JPS582749A - Adsorbent for affinity chromatography - Google Patents
Adsorbent for affinity chromatographyInfo
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- JPS582749A JPS582749A JP56102731A JP10273181A JPS582749A JP S582749 A JPS582749 A JP S582749A JP 56102731 A JP56102731 A JP 56102731A JP 10273181 A JP10273181 A JP 10273181A JP S582749 A JPS582749 A JP S582749A
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- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
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- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアフィニティークロマドクラフィー用吸着体に
関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to an adsorbent for affinity chromatography.
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性
基、その他に関し略号で表示する場合IUPAC,IU
Bの規定或いは当該分野における慣用記号に従うものと
し、その例を次に挙げる。またアミノ酸などに関し光学
異性体がありうる場合は、特に明示しなければL体を示
すものとする。In this specification, when amino acids, peptides, protective groups, active groups, etc. are expressed by abbreviations, IUPAC, IU
The regulations in Section B or the symbols commonly used in the field shall be followed, examples of which are listed below. Furthermore, when an amino acid or the like can have optical isomers, the L-isomer is indicated unless otherwise specified.
Ary毒アルfニン Axn :アスパラfシ Str :tす。Ary poison arf-nine Axn: Asparagus Str:t.
Gln−ジルタミン
Net’、メチ才二シ
Ltu :0イシシ
P杓 :フェニルアラニル
T1.:チロシン
Glf :グリシゝ
Z :カルボベシリ士シ基
S□ :コハク酸イ三ド基
Tas :戸−トルエシスルホニル基B、、:第3級
ブト牛ジカルボニル基
インターフエ0シは生体細胞がウィルス感染を受けた時
に産生ずる抗ウイルス性糖蛋白質であり、これを利用し
てウィルス性疾患を予防乃至治療することが注目されつ
つある。而してヒトのインターフエロンはα型インター
フエ;計シ(LzuζocytzzInterfero
n IIL−戸her blastaid In
terferon ) 。Gln-Diltamine Net', Metisaijishi Ltu: 0 IshishiP: Phenylalanyl T1. :Tyrosine Glf :Glycine Z :Carbovecilyl group S□ :Succinic acid group Tas :Toluecysulfonyl group B, :Tertiary butylene dicarbonyl group It is an antiviral glycoprotein produced when infected, and its use to prevent or treat viral diseases is attracting attention. Therefore, human interferon is α-type interferon;
n IIL-her blastaid In
terferon).
β型イ、、 ターフI Oン(Fibrtrblast
Interferon)及びγ型イシターフエ□ y
(Immune Interferon)の混合物で
あることが今日までた解明されている。β-type I, Turf Ion (Fibrtrblast)
Interferon) and γ-type Ishitafue □ y
Until now, it has been elucidated that it is a mixture of (Immune Interferon).
しかしながら斯かるヒトのインターフエロンを単一な型
の糖蛋白質にまで精製する技術は未だ開発されてい危い
。However, the technology to purify such human interferon into a single type of glycoprotein has not yet been developed.
本発明の目的はヒトのインターフエロンよりβ型イシタ
ーフエ0シを単離精製することにある。The object of the present invention is to isolate and purify β-type isterferon from human interferon.
即ち本発明は、一般式
%式%
〔式中R1gl水素原子、H−Pkt−基、H−Lzu
−β型イシターフエ0ンのN末端ペプチドと担体との複
合体からなるヒトβ型インターフェロン抗原 “
を哺乳動物体に投与して得られるしトβ型イシターフエ
0シ抗体を不溶性支持体上に固定化してなることを特徴
とするアフィニティークロマドタラフィー用吸着体に係
る。That is, the present invention is based on the general formula % [wherein R1gl hydrogen atom, H-Pkt- group, H-Lzu
-Human β-type interferon antigen consisting of a complex of the N-terminal peptide of β-type interferon and a carrier.
The present invention relates to an adsorbent for affinity chromatotraffy, characterized in that it is made by immobilizing a β-type antibody obtained by administering to a mammal on an insoluble support.
本発明のアフイニテイク0マドグラフィー用吸着体を使
用すれば、ヒトのイシタ〜フエ0シよりしトβ型インタ
ーフエ0シを単離精製することができる。即ちしトのイ
ンターフエロンよシしトβ型イシターフエ0シのみを選
択的に吸着し得、またヒトβ型インターフェロンが吸着
されたアフィニテイクOマドグラフィー用吸着体からの
ヒトβ型インターフェロンの脱離を緩和な条件下簡易な
操作で行なうことができ、それ故ヒトβ型イシターフエ
0シ活性を失活させることなく、しかも高純度のヒトβ
型インターフェロンを定量的に得ることができる。By using the adsorbent for affinitake 0 magnetography of the present invention, it is possible to isolate and purify the β-type interferon from human ishita-fue 0. In other words, it is possible to selectively adsorb only the β-type interferon, and also to prevent the desorption of human β-type interferon from the adsorbent for affinitake O adsorption to which human β-type interferon has been adsorbed. It can be carried out with simple operations under mild conditions, and therefore does not deactivate the human β-type enzyme activity and can produce highly purified human β-type protein.
type interferon can be obtained quantitatively.
