disulfide bonds is to stabilize protein structure.

従って、ジスルフィド結合が破壊された場合、タンパク
質は溶液中で不安定となる。Therefore, if a disulfide bond is broken, the protein becomes unstable in solution.

そして、不安定化したタンパク質は、塩析、加熱、ｐＨ
変化、溶媒の添加等の適当な手段によって容易に沈澱さ
せることができる。Then, the destabilized protein is removed by salting out, heating, pH
It can be easily precipitated by appropriate means such as modification, addition of a solvent, etc.

本発明の方法が効果的であるのは、α−１−抗トリプシ
ンがたった一つのジスルフィド結合を有し、この結合が
タンパク質の鎖の安定化に関与しないためでおると推察
される。このように、α−１−抗トリプシンは還元工程
において不安定化されず、−ヒ澄み液に残留する。望む
ならば、この一つのジスルフィド結合は還元工程後ＫＭ
生することができる。It is presumed that the method of the present invention is effective because α-1-antitrypsin has only one disulfide bond, and this bond does not participate in stabilizing the protein chain. In this way, alpha-1-antitrypsin is not destabilized in the reduction step and remains in the -hypermineral fluid. If desired, this one disulfide bond can be converted into KM after the reduction step.
can live.

通常の場合、α−１−抗トリプシンのような溶液中に残
留するタンパク質は、目的とするタンパク質であｐｌさ
らに使用するため回収される。しかしながら、本発明の
方法は、沈澱したタンパク質を変性した形態で使用する
ために、あるいは他の形態に転化させるために沈澱した
タンパク質を回収することを望む場合に、沈澱したタン
パク質を溶液中のタンパク質から分離することにも利用
することができる。Typically, proteins remaining in solution, such as alpha-1-antitrypsin, are recovered for further use with the protein of interest. However, the method of the present invention is useful for converting precipitated proteins into proteins in solution when it is desired to recover the precipitated proteins for use in a denatured form or for conversion to other forms. It can also be used to separate from

本発明の方法の使用から副次的利益が得られる。本発明
において用いられる還元条件は、タンパク質起原の肝炎
ビールスの伝染性を効果的に破壊するのに役立つ。これ
は、ビールスの膜が種々のジスルフィド含有タンパク質
を持っているため、本発明の方法の条件下ではビールス
の膜が変性され、それによってビールスがその伝染性を
失なうものと思われる。Secondary benefits are obtained from the use of the method of the invention. The reducing conditions used in the present invention serve to effectively destroy the infectivity of protein-based hepatitis viruses. This is probably because the viral membrane contains various disulfide-containing proteins, so that under the conditions of the method of the invention the viral membrane is denatured, thereby causing the virus to lose its infectivity.

好ましい実施態様においては、タンパク質溶液として人
の血液プラズマが利用される。好ましくハ、本発明の方
法では、α−１−抗トリプシンか豊富であり（タンパク
質の６〜１０チ）、又現在アルブミン及びγ−グロブリ
ンの製造の間中比較的使用されないサイドフラクション
であるため、出発原料として血液プラズマのコンフラク
ションＩＶ−Ｉを利用する。In a preferred embodiment, human blood plasma is utilized as the protein solution. Preferably, in the method of the invention, α-1-antitrypsin is abundant (6 to 10 proteins) and is currently a relatively unused side fraction during the production of albumin and γ-globulin. Blood plasma confluency IV-I is utilized as a starting material.

コンフラクションＩＶ−Ｉのペーストハ、おおよそ、タ
ンパク質を２５〜３５チ、アルコールを３０〜３５チ、
Ｈ２Ｏを３０〜４０％含有し、少なくとも次のタンパク
質から構成されている。Confraction IV-I paste contains approximately 25-35 grams of protein, 30-35 grams of alcohol,
It contains 30-40% H2O and is composed of at least the following proteins:

アルブミン（約１５〜２０チ）、α−１−抗トリプシン
（約６〜１０％）、α−１−抗キモトリプシン（約４〜
６％）、セルロブラスミン（２゜５チ）、ハツトグロブ
リン（約２チ）、抗トロンビンＩ（約ｉ％）、トランス
フェリン（約７チ）、ヘモベキシン、α−２−グラスミ
ン阻吾剤、α−１−リボプロティン、プラスミノーゲン
、フイプリノーケ／、’２　＋　Ｃ５＋α−１−アシッ
ドグリコプロティン、Ｃｌエステラーゼ阻害剤、インタ
ー−α−トリプシン阻害剤、Ｃ１エステラーゼ不活性化
剤。Albumin (approximately 15-20%), α-1-antitrypsin (approximately 6-10%), α-1-antichymotrypsin (approximately 4-10%),
6%), celluloblasmin (2°5%), pig globulin (approximately 2%), antithrombin I (approximately i%), transferrin (approximately 7%), hemovexin, α-2-grasmin inhibitor, α -1-riboprotein, plasminogen, fipurinoke/,'2+C5+α-1-acid glycoprotein, Cl esterase inhibitor, inter-α-trypsin inhibitor, Cl esterase inactivator.

本発明の方法において用いられるタンパク質溶液は、タ
ンパク質起原とは無関係に、タンパク質含有量が約５０
■／−未満になるように希釈するのが好ましい。タンパ
ク質の濃度がかなり高い場合には、過度のα−１−抗ト
リプシンが沈澱したタンパク質に吸収されて失なわれる
。The protein solution used in the method of the invention has a protein content of about 50%, regardless of the protein origin.
It is preferable to dilute to less than 1/-. If the protein concentration is fairly high, excess α-1-antitrypsin will be absorbed and lost to the precipitated protein.

試　　　　験 原料及び方法 コンフラクションＩＶ−Ｉは、冷凍した均質化ペースト
として、カリフォルニア州、バークレイのカッターラボ
ラトリイズから入手した。トリブシ／阻害能力（’ｒ　
Ｉ　Ｃ）は、基質としてベンゾイル−ＤＬ−アルギニン
−ｐ−二ｌ−ロアニリドを用い、結晶化した、塩分を含
まない牛のトリプシンにュージャージー州、フリーホー
ルドのワシントンケミカル　カンパニー製）に対して測
定した。活性トリプシンのパーセンテイジはｐ−ニトロ
フェニルｐ′−グアニジノベンゾエートで滴定すること
によって測定した。α−１−抗トリプシンの濃度は、人
のα−１−抗トリプシン（ミネソタ州、チェス力のカレ
スタンドラプス製）にうさぎの抗−血清を用いてラジア
ルイミュノデイフユージョン法（ＲＩＤ）によって測定
した。比活性は、ｍｇ／−で表わしたＴｉＣを、ロウリ
ーの方法などによって測定したタンパク質の濃度あるい
は凍結乾燥したタンパク質の重址で除することによって
算定した（１５チ水分補正）。α−１−抗トリプシンの
吸光係数ｒよ １ｍ、２８０ｎｍ であり、タンパク質の濃度及び精製した生成物の比活性
の測定に使用した。Test Materials and Methods Confaction IV-I was obtained from Cutter Laboratories, Berkeley, Calif., as a frozen homogenized paste. Tribushi/inhibitory ability ('r
IC) was determined on crystallized, salt-free bovine trypsin (Washington Chemical Company, Freehold, Jersey) using benzoyl-DL-arginine-p-dil-roanilide as the substrate. . The percentage of active trypsin was determined by titration with p-nitrophenyl p'-guanidinobenzoate. Concentrations of α-1-antitrypsin were measured by radial immunodiffusion (RID) using rabbit anti-serum to human α-1-antitrypsin (Karestand Lapus, Chess, Minnesota). did. The specific activity was calculated by dividing the TiC in mg/- by the concentration of the protein or the weight of the lyophilized protein, as determined by the method of Lowry (15% moisture correction). The extinction coefficient of α-1-antitrypsin was 1 m, 280 nm, and was used to measure the concentration of the protein and the specific activity of the purified product.

最終生成物は、酸性の不連続緩衝系を用いてスターチゲ
ル電気泳動によってフェノタイプにし、次いで抗原−抗
体電気泳動を交差ｌ−た。The final product was phenotyped by starch gel electrophoresis using an acidic discontinuous buffer system, followed by cross-antigen-antibody electrophoresis.

分析ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動はラエムリ（Ｌ
ａｅｍｍｌｉ、　１９７０　）の方法により９チゲルに
おいて行なった。免疫電気泳動はＬＫＢ系における標準
方法によって実施し、た。Analytical SDS acrylamide gel electrophoresis was performed using Laemli (L
Aemmli, 1970). Immunoelectrophoresis was performed by standard methods in the LKB system.

コンフラクションＩＶ−Ｉペーストｌ”ｊ、ｐＨ８，５
で０．１Ｍの緩衝液（ホスフェート、トリス）に清解し
、アルコール除去の目的に役立つｐＨ７，６で００１Ｍ
の緩衝液に対して透析することによって活性化し得る。Confraction IV-I paste l”j, pH 8,5
0.1M buffer (phosphate, Tris) at pH 7.6 to serve the purpose of alcohol removal.
can be activated by dialysis against a buffer of

このことは後述する実施例１において示されているが、
アルコールを除去するための透析は必須ではない。This is shown in Example 1, which will be described later.
Dialysis to remove alcohol is not required.

実施例を通じて言及した分析方法は、次の参考文献に記
載されている通りである。The analytical methods mentioned throughout the Examples are as described in the following references:

ＴｉＣ＝Ｂ、Ｆ、　Ｅｒｌａｎｇｅｒ、　Ｎ、　Ｋｏｋ
ｏｗｓｋｙ　ａｎｄ　Ｗ、　Ｃｏｈｅｎ。TiC = B, F, Erlanger, N, Kok
owsky and W, Cohen.

伸傳、用恕榊醤町卯璧シ、　９５．２７１−２７８（１
９６１）。Shinden, Yokun Sakakichocho Ubishi, 95.271-278 (1
961).

ＲＩＤ＝＝Ｍ、　Ｍａｎｃｉｎｌ、　Ａ、　Ｐ、　Ｃａ
ｒｂｏｎａｒａ　ａｎｄ　Ｊ、　Ｆ。RID==M, Mancinl, A, P, Ca
rbonara and J, F.

Ｈｅｒｅｍａｎｓ、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　２９．２５５−２５４　（１９６５）。Heremans, Immunochemistry
, 29.255-254 (1965).

Ｌｏｗｒｙ＝０．　）Ｌ　Ｌｏｗｒｙ、　Ｎ、　Ｌ、　
Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ、　Ａ、　Ｊ、　Ｆａｒｒａｎｄ
　Ｈ，Ｊ、　Ｒａｎｄａｌｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　９
豐、、　１９３．２６５−２７２　（１９５１）。Lowry=0. )L Lowry, N, L,
Rosebrough, A. J., Farrand
H, J, Randall, J, Biol, 9
Fyo, 193.265-272 (1951).

実施例１ α−１−抗トリプシンの活性化及び塩析コンフラクショ
ンＩＶ−１１０ＤｆをｐＨ８，５の０．１Ｍホスフェー
ト１．０１Ｊツトルに溶解し、約３時間攪拌した。溶解
しなかった原料は１過によって除去した。溶液は次に示
す４つのアリコ−４に分けた。第１のアリコー）　（Ａ
）は約２０ｑ／−まで直接凝縮した。第２のアリコー１
　（Ｂ）は、光ｊ＝、１０．０００Ｍ、Ｗ、カットオフ
のＤＣ−２アミコン卒胴フアイバー（Ｄ　Ｃ−２Ａｍ１
ｃｏｎ　ｈｏｌｌｏｗ　ｆｉｂｅｒ）ヲ用いてｐＨ８，
５の０．（ＮＭホスフェートに対して透析し、次いで、
約２０η／−まで濃縮した。Example 1 Activation and salting out of α-1-antitrypsin Confraction IV-110Df was dissolved in 1.01 J of 0.1M phosphate at pH 8.5 and stirred for about 3 hours. Undissolved raw materials were removed by one sieve. The solution was divided into four aliquots as shown below. (A
) was directly condensed to about 20q/-. second aliko 1
(B) DC-2 Amicon fiber (DC-2Am1) with light j=, 10.000M, W, cutoff
pH 8 using con hollow fiber)
5 of 0. (dialyzed against NM phosphate, then
It was concentrated to about 20η/-.

第３のアリコート（Ｃ）は、約５０Ｔｎｇ／−まで限外
ｐ過によって濃縮した。第４のアリコー）　（Ｉ））は
、ｐＨ８，５の０．０１　Ｍホスフェートに対して透析
し、次いで約５０ｍ９／−まで濃縮した。これらの（χ
−１−抗トリプシン溶液の各アリコート（ＡｍＤ）をそ
れぞれ１０−ずつ用意した。それぞれ溶液の半分は０．
１Ｍジチオトレトール（ＤＴＴ）を用いて２５℃で３時
間又は２４時間処理した。The third aliquot (C) was concentrated by ultrapfiltration to approximately 50 Tng/-. The fourth aliquot) (I)) was dialyzed against 0.01 M phosphate at pH 8.5 and then concentrated to approximately 50 m9/-. These (χ
-1- Each aliquot (AmD) of 10 anti-trypsin solution was prepared. Each half of the solution is 0.
Treated with 1M dithiothretol (DTT) at 25°C for 3 or 24 hours.

そし、て、全ての試料は５℃で５０チ（ＮＨ４）２５ｏ
ｉｌの最終濃度まで塩析し、−晩生攪拌した。次いで、
これを３００　Ｏｒｐｍで２時間遠心分離した。Then, all the samples were heated at 5°C and 50°C (NH4)25o.
Salted out to final concentration of il and stirred late. Then,
This was centrifuged at 300 Orpm for 2 hours.

沈澱物を５０％（ＮＨ４）ｚｓＯ＋＋で洗浄し、上亀み
液を一緒にした。各ザンプルについて、初期及び最終ト
リプシン阻害能力をＴＩＣ分析によって、又タンパク質
含有量をロウリーの方法によって測定した。その結果を
表１に総括する。The precipitate was washed with 50% (NH4)zsO++ and the supernatants were combined. For each sample, initial and final trypsin inhibition capacity was determined by TIC analysis and protein content by Lowry's method. The results are summarized in Table 1.

結論 １．塩析する前にアルコールを除去するためのコンフラ
クションＩＶ−Ｉ溶液の透析は必要としない。Conclusion 1. Dialysis of the Confraction IV-I solution to remove alcohol before salting out is not required.

２、ＤＴＴは、上澄み液中のα−１−抗トリプシンの回
収に不利益な影響を及ぼさずにタンパク質の沈澱物の媒
質を提供するのに非常に効果的である。2. DTT is very effective in providing a medium for protein precipitation without adversely affecting the recovery of α-1-antitrypsin in the supernatant.

３、タンパク質の濃度が２０〜５０η／ゴの範囲におい
ては、同僚に極めて効果的に、選択的に塩析される。3. When the protein concentration is in the range of 20-50 η/g, it is very effectively and selectively salted out.

実施例２ 抗トリプシンの回収を最大にするため、コンフラクショ
ンＩＶ−Ｉを透析しないで実施例１に記載したように活
性化した。活性化溶液は、ロウリーの方法（二よる測定
によれば約２７．７ｓＩｑ／ｙのタンパク質を含有して
いた。次のＤＴＴ濃度を使用した。０．０．０２　Ｍ、
　　０．０３　Ｍ、　　０．０５Ｍ、　　０．１０　Ｍ
、　　０．２０　Ｍ０各ＤＴＴ濃度に対し、分離培養を
３時間、８時間及び２４時間行なった。還元後、各アリ
コート１０ｍ１を、飽和（ＮＨｌｌ）２Ｓｏ、１０ｒｎ
ｔを用いて５℃で５０％の最終濃度まで沈澱させ、２４
時間培養し、次いで、遠心分離し、洗浄し、再び遠心分
離した。α−１−抗トリプシンのジスルフィド納金を再
生するため、上澄み液を、０．０１Ｍシスティンを含有
する、ｐＨ７，６の０．０１Ｍホスフェート緩衝＃ｉ、
１×４リットルに対して透析した。過剰のシスティンを
除去するために０．０１Ｍホスフェート緩衝液３×４リ
ツトルに対する最終透析を行なった。Example 2 To maximize recovery of anti-trypsin, Confraction IV-I was activated as described in Example 1 without dialysis. The activation solution contained approximately 27.7 sIq/y of protein as determined by the method of Lowry (2). The following DTT concentrations were used: 0.0.02 M;
0.03M, 0.05M, 0.10M
, 0.20 M0. Separation culture was performed for 3 hours, 8 hours, and 24 hours for each DTT concentration. After reduction, each 10 ml aliquot was treated with saturated (NHll)2So, 10rn
Precipitate to a final concentration of 50% at 5 °C using
Incubated for an hour, then centrifuged, washed, and centrifuged again. To regenerate the disulfide deposits of α-1-antitrypsin, the supernatant was treated with 0.01 M phosphate buffer #i, pH 7.6, containing 0.01 M cysteine.
Dialyzed against 1 x 4 liters. A final dialysis against 3 x 4 liters of 0.01M phosphate buffer was performed to remove excess cysteine.

結　　論 第１図及び第２図に示した測定結果から次のことがわか
る。Conclusion The following can be seen from the measurement results shown in Figures 1 and 2.

１、ジチオトレトール（ＤＴＴ）を用いて還元し７、次
いで（ＮＨ，、）２ＳＯ１（ｓ　ｏ％）を用いて沈澱さ
せることは、コン　フラクションＩＶ−［）α−１−抗
トリプシン含有タンパク員溶液から混入タンパク質を除
去するのに非常に効果的である。1. Reduction with dithiothretol (DTT) and then precipitation with (NH, )2SO1 (so%) resulted in confluence IV-[)α-1-antitrypsin-containing protein members. Very effective in removing contaminating proteins from solutions.

２６　　効果は、還元剤の濃度及び還元時間に依存する
。０．０５Ｍ　ＤＴＴの８時間処理は、精製ファクター
８．０以上を与え、非常に効果的である（コントルール
の場合の精製ファクター５．０と比較して）。ＤＴＴの
濃度をさらに高くすれば幾分良くなるが、コストファク
ターが増大する上改良もほんのわずかに過ぎない。26 The effectiveness depends on the concentration of the reducing agent and the reduction time. The 8 hour treatment with 0.05M DTT is very effective, giving a purification factor of over 8.0 (compared to a purification factor of 5.0 for control). Increasing the concentration of DTT even higher provides some improvement, but increases the cost factor and provides only marginal improvement.

３、アルブミンはこの処理で完全に除去される。3. Albumin is completely removed by this treatment.

４、α−１−抗トリプシン活性の回収率はＴＩＣによる
測定によれば７５〜８０饅であり、ＤＴＴが存在しない
場合の回収率と近似している。4. The recovery rate of α-1-antitrypsin activity is 75-80 yen as measured by TIC, which is close to the recovery rate in the absence of DTT.

５、免疫学的活性の回収率（ラジアルイミュノデイフイ
ージョン）は約５５〜６０％である。5. The recovery rate of immunological activity (radial immunodeficiency) is about 55-60%.

（注：これは、最初のコン　フラクションＩＶ−ｆ溶液
においてα−１−抗トリプシンが＃果したためであり、
このことは実施例３において示す。）実施例３ 抗トリプシン凝集体がコン　フラクションＩＶ−１に存
在するかどうかをみるため、タンパク質２５．６ツ／−
及びα−１−抗トリプシン１．７η／ゴ（ＴＩＣによシ
測定）を含有するコン　フラクンヨンＩＶ−１溶液のア
リコート０．６ｍｌを０．１０　ＭＮＨ，）（Ｃｏ、で
平衡状態にあるセファデックスＧ　−１５０カラム（１
，５Ｘ　９１　ｃｆｎ）の上方に注入した。(Note: This is due to the role of α-1-antitrypsin in the first confraction IV-f solution;
This is demonstrated in Example 3. ) Example 3 To determine whether anti-trypsin aggregates were present in fraction IV-1, 25.6 proteins/-
A 0.6 ml aliquot of Conflux IV-1 solution containing α-1-antitrypsin 1.7η/G (measured by TIC) was added to Sephadex equilibrated with 0.10 MNH,)(Co,). G-150 column (1
, 5X 91 cfn).

浴出液のＴＩＣ分析に対し７て、フラクション１８〜２
９はほんのわずかの阻害活性を示した。7 for TIC analysis of bath effluent, fractions 18-2
9 showed only slight inhibitory activity.

そして、これらのフラクションをプールした（ピークＡ
）。大きな活性を持つフラクション３０〜４０を一緒に
した（ピークＢ）。These fractions were then pooled (peak A
). Fractions 30-40 with high activity were combined (peak B).

１　　”υ 結論 コンフラクションＩＶ−Ｉは約５２９６の凝集体を含有
していると思われる。これは、およそ次の２つの理由に
よる。１）ラジアル　イミュノデイフユージョン分析（
ＲＩＤ）は、単量体のα−１−抗トリプシンと重合した
α−１−抗トリプシンとを区別しない。重合したα−１
−抗トリプシンは寒天ゲル中に拡散しないのでその濃度
は低く評価される。、２）カラムが最適でなかったので
、単量体が若干ピークＡで溶離された。1 ”υ Conclusion Confraction IV-I appears to contain approximately 5296 aggregates. This is due to approximately two reasons: 1) Radial immunodiffusion analysis (
RID) does not distinguish between monomeric α-1-antitrypsin and polymerized α-1-antitrypsin. Polymerized α-1
- Antitrypsin does not diffuse into the agar gel, so its concentration is underestimated. , 2) Some monomer was eluted in peak A because the column was not optimal.

そして、これがα−１−抗トリプシンの重合体を過大評
価させることになったと思われる。換言すれば、ピーク
Ａで見られた、限定されたトリプシン阻害活性は、コン
フラクションＩＶ−Ｉに存在することが知られている他
の分子量の高い阻害剤、即ちα−２−マクログロブリン
、インター−α−トリズシン阻害剤の結果でおると思わ
れる。And this seems to have caused the α-1-antitrypsin polymer to be overestimated. In other words, the limited trypsin inhibitory activity seen with peak A is due to other high molecular weight inhibitors known to be present in fraction IV-I, namely α-2-macroglobulin, -This is thought to be the result of the α-trizucin inhibitor.

実施例会 抗トリプシン凝集体に対する還元及び塩析の効果を試験
するため、還元−塩析したコンフラクションＩＶ−Ｉの
上澄み液を０．１　Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３に対して透析し
、タンパク質１９．１ｍｇ及びα−１＝抗トリプシン９
．６■を含有するアリコート１−を同一の緩衝液で平衡
状態にあるセファデックスＧ−１５０カラム（１，５Ｘ
９１鋸）内へ注入した。EXAMPLE To test the effect of reduction and salting out on anti-trypsin aggregates, the reduced-salted out confaction IV-I supernatant was dialyzed against 0.1 M NH4HCO3 and 19.1 mg of protein and α- 1 = anti-trypsin 9
．． Aliquots 1- containing
91 saw).

フラクションをプールし、Ａ（凝集体ピーク）及びＢの
標識を付した。そして、これらを、下記表面に示す通り
、種々の分析法によって分析した。Fractions were pooled and labeled A (aggregate peak) and B. These were analyzed by various analytical methods as shown below.

表　　■ Ａ　　　　　　０　　　　　　　　　　０Ｂ　　　　　
　Ｏ，４２５，５ 結論 コン７ラクシヨンをＤＴＴで処理し、次いで（ＮＨ４）
２８０４によって塩析した場合は、全ての凝集したα−
１−抗トリゾジノを効果的に除去することは明らかであ
ると思われる。Table ■ A 0 0B
O,425,5 Conclusion Con7 treatment with DTT and then (NH4)
When salting out with 2804, all aggregated α-
It seems clear that 1-antitrizodino is effectively removed.

実施例５ 還元時間及び／又は還元剤のモル濃度を塩析系において
減少させることができるかどうかをさらに測定するため
、３７℃で実験した。Example 5 To further determine whether the reduction time and/or the molar concentration of the reducing agent can be reduced in a salting out system, experiments were conducted at 37°C.

活性化ｔ、ＪｃコンフラクションＩＶ−Ｉをタンパク質
３１．９η／−を含有するアリコー）９．５ｄに分け、
種々の濃度のＤＴＴ又はシスティンを添加して３７℃で
２時間、４時間又は８時間処理し、た。還元剤を含有し
ないコントロールの溶液も同様に処理した。それから、
全てのアリコートを５０チ（ＮＨｌｌ）２８０＋４の最
終濃度まで処理し、５℃で２４時間培養し、１０．００
　Ｏｒｐｍで遠心分離し、沈澱物を冷５０％（ＮＨ４）
２８０４で洗浄した。The activated t, Jc confluence IV-I was divided into 9.5 d aliquots containing 31.9 η/− of protein;
Various concentrations of DTT or cysteine were added and treated at 37°C for 2, 4 or 8 hours. A control solution containing no reducing agent was treated similarly. after that,
All aliquots were treated to a final concentration of 50 NHll 280+4, incubated for 24 hours at 5°C, and 10.00
Centrifuge at Orpm and cool the precipitate in 50% (NH4)
Washed with 2804.

上澄み液を一緒にして、０．０１Ｍシスティンを含有す
るｐＨ７，６の０．０１　Ｍホスフェート１×４リット
ルに対して、次いでシスティンを含有していないｐＨ７
，６の０．０１　Ｍホスフェート３Ｘ４リットルに対し
て透析した。Ｔ　Ｉ　Ｃ，ロウリー及びアルブミン　ラ
ジアル　イミュノデイフユージョン分析を行なった。そ
の結果を表■に総括する。The supernatants were combined and added to 1 x 4 liters of 0.01 M phosphate, pH 7.6, containing 0.01 M cysteine, then to pH 7, containing no cysteine.
, 6 against 3×4 liters of 0.01 M phosphate. TIC, Lowry and albumin radial immunodiffusion analyzes were performed. The results are summarized in Table ■.

表　　　　　■ ０．０１ＭＤＴＴ　７８，６１７．０２．０５．５０．
０５ＭＤＴＴ　　　７Ｂ、６　　　１１，５　　　　０
　　７．５０．１ＭＤＴＴ　７０．９１０．３０７．５
０．１Ｍシスティン　　８５．５　　　　２４．０　　
　　　？５．０　　　３．３１．０Ｍシスティン　７５
．５　　　　１６．０　　　　２１．ロ　　　５０口４
噴 コントロール　　　　８９，０　　　　５１．５　　　
　９？、５　　　５．００．０１ＭＤＴＴ　７４．２１
３．０７．７６．３０．０５Ｍ　　ＤＴＴ　　　　　　
　　６Ｂ、０　　　　　　　　　１０．８　　　　　　
　　　　　　　０　　　　　　６．８０．１ＭＤＴＴ　
７４．２９，６０８．５０．１Ｍ　システィン　Ｂ４．
８　　　　２５．８　　　　８９．３　　　５．５１．
０Ｍ　システィン　７４．２　　　　１２．９　　　　
　１．５　　　６．３８時間 コントロール　　　　　９４，８　　　　５２．８　　
　１００．０　　　４５．５０．０１ＭＤＴＴ　　　　
７６．８　　　　１３．０　　　　１．ロ　　　６．３
０．０５Ｍ　ＤＴＴ　　　８０．０　　　１１．３　　
　　０　　７．５０．１Ｍ　ＤＴＴ　　　　７３．８　
　　　９．４　　　　　０　　　８．５０．１Ｍ　シス
ティン　９１，５　　　　２４．７　　　　９９．０　
　　４，０１、ＯＭ　　７ステイン　　７９，８　　　
　１４，９　　　　　　　０　　　５．８結論 ＤＴＴを添加し、６７℃で４〜８時間処理して得られた
精製ファクターは、２５℃で２４時間処理した場合と同
様であった。システィンは１Ｍの場合でさえ、０．０５
ＭのＤＴＴより効果がない。Table ■ 0.01MDTT 78,617.02.05.50.
05MDTT 7B, 6 11, 5 0
7.50.1MDTT 70.910.307.5
0.1M cysteine 85.5 24.0
? 5.0 3.31.0M cysteine 75
．． 5 16.0 21. B 50 mouths 4
Jet control 89.0 51.5
9? , 5 5.00.01MDTT 74.21
3.07.76.30.05M DTT
6B, 0 10.8
0 6.80.1MDTT
74.29,608.50.1M Sistine B4.
8 25.8 89.3 5.51.
0M Sistine 74.2 12.9
1.5 6.38 hour control 94.8 52.8
100.0 45.50.01MDTT
76.8 13.0 1. B 6.3
0.05M DTT 80.0 11.3
0 7.50.1M DTT 73.8
9.4 0 8.50.1M Sistine 91.5 24.7 99.0
4,01, OM 7 stain 79,8
14,90 5.8 Conclusion Purification factors obtained by adding DTT and treating at 67°C for 4-8 hours were similar to those obtained by treating at 25°C for 24 hours. Even when cysteine is 1M, it is 0.05
It is less effective than M's DTT.

実施例６ 還元後の塩析におけるｐＨの影響を調べるため、エタノ
ールを除去せずにコンフラクションＩＶ−■を活性化し
た。この実験のために、塩析をｐＨ６，０及びｐＨ８，
５で行なった。ｐＨ８，５の０．１Ｍホスフェートに溶
解したコン７ラクシヨンＩＶ−Ｉ８０−（１５ｍｇ／ｍ
Ｊタンパク質、ロウリー渕を４０−ずつ２つのサンプル
（Ａ及びＢ）に分けた。サンプルＡを０．１ＭＤＴＴに
よって室温で２４時間処理した。サンプルＢはコントロ
ールとしてそのまま保持した（ＤＴＴなし）。還元後、
サンプルＡをアリコー）　ＡＩ及びＡ２に等分した。ア
リコートＡｌを攪拌下ＩＭＨＣ１でｐＨ６，０まで滴定
した（最終容積２２．ｓｍｊ）。了りコートＡ２を、ア
リコートＡ１と同じタンパク質濃度とするためにｐＨ８
，５で希釈した。　コントロールのサンプルＢもサンプ
ルＡと同様に処理した。各アリコー）　（Ａ１．　Ａ２
．　Ｂｌ、　Ｂ２　）からそれぞれ２０−とり、これら
を５０％塩の最終濃度まで５℃で（ＮＨ４）２８０１１
ｖｃよッテ処理した。２４時間培養した後、固体沈澱物
（５ｏｌｉｄ　ｐｐｔａ　）をｉｏ。Example 6 In order to investigate the influence of pH on salting out after reduction, Confraction IV-■ was activated without removing ethanol. For this experiment, salting out was carried out at pH 6.0 and pH 8.
I did it at 5. Con7 lactation IV-I80- (15 mg/m
The J protein, Lowry Fuchi, was divided into two samples (A and B) of 40. Sample A was treated with 0.1 MDTT for 24 hours at room temperature. Sample B was kept as a control (no DTT). After reduction,
Sample A was equally divided into aliquots AI and A2. An aliquot Al was titrated with IMHC1 under stirring to pH 6.0 (final volume 22.smj). Finished coat A2 was adjusted to pH 8 to give the same protein concentration as aliquot A1.
, 5. Control sample B was also treated in the same manner as sample A. each alico) (A1. A2
．． (NH4)28011 at 5 °C to a final concentration of 50% salt.
VC Yotte processing. After 24 h of incubation, the solid precipitate (5 solid ppta) was washed io.

ＯＤＤ　ｒｐｍで遠心分離し、洗浄して、ｏ、　ｏ　ｉ
　Ｍシスティンを含有するｐＨ７，６の０．０１　Ｍホ
スフェ−１−ＩＸ４リットルに対して、次いでｐＨ７，
６の０．０１Ｍホスフェート３×４リツトルに対して透
析した。Centrifuge at ODD rpm, wash, o, o i
For 4 liters of 0.01 M Phosphe-1-IX at pH 7.6 containing M cysteine, then
Dialyzed against 3 x 4 liters of 0.01M phosphate 6.

−八４− 結論 塩析前にｐＨを６に調整した場合、全部のタンパク質の
沈澱量を幾分大きくするが、α−１−抗トリプシンの沈
澱量も増加する。精製ファクターは、ｐＨ６及び８．５
でほぼ同じ結果が得られる。α−１−抗トリプシンの損
失がｐＨ６で大きいので、ｐＨ８，５での塩析が好まし
いと思われる。-84- Conclusion When the pH is adjusted to 6 before salting out, the amount of all proteins precipitated becomes somewhat larger, but the amount of α-1-antitrypsin precipitated also increases. Purification factors are pH 6 and 8.5
almost the same results are obtained. Since the loss of α-1-antitrypsin is greater at pH 6, salting out at pH 8.5 appears to be preferable.

実施例７ プラズマを還元及び塩析することによって遂行される精
製ファクターを測定するため、肋溶性プラズマを２倍、
４倍又は６倍に希釈し、各溶液をそれぞれ２つに等分し
た。このうらそれぞれ１つを０．１ＭＤＴＴによって２
５℃で２４時間還元し、次いで５０チ（ＮＨｌｌ）２８
０４まで塩析した。他のそれぞれ１つは培養し塩析した
が、還元しなかった。還元アリコー）Ａ、ＢＸ　Ｃは１
０．００Ｏｒｐｍ　（５℃）で２０分間遠心分離するこ
とによって容易に除去し得る不溶性タンパク質を有して
いた。上澄み液と洗浄液とを一緒にし、５０　ｑ６（Ｎ
ｎ４）２ｓＯＩＩ飽和まで処理し、５℃で２４時間賠１
して前記の如く遠心分離した。コントロールも（Ｎｌ（
＋４　）２　ＳＯ＋４などで同様に処理した。Example 7 To determine the purification factor achieved by reducing and salting out the plasma, the costolytic plasma was doubled;
Diluted 4-fold or 6-fold, and each solution was divided into two equal parts. Add one of each of these to 2 by 0.1MDTT.
Reduced at 5°C for 24 hours, then reduced to 50 NHll28
It was salted out until 0.04. Each of the others was incubated and salted out, but did not reduce. reduction aliquot) A, BX C is 1
It had insoluble protein that could be easily removed by centrifugation for 20 minutes at 0.00 Orpm (5°C). Combine the supernatant liquid and washing liquid and add 50 q6 (N
n4) Treat to 2sOII saturation and incubate at 5°C for 24 hours.
and centrifuged as above. The control is also (Nl(
+4)2 Treated in the same manner as with SO+4.

名溶液を、０．０１Ｍシスティンを含有するｐＨ７゜６
のホスフェート１×４リツトルに対して、次いでホスフ
ェ−１・単独に対して透析した。A solution containing 0.01M cysteine at pH 7.6
Dialysis was performed against 1 x 4 liters of phosphate and then against phosphate-1 alone.

＜ＩＩＧＱ（Ｊ　　　ρ　　に）　　１結　　論 直光−塩析系は、プラズマにおける精製ファクターを非
常に増大させる。プラズマ溶液の希釈は良好な結果を与
える。アルブミンは、ラジアルーイミュノデイフユージ
ョンによって示されたように、本質的に完全に沈澱し得
る。<IIGQ (J ρ ) 1 Conclusion The direct light-salting system greatly increases the purification factor in the plasma. Dilution of the plasma solution gives good results. Albumin can be essentially completely precipitated as demonstrated by radial immunodiffusion.

実施例８ 上澄み液からのα−１−抗トリプシンの分離を説明する
ため、コンフラクションＩＶ−ＩＱ活性化し、前の実施
例に記載したように還元し塩析した。得られた溶液（７
７０Ｔｎｌ）は、タンパク質を約２．７７　ｍｙ　／　
ｍｌ含有していた。該タンパク質の約５０俤はα−１−
抗トリプシ／であった。２０ｍＪＤＥＡＥ−セルロース
カラムにｐＨ７，６の０．０１Ｍホスフェートを充てん
し平衡状態にした。抗トリプシン活性に関して溶出液フ
ラクションを監視するためにＴＩＣを用いた。タンパク
質の総計が１．８４ｆ又は樹脂１−当りのタンパク質が
９２■の、最大カラム能力に相当する溶液６６４　ｍｌ
を充てんした。それから不結合のタンパク質を除去する
ため樹脂を出発緩衝液で洗浄し、次いでｐＨ７，６の０
．０１ＭホスフェートからｐＨ６，０の、０．０１　Ｍ
ホスフェート」−０，０７ＭＮａＣ１へ次第に頌斜させ
た液４００ｄで溶離した。ＯＤ及びＴｉＣを監視した後
、活性フラクション（６０〜１１５）をプールシタ。タ
ンパク質の約５９７１ｎｇ（約５２饅）が樹脂に結合し
なかった。結果を表■に総括する。Example 8 To demonstrate the separation of α-1-antitrypsin from the supernatant, Confraction IV-IQ was activated, reduced and salted out as described in the previous example. The resulting solution (7
70Tnl) contains protein at approximately 2.77 my/
It contained ml. Approximately 50 units of the protein are α-1-
It was anti-trypsy/. A 20mJDEAE-cellulose column was filled with 0.01M phosphate at pH 7.6 and brought into equilibrium. TIC was used to monitor eluate fractions for antitrypsin activity. 664 ml of solution corresponding to maximum column capacity with total protein of 1.84 f or 92 μ of protein per resin.
was filled. The resin was then washed with starting buffer to remove unbound protein, followed by
．． 0.01 M phosphate to pH 6.0
The solution was eluted with 400 d of diluted solution of phosphate-0.07M NaCl. After monitoring OD and TiC, pool the active fraction (60-115). Approximately 5971 ng of protein was not bound to the resin. The results are summarized in Table ■.

結論 得られ九生成物は全く純粋であった（比活性０．９４■
抗トリプシン／■タンパク質）また、本実施例では、過
充てんし九カラムを効果的に利用できることが例証され
た。It was concluded that the product obtained was completely pure (specific activity 0.94
Anti-trypsin/■ protein) This example also demonstrated that overpacked nine columns can be effectively utilized.

実施例９ コンフラクションＩＶ−Ｉを、前の実施例で記載したよ
うに、活性化、還元及び塩析した。２３ｍｊＤＥＡＥ−
セルロースカラムｐＨ７，６の０．０１　Ｍホスフェー
ト緩衝液で平衡状態にし、樹脂１ｒｎｌ幽りのタンパク
質が２５．７１１９に相当するタンパク質溶液４３０−
を通した。不結合のタンパク質を出発緩衝液で洗い落し
、そして、カラムを、ｐＨ７，６の０．０１　Ｍホスフ
ェートからｐＨ６，０の、０．０１Ｍホスフェ？　＋０
．１　Ｍ　ＮａＣ１ヘ次第に傾斜させた液５００−で溶
解した。タンパク質溶離パタンを得、活性に関してタン
パク質を検査した後、チューブ１７５〜２１０をプール
した。結果を表■に総括する。Example 9 Confraction IV-I was activated, reduced and salted out as described in the previous example. 23mjDEAE-
Equilibrate the cellulose column with 0.01 M phosphate buffer, pH 7.6, and add 430 -
passed through. Unbound protein is washed away with starting buffer and the column is washed from 0.01 M phosphate at pH 7.6 to 0.01 M phosphate at pH 6.0? +0
．． Dissolved in 1M NaCl with 500ml gradient solution. After obtaining the protein elution pattern and testing the protein for activity, tubes 175-210 were pooled. The results are summarized in Table ■.

結論 過充てんしなかったＩ）ＥＡＥ方法は、カラムに充てん
されたα−１−抗トリプシンの総量に対して８４チの回
収率で純度の高い優れた生成物を与える。多量の抗キモ
トリプシンがカラムに強く結合していること、そして望
むならばこれを分離できることが明白である。Conclusion I) The EAE method without overpacking gives an excellent product of high purity with a recovery of 84 cm based on the total amount of α-1-antitrypsin packed in the column. It is clear that a large amount of antichymotrypsin is strongly bound to the column and that this can be separated if desired.

実施例１０ コンフラクションＩＶ−Ｉ溶ｔＬを、前の実ｍ例で記載
したように、活性化、還元及び塩析した。Example 10 Confraction IV-I tL was activated, reduced and salted out as described in the previous example.

タンパク質１６．３η／−及びα−１−抗トリプシン５
．９１１ｖ／−を含有し、０．０１Ｍ１Ｍホスフェ−０
，０１Ｍシスティンでｐ）（乙６に調整し、ＤＴ　Ｔ　
／　（ＮＨ４）２８０４処理したタンパク實溶液３６５
−を、限外濾過によって約２５０−まで濃縮した。この
溶液を、１００．０００Ｍ、Ｗ、のカットオフ空胴フ゛
アイバーを用いて０．０５　Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３１９８
０−に対して透過した。Ｆｉ液及びチャンバー（Ｃｈａ
−ｍｂａｒ　ｌ内に残留した溶液の両方について、α−
１−抗トリプシン含量及び純度を検査し、ＤＥＡＥ−セ
ルロースから得られたα−１−抗トリプシンと比較した
。Protein 16.3η/- and α-1-antitrypsin 5
．． 911v/-, 0.01M 1M Phosphe-0
, 01M cysteine p) (adjusted to Otsu 6, DT T
/ (NH4)2804 treated protein solution 365
- was concentrated to about 250- by ultrafiltration. This solution was mixed with 0.05 M NH4HCO3198 using a cutoff cavity fiber of 100.000 M, W.
Transmitted to 0-. Fi liquid and chamber (Cha
- for both solutions remaining in mbar l, α-
The 1-antitrypsin content and purity were tested and compared with α-1-antitrypsin obtained from DEAE-cellulose.

１００、０００Ｍ、Ｗ、カットオフでのアミコン限外濾
過を用いた場合、α−１−抗トリプシンの８７チが膜を
通過し、１．８倍の精製ファクターが得られた。精製し
たタンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、高
分子量の１つの主要な不純物、おそらくα−１−抗トリ
プシン凝集体を見せた。他方、ＤＥＡＥ−セルロースに
よって精製された物質は均質であった。生成物の純度に
ついても、プラズマのタンパク質とは異なった抗体を用
いて免疫電気泳動（ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓ１８）によって検査した。ＤＥＡＥ−セルロース
によって精製された阻害剤は、抗トロンビン璽及びα−
１−リポプロティンの不純物を示した。Using Amicon ultrafiltration with a 100,000 M, W, cutoff, 87 ml of α-1-antitrypsin passed through the membrane, yielding a 1.8-fold purification factor. A 5DS-polyacrylamide gel of the purified protein revealed one major impurity of high molecular weight, probably α-1-antitrypsin aggregates. On the other hand, the DEAE-cellulose purified material was homogeneous. The purity of the product was also determined by immunoelectrophoresis using antibodies different from plasma proteins.
res18). DEAE-cellulose purified inhibitors are antithrombin and α-
1-Lipoprotein impurities were shown.

アミコンによってｎ製したα−１−抗トリプシンは、上
記不純物に加えて、α−１−抗キモトリプシン、α−１
−アシッドグリコプロティン及びＣＩＳ不活性化剤も含
有していた。α-1-antitrypsin manufactured by Amicon contains, in addition to the above impurities, α-1-antichymotrypsin, α-1
-Also contained acid glycoproteins and CIS inactivators.

結論 ＤＥＡＥ−セルロースによる精製工程は、純度（８９％
対７０〜７５チ）及び回収率（９１俤対８７　％　）　
Ｉｆ（おいて限外１過より優れている。Conclusion DEAE-cellulose purification process has a purity (89%
70-75%) and recovery rate (91% vs. 87%)
If (is better than the ultra 1 pass).

他方、限外ｐ過による精製は、非常に迅速且つ簡単で安
価でおり、また容易に規模を大きくすることができる。On the other hand, purification by ultrapolar filtration is very quick, simple, and inexpensive, and can be easily scaled up.

実施例１１ ローレル等による刊行物（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、、　５７：１０７−１１３．１９７５）においては
、α−１−抗トリプシンをチオール−ジスルフィド交換
させるためにプラズマを３０　ｍＭβ−メルカプトエタ
ノールで処理している。この工程では、チオールクロマ
トグラフイエ程の前にα−１−抗トリプシンを部分的に
精製するため硫酸アンモニウム分別を行なっている。Example 11 Publication by Laurel et al. (Eur, J. Bioche
1975), plasma was treated with 30 mM β-mercaptoethanol to cause thiol-disulfide exchange of α-1-antitrypsin. In this step, ammonium sulfate fractionation is performed to partially purify α-1-antitrypsin before the thiol chromatography step.

本実施例では、ローレル等によって記載された条件及び
本発明法で使用された条件を用いて、β−メルカプトエ
タノールとＤＴＴとの還元剤としての効果を比較した。In this example, the effectiveness of β-mercaptoethanol and DTT as reducing agents was compared using the conditions described by Laurel et al. and the conditions used in the method of the present invention.

ローレル等の条件：３０ｍＭβ−メルカプトエタノール
で培養し、次いで、２５℃で５０チ飽和（ＮＨ４）２ｓ
Ｏｑで分別した。本発明法の条件；１００ｍＭＤＴＴで
２４時間培養し、次いで、４℃で５０％飽和（ＮＨ４）
２ＳＯ＋４で分別した。Conditions of Laurel et al.: Cultivation with 30mM β-mercaptoethanol, then 50% saturated (NH4) 2s at 25°C.
It was separated by Oq. Conditions for the method of the present invention: Culture in 100mM DTT for 24 hours, then 50% saturation (NH4) at 4°C.
It was separated using 2SO+4.

下記表Ｘに列挙した実験を行なった。The experiments listed in Table X below were conducted.

最終の還元剤濃度（３０又は１００ｍＭ）を与えるため
、プラズマのアリコート２．０ｒｎｔに還元剤水溶液４
．　Ｏｒｎｔを添加した。これらの処理プラズマのサン
プルを２５℃で１時間又は２４時間培養し、次いで、１
００俤飽和（ＮＨ４）２８０４溶液６．０−を２５℃又
は４℃でそれぞれに添加した。To give a final reducing agent concentration (30 or 100 mM), a 2.0 rnt aliquot of plasma was added with 4 ml of reducing agent aqueous solution.
．． Ornt was added. These treated plasma samples were incubated at 25°C for 1 or 24 hours and then incubated at 1
6.0 - of a saturated (NH4) 2804 solution was added at 25°C or 4°C, respectively.

６時間後、サンプルを３．０００　ｘｇで２０分間遠心
分離し、５０チ飽和（ＮＨ４）２　ＳＯ＋＋で洗浄して
再び遠心分離した。上澄み液を、１０ｍＭシスティンを
含有するｐＨ７，６の１０　ｍＭリン酸ナナトリウム緩
衝液対して、次いでｐＨ７，６の１０ｍＭホスフェート
単独に対して透析した。透析した上澄み液及びプラズマ
のコントロールについて、ロウリー及びＴＩＣ分析を行
なった。その結果を表Ｘに示す。After 6 hours, samples were centrifuged at 3.000 xg for 20 minutes, washed with 50 saturated (NH4)2SO++ and centrifuged again. The supernatant was dialyzed against 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.6, containing 10 mM cysteine and then against 10 mM phosphate alone, pH 7.6. Lowry and TIC analyzes were performed on dialysed supernatants and plasma controls. The results are shown in Table X.

表　　　　　Ｘ プラズマからのα−１−抗トリプシンの４′＃製におけ
るβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）とＤＴＴとの歯
元剤としての比較 コントロール　　２．５　　　　１３１．２　　０．０
１９　　１１、時間還元 還元剤なし　　　１．９５　　　　６６．８　　０．０
２９　　１゜５３０ｍＭ　　ＢＭＥ　　　２．１７　　
　　７２．５　　０．０３０　　１．６３０ｍＭ　　Ｄ
ＴＴ　　　１．９６　　　　１８．０　　０．１０９　
　５．７１００ｍＭＢＭＥ　　１．８６　　　　７１，
１　　０．０２６１．４１００ｍＭ　Ｄ’Ｉ’Ｔ　　１
．７６　　　　　　Ｂ、１　　０．２１７　　１１．４
２４時間還元 還元剤なし　　　２．０８　　　　７２．０　　０．０
２９　　１．５３０ｍＭ　　ＢＭＥ　　　１．９６　　
　　７１．３　　０．０２７　　１．４５０ｍＭ　　Ｄ
Ｔ’ｌ”　　　０．９Ｂ　　　　　　４．５５　０．２
１５　１１．３１００ｍＭ　ＭＢＫ　　１．８８　　　
　５３，０　　０．０３５　　１．８１００ｍＭ　ＤＴ
Ｔ　　、１．０７　　　　　５，２８０．２０３　１０
．７結論 表Ｘの結果は次の結論を示している。Table X Comparison control of β-mercaptoethanol (BME) and DTT as a dental agent in 4'# production of α-1-antitrypsin from plasma 2.5 131.2 0.0
19 11, Time reduction No reducing agent 1.95 66.8 0.0
29 1゜530mM BME 2.17
72.5 0.030 1.630mM D
TT 1.96 18.0 0.109
5.7100mMBME 1.86 71,
1 0.0261.4100mM D'I'T 1
．． 76 B, 1 0.217 11.4
24 hours reduction No reducing agent 2.08 72.0 0.0
29 1.530mM BME 1.96
71.3 0.027 1.450mM D
T'l" 0.9B 4.55 0.2
15 11.3100mM MBK 1.88
53,0 0.035 1.8100mM DT
T, 1.07 5,280.203 10
．． 7 Conclusion The results in Table X show the following conclusions.

１．１時間培養、還元剤使用、２５℃での塩析： ａ、ＤＴＴと（ＮＨ４）２８０４を加えた場合は、５゜
チ飽和（ＮＨ４）２　ＳＯ＋＋単独の場合より、プラズ
マからのα−１−抗トリプシンの精製を著しく向上させ
る。１００ｍＭＤＴＴは、短い培養期間において３０ｍ
ＭＤＴＴより効果がある。1. Incubation for 1 hour, using reducing agent, salting out at 25°C: a. When DTT and (NH4)2804 were added, α- from the plasma was lower than when using 5° saturated (NH4)2SO++ alone. 1- Significantly improves the purification of anti-trypsin. 100mM DTT is 30mM in a short culture period.
More effective than MDTT.

ｂ、　β−メルカプトエタノールと５０％飽和（ＮＩ（
４）２　ＳＯ４を加えた場合は、α−１−抗トリプシン
の精製において、（ＮＨ４）２５Ｏ１ｌ＊独の場合を超
える改良を生じていない。１００ｍＭβ−メルカプトエ
タノールと３０　ｍＭβ−メルカプトエタノールはいず
れも効果的でない。b, β-mercaptoethanol and 50% saturation (NI(
4) The addition of 2SO4 did not result in any improvement over the case of (NH4)25O11* in the purification of α-1-antitrypsin. Neither 100mM β-mercaptoethanol nor 30mM β-mercaptoethanol are effective.

Ｃ１ローレル寺の条件（３０ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール、１時間培ＩＩＥ、５０％飽和（ＮＨｌＩ）２８０
１＋、室温（約２２℃））は、α−１−抗トリプシンの
精製において、（ＮＨ４）２ＳＯ＋４単独の場合を超え
る改良を生じていない。ローレル等の方法におけるβ−
メルカプトエタノールの使用は、次のチオール交換クロ
マトグラフィのためにα−１−抗トリプシ／を還元する
ためであり、混入タンパク員を不安定することによって
α−１−抗トリプシンの精製を向上させるためではない
。C1 Laurel Temple conditions (30mM β-mercaptoethanol, 1 hour culture IIE, 50% saturation (NHlI) 280
1+, room temperature (approximately 22° C.)) did not produce any improvement over (NH4)2SO+4 alone in the purification of α-1-antitrypsin. β- in the method of Laurel et al.
The use of mercaptoethanol is to reduce α-1-antitrypsin for subsequent thiol exchange chromatography and not to improve purification of α-1-antitrypsin by destabilizing contaminating protein members. do not have.

２、２４時間培養、還元剤使用、４℃での塩析； ａ、ＤＴＴと５０優飽和（ＮＨｌｌ）２Ｓ０１１を加え
た場合は、（ＮＨｌｌ）２５ＯＩＬ単独の場合より、プ
ラズマからのα−１−抗トリプシンの精製を着しく向上
させる。３０ｍＭＤＴＴは、この培養期間において１０
０ｍＭＤＴＴと同じ位効果がある。2. Culture for 24 hours, use of reducing agent, salting out at 4°C; a. When DTT and 50-dominantly saturated (NHll)2S011 were added, the α-1- Significantly improves the purification of anti-trypsin. 30mM DTT was added at 10mM during this culture period.
It is as effective as 0mM DTT.

ｂ、　β−メルカプトエタノールと５０％飽和（ＮＨ＋
４　）２８０４を加えた場合は、１時間の還元において
さえも、α−１−抗トリプシンの精製において、（ＮＨ
ＩＩ）２８０Ｉｌ牟独の場合を超える改良を生じておら
ず、２４時間で１００ｍＭにおいて始めてわずかな改良
がみられた。b, β-mercaptoethanol and 50% saturation (NH+
4) When 2804 was added, (NH
II) No improvement occurred over that of 280Il, only a slight improvement was seen at 100mM at 24 hours.

Ｃ１還元剤で２４時間培養した、３倍に希釈したプラズ
マのＤＴＴ処理サンプルにおけるα−１−抗トリプシン
の収率は約４０％であり、これは堅固なかたま９が構成
されたためである。α−１−抗トリプシンの収率におけ
る、このＤＴＴの効果は、１時間培養しまたサンプルに
おいても、また、前の実施例に示した如く、６倍に希釈
したプラズマにもみられなかった。The yield of α-1-antitrypsin in DTT-treated samples of 3-fold diluted plasma incubated for 24 hours in C1 reducing agent was approximately 40%, due to the formation of solid masses 9. This effect of DTT on the yield of α-1-antitrypsin was not seen in samples incubated for 1 hour or in plasma diluted 6 times as shown in the previous example.

実施例１２ プラズマからのα−１−抗トリプシンの精製において、
還元−塩析系によるｆ＃製と比べて、ＤＴＴ単独でも１
−分効果があるかどうかをみるために、ド配表Ｍに列挙
した実験を行なった。。Example 12 Purification of α-1-antitrypsin from plasma:
Compared to f# production using a reduction-salting system, DTT alone has a
In order to see whether there is a - minute effect, we conducted the experiment listed in Table M. .

ピアス及びエラジオ（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍ
ｅｄ、　９４：　８２６−８６１．１９７９）は、α−
１−抗トリプシンを等電的に焦点を合わせること（１ｓ
ｏｅｌｅｃｔｒｉａ　ｆｏｃｕｓｉｎｇ　）によってフ
ェノタイツ゛する前に、プラズマからアルブミンを除去
するためにＬ）ＴＴを使用した。彼等は、３０　ｍＭ　
Ｄ　’ｒ　’１”を用いて、６７℃で１時間でアルジミ
ンが略同なかたまりになって沈澱することを発見した。Pierce and Eladio (J, Lab, Cl1n, M
ed, 94: 826-861.1979) is α-
1-Isoelectrically focusing the antitrypsin (1s
L) TT was used to remove albumin from the plasma before phenotizing by oelectria focusing). They are 30mM
Using D'r'1'', it was discovered that aldimine precipitated in substantially the same mass at 67°C for 1 hour.

本実験では、３ｏ及びｉｏ。In this experiment, 3o and io.

ｍＭｍ度の還元剤を用いた場合、ＤＴＴと（ＮＨ４）２
８０４の組合せがＤＴＴ単独よりα−１−抗トリプシン
の楕製會向上させることを示した。When using a reducing agent of mmM degree, DTT and (NH4)2
The combination of 804 was shown to improve α-1-antitrypsin activity over DTT alone.

上ｒ＋己Ｄ　Ｔ　Ｔ　濃度を与えるため、プラズマのア
リコー）　２．０　ｍｇに還元剤水溶液０．２　〃Ｊを
添加した。歯元処理し／こプラズマのサンプルを３７℃
で１時１…培養し、それから、３０００ｘｇで遠心分離
するか若しくは５０％飽和（Ｎｌ（４）２８０４で分別
して遠心分離した。上澄み液を、１ｏｍＭ’Ｊン酸ナト
リウム（ｐＨ７，６）　＋１０ｍＭシスディン緩衝液に
対して、次いで１ｏｍＭホスフェート（ｐＨ７，６）Ｋ
対して透析した。サンプル及びプラズマのコントロール
をロウリ及びＴＩＣによって分析した。ぞの結果を表Ｍ
に示した。In order to give the upper r+self D T T concentration, 0.2 J of an aqueous reducing agent solution was added to 2.0 mg of plasma aliquot. Teeth root treated/this plasma sample was heated to 37°C.
and then centrifuged at 3000xg or fractionated with 50% saturation (Nl(4) 2804). buffer, then 1 omM phosphate (pH 7,6) K
Dialysis was performed against Samples and plasma controls were analyzed by Lowry and TIC. Table of results M
It was shown to.

表　　　　　ＸＩ プラズマからのα−１−抗トリプシンの精製におけルＤ
ＴＴ単独とＤＴＴ　＋　５０％飽和（ＮＦＩｌｌ）２ｓ
Ｏ１との比較 （Ｎｆ（１１）２ＳＯ５なし ＤＴＴなし　　　　１．６２　　　　　Ｂ８．９　　０
．０１８　　１，０３０ｍＭ　ＤＴＴ　　　Ｏ，６０１
３，２０，０４５２，５１００ｍＭＤＴＴ　　　Ｏ，６
４１４，９０，０４３２，４（ＮＨｌ）２ＳＯ１あり ＤＴＴなし　　　　　１．５５　　　　　４４．６　　
　０．０３５　　１．９３０ｍＭ　ＤＴＴ　　　Ｏ，６
１３，２６０，１８８１０，４１００ｍＭＤＴＴ　　　
Ｏ，４９５，１７０，１５５Ｂ、６結論 １、ＤＴＴ単独の場合は、非希釈のプラズマからのα−
１−抗ｌ・リプシンのわずかな？＃蜆を与える。Table XI LuD in the purification of α-1-antitrypsin from plasma
TT alone and DTT + 50% saturation (NFIll) 2s
Comparison with O1 (Nf(11)2SO5 without DTT 1.62 B8.9 0
．． 018 1,030mM DTT O,601
3,20,0452,5100mMDTT O,6
414,90,0432,4 (NHl) With 2SO1 and without DTT 1.55 44.6
0.035 1.930mM DTT O,6
13,260,18810,4100mMDTT
O, 495, 170, 155B, 6 Conclusion 1. In the case of DTT alone, α- from the undiluted plasma
1- Slight amount of anti-l lipsin? #Give worms.

２、　　ＤＴＴと５０％飽和（ＮＨｌ）２Ｓ０１１を加
えた場合は、α−１−抗トリプシンの精製をＤＴＴ単独
の場合の約４倍改良する。2. Addition of DTT and 50% saturated (NHl) 2S011 improves purification of α-1-antitrypsin by approximately 4 times over DTT alone.

３、　ピアスとエラジオの条件（３０ｍＭ　ＤＴＴ、３
７℃で１時間）は、１）ＴＴ還元と５ｏ％飽和（ＮＨ，
）２８０．による分別の組合せによって示された、α−
１−抗トリプシン精製の驚異的な向上を示さない。3. Conditions for piercing and erasion (30mM DTT, 3
1 hour at 7°C) for 1) TT reduction and 5o% saturation (NH,
)280. α−
1 - Does not show a surprising improvement in antitrypsin purification.

４、　　ＤＴＴ還元で培養した非希釈のプラズマからの
α−１−抗トリプシンの低収率（３０〜４０％）は、か
たま９が生成されたことに起因する。このＤＴＴの影響
け、前に示したように、６倍に希釈したプラズマには見
られナイ。4. The low yield (30-40%) of α-1-antitrypsin from undiluted plasma cultured with DTT reduction is due to the formation of lumps 9. As shown earlier, this DTT effect is not seen in plasma diluted six times.

実施例１３ エアロジル（Ａｅｒｏｓｉｌ）　、燻蒸し九シリカ製品
であるが、これが還元−塩析法においてα−１−抗トリ
プシンの精製を改良することができるかどうかを試験す
るため、また、生成物が（トリプシンに加えて）エラス
ターゼに対して活性を保持しているかどうかを測定する
ため、次の実験を行なった。Example 13 Aerosil, a fumigated nine-silica product, was also used to test whether it could improve the purification of alpha-1-antitrypsin in a reduction-salting-out method. To determine whether activity against elastase (in addition to trypsin) was retained, the following experiment was performed.

コン　フラクションＩ　Ｖ−１中のα−１−抗トリプシ
ンの活性化を、ｐＨ８，５のｏ、ＩＭ）リス−ＭＣＩ０
．５を中にコン　フラクション■Ｖ−■ペースト５０〜
を蕗博し、この溶液な２５℃で一晩中撹打することによ
って行なつ７’＜、、２５ｍＭの一度のジテオトレトー
ヤを活性化したコン　フラクションＩＶ−１に２．５％
エアロジルＳａＯ（ディガツサ、インコーポレー？／ヨ
ン、チェイタ−ポロ、ニューシャーシー州）の存在下に
２５′Ｃで加え、２４時間攪拌した。エアロジル５８０
は燻蒸シリカ物質であり、水溶液からα−リボプロティ
ン、β−リボプロティン及びβ−グロブリンを除去する
のに効果があると報告されている。ジチオトレトール処
理溶液を４℃で５０％飽和硫酸アンモニウムで塩析Ｌ７
、ぞして、−晩平衡状態にした後、３０００Ｘｒで１時
間遠心分離し友。沈澱物を５０−飽和（Ｎ′［■１ｌ）
２　ｓｏ、、で洗浄し１、再び遠心分離した。Activation of α-1-antitrypsin in Confraction I V-1 was detected at pH 8.5o, IM) Lys-MCI0.
．． 5 in Confraction ■V-■ Paste 50~
Add 2.5% to Confraction IV-1, which was activated with Diteotretoya at 7'<, 25 mM, by stirring this solution overnight at 25 °C.
It was added at 25'C in the presence of Aerosil SaO (Digatusa, Inc., Chaterpol, New Jersey) and stirred for 24 hours. Aerosil 580
is a fumigated silica material that is reported to be effective in removing α-riboprotein, β-riboprotein, and β-globulin from aqueous solutions. Salting out the dithiothretol treated solution with 50% saturated ammonium sulfate at 4°C L7
Then, after equilibrating for one night, the mixture was centrifuged at 3000Xr for 1 hour. The precipitate was 50-saturated (N' [■1 l)
The cells were washed with 2 SO, 1 and centrifuged again.

上澄み液を一緒にして、１０ｍＭシスティンを含有する
しＨ７，６の１０ｒｎＭリン酸ナトリウムに対して透析
し、次いでｐＨ７，６のリン酸す）　ＩＪウムに対して
透析した。The supernatants were combined and dialyzed against 10 nM sodium phosphate containing 10 mM cysteine and then against IJ phosphate, pH 7.6.

※　エラスターゼ阻害能力（Ｅ　Ｉ　Ｃ）は、ｐ−ニト
ロフェニル−Ｈ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−
１−アラニンを基質として用いて豚の膵臓のエラスター
ゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）に対して
測定した。Ｖｉａｓｅｒ、　Ｌ、、　ａｎｄ　Ｂｌｏｕ
ｔ。*Elastase inhibitory ability (E I C) is p-nitrophenyl-H-tert-butyloxycarbonyl-
Measurements were made against porcine pancreatic elastase (Calbiochem-Behring) using 1-alanine as substrate. Viaser, L., and Blou
t.

２５７−２６０゜ 結論 １、エアロジル法は、より大きな精製ファクターを与え
（約１６．７．１３．９対８．１５（嚢■））、混入タ
ンパク質を除去するのに効果があると思われる。α−１
−抗トリプシンの回収率はエアロジルの不存在下で行な
った実験の場合と同程度であった。257-260° Conclusion 1. The Aerosil method gives a larger purification factor (approximately 16.7.13.9 vs. 8.15 (sac ■)) and appears to be effective in removing contaminating proteins. α-1
- The recovery of anti-trypsin was comparable to that in experiments performed in the absence of Aerosil.

２、生成物は、トリプシン阻害能力に類似したエラスタ
ーゼ阻害能力を有していた。2. The product had elastase inhibition ability similar to trypsin inhibition ability.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図及び第２図は実施例２における測定結果を示すグ
ラフである。1 and 2 are graphs showing the measurement results in Example 2.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 （１）血液プラズマのタンパク質の混合物の溶液からα
−１−抗トリプシンを、下記の（ａ）工程、（ｂ）工程
及び（ｃ）工程により単離することを特徴とする、α−
１−抗トリプシンの単離方法。 （ａ）　　上記タンパク質を不安定化するに足る数の、
上記タンパク胃内のジスルフィド結合を破壊する。 （ｂ）　　不安定化したタンパク質を沈澱させる。 （ｃ）　　そして、上記溶液から非沈澱のα−１−抗ト
リプシンを回収する。 （２）さらに、上記α−１＝抗トリプシンを回収する前
に上記溶液から沈澱したタンパク質を分離する工程を特
徴する特許請求の範囲第（１）項記載のα−１−抗トリ
プシンの単離方法。 （３）　　上記ジスルフィド結合の破壊が、ジスルフィ
ド結合を還元するのに十分であるが、タンパク質を分断
するほど他のタンパク質の結合を還元するには不十分で
ある還元力を有する、効果的濃度の還元剤で上記溶液を
処理することによって行なわれる、特許請求の範囲第（
１）項記載のα−１−抗トリプシンの単離方法。 （４）上記還元剤がモノチオール類及びジチオール類か
ら選択される、特許請求の範囲第（３）項記載のα−１
−抗トリプシンの単離方法３、（５）上記モノチオール
が約０．１〜１．５Ｍの濃度で存在し、また上記ジチオ
ールが約０．０１〜０．１Ｍの濃度で存在する、特許請
求の範囲第（４）項記載のα−１−抗トリプシンの単離
方法。 （６）上記還元剤がジチオトレトール及びジチオエリト
リトールから選択される、特許請求の範囲第（３）項記
載のα−１−抗トリプシンの単離方法。 （７）−Ｆ記還元剤が約０．０５〜０．１０Ｍの濃度で
上記溶液に添加される、特許請求の範囲第（６）項記載
のα−１−抗トリプシンの単離方法。 （８）還元反応が約２５〜３７℃で約２〜２４時間行な
われる、特許請求の範囲第（７）項記載のα−１−抗ト
リプシンの単離方法。 （９）上記不安定化したタンパク質が塩析によって沈澱
される、特許請求の範囲第（１）項記載のα−１−抗ト
リプシンの単離方法。 ＯＱｌ　　上記塩析が硫酸塩を添加することによって行
なわれる、特許請求の範囲第（９）項記載のα−１−抗
トリプシンの単離方法。 （ＩＩ）　　上記血液プラズマのタンパク質が、ｐＨが
約６〜８．５の緩衝溶液中に保持されている、特許請求
の範囲第（１）項記載のα−１−抗トリプシンの単離方
法。 （１２上ｄ己卯沈澱のα−１−抗トリプシンの回収がク
ロマトグラフィ分離によって行なわれる、特許請求の範
囲第（１）項記載のα−１−抗トリプシ／の単離方法。 （１：１　　上記クロマトグラフィ分離が、上記非沈澱
のα−１−抗トリプシンを含有する一ヒ記溶液ｉ　ＤＥ
ＡＥ−セルロースのカラムに通すことによって行なわれ
る、特許請求の範囲第α３項記載のα−１−抗トリプシ
ンの単離方法。 Ｉ　上記浴液が、ＤＥＡＥ−セルロースの結合能力以上
にタンパク質を導入する量で上記カラムに通される、特
許請求の範囲第（１９項記載のα−１−抗トリプシンの
単離方法。 ｆｌｓ　　上記非沈澱のα−１−抗トリプシンが、限外
１過によって上記溶液から回収される、特許請求の範囲
第（１）項記載のα−１−抗１−　ＩＪプシンの単離方
法。 （１６）上記血液プラズマのタンパク質の混合物が人の
プラズマのコンフラクションＩＶ−Ｉである、特許請求
の範囲第（１）項記載のα−１−抗トリプシンの単離方
法。 αη　上記不安定化したタンパク質が、塩析によって沈
澱される前に、α−１−抗トリプシンの精製を向上させ
るのに十分な量の燻蒸したシリカで処理される、特許請
求の範囲第（９）項記載のα−１−抗トリプシンの単離
方法。 （ｆｉｌｌ　　ｐＨが約６〜８．５で且つタンパク質の
濃度が約５０■／−より少ない、血液プラズマのタンパ
ク質のコンフラクションＩＶ−Ｉの緩衝溶液からα−１
−抗トリプシンを、ドｄ己の（ａ）、（ｂ）　、（ｃ）
及び（ｄ）工程により単離することを特徴とする、α−
１−抗トリプシンの単離方法。 （ａ）　　上記タンパク胃内のジスルフィド結合を破壊
するのに足る、ジチオトレトール及びジチオエリトリト
ールから選択された還元剤を添加する。 （’ｂ）　　それから、上記タンパク質を沈澱させるの
に足る、２価の塩を添加する。 （ｅ）　　上澄み液と沈澱したタンパク質とに分離する
。 （ｄ）　　そして、クロマトグラフィ分離によって上呂
己上澄み液からα−１−抗トリプシンを回収する。 叫　さらに、上記回収したα−１−抗トリプシンを再生
する工程を特徴する特許請求の範囲第０８項記載のα−
１−抗トリプシンの単離方法。 （２０）　　上記再生が、上記回収したα−１−抗トリ
プシンをシスティンの緩衝溶液に対して透析することに
よって行なわれる、特許請求の範囲第（１０項記載のα
−１−抗トリプシンの単離方法。 （２Ｉ）　　安定化に利用されるジスルフィド結合を分
子内に化学的に有していないタンパク質又は上記結合を
全く有していないタンパク質を、上記結合を有するタン
パク質を含むタンパク質の溶液から下記の（、）工程、
（ｂ）工程及び（ｃ）工程により単離することを特徴と
１−る、タンパク質の単離方法。 （１Ｌ）安定化したタンパク質を不安定化するに足る数
の、上記安定化したタンパク胃内のジスルフィド結合を
破壊する処理を上記溶液に対し行なう。 （ｂ）　　破壊されたジスルフィド結合を有するタンパ
ク質を選択的に沈澱させる一方、他のタンパク質を上澄
み液に残留させる。 （、）　　そして、（１）沈澱したタンパク質及び（２
）上澄み液に残留するタンパク質の、少なくとも一つを
回収する。[Claims] (1) α from a solution of a mixture of blood plasma proteins
-1-Antitrypsin is isolated by the following steps (a), (b) and (c), α-
1- Method for isolating antitrypsin. (a) a number sufficient to destabilize the protein;
The disulfide bonds in the protein stomach are destroyed. (b) Precipitate the destabilized protein. (c) Then, non-precipitated α-1-antitrypsin is recovered from the solution. (2) Isolation of α-1-antitrypsin according to claim (1), further comprising the step of separating precipitated proteins from the solution before recovering the α-1-antitrypsin. Method. (3) Disruption of the disulfide bond is achieved at an effective concentration with reducing power sufficient to reduce the disulfide bond, but insufficient to reduce bonds in other proteins to the extent that it disrupts the protein. Claim No.
1) The method for isolating α-1-antitrypsin as described in section 1). (4) α-1 according to claim (3), wherein the reducing agent is selected from monothiols and dithiols.
- Method for isolating antitrypsin 3, (5) the monothiol is present in a concentration of about 0.1 to 1.5M, and the dithiol is present in a concentration of about 0.01 to 0.1M; A method for isolating α-1-antitrypsin according to item (4). (6) The method for isolating α-1-antitrypsin according to claim (3), wherein the reducing agent is selected from dithiothretol and dithioerythritol. (7) The method for isolating alpha-1-antitrypsin according to claim 6, wherein the reducing agent -F is added to the solution at a concentration of about 0.05-0.10M. (8) The method for isolating α-1-antitrypsin according to claim (7), wherein the reduction reaction is carried out at about 25 to 37°C for about 2 to 24 hours. (9) The method for isolating α-1-antitrypsin according to claim (1), wherein the destabilized protein is precipitated by salting out. OQl The method for isolating α-1-antitrypsin according to claim (9), wherein the salting out is performed by adding a sulfate. (II) The method for isolating α-1-antitrypsin according to claim (1), wherein the blood plasma protein is maintained in a buffer solution having a pH of about 6 to 8.5. (12) The method for isolating α-1-antitrypsin according to claim (1), wherein the recovery of α-1-antitrypsin from the precipitate is carried out by chromatographic separation. (1:1 The chromatographic separation is performed using a solution i DE containing the non-precipitated α-1-antitrypsin.
A method for isolating α-1-antitrypsin according to claim α3, which is carried out by passing it through an AE-cellulose column. I. The method for isolating α-1-antitrypsin according to claim 19, wherein the bath solution is passed through the column in an amount that introduces protein in excess of the binding capacity of DEAE-cellulose. The method for isolating α-1-anti-1-IJpsin according to claim (1), wherein non-precipitated α-1-antitrypsin is recovered from the solution by ultrafiltration. ) The method for isolating α-1-antitrypsin according to claim (1), wherein the mixture of blood plasma proteins is human plasma confluence IV-I. αη The destabilized protein α-1 according to claim 9, wherein the α-1-antitrypsin is treated with an amount of fumigated silica sufficient to improve the purification of the α-1-antitrypsin before being precipitated by salting out. - Method for isolating antitrypsin.
- Antitrypsin (a), (b), (c)
and (d), characterized in that it is isolated by step (d).
1- Method for isolating antitrypsin. (a) Adding a reducing agent selected from dithiothretol and dithioerythritol sufficient to break the disulfide bonds in the protein stomach. ('b) Then add enough divalent salt to precipitate the protein. (e) Separate into supernatant and precipitated proteins. (d) α-1-antitrypsin is then recovered from the upper supernatant by chromatographic separation. The α-1-antitrypsin according to claim 08, further comprising a step of regenerating the recovered α-1-antitrypsin.
1- Method for isolating antitrypsin. (20) The regeneration is performed by dialyzing the recovered α-1-antitrypsin against a cysteine buffer solution.
-1- Method for isolating antitrypsin. (2I) A protein that does not chemically have a disulfide bond used for stabilization in its molecule, or a protein that does not have the above bond at all, is extracted from a solution of the protein containing the protein that has the above bond as described below (, ) process,
1- A method for isolating a protein, characterized in that the protein is isolated by step (b) and step (c). (1 L) The solution is subjected to a treatment to destroy a sufficient number of disulfide bonds in the stabilized protein stomach to destabilize the stabilized protein. (b) Selectively precipitating proteins with broken disulfide bonds, while leaving other proteins in the supernatant. (,) and (1) precipitated protein and (2
) Recovering at least one of the proteins remaining in the supernatant.