JPS5840094A - Production of theanine-relating substance by means of microorganism - Google Patents

Abstract

PURPOSE:Utilizing the chemical energy formed by fermentation of a saccharide by a microorganism, the reaction of glutamic acid with a mono-lower-alkylamine is carried out in the presence of an enzyme synthesizing glutamine and the titled substance is collected. CONSTITUTION:Dried cells of a microorganism producing ATP by the fermentation of a saccharide such as Saccharomyces cerevisiae IF00635 and an enzyme synthesizing glutamine such as Micrococcus glutamicus ATCC13032 or Brevibacterium flavum ATCC 14067 are added to the reaction mixture. The reaction mixture contains L-glutamic acid and a mono- or di-lower-alkylamine such as methyline or ehylamine as substrates and the reaction is effected under mild stirring at 10-60 deg.C and a pH of 6-11. The reaction mixture is subjected to adsorption and elution by means of ion-exchange resins to give theanine-relative substances and gamma-L-glutamylethylamide.

Description

【発明の詳細な説明】 ［１’ｌ　　発明の背見 技術分野 本発明は、テアニン関連物ア１の製造法に関する。[Detailed description of the invention] [1’l　Background of invention Technical field The present invention relates to a method for producing theanine-related substance A1.

γ−Ｌ−グルタミルエチルアミ１とであるテアニンは、
玉露の旨味の主要成分として１（重要な物〕ｉ＋ｒであ
る。また、テアニンの近縁化合物であるγ−Ｌ−グルタ
ミルメチルアミドもテアニン様の旨味を有しているのみ
でなく、むしろテアニンよりも゛＾味性は強いといわれ
る。したがって、これらテアニン関連物質は茶をはじめ
とする食品の香味物質として重要な物質であることは明
白であるが、また一方、近年ｒ−グルタミル誘導体が勅
・植物体における生理活性物質として作用することが指
摘され、それらの工業的生産法の開発が期待されている
。他方、生合成の見Ｊ（！！から考察すると、玉］ルｘ
園では光合成が抑制されているため、テアニンが茶菓乾
物あたり１．５チ前後蓄積されるが、−収態茶園では光
合成が活発であるため、はとんど／ＩＩ’　４−ｔｉｔ
されない。一方、グルタミルメチルアミｌゞけ茶樹ｌ、
「ど一部の植物体において、生育中に一時的に微１１１
１咋４１’ｊさね、るが、速やかに分Ｍγされてテアニ
ンのように￥ｔｈＴ１″／！！：ｔメｔされることはな
い。Theanine, which is γ-L-glutamyl ethylamide 1, is
The main component of the umami flavor of Gyokuro is 1 (important) i + r. In addition, γ-L-glutamyl methylamide, a compound closely related to theanine, not only has a theanine-like umami flavor, but also has a stronger flavor than theanine. It is also said to have a strong taste. Therefore, it is clear that these theanine-related substances are important substances as flavoring substances in foods such as tea, but on the other hand, in recent years, r-glutamyl derivatives have been It has been pointed out that they act as physiologically active substances in plants, and the development of industrial production methods for them is expected.
In tea gardens, photosynthesis is suppressed, so about 1.5 units of theanine are accumulated per dry matter of tea confectionery, but in tea gardens, photosynthesis is active, so the amount of theanine is
Not done. On the other hand, glutamyl methyl amylamide tea tree l,
``In some plants, a small amount of 111
1 咋41'j, but it is quickly reduced to Mγ and is not reduced to ¥thT1″/!!:tmet like theanine.

先行技術 醗酵化学エネルギーの合成への利用ということは本発明
者らの一部がかねてより提唱してぎたとこノ）である。Prior Art The use of fermentation chemical energy for synthesis has been proposed by some of the present inventors for some time.

たと七ば、酸酢工学会誌、即：１３６イく・、第５号、
第５０８〜５２６　ｉ、’Ｊ　（１９７８年）および有
機合成化学１ルｆ、会１１．！二、第；（９巻、第６号
、第４８７〜４９８ｔ、Ｍ　（１９旧即）参照。Shichiba, Journal of Acid and Vinegar Engineering Society, Soku: 136 Iku, No. 5,
508-526 i, 'J (1978) and Synthetic Organic Chemistry 1 Lef, Society 11. ! 2, No. (9th volume, No. 6, 487-498t, M (19th edition)).

また、本発明者らの一部は、このような醗酵化学エネル
ギーを利用したものとして、構造上テアニンの１ｊＪ化
合物ともいうべきグルタミンの酵素約合１ｒｌｔ法を４
ノを案し２ている。特公昭５６−１９１８号公報参照。In addition, some of the present inventors have developed the 1rlt method for enzymatic synthesis of glutamine, which structurally can be called 1jJ compound of theanine, as a method that utilizes such fermentation chemical energy.
I'm thinking of 2. See Japanese Patent Publication No. 56-1918.

［＋１１　　発明の４１”ｆ９要 ｆ〃旨 小：発明渚らはテアニン関連物質の製造法についてＪｔ
ｉｌ々研究した結Ｊ４’４、微生物のｍ＋醇化学エネル
ギー　３４；ｌ団ｊすることによりグルタミン合成酵素
が糖とグルタミン酸およびメチルアミンもしくけエチル
アミンとからγ−グルタミルメチルアミドもしくはγ−
グルタミルエチルアミ１″′を合成する能力を有するこ
とを発’、Ｗ、　ｌ、た。本発明は、これらの新知見に
基くものである。[+11 Invention 41”f9 Summary f〃Short summary: Invention Nagisa et al.
As a result of extensive research, glutamine synthetase converts sugar, glutamic acid, and methylamine or ethylamine into γ-glutamylmethylamide or γ-
It was discovered that the present invention has the ability to synthesize glutamyl ethylamide 1''.The present invention is based on these new findings.

従って、本発明による微生物によるテアニン関連物質の
製造法は、微生物によ々＋　１．’ｉの醗１１１にによ
り生成する化学エネル・−一を利用１２て、グルタミン
合成酵素の存在下で１７−グルタミン酸と七）才たけジ
低級アルキルアミンとを反応さ→ト、牛成した対応γ−
Ｉ７−グルタミル低級アルギルアミ１？ケ採取すること
、を特徴とするものである。Therefore, the method for producing theanine-related substances using microorganisms according to the present invention has the following advantages: +1. Utilizing the chemical energy produced by step 111, 12-glutamic acid and 7) di-lower alkylamine were reacted in the presence of glutamine synthetase, and the corresponding reaction γ was synthesized. −
I7-Glutamyl lower argylami 1? It is characterized by the fact that it collects

効果 本発明は醗酵化学エネルギーの合成への利用に係るもの
であって、この場合の合成はグルタミン合成酵素による
Ｌ−グルタミン酸のアルキルアミド化である。グルタミ
ン合成酸素のＫ　ｊｕｔとして４常用いられるアンモニ
アが低級アルキルアミンに変っても、合成酵素活性が兄
現するだけでなく、醗酵エネルギー生成系がアルキルア
ミンに」一つて１（１１害されず、さらにエネルギー共
役も成立して、グＡ・タミンのＮ−アルキル誘導体であ
るテアニン関連物質が生成したという本発明者らの発見
は、工業に有利な効果をもたらすものである。Effects The present invention relates to the use of fermentation chemical energy for synthesis, and the synthesis in this case is alkylamidation of L-glutamic acid by glutamine synthetase. Even if ammonia, which is commonly used as a K-jut for glutamine synthesis oxygen, is changed to a lower alkylamine, not only the synthesizing enzyme activity is enhanced, but also the fermentation energy generation system is not harmed by the alkylamine. Furthermore, the discovery by the present inventors that energy conjugation was also established and a theanine-related substance, which is an N-alkyl derivative of guA/tamine, was produced has an advantageous effect on industry.

本発明においては、糖の醗酵で生成する化学エネルギー
がＡＴＰ　−ＡＩ’）Ｐ系の触ｔ！！！１作用を介して
グルタミン酸と低級アルギルアミン、特にメチルアミン
もしくはエチルアミン、とからのテアニン関連物４５の
合成にＡノ率的に利用されるので、多量の高価なＡＴｒ
’を基１ｄ＋とじて添加する必要はない。むしろ、高淵
ｒｒ＜゛のＡＴＩ）の添加は合成反応を阻害することが
ル、る。In the present invention, the chemical energy generated by fermentation of sugar is transferred from the ATP-AI')P system. ! ! A large amount of expensive ATr is used in the synthesis of theanine-related compounds 45 from glutamic acid and lower argylamines, especially methylamine or ethylamine, through one action.
It is not necessary to add ' as a group 1d+. On the contrary, the addition of Takafuchi (rr < ATI) may inhibit the synthesis reaction.

寸だ、本発明は糖の醗酵と不可分であるから、本発明の
実施＋′ｌ：　１．Ｉ！の醗酵ｐＧ物、特にアルコール
、の生産を伴ｔ「うことになる。すなわち、本発明は、
’Ｓ２　’ｉ’ｆ　？ＩＺかつ・２イオマス工ネルギー
生産方式に係り、しかもＩｒ＋（公害化学生産方式の性
格を有している。Since the present invention is inseparable from sugar fermentation, implementation of the present invention +'l: 1. I! The present invention involves the production of fermented pG products, especially alcohol.
'S2 'i'f? It relates to the IZ and 2 iomas energy production system, and has the characteristics of an Ir+ (polluting chemical production system).

本発明は、微生物による糖の醗酵により生成する化学エ
ネルギーを利用して、グルタミン酸の１ｌｔｖ素的Ｎ−
アルキルアミド化を行なおうとするものである。The present invention utilizes chemical energy generated by fermentation of sugar by microorganisms to produce 1ltv elementary N-
The purpose is to perform alkylamidation.

ここで、「微生物によるわ、１１の醗酵により牛成する
化学エネルギーを利用して」ということは、ｉ；々生物
、特に酵母、による糖の醗酵、特にアルコール醗酵、に
際して発生するＡＴＴ’をエネルギー０；１、として利
用することを章味する。アルコール醗酵によって生ずる
有効エネルギーの正味のＩｌ’Ｖ　ｔｉｎは、１モルの
グルコースがアルコールに変化する土でに消費されたＡ
、ＴＰＯ収支からＭｌ−算することができる。Here, "using the chemical energy produced by fermentation by microorganisms" means that ATT' generated during sugar fermentation, especially alcohol fermentation, by living organisms, especially yeast, is used as energy. Consider using it as 0;1. The net useful energy Il'V tin produced by alcoholic fermentation is the amount of A consumed in the soil where one mole of glucose is converted to alcohol.
, Ml can be calculated from the TPO balance.

すなわち、１モルのグルコースがアルコールｒｆｌｌ’
　ｆ（’；を受けてフルクトース−１，６−ニリン酸（
Ｆｌ）Ｐ）となる過程で２モルのＡＴＰが消費されるが
、このＦＤＰがさらに醗酵を受けてエタノールにまで分
解する過程で４モルのＡＴＰが回収されるから、結局１
モルのグルコースがアルコール醗酵な受けると２モルの
ＡＴＰＯ正味利得が得られるということになる。That is, 1 mole of glucose becomes alcohol rfl'
fructose-1,6-diphosphoric acid (
2 moles of ATP are consumed in the process of becoming Fl)P), but 4 moles of ATP are recovered in the process where this FDP undergoes further fermentation and is decomposed into ethanol, so in the end, 1 mole of ATP is recovered.
This means that for every mole of glucose subjected to alcohol fermentation, there is a net gain of 2 moles of ATPO.

本発明は、Ｌ−グルタミン酸とアルキルアミンとの酸素
反応に際してもともと必要であるＡ’ｌ”Ｐをこの糖醗
酵匠よって発生するＡＴＰで賄なおうとするイ、のであ
２・。従って、この酵素反応に必要なＡＴｒ’イど該反
１．１３中にｉｎ　５ｉｔｕ　で生成させることが必彼
で、し）す、また従って糖醗酵工程のうち少なくともＡ
ＴＰ発生工程、すなわちＦＤＰ生成工程より下流１の工
４１７Ｉ、をＨ’ｉＮｊ素反応と同一系で、すなわち共
役させて、実１心１−ろことが必要である。The present invention aims to supply A'l''P, which is originally required for the oxygen reaction between L-glutamic acid and an alkylamine, with the ATP generated by this sugar fermentation process.2.Therefore, this enzymatic reaction It is essential that the ATr' required for the reaction is generated in 5 situ during the reaction 1.13, and therefore at least ATr' in the sugar fermentation process
It is necessary to conduct the TP generation step, that is, step 417I downstream from the FDP generation step, in the same system as the H'iNj elementary reaction, that is, to conjugate it, and to conduct the real one-core reaction.

２、−助一〇葡−酵力−４粘りテアニン関連物質の合暖
１）一般 前８１−：　Ｌ／たように、グルタミン酸と低級アルキ
ルアミンとの酵素反応によるテアニン関連物質の合成（
工、ｉ）、’ｌ醗酵工（！＋１σ）うちＡ、ＴＰ発生工
程以降と同一系で実１崩されろ。０’Ｃって、本発明の
実施態様とし＝Ｃ＆’Ｊ’　、たどえば、糖の１１が酊
開始と同時に、すなわち１．１＋と無ＬＳ　ＩＪン酸と
からＩｊ：］）ｔＩを生成させつつ、友）ろいし６１糖
の醗酵な開始させてＦＴ）Ｐを生成させたのちに、テア
ニン関連物質合成工程を開始ないし実１ｆＩＩ＋する態
様がありうる。2, - Sukeichi Grape - Fermentation power - 4 Viscosity Combination of theanine-related substances 1) General 81-: Synthesis of theanine-related substances by enzymatic reaction between glutamic acid and lower alkyl amines (
Process, i), 'l fermentation process (!+1σ) A, 1 in the same system as after the TP generation process. 0'C is an embodiment of the present invention = C&'J', and according to this, 11 of sugars generates Ij:])tI at the same time as the start of intoxication, that is, from 1.1+ and no LS IJ acid. There may be an embodiment in which the fermentation of the 61-saccharide is started to produce FT) P, and then the process of synthesizing theanine-related substances is started or the 1fII+ is started.

糖へ３酊工桿もテアニン関連物質合成工程も微生物の作
用の下に行なわれるから、両工程をＣ１１一種の微生物
、すなわちグルタミン合成酵素ないし該酵素生成能とＡ
ＴＰ生成能とを併有する微生物、によって行なうことが
できる。しかし、ｌｌ、ｌｊの醗酵系に！／４１’ｌｉ
微生物の強力なグルタミン合成１ψ（素糸を別に添加ｔ
、て行なう方が効果的である。Since both the sugar production and theanine-related substance synthesis processes are carried out under the action of microorganisms, both processes are carried out by C11 types of microorganisms, namely glutamine synthetase or the ability to produce this enzyme.
This can be carried out using microorganisms that also have the ability to produce TP. However, in the fermentation system of ll, lj! /41'li
Strong glutamine synthesis by microorganisms 1ψ (separately added t
, it is more effective to do so.

本発明における７１要な反応因子の一つは、リン酸の存
在でおる。ＦＤＰの醗酵中ｉ１’ρを行なつ１．−後に
ケア灼彫トヶ□ヶ５ＪＮＱｌ’ｒ＋’ｉ、ヮ１５．や−
ｒｌ＋　Ｋ：　４（、分量のリン酸化合物が存在するの
で、特別に無機リン酸を補足する必要はない。One of the essential reaction factors in the present invention is the presence of phosphoric acid. Performing i1'ρ during fermentation of FDP1. -After care, the burnt carving toga□ga5JNQl'r+'i, ヮ15. Ya-
rl+K: 4 (, Since the amount of phosphoric acid compound is present, there is no need to specifically supplement inorganic phosphoric acid.

本発明における他の重すｙ　ｌ：ｃ反応因子は、金属Ｊ
焦の存在である。塩化マグネシウムベ’　（ｉｉｌｔ酸
マグネシウムなどのマグネシウムイオンは、テアニン関
連物質の合成に必要である。さらに、塩化マンガンや塩
化コ・々ルトなどのマンガンイオン（ＭｎＩｔ　）やコ
ノセルトイオン（Ｃｏ””　）をマグネシウムイオン（
Ｍｇ”　）と共存させると、合成産物の収Ｍ２け増大す
る。Another heavy l:c reaction factor in the present invention is the metal J
It is the existence of jiao. Magnesium ions such as magnesium chloride (iiltate) are necessary for the synthesis of theanine-related substances.Furthermore, manganese ions (MnIt) and conocert ions (Co"") such as manganese chloride and cochloride are required for the synthesis of theanine-related substances. Magnesium ion (
When coexisting with Mg''), the yield of the synthetic product increases by M2.

２）糖の酪シ酵 本発明における醗酌化学エネルギー生成微生物と１−て
を丁、１．’ｉの醗酵によってＦ′Ｉ）Ｐを生成すると
同時にＦＩ）ＰからＡ’ｌ’ｌ）を生成する能力を有す
るサツカロマイ七ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ、ｅｓ　
）　属などの微生物、特に酵ｆｉｌ、が一般にイ・１１
用できる。2) Milky fermentation of sugar The chemical energy producing microorganism used in the present invention and 1. Saccharomyc, es which has the ability to produce F'I)P by fermentation of 'i and simultaneously produce A'l'l) from FI)P.
) microorganisms such as the genus A. 11, especially yeast fil.
Can be used.

本発明で使用ｒ＋’ｌ’　ｒｉｌ宝な微生物の具体例を
量げれば゛サツカロマイセス・セレビシェ　ＩＦＯ０６
３５および同ＴＦＯ０２１６，サツカロマイセス・カー
ルスベルゲンシスＴＦＯ１２６／１および同ＩＦＯ０７
５１、その他か；ｔＩ）ろ。A specific example of the valuable microorganisms used in the present invention is Satsucharomyces cerevisiae IFO06
35 and TFO0216, S. carlsbergensis TFO126/1 and IFO07
51.Other?;tI)ro.

これらの微生物の菌体を得るためには通常の培）（′ｆ
、法が用いられる。これらの微生物は溶媒処理菌体、破
砕菌体、乾燥画体、無細胞標品なと各種の形縛でイリリ
１１できイ）。In order to obtain the cells of these microorganisms, a normal culture) ('f
, the law is used. These microorganisms can be prepared in various forms such as solvent-treated cells, crushed cells, dried specimens, and cell-free specimens (11).

つ−（行なわれる。One (to be carried out)

この酵素反応での基質の一つであるし一グルタミン酸は
、Ｊｆ離の酸の外に塩、特に水浴性塩、就中アルカリ金
属塩、であることができる。Monoglutamic acid, which is one of the substrates in this enzymatic reaction, can be a salt, especially a water-bath salt, especially an alkali metal salt, in addition to the Jf-reducing acid.

もう一方の基質である低級アルキルアミンは先ず、アミ
ド化反応に関与すべきところからモノアルキルアミンま
たはジアルキルアミンでｔ）ろべきである。特に、モノ
アルキルアミンが好＋Ｌい。The other substrate, a lower alkylamine, should first be removed with a monoalkylamine or dialkylamine from the point where it should participate in the amidation reaction. In particular, monoalkylamines are preferred.

また、アルキル基は低級、特に炭侶数３Ｉソ下４’、ｌ
　ＩＯ゛、であるべきである。従って、本発明予々、ロ
リー１゛イ）低級アルキルアミンの好ま１〜い貝１体例
は、モノメチルアミンおよびモノエチルアミンである。In addition, the alkyl group is lower, especially carbon number 3I, 4', l
It should be IO゛. Therefore, in advance of the present invention, preferred examples of lower alkylamines are monomethylamine and monoethylamine.

この酵素反応にはＡＴＰがノ１／？須であって、　４Ｉ
Ｙ’つてＡＴＰも基質の一つというべきで、ワ）ろが、
４〜発明ではこのＡＴＰを糖醗酵工程からＩｎ　ａｌｔ
、ｕ　　で／ｈ２“ｒされアルキルアミン（およびＡＴ
Ｐ　）を鳩質とすシ）グルタミン合成酵素の作用によっ
て行ｔ「われる。グルタミン合成酵素としては合［１的
的１．に任調のものが利用でき、またこのような酵素は
種々の微生物かも得ることができる。適当な微生物とし
２ては、マイクロコツカス−グルタミン酸（Ｍｏｇｌｕ
ｔａｍｌｃｕｓ　）ＡＴＣＣ１３０３２、マイクロコツ
カス・グルタミクスＡ’ｌ”、ＣＣ１３０６０、マイク
ロコツカス・グルタミクスＡＴＣＣ１３０５９、ゾレビ
ノ々クテリウム・フラブム（ｌｌｒｅｖｌｂａｃｔｅｒ
ｌｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　）　ＡＴＣＣ１４０６７、ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｌｂａｃ
ｔ。This enzymatic reaction requires ATP of 1/? 4I
Y' ATP should also be considered one of the substrates.
4~ In the invention, this ATP is extracted from the sugar fermentation process.
, u at/h2“r and alkylamine (and AT
P) is produced by the action of glutamine synthetase.A wide variety of glutamine synthases are available, and such enzymes can be used in various microorganisms. Suitable microorganisms include Micrococcus glutamate (Moglu
tamlcus) ATCC 13032, Micrococcus glutamicus A'l", CC13060, Micrococcus glutamicus ATCC 13059, Zorevinocterium flavum (llrevlbacter
lum flavum) ATCC14067, Brevibacterium ammoniagenes (Brevlbac
t.

ａｍｍｏｎｌａｇｏｎｅｓ　）　ＡＴＣＣ６８７］、　
ゾレピノ々クテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ６８
７２などがあげられる。ammonlagones) ATCC687],
Zolepinoctherium ammoniagenes ATCC68
72 etc.

本発明においてはこれらの微生物の各柿処理標品、たと
えば菌体磨砕物、超音波処理菌体、溶剤処理菌体、低温
乾燥菌体、無細胞抽出液、硫安塩析物、精製酵素標品、
固定化したもの、などを利用することができる。なお、
これらの微生物から効率よくグルタミン合成酵素を得ろ
方法として、本発明者らの一部による特願昭５５−１０
８９３２号記載のものがある。In the present invention, persimmon-treated specimens of these microorganisms, such as ground bacterial cells, ultrasonic-treated bacterial cells, solvent-treated bacterial cells, low-temperature-dried bacterial cells, cell-free extracts, ammonium sulfate salt precipitates, and purified enzyme preparations are used in the present invention. ,
Fixed ones can be used. In addition,
As a method for efficiently obtaining glutamine synthetase from these microorganisms, a patent application filed by a portion of the present inventors was proposed in 1982-10.
There is one described in No. 8932.

基′Ｌ４と１７で添加１′るグルタミン酸の量にはｒｆ
４４に１１＋ｌｌ限はないが、反応後に未反応のグルタ
ミン酸がる。アルギルアミンを゛よ４００ｍＭレベル以
上に高濃度に添加すると、反応が阻“Ｍされる結東、生
；Ｉシ１グ１の収量が低下する。しかし、アルキルアミ
ンを数回に分割して添加する方法にＪ：　ｈば、各添加
時に４００　ｍＭ以上の濃度にならフ、「い限り、メチ
ルアミンもしくはエチルアミンの）；１ス添加１ｙｌ”
ａ′￥くすイ）こ反応は、軽い攪拌条件下で行１ようの
ｆ＋″−奸１Ｙシい。The amount of glutamic acid added at groups L4 and 17 requires rf
Although there is no limit to 11+ll in 44, unreacted glutamic acid remains after the reaction. If algylamine is added at a higher concentration than 400mM level, the reaction will be inhibited and the yield of I-Sig1 will be reduced. However, if the alkylamine is added in several portions, Method J: If the concentration is 400 mM or more at each addition, add 1 ml of methylamine or ethylamine).
a'\kusui) This reaction is carried out under conditions of light stirring, as shown in row 1.

反応温度は１０〜ｌ）０　°Ｃ１反応ｐ１１げ６〜１１
の１１釦）１（が望ましい。本発明の好ましい実Ｍ！ｉ
　ｉ（％？　Ｉτ°Ｉに従って反応をｐＨ７〜１０のア
ルカリ側で行なうと、生産収率が著しく面まる。通常３
〜〔ｊＯ時間反応を継続して行なうと、著量のテアニン
関連物辿が層積される。なお、これらの反応条件は糖の
醗酵条件ともなることはいうまでもない。The reaction temperature is 10-1) 0 °C1 reaction p11 6-11
11 buttons) 1 (is desirable. Preferred practice of the present invention M!i
i (%? If the reaction is carried out on the alkaline side with pH 7 to 10 according to Iτ°I, the production yield will be significantly reduced. Usually 3
~ [jO When the reaction is continued for an hour, a significant amount of theanine-related substances are deposited. It goes without saying that these reaction conditions also serve as sugar fermentation conditions.

反応液からテアニン関連物質を分１ｉ１ｆｔするにｔｌ
、たとえば通常のイオン交換樹脂への吸オＶ：ｉ、Ｌｌ
−ひ酢離（たとえばアンモニア液等による）によればよ
い。溶離されたテアニン関連物質＋−＋、常法により掬
縮お、１−びｈ’ｔ　′Ｊｐ’Ｊ　ｌ、、必要に応じて
結晶として回収」４）ことができる。To remove theanine-related substances from the reaction solution 1/1 ft.
, for example, absorption V: i, Ll to ordinary ion exchange resin
- It may be removed by vinegar removal (for example, using ammonia solution, etc.). The eluted theanine-related substances can be scooped out by conventional methods and recovered as crystals if necessary.

３、実り例 実！血例１ １）フラクト−ス−１，６−ニリン酸（ＦＤＰ）から醗
酊化学エネルギー（ＡＴＰ）を生成する能力を有スるザ
ツカロミセス・セレビシェＩＦ’００６３５の乾燥＋Ｖ
１体を、次のようにして調和μした。肩付フラスコ（２
１Ｊツトル容）４本に、グルコース５％、（ｉｆ安０．
！５ｏり、Ｋ）１２ＰＯ４０、５％、　酵母エキス０．
２　’％、ニコ・−シ′ステイーシリカー０．５係、ペ
プトン０．２係、ＭｇＳＯ４・５Ｈ２００，０５％（ｐ
Ｈ６，０）からなる培地５００　ｍ／′を添加して殺菌
したのち、酵母を接種して、ニジ８℃で４（ｌ　ＩＱ　
１！１１　’Ｕφ当培ｉ：６シた。得られた菌体は減圧
条件Ｆで乾燥し、４℃で保存した。3. Fruitful examples! Blood Example 1 1) Drying of Zatucharomyces cerevisiae IF'00635, which has the ability to generate intoxicated chemical energy (ATP) from fructose-1,6-diphosphoric acid (FDP) +V
One body was harmonized as follows. Shoulder flask (2
(1J volume) 4 bottles, glucose 5%, (if low 0.
! 5o, K) 12PO40, 5%, yeast extract 0.
2'%, Nico-C'Stay Silica 0.5%, Peptone 0.2%, MgSO4.5H200.05% (p
After sterilization by adding 500 m/' of a medium consisting of H6,0), yeast was inoculated and the culture medium was incubated at 8°C with
1!11 'Uφcurrent i:6shita. The obtained bacterial cells were dried under reduced pressure condition F and stored at 4°C.

２）マイクロコツカス・グルタミックスＡＴＣＣ１３０
３２のグルタミン合成ｈＶ素を、次のようにして＋＋Ａ
　ｖ＊　＋〜だ。2) Micrococcus glutamix ATCC130
32 glutamine synthetic hV element was converted to ++A as follows.
v* +~.

（１）菌体の培徐 ３（）リットル容ジャーファーメンタ−に、グルコース
１チ、グルタミン酸ソーダ１５ｍＭ、　　ｑｌ？４グエ
ギス０．２％、冊２ＰＯ４０，０５％、Ｋ２ＴＩＰＯ，
ｉ　０．０５チ、ＭｇＳＯ４・５Ｈ２００，０３係（ｐ
Ｈ７，０）を含む培地２４５リツトルを仕込んで殺菌１
−だのち、マイクロコツカス・グルタミクスな接種１し
て、２８℃で２・１時間好気培養を行なった（攪拌１５
０　ｒｐｍ　、　：ｉｌｉ↓気１ｔ１２０１！　ｚ４）
　）。(1) Cultivation of bacterial cells In a 3-liter jar fermentor, add 1 t of glucose, 15 mM of sodium glutamate, and ql. 4 GUEGIS 0.2%, book 2PO 40.05%, K2TIPO,
i 0.05chi, MgSO4・5H200,03 section (p
Pour 245 liters of medium containing H7,0) and sterilize it.
- Afterwards, Micrococcus glutamicus was inoculated 1 and aerobically cultured at 28°C for 2.1 hours (stirring 15
0 rpm, :ili↓Ki1t1201! z4)
).

（２）グルタミン合成酵素のｔｔｌ、ＩＪ　ｉ’！！培
養後、連続遠心分離してイ（１ら槍１．六−閑体を０．
０１Ｍリン酸カリ緩イ・ＶＪ液（Ｔ）ＩＩ　６．０．０
℃）に爪千ン凧）させ、［グイノーミル−］　（Ｄｉｎ
ｏ　Ｍｉｌｌ　）で菌体を破壊したのち、遠心分離して
、無細胞抽出液を（！ｊた。(2) ttl of glutamine synthetase, IJ i'! ! After culturing, continuous centrifugation was performed to remove the cells.
01M potassium phosphate mild VJ solution (T) II 6.0.0
℃) to make a thousand kites), [Guinomil-] (Din
After disrupting the bacterial cells with O Mill), the cells were centrifuged to obtain a cell-free extract (!j).

無細胞抽出液にリン酸緩価液を０．ＩＭ、塩化マンガン
を０．０２Ｍになるよう加え、５（１℃７１０分間の熱
処理を行なった。次に、遠心分離してイ１＃られた」；
澄液に硫安を加支て、６５係飽和とした。得られた沈殿
物を０．ＯＩＭ　ＩＪン酸緩（＋ｌｔｊ液に溶かし、同
緩価ｆ１〜に対して透析した。この祷析内液を、１）Ｅ
　Ａ　Ｅ−セルロースカラム（前もって０．０１　Ｍリ
ン酸緩衝液、ｐＨ６，０で平衡としたもの）に吸ン）ヶ
させたのち、同緩衝液で洗浄した。ついで、同４１衝液
中の食塩？ｒｉｈ　１（１゛を段階的に高めて、酵素を
溶出させた。グルタミン合成酵素活性は、食塩０．３〜
０．３５Ｍの両分に溶出１．た。比活性のｉＩ’ｊｊい
画分を集め、硫安７０係飽和どして懸濁状４１１１で４
℃で保存した。使用時にけＩＩＩＩ！ｌ叱ＡＪ′昌１り
なリン酸緩ｆｉｉｉｉ液に浴かし、透析して用いた。本
酵素セツ品の比活性は、１００単位／ｍ４タンノにり’
ｆ！Ｊ’　ｒｉｌｌ　ｆｊｊでｋ）つた。ただし、酵素
中位としては、３７℃で１分間に触θ１１すされる４１
が１μモルのとぎ１１１４位と１．た。Add 0.0% mild phosphoric acid solution to the cell-free extract. IM, manganese chloride was added to a concentration of 0.02M, and heat treatment was performed at 1°C for 710 minutes.Next, it was centrifuged and separated.
Ammonium sulfate was added to the clear liquid to make it saturated at 65%. The obtained precipitate was reduced to 0. OIM IJ was dissolved in a mild acid (+ltj) solution and dialyzed against the same mild concentration f1.
A E-cellulose column (preliminarily equilibrated with 0.01 M phosphate buffer, pH 6.0) was loaded onto the column, and then washed with the same buffer. Next, the salt in the same 41 solution? The enzyme was eluted by increasing rih 1 (1゛) stepwise.Glutamine synthetase activity
Elute in both parts of 0.35M 1. Ta. Fractions with specific activity iI'jj were collected and saturated with ammonium sulfate to form a suspension of 4111.
Stored at °C. When using it! It was used after bathing in a mild phosphoric acid solution and dialyzing it. The specific activity of this enzyme set product is 100 units/m4 Tannori'
f! J' rill fjj k) ivy. However, as an enzyme medium, 41
is 1 μmol of the 1114th position and 1. Ta.

：１）γ−グルタミルメチルアミドの生成反応は、次の
ようにして省ｄ「つだ。:1) The reaction for producing γ-glutamyl methylamide can be carried out as follows.

リン酸カリ緩イｇｉｉ７ｉｉ（（ｐＨ７，０）　　２０
０　ｆｉモル／ｒｎｌグツｌ／コース　　　　　　　　
　２００〃Ｌ−グルタミン１１ψソーダ　　　　１００
　　〃モノメチルアミン　　　　　３００〃 Ｍ、、Ｃ］２　　　　　　　　　　　　１５　　　／／
ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　２　　　ｔｔ七配
反応僧に酵１＃Ｊの乾燥菌体とグルタミン合成酵素とを
添加し、〃３°Ｃで５時間振備しながら反応させたとこ
ろ、γ−グルタミルメチルアミ１１の生成量とし°Ｃ表
】に示す結果を得た。Potassium phosphate slow pH 7ii ((pH 7,0) 20
0 fimol/rnl gtul/course
200〃L-glutamine 11ψ soda 100
〃Monomethylamine 300〃 M,,C]2 15 //
When dry bacterial cells of yeast 1#J and glutamine synthetase were added to the ATP 2 tt seven-segment reaction mixture and allowed to react with shaking at 3°C for 5 hours, the amount of γ-glutamylmethylamine 11 produced was The results shown in the °C table were obtained.

表　１ 実施例２ 実施例１に準じて調製したｒ・＋’ｉ　ＩＩＩの＋：ｆ
、　４・Ｙ１蘭体とグルタミン合成酵素を用いた。Table 1 Example 2 +:f of r・+'i III prepared according to Example 1
, 4-Y1 orchid body and glutamine synthetase were used.

リン酸カリ緩衝液（ｐＨ７，０）　２００μモルＡＩｒ
　ｉグルコース　　　　　　　　２００　　ｔｔＬ−グ
ルタミン酸ソーダ　　　　１００　　〃モノメチルアミ
ン　　　　　３００〃 ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　１５　　ｔｔル
）イ）いし、） ＭｇＣ１２１５ｔｔ ＋ ＭｎＣｌ２　　　　　　　　　　　　　５　７／Ｐｉ？
　／ｉｔの乾燥蘭体畦４０　ｒｎｔ７／ｒｎｌグルタミ
ン合成酔素Ｍ−４００単位／ｍｅ上記反応液を謔℃で４
時間反応させたところ、表２に示す結果を得た。Potassium phosphate buffer (pH 7,0) 200 μmol AIr
i Glucose 200 tt L-Sodium glutamate 100 Monomethylamine 300 MgCl2 15 tt I) I) MgC1215tt + MnCl2 5 7/Pi?
/it dry orchid ridge 40 rnt7/rnl glutamine synthetic narcotic agent M-400 units/me The above reaction solution was heated to 4°C.
When the reaction was carried out for a certain period of time, the results shown in Table 2 were obtained.

表２ 実施例３ 実希１例１に準じて１’ｊｌ＃製した＾ぞ母の乾燥（箔
体とｋ（ｇｌｕｔａｍｌｃ＋＋＋ｉの無細胞抽用液を用
いた。Table 2 Example 3 Miki 1 Dry 1'jl# produced according to Example 1 (foil and cell-free extraction solution of glutamlc+++i were used.

基本反応液＃１成 リン酸カリ緩衝液（ｐＩ（７，０）　　　２００μモル
フ’＋＋＋　ｅグルコース　　　　　　　　　２００１
１モノメチルアミン　　　　　　２０Ｃ）／ｌグルタミ
ン酸ソーダ　　　　　１５０１１ＭｇＣ１２１５〃 酵ｌ廿の乾燥菌体　　　　　　　４０ｍｅ）／ｉノ＋１
細菌の無細胞抽１１１液（タン・ぞりｂｌ：　）　　　
２５　ＩＩ＋安綿上記反応液を５時間路℃で反応させＩ
、−ところ、γ−グルタミルメチルアミ１：″５μモル
／　ｒｒｌｅが生成した。Basic reaction solution #1 Potassium phosphate buffer (pI (7,0) 200μmorph'+++ eGlucose 2001
1 Monomethylamine 20C)/l Sodium glutamate 15011MgC1215 Dried bacterial cells from fermentation 40me)/iNO+1
Bacterial cell-free extraction 111 liquid (Tan・Sori BL: )
25 II + cheap cotton The above reaction solution was reacted at ℃ for 5 hours.
, - However, γ-glutamylmethylamine 1: 5 μmol/rrle was produced.

実施例４ 実施例１に準じて調製した酵１すの蕪、１Ｉｌｌ胞抽出
沿とブレビ、２クテリウム・フラブムＡＴＣＣ１４０６
７のグルタミン合成酵素標品な用いた。Example 4 Fermentation prepared according to Example 1: 1 Turnip, 1 Ill spore extraction, 2 Cuterium flavum ATCC 1406
A glutamine synthetase preparation of No. 7 was used.

リン酸カリ緩衝液　　　　　　　　　５０μモルｆｉｒ
　ｅＦＤＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　４０　
　　／／グルタミン酸ンーダ　　　　　　５０／ｌモノ
エチルアミン　　　　　　　５０〃ＡＴＰ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２μモ化／ｍｅ１’ＰＰ （１，−イアオフ、。１ＪｙＡｔｐ）　　　　”０″・
摩１厩１υの大＋＋に１１１１ｔ：１ｌｌｌｌｌｉ（＆
　（タン・ξりＭ’、　）　　　　４　ＩηｑΔａグル
タミン合成１’ｌ￥累イー”１（品（タン・ξり叶）　
　１０　ｒｎＱ／ｒｎｅｊ−ｆｔ１．：反応フイレなＴ
ＩＨ８，５に調整したのち、２８℃で：（ｎ；３間反応
をｒ’ｉ　ｌｒったどころ、テアニン（γ−グルタミル
エチルアミド”）　１０μモル／ｍｅが生成した。Potassium phosphate buffer 50 μmol fir
eFDP 40
//Glutamate 50/l Monoethylamine 50 ATP
2 μm conversion/me1'PP (1,-iaoff, .1JyAtp) "0"・
1111t: 1llllli (&
(Tan・ξりM', ) 4 IηqΔa Glutamine synthesis 1'l￥Cumulative E"1 (product (Tan・ξri Kano)
10 rnQ/rnej-ft1. :Reaction fillet T
After adjusting the IH to 8.5, the reaction was carried out at 28° C. for 3 hours, and 10 μmol/me of theanine (γ-glutamyl ethylamide) was produced.

実ノｄ１１１同５ ’）ｊ、　’ＩｒｆＩｉ例１に僧じ−Ｃｈ’、四ひの無
細胞抽出液とプレビックチリウム・°γンモニアゲネス
ＡＴＣＣ６８７２のグルタミンｒｉ　１ｌＶｊ’ｙ　Ｈ
（ｚ：、　ｔ、調７ｐ￥した。Fruit d111 same 5')j, 'IrfIi Example 1 to Monji-Ch', cell-free extract of Shihi and glutamine of Prebic Tyrium °γammoniagenes ATCC6872 ri 1lVj'y H
(z:, t, key 7p ¥.

第−Ｐ＋２１””＋’　　フラクト−スニリン酸の生成
反応ニリン酸カリ（ｐＨ７，０）　　　　　　　１００
　ｐモｔｖ／ｍｅグルコース　　　　　　　　　１ｏｏ
〃ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　２０Ａ’ｌ”Ｐ
　　　　　　　　　　　　　　　２ＮＡＩ）　　　　　
　　　　　　　　　５０　ｔｔｇ／ｍｅＴＰＰ　　　　
　　　　　　　　　　　　　５０μｇ　／＋：＋ｅ酵母
の無細胞抽出液（タン・ぞり暗）　　　８　Ｔｎ’ｔ／
＋ｎε上記反応液な３７°Ｃで３　＋＋！ｊ間反応さ猪
て、Ｆｌｌｌ）を生成させた。この反応液を加熱し”Ｃ
反応を市め、遠心分１璽（して上？（′ｆ液を得た。こ
の＋ｒ（ｆ液を１．５　ｍｌ！とり、グルタミン酸ソー
３’　２５　ｉｔモル、コーチルアミンδμモル、酊Ｉ
Ｉ＋の無細胞抽出液８　ｍｑ　（タンＡり）、グルタミ
ン合成酵素加ｍｔ２　（タンパク）を１１１１女、ｐＨ
を８．５に調整し、かつ余財に２ｍ＊と１７た。この反
応液を（９）℃、３時間反応させたとこ７）、デアエフ
５３モル／ｍｅが生成した。-P+21""+' Fructo-sunilic acid production reaction Potassium diphosphate (pH 7,0) 100
pmotv/me glucose 1oo
〃MgCl2 20A'l”P
2NAI)
50 ttg/meTPP
50 μg /+: +e Yeast cell-free extract (tan, dark) 8 Tn't/
+nε The above reaction solution was heated to 37°C at 3 ++! The reaction was carried out for two hours to produce Fllll. This reaction solution was heated to "C"
The reaction was stopped, centrifuged, and 1.5 ml of this +r(f solution was obtained!).
8 mq of I+ cell-free extract (tan A), 1111 mq of glutamine synthetase-added mt2 (protein), pH
was adjusted to 8.5, and the surplus was 2m* and 17. When this reaction solution was reacted at (9)° C. for 3 hours, 53 mol/me of DEAF was produced.

実施例６ 実施例１に準じて？＃製したグルタミン合成酬索を常法
にしたがってポリアクリルアマイドゲル及びカラギーナ
ンで固定化酵素標品とした。Example 6 According to Example 1? #The prepared glutamine synthetic wire was used as an immobilized enzyme preparation using polyacrylamide gel and carrageenan according to a conventional method.

得られた固定化ｒＷ素標晶を用い、酵素源以外は実施例
１に示す反応液組成で′７８℃、８時間１辰面しながら
反応させたところ、７゛−グルタミルメチルアミｒの収
縦として表３の結果を得た。Using the obtained immobilized rW elementary crystals and reacting with the reaction solution composition shown in Example 1 except for the enzyme source at 78°C for 8 hours under direct sunlight, the yield of 7'-glutamylmethylamyl r was obtained. The results shown in Table 3 were obtained for the longitudinal direction.

表３ 出願人代印人　　　猪　股　　　　清Table 3 Applicant Indian person Kiyoshi Inomata

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、微生物による糖の醗酵により生成する化学二゛ネル
ギーを利用して、グルタミン合成酵素の存在下でグルタ
ミン酸とモノまたは・ジ低級アルキルアミンとを反応さ
せ、生成した対応γ−Ｌ−グルタミル但級アルキルアミ
ドを採取ちことを特徴とする、微生物によるテアニン関
連物質の製造法っ ２、低級アルキルアミンがメチルアミンまたはエチルア
ミンである、特許請求の範囲第１項記載の方法。[Scope of Claims] 1. A corresponding γ produced by reacting glutamic acid with a mono- or di-lower alkylamine in the presence of glutamine synthetase using chemical energy produced by fermentation of sugar by microorganisms. - A method for producing a theanine-related substance using a microorganism, characterized in that L-glutamyl alkylamide is collected. 2. The method according to claim 1, wherein the lower alkylamine is methylamine or ethylamine.