本発明のアフイニテイク0マドグラフィー用吸着体は下
記に示す方法により製造される。即ち上記一般式(1)
で表わされるぺづチドをパラテンとして用いることによ
り、八づテシー担体結合試薬の存在下に担体と反応させ
てぺづチドー担体複合体からなるヒトβ型インターフェ
ロン抗原を製造し得、次にこのしトβ型イシターフエ0
ン抗原よりヒトβ型インターフェロンに対して特異的反
応性を有するしトβ型イシターフエ0シ抗体を製造し得
、さらにこのしトβ型インターフエ0ン抗体をアフィニ
ティークロマドグラフイーの吸着体に含有させることに
より本発明の吸着体が製造される。The Affinitake 0 adsorbent for magnetography of the present invention is manufactured by the method shown below. That is, the above general formula (1)
By using the peptide represented by as paraten, human β-type interferon antigen consisting of a peptide carrier complex can be produced by reacting with a carrier in the presence of a Yazutesy carrier-binding reagent, and then this β-type Ishitafue 0
It is possible to produce a β-type interferon antibody that has specific reactivity to human β-interferon from human β-interferon antigens, and to use this β-type interferon antibody as an adsorbent for affinity chromatography. The adsorbent of the present invention is produced by containing the above.
本発明で用いられる一般式(1)のペプチドは新規化合
物であシ、斯かるペプチドは以下の方法によって製造で
きる。The peptide of general formula (1) used in the present invention is a new compound, and such a peptide can be produced by the following method.
一般式(1)のペプチドは、ペプチド合成の常套手段で
製造し得る。固相合成法、液相合成法のいずれによって
もよいが、液相合成法が有利な場合が多い。そのような
ぺづチド合成の手段は、たとえば“TA/ Pt戸tl
ties”、第1巻(+966)。The peptide of general formula (1) can be produced by conventional peptide synthesis methods. Either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used, but the liquid phase synthesis method is often advantageous. Such means of peptide synthesis include, for example, “TA/Pt tl
Ties”, Volume 1 (+966).
5thr”tittr and Luhkt著、 Ac
ademic Press 、 NztuYard 、
U、S、A、あるいは“ペプチド合成”東屋ら著、丸
善株式会社(1975年)に記載されており、たとえば
アジド法、り0ライド法、酸無水物法、混酸無水物法、
DCC法、活性エステル法)例えば戸−ニト0フェニル
エステル法1N−しド0+シコハク酸イミドエステル法
1シアノメチルエステル法等1.ウッド9Tド試薬Kを
用いる方法、カルポジイミダリール法、醸化還元法、D
CC/アディティブ(例HONB、 HOBt、 HO
5st ) 法などがあげられる〇
一般式(1)のペプチドは、一般のポリペプチドの合成
法、例えば末端アミノ酸に順次1個づつアミノ酸を縮合
させる所謂ステラづワイズ法為数個のフラグメントに分
けてカップリンクさせていく方法等に従い容易に製造で
きる。より詳細には上記ペプチドは、その結合の任意の
位置で2分される+1
2種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシ
ル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反
応性アミノ基を有する原料をペプチド合成の常套手段で
縮合させ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その
保護基を常套手段で脱離させることにより製造し得る。5thr”tittr and Luhkt, Ac
academic Press, NztuYard,
U, S, A, or "Peptide Synthesis" is described in Azumaya et al., Maruzen Co., Ltd. (1975), and includes, for example, the azide method, the lylide method, the acid anhydride method, the mixed acid anhydride method,
(DCC method, active ester method) For example, 1. Method using Wood's 9T reagent K, carpodiimidalyl method, fermentation reduction method, D
CC/Additive (e.g. HONB, HOBt, HO
5st) method etc.〇The peptide of general formula (1) can be synthesized by a general polypeptide synthesis method, for example, by dividing it into several fragments using the so-called Stellarwise method, in which amino acids are sequentially condensed one by one to the terminal amino acid. It can be easily manufactured by following a method such as cup linking. More specifically, the above-mentioned peptide is divided into two parts at any position of the bond.+1 A raw material having a reactive carboxyl group corresponding to one of the two fragments and a reactive amino group corresponding to the other fragment. When the raw materials are condensed using a conventional method for peptide synthesis and the resulting condensate has a protecting group, it can be produced by removing the protective group using a conventional method.
一般式(1)のペプチドを製造する反応工程でアルギニ
ンは通常保護しておくのが望ましい場合が多く、最終工
程としてはペプチドの構成アミノ酸残基の少なくとも一
つが保護された保護ぺづチドから保護基をすべて脱離す
ることにより製造しうる場合が多い。It is often desirable to protect arginine in the reaction process for producing the peptide of general formula (1), and in the final step, at least one of the constituent amino acid residues of the peptide is protected from a protected peptide. In many cases, it can be produced by eliminating all groups.
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護及び保護基
、並びにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活
性化などもまた公知のものあるいは手段から適宜選択し
得る。Protection of functional groups that should not participate in the reaction of raw materials, protective groups, removal of the protective groups, activation of functional groups that participate in the reaction, etc. can also be appropriately selected from known methods or methods.
原料のアミノ基の保護基としては、例えばカルボベ、ン
リ+シ、tire−プチルオ士ジカルボニル−tart
−アミ41士ジカルボニル1イソボルニルオ士ジカルボ
ニル、t−メト牛シベンジルオ士ジカルボニル−%2−
り0ル一ベシジルオキシカルボニル1アタマシチルオ士
シカルボニル−ト1ノフルオ0ア七チル為フタリル為ホ
ルミル10−二トOフェニルスルフェニル1ジフェニル
ホスフィノチオイルなどが挙げられる。カルボキシル基
の保護基としては、例えばアル牛ルエステル(例メチル
、エチル島づ0じル1ブチル、 tart−づチルなど
のエステル基)1ベシジルエステJし基−戸−二ト0ベ
ンジルエステル基Sl’−メト牛ジベンジルエステル基
171−りOルベシジルエステル基−ベシズじドリルエ
ステル基、カルボベンリ+シしドラシト基、tIrt−
プチルオ十ジカルボニルしドラシト基、トリチルしドラ
シト基等が挙げられる。As the protecting group for the amino group of the raw material, for example, carboben, ni+shi, tire-butyl-dicarbonyl-tart
-Ami41 dicarbonyl 1 isobornyl dicarbonyl, t-methoxybenzyl dicarbonyl-%2-
Examples include 0-besidyloxycarbonyl-1 atamacyl-oxycarbonyl-1-fluoro-7-ethyl-phthalyl-formyl-10-di-O-phenylsulfenyl-1-diphenylphosphinothioyl. Examples of protective groups for carboxyl groups include alkylene esters (eg, ester groups such as methyl, ethyl butyl, tart-butyl, etc.), besidyl ester groups, and benzyl ester groups Sl'. -methox dibenzyl ester group 171-riO rubesidyl ester group -besiz dibenzyl ester group, carbobenly + dibenzyl ester group, tIrt-
Examples thereof include a butyl-o-decacarbonyl-dracito group, a trityl-dracito group, and the like.
アルfニンのタアニジノ基の保護基としては、例えばニ
ド0基、トシル基、戸−メト士シベ:Jt!ジスルホニ
ル基、カルボベンリ+シ、イソボルニルオ士ジカルボニ
ル、アタマンチルオ士ジカルボニル等が挙げられる。ま
た、そのクアニジノ基は酸(例、ベンゼンスルホン厳島
トルニジスルホン酸、塩酸、硫酸など)塩の形で保護し
てもよい。Examples of protective groups for the taanidino group of arufine include a nido group, a tosyl group, and a methoxyl group: Jt! Examples thereof include a disulfonyl group, a carbobenyl group, an isobornyl dicarbonyl group, an atamantyl dicarbonyl group, and the like. Further, the quanidino group may be protected in the form of an acid salt (eg, benzenesulfone Itsukushima tornidisulfonic acid, hydrochloric acid, sulfuric acid, etc.).
メチオニンはスルホ+サイドの形で保護しておいてもよ
い。原料のカルボ+シル基の活性化されたものとしては
、例えば対応する酸り0ライド、酸無水物又は混合酸無
水物、アジド、活性エステル(メチルアルコール1エチ
ルアルコール、ベンジルアルコール1ペンタク00フエ
ノール1戸−二ト。つエノール、y−eFa+シサクシ
ンイ!ド1N−しド0十ジベンズトリアリール−%N−
しド0+シー5−ノルボルネン−2,3−ジカルボ士シ
イ三ド等とのエステル)等が挙げられる。ペプチド結合
形成反応は縮合剤(例:ジシク0へ士ジルカルボジイミ
ド、カルポジイミダリール等のカルボシイ三ド試薬、テ
トラエチル上0ホスフイト)の存在下に実施し得る場合
がある。Methionine may be protected in the form of sulfo+side. Raw materials with activated carbo+syl groups include, for example, the corresponding acid 0ride, acid anhydride or mixed acid anhydride, azide, active ester (methyl alcohol 1 ethyl alcohol, benzyl alcohol 1 pentac 0 0 phenol 1 Enol, y-eFa + Shisakushini!do1N-shido01 dibenztriaryl-%N-
Examples include esters of 0 + 5-norbornene-2,3-dicarboxylic acid, etc. The peptide bond-forming reaction may be carried out in the presence of a condensing agent (eg, tricarboxylic reagents such as dihydrylcarbodiimide, carposiimidalyl, tetraethyl phosphite).
上記一般式(1)で表わされるぺづチドはより具体的に
は以下に示す方法に従い製造される。即ち一般式(1)
のペプチドのうち、Rが水素原子を示すぺづチドは下記
(1)に従い製造され、RがH−Pkz −暮を示すペ
プチドは下記(II)に従い製造され、RがH−L z
u −G / y −P A z−基を示すべづチド
は下記(2)に−基を示すぺづチドは下記(転)に従い
製造され1またRがH−Me l−5ty−Tyr−A
xn−Liu−Lzu−Gl y −Phz−基を示す
ペプチドは下記(7)に従い製造される。More specifically, the peptide represented by the above general formula (1) is produced according to the method shown below. That is, general formula (1)
Among the peptides, peptides in which R represents a hydrogen atom are produced according to the following (1), and peptides in which R represents H-Pkz-d are produced according to the following (II), and R is H-Lz
u -G / y -P A z- group is produced according to the following (2), a - group is produced according to the following (transition), and R is H-Me l-5ty-Tyr- A
A peptide exhibiting an xn-Liu-Lzu-Gly-Phz- group is produced according to the following (7).
(1) A−Lg u−Gl n −B(2)
(4)
H−Lzu−Gl n−Ary−5zr−5et −0
N(1) CH−Lzu−
Gin−Ary−5er−5zr−ON(ll)C
H−Phz−Ltu−Gln−Ary−5tr−5zr
−ONH−Leu−Gly −Phz −Leu−Gl
n−Ar(1−5tr−5tr −OHA−Tyr−A
’xn−Lzu−Lzu−Gl y−Pkt−Ltu−
Gln −C
H−Tyr −Asn−Leu −Lay −Gly
−Pkz −Ltu−Gln−Ary−5ty −5p
y −0H(7)H−T y r−As n−Lx u
−Lx u−Gl y−PA t−1、。−Gln−A
rg−5et−5et−ORPhz−Ltu−C;In
−Arg−5et−5tr−ORH−Net−5zr−
Tyr−Azn−Lzu−Ltu−Gly−Pkt−L
xu−Gln−Arg−5et−5tr−OR(上記(
1)〜(V)において、Aはアミノ基の保護基、Bは水
酸基又はカルボ中シル基の活性基SCはアル平ニジのク
アニジノ基の保護基をそれぞれ示す0)Itペプチド(
2)とペプチド(3)との反応は、溶媒の存在下に行な
うことができる。溶媒としては、ぺづチド縮合反応に使
用し得ることが知られているものから適宜選択でき、例
えば無水または含水のジメチルホルムアミド1.ジメチ
ルスルホ牛シト、じリジン1り00ホルムS”lオ牛サ
シ)ジグ0ルメタン1テトラしドロフラン1酢酸エチル
1N−メチルじ0リドン)へ十寸メチルリン酸トリアミ
ド或いはこれらの混合溶媒等が挙げられる。ペプチド(
3)とペプチド(2)との使用割合としては特に限定さ
れず広い範囲内で適宜選択することができるが、通常前
者に対して後者を等量〜5倍量、好ましくは等量〜1.
5倍量使用するのがよい。反応温度はペプチド結合形成
反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選
択され1通常的−40〜約60℃、好ましくは約−20
〜約40℃の範囲から、適宜選択される。反応時間は一
般に数分〜30時間程度である。(1) A-Lg u-Gl n -B(2) (4) H-Lzu-Gl n-Ary-5zr-5et -0
N(1) CH-Lzu-
Gin-Ary-5er-5zr-ON(ll)C H-Phz-Ltu-Gln-Ary-5tr-5zr
-ONH-Leu-Gly -Phz -Leu-Gl
n-Ar(1-5tr-5tr-OHA-Tyr-A
'xn-Lzu-Lzu-Gly-Pkt-Ltu-
Gln -C H-Tyr -Asn-Leu -Lay -Gly
-Pkz -Ltu-Gln-Ary-5ty -5p
y -0H(7)H-T y r-As n-Lx u
-Lx u-Gly-PA t-1,. -Gln-A
rg-5et-5et-ORPhz-Ltu-C;In
-Arg-5et-5tr-ORH-Net-5zr-
Tyr-Azn-Lzu-Ltu-Gly-Pkt-L
xu-Gln-Arg-5et-5tr-OR (above (
In 1) to (V), A represents a protecting group for an amino group, B represents a hydroxyl group or an active group for a carboxyl group SC represents a protective group for an alkyl quanidino group, respectively 0) It peptide (
The reaction between 2) and peptide (3) can be carried out in the presence of a solvent. The solvent can be appropriately selected from those known to be usable in the peptide condensation reaction, such as anhydrous or water-containing dimethylformamide. Examples include dimethyl sulfonate, dilysine, dilysine, 1 form, 1 tetramethane, 1 tetrahydrofuran, 1 N-methyl acetate, 1 N-methyl phosphoric acid triamide, and mixed solvents thereof. .peptide(
The proportion of peptide (3) and peptide (2) to be used is not particularly limited and can be appropriately selected within a wide range, but usually the latter is used in an equivalent amount to 5 times the amount of the former, preferably an equivalent amount to 1.
It is best to use 5 times the amount. The reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for peptide bond forming reactions, usually from -40°C to about 60°C, preferably about -20°C.
to about 40°C, as appropriate. The reaction time is generally about several minutes to 30 hours.
ぺづチド(5)とアミノ酸(6)との反応、ぺづチド(
8)とべづチド(9)との反応、ペプチドQl)とペプ
チド(2)との反応及びペプチドQ4とべづチドQf9
との反応はいずれもペプチド(2)とペプチド(3)と
の反応と同様にして行なうことができる。゛
上記縮合反応終了後、得られるペプチド(4)のA及び
Cの保護基は常法により離脱できる。斯かる方法として
は例えば液体アシ上ニア中での金属ナトリウムによる還
元方法を挙げることができる。Reaction between peptide (5) and amino acid (6), peptide (
8) Reaction between peptide Ql) and bedutide (9), reaction between peptide Ql) and peptide (2), and peptide Q4 and bedutide Qf9
The reaction with peptide (2) and peptide (3) can be carried out in the same manner as the reaction between peptide (2) and peptide (3).゛After the completion of the above condensation reaction, the protecting groups of A and C of the resulting peptide (4) can be removed by a conventional method. Such a method includes, for example, a reduction method using metallic sodium in liquid ascinia.
金属ナトリウムは、反応溶液がパーマネントブルーに3
0秒〜lO分間程度呈色しているような量で用いられる
。この還元は通常−40〜−7et程度にて行なわれる
。Metallic sodium causes the reaction solution to turn a permanent blue color.
It is used in such an amount that it remains colored for about 0 seconds to 10 minutes. This reduction is usually carried out at about -40 to -7 et.
ぺづチド(7)、ぺづチドQO1ぺづチド(至)又Gま
ペプチドα6からの保護基A及びCの除去&ま、ペプチ
ド(4)から保護基A及びCを除去する方法と同様にし
て行なわれる。Peptide (7), Peptide QO1 Peptide (To) and G Removal of protecting groups A and C from peptide α6 & Same method as removing protecting groups A and C from peptide (4) It is carried out as follows.
上記(1)において用いられるぺづチド(唱ま例えGf
下記に示す方法により製造される。Pezuchido (shouma analogy Gf) used in (1) above
It is manufactured by the method shown below.
H−5zr−OR”
(至)
A−5ay−B A−5ay−5tr
−OR”Qη a嗜H−5
tr−5tr −OR”
(ホ)
A−Ary−5Ir−5lr −OR工翰
A−Arq−5zr−5zr−OH
・翰
(3)
〔上記においてRi は低級アル牛ル基を示す。H-5zr-OR” (To) A-5ay-B A-5ay-5tr
-OR"Qη a-h-5
tr-5tr -OR'' (E) A-Ary-5Ir-5lr -OR 翰A-Arq-5zr-5zr-OH ・翰(3) [In the above, Ri represents a lower alkyl group.
JXB及びCは前記に同じ。〕
アミノ酸α力とアミノ酸(至)との反応1ま前記ぺづチ
ド(2)とペプチド(3)との反応と同様にして行なう
ことができる。JXB and C are the same as above. ] Reaction 1 between amino acid α and amino acid (1) can be carried out in the same manner as the reaction between peptide (2) and peptide (3).
ペプチド翰のAの保護基は常法番こより離脱できる。斯
かる方法としては、例え1還元的方法(例式ラジウム、
l〜ラジウム黒等の触媒を用しする水素添加、液体アン
モニア中金属すトーノウムによる還元)Sアシドリシス
(例トリフルオロ酢酸、弗化水素、メタンスルホシ酸、
臭化水素酸等の強醗によるアシドリシス)等が挙げられ
る。例えば触媒を用いる水素添加の場合には、水素圧1
気圧、0〜40℃にて行なうことができる。触媒の使用
量は通常100111〜1f程度でよく1一般に1〜4
8時間程度で反応は終了する。またアシドリシスの場合
には無溶媒下通常0〜30℃程度、好ましくは0〜20
°Cにて行なわれ、一般に15分〜1時間程度で反応は
終了する。酸の使用量としては原料化合物に対し通常5
〜10倍量程度とするのがよい。また液体アシモニア中
金属ナトリウムによる還元については既に上記で述べた
条件を採用できる。The protecting group A of the peptide chain can be removed using a conventional method. Such a method includes, for example, a reductive method (for example, radium,
Hydrogenation using a catalyst such as radium black, reduction with metal sodium in liquid ammonia) S acidolysis (e.g. trifluoroacetic acid, hydrogen fluoride, methanesulfosic acid,
Acidolysis with strong alcohol such as hydrobromic acid), etc. For example, in the case of hydrogenation using a catalyst, hydrogen pressure 1
It can be carried out at atmospheric pressure and 0 to 40°C. The amount of catalyst used is usually about 100111 to 1f.1 Generally 1 to 4
The reaction is completed in about 8 hours. In addition, in the case of acidolysis, it is usually about 0 to 30°C, preferably 0 to 20°C without a solvent.
The reaction is carried out at °C and generally completes in about 15 minutes to 1 hour. The amount of acid used is usually 5% based on the raw material compound.
It is best to use about 10 times the amount. Furthermore, the conditions already described above can be used for the reduction with metallic sodium in liquid asimonia.
ぺづナト翰とアミノ酸(ハ)との反応は前記ペプチド(
2)とペプチド(3)との反応と同様にして行なうこと
ができる。The reaction between Pezunato and the amino acid (c) is the reaction of the above peptide (
The reaction can be carried out in the same manner as the reaction between 2) and peptide (3).
ペプチド■を加水分解してペプチド(至)を得る反応は
例えに塩酸、硫酸等の鉱酸、水醸化ナトリウム、水酸化
カリウム等のアルカリの存在下水、メタノール1エタノ
ール、ジオ士サン等の溶媒中にて行なわれる。該反応は
通常20〜50℃にて30分〜3時間程度で行なわれる
。For example, the reaction of hydrolyzing peptide ■ to obtain peptide (sol) is carried out in the presence of a mineral acid such as hydrochloric acid or sulfuric acid, an alkali such as sodium hydroxide or potassium hydroxide, water, methanol 1 ethanol, or a solvent such as diosan. It is done inside. The reaction is usually carried out at 20 to 50°C for about 30 minutes to 3 hours.
ペプチドに)から保護基Aを除去する方法としては、例
えばパラジウム、パラジウム黒等の触媒を用いる水素添
加、アシドリシス等の方法を挙げることができる。これ
らの方法の条件としては既に上述した条件をいずれも採
用できる。Examples of methods for removing the protecting group A from peptides include hydrogenation using a catalyst such as palladium or palladium black, and acidolysis. As conditions for these methods, any of the conditions already mentioned above can be adopted.
上記(II)において用いられるぺづチド(5)はぺづ
チド(4)から保護基Δを除去することにより製造され
る。また同様にして上記(2)において用いられるペプ
チド(8)はぺづチド(7)から保護基Aを除去するこ
とにより製造され、上記(転)において用いられるぺづ
チドa1はペプチドα1から保護基Aを除去することに
より製造され、上記(9)において用いられるペプチド
a4はぺづチド(至)から保護基Aを除去することによ
り製造される。ペプチド(4)、ペプチド(7)、ペプ
チドα呻及びペプチド(2)から保護基Aを除去する方
法としては例えばパラジウム1パラジウム黒等の触媒を
用いる水素添加、アシドリシス等を挙げることができる
。これらの方法の条件としては既に上述した条件をいず
れも採用できる。The peptide (5) used in (II) above is produced by removing the protecting group Δ from the peptide (4). Similarly, the peptide (8) used in the above (2) is produced by removing the protecting group A from the peptide (7), and the peptide a1 used in the above (transformation) is protected from the peptide α1. Peptide a4, which is produced by removing group A and used in (9) above, is produced by removing protecting group A from a peptide. Examples of methods for removing the protecting group A from peptide (4), peptide (7), peptide α and peptide (2) include hydrogenation using a catalyst such as palladium 1 palladium black, acidolysis, and the like. As conditions for these methods, any of the conditions already mentioned above can be adopted.
上記(転)において用いられるペプチド(ロ)は例えば
下記に示す方法により製造される0
H=Lzu−OH工
(2)
A−Ax n−B A−Ax
n−Lx u−OR工■
(ホ)−−−m−tH−A x n −L z u
−07?工酷
曽
↓
A−Tyr−Asn−Lxu−OH
(2)
〔上記においてR”、滅B 及びCは前記に同じ。〕?
・アミノ酸−とアミノ酸に)との反応及びぺづチド勃と
アミノ酸(2)との反応はいずれも前記ペプチド(2)
とペプチド(3)との反応と同様にして行なうことがで
きる。ペプチド(ホ)から保護基Aを除去するには前記
ペプチドQ(Iから保護基Aを除去する方法をいずれも
適用できる。またペプチド翰を加水分解してペプチド曽
を得る反応゛は前記ペプチド四を加水分解してぺづチド
(至)を得る反応と同様の条件下に行なうことができる
。The peptide (b) used in the above (conversion) is produced, for example, by the method shown below.
n-Lx u-OR engineering ■
(e)---m-tH-A x n -Lz u
-07? Kokuso↓ A-Tyr-Asn-Lxu-OH (2) [In the above, R", B and C are the same as above.]?
・The reaction between amino acid and amino acid (amino acid) and the reaction between peptide erection and amino acid (2) are both caused by the above-mentioned peptide (2).
It can be carried out in the same manner as the reaction between and peptide (3). To remove the protecting group A from the peptide (E), any of the methods for removing the protecting group A from the peptide Q (I) described above can be applied.In addition, the reaction for hydrolyzing the peptide chain to obtain the peptide Z can be carried out using the above-mentioned peptide Q (I). can be carried out under the same conditions as the reaction to obtain peptides by hydrolyzing .
ぺづチド四からペプチド斡を得る好ましい方法として例
えば混合酸無水物法、アジド法等を挙げることができる
。Preferred methods for obtaining peptides from peptides include, for example, the mixed acid anhydride method and the azide method.
混合酸無水物法では、適当な溶媒中塩基性化合物の存在
下アル牛ルハ0カルボン酸を用いて行なわれる。使用さ
れるアル+ルハ0カルボン酸としては例えばり00蟻酸
メチル1プ〇七蟻酸メチル為り00蟻醗エチル1プoV
、蟻酸エチル為りoo蟻酸イソブチル等が挙げられる。The mixed acid anhydride method is carried out using an alkoxycarboxylic acid in the presence of a basic compound in a suitable solvent. The alkoxylic acid used is, for example, 00 methyl formate 1 methyl heptaformate 00 ethyl formate 1 oV
, ethyl formate, oo isobutyl formate, and the like.
また塩基性化合物としては例えばトリエチルアミン、ト
リメチルア三シ為ピリジシ1.;メチルアニリシ1N−
メチルモルホリシ、1.5−ジアザピシクo (413
t o )ノネ:I−5(DBN)、1,5−ジアザじ
シフo (514−O〕ウンデtシー5 (DBU)、
1.4−ジアザじシフO(2,2,2)オクタシ(DA
BCO) 等の有機塩基、炭−カリウム、炭酸ナトリウ
ム、炭酸水素カリウム1炭醗水素ナトリウム等の無機塩
基が挙げられる。用いられる溶媒は混合酸無水物法に慣
用の溶媒がいずれも使用可能であり、具体的には塩化メ
チレジ1りooホルム1シダooエタン等のIS Oゲ
シ化炭化水素類1ベンセシ、トルエン、十シレシ等の芳
香族炭化水素類1ジエチルエーテル)テトラしド0フラ
ジS、;メト牛シエタシ等のエーテル類A酢酸メチル1
酢酸エチル等のエステル類1N、N−ジメチルホルムア
ミド為ジメチルスルホ士シト)へ牛すメチルリン酸トリ
ア三ド等の非づ0トシ性極性溶媒などが挙げられる。該
反応は−20〜100℃好ましくは一20〜50℃にお
いて行なわれ、反応時間は一般に5分〜10時間好まし
くは5分〜2時間である。Examples of basic compounds include triethylamine, trimethylaminopyridine, 1. ; Methylanilisi 1N-
Methylmorpholysyl, 1,5-diazapico (413
t o ) none: I-5 (DBN), 1,5-diazajisifu o (514-O) undetcy 5 (DBU),
1.4-Diazazischiff O(2,2,2)octasi(DA
Examples include organic bases such as charcoal-potassium, sodium carbonate, potassium bicarbonate, and sodium monocarbohydrate. The solvent used can be any of the solvents commonly used in the mixed acid anhydride method, and specifically, 1 methyl chloride, 1 0 form, 1 sidium, 1 sulfuric acid hydrocarbon such as ethane, 1 benzene, toluene, Aromatic hydrocarbons (diethyl ether, etc.) 1) Ethers (metobushi), etc. (1) Methyl acetate
Examples include esters such as ethyl acetate, 1N, N-dimethylformamide, dimethylsulfonate, and non-polymerizable polar solvents such as methylphosphoric acid triazide. The reaction is carried out at -20 DEG to 100 DEG C., preferably -20 DEG to 50 DEG C., and the reaction time is generally 5 minutes to 10 hours, preferably 5 minutes to 2 hours.
アジド化法では、まず活性化されたカルボ士シル基、例
えばメチルアルコール為エチルアルコール、ベンジルア
ルコール等のアルコールで活性化されたカルボ牛シル基
にしドラ、;ン水和物を適当な溶媒中にて反応させれば
よい。用いられる溶媒としては例えばジオ十サン1ジメ
チルホルムア三ド、ジメチルスルホ+シト又はこれらの
混合溶媒等を挙げることができる。しドラジン水和物の
使用量としては活性化されたhルボ十シル基に対して通
常5〜20倍モル量、好ましくは5〜10倍モル量とす
るのがよい。該反応は通常ζ50°C以下、好ましくは
一20〜\50″Cにて行なわれる。In the azidation method, first, an activated carboxyl group, for example, a carboxylic group activated with an alcohol such as methyl alcohol, ethyl alcohol, benzyl alcohol, etc., is dissolved in a suitable solvent. All you have to do is react. Examples of the solvent that can be used include dioxane-1-dimethylformamide, dimethylsulfo+cyto, a mixed solvent thereof, and the like. The amount of cydrazine hydrate to be used is usually 5 to 20 times, preferably 5 to 10 times, the amount of activated h-rubodecyl group. The reaction is usually carried out at a temperature of ζ50°C or less, preferably from -20 to \50''C.
斯くして末端アミノ酸のカルボ+シル基部分がしドラジ
ンで置換された化合物(しドラジン誘導体を製造し得る
。末端アミノ酸のカルボ牛シル基部分がアジドで置換さ
れた化合物は酸の存在下適当な溶媒中上記で得られるし
ドラジン誘導体と亜硝酸化合物を反応させることにより
製造される。酸としては通常塩酸が用いられる。溶媒と
しては例えばジオ+サン、ジメチルホルムアミドSジメ
チルスルホ+シト又はこれらの混合溶媒等が挙げられる
。また亜硝酸化合物としては例えば亜硝酸ナトリウム、
亜硝酸イソアミル、塩化ニド0シル等を挙げることがで
き、斯かる亜硝酸化合物をしドラジン誘導体に対して通
常等上ルー2倍モル量、好ましくは等七ル〜1.5倍t
ル量用いるのがよい。In this way, a compound in which the carboxyl group of the terminal amino acid is substituted with didrazine (a didrazine derivative can be produced. It is produced by reacting the dorazine derivative obtained above with a nitrous acid compound in a solvent. Hydrochloric acid is usually used as the acid. Examples of the solvent include dioxane, dimethylformamide, dimethylsulfo+cyto, or a mixture thereof. Solvents, etc. Examples of nitrite compounds include sodium nitrite,
Isoamyl nitrite, nitrite chloride, etc. can be mentioned, and such nitrite compounds are usually used in a molar amount equivalent to 2 times, preferably 1 to 1.5 times the amount of the dorazine derivative.
It is best to use the same amount.
該反応は通常−20〜0°C1好ましくは−20〜−1
0℃にて行なわれ、一般に5〜10分程度で反応は終了
する。The reaction is usually carried out at -20 to 0°C, preferably -20 to -1
The reaction is carried out at 0°C and generally completes in about 5 to 10 minutes.
上記のようにして製造された一般式(1)のペプチドは
反応混合物からぺづチドの分離手段例えば抽出、分配、
hラムダ0マドグラフイー等により単離精製される。The peptide of general formula (1) produced as described above can be separated from the reaction mixture by means such as extraction, distribution, etc.
It is isolated and purified by h-lambda 0 madography and the like.
RIA法において用いられる標識抗原の製造原料である
標識ぺづチドは上記で製造されるぺづチドに(,1等の
放射性ヨードを導入することにより製造される。該放射
性ヨードの導入は通゛常のヨード化法、例えばり0う三
ンTを用いる酸化的ヨード化法(F、 M、Hunte
r and F、C0Grztnasoad ; Na
turI、 194. P495(1962)、Bio
ckzm、10g9. P 114(1963)参照〕
により行なわれる。例えば上記ヨード化法は、適当な溶
媒例えば0.2Mリン酸緩衝液(PH−7,4)等の溶
媒中、り0う三ンTの存在下室温付近にて10〜30秒
程度で行なわれる。用いられるペプチド、放射性ヨード
及びり0う三ンTの使用割合としては、例えばチロシン
に放射性ヨードを1個導入する場合には、ぺづチド中に
含まれ″るチロシン分子1ナノ七ルに対して放射性ヨー
ドを1三りfユーリー程度、り0う三ンTをlO〜10
0ナノtル程度用いるのがよく、またチロシンに放射性
ヨードを2個導入する場合には、ぺづチド中に含まれる
チロシン分子1ナノ七ルに対して放射性ヨードを2ミリ
士ユーリー程度、り0う三ンTを10〜100ナノ七ル
程度用いるのがよい。斯くして製造される放射性ヨード
により標識化されたペプチドは通常の分離手段例えば抽
出、分配、カラムク0マドクラフイー、透析等により単
離精製される。The labeled peptide, which is the raw material for producing the labeled antigen used in the RIA method, is produced by introducing radioactive iodine (1) into the peptide produced above.The introduction of the radioactive iodine is generally carried out by Conventional iodination methods, such as oxidative iodination using phosphorus (F, M, Hunte
r and F, C0Grztnasoad; Na
turI, 194. P495 (1962), Bio
ckzm, 10g9. See P 114 (1963)]
This is done by For example, the above iodination method is carried out in a suitable solvent such as 0.2M phosphate buffer (PH-7,4) in the presence of phosphoric acid at room temperature for about 10 to 30 seconds. It will be done. For example, when introducing one radioactive iodine into tyrosine, the ratio of the peptide, radioactive iodine, and phosphor T to be used is, for example, when one radioactive iodine is introduced into tyrosine, it is The radioactive iodine is about 13 F, and the radioactive iodine is about 10 to 10.
It is best to use about 0 nanotons of radioactive iodine, and when introducing two radioactive iodines into tyrosine, it is recommended to use about 2 milliliters of radioactive iodine per nanogram of tyrosine molecules contained in the peptide. It is preferable to use about 10 to 100 nano-T. The radioactive iodine-labeled peptide thus produced is isolated and purified by conventional separation means such as extraction, partitioning, column chromatography, dialysis, and the like.
このようにして得られるペプチドは必要ならば凍結乾燥
させて保存しておくこともできる。The peptides thus obtained can be stored by lyophilization, if necessary.
本発明方法においては、ハプテンとして上記一般式(1
)で表わされるペプチドを使用する。In the method of the present invention, the above general formula (1
) is used.
八つテンに結合される担体としては、通常抗原の作成に
当り慣用される高分子の天然若しくは合成の蛋白質を広
く使用でき、例えば馬血清アルジミン、牛血清アルブミ
ン、ウサf血清アルプ三ン、人血清アルづ三ン1しツジ
血清アルブミン等の動物の血清アルプ三ン類、馬面清ジ
0プリシ、牛血清ジ0プリシ)ウサ千血清り0プリシ、
人血清り0プリン、ヒツジ血清l)oづリン等の動物の
血清グ0プリシ類1馬チ0グ0プリシ1牛チ0グ0プリ
ン為ウサ4foジ0プリン、人チ0夕0づリン、しツジ
チ0り0プリン等の動物のチ0り0づリン類1馬へrニ
ジ0じシ、牛へ七ジ0づリン1ウサfへV:りOプリン
、人へ七り0プリン)しツジヘ℃り0プリン等の動物の
へr:り0プリン類、動物のへ七シアニン類1回虫より
抽出された蛋白質(アスカ−リス抽出物、特願昭54−
92781号参照)、ポリリジン1ポリグルタミン酸1
リジシークルタエシ讃共重合9体、リジシ又はオルニチ
ンを含む共重合体等を挙げることができる。
Bアスカ−リス抽出物について以下に詳述する。As the carrier bound to octatene, a wide range of high-molecular natural or synthetic proteins commonly used in the preparation of antigens can be used, such as horse serum aldimine, bovine serum albumin, rabbit f serum alpine, and human serum alpine. Animal serum albumins such as serum albumin, horse serum albumin, bovine serum albumin, rabbit serum albumin,
Animal serum such as human serum 0 purine, sheep serum 1) ozurin, etc. , Shitsujichi 0ri 0 pudding and other animals to 1 horse r Niji 0jishi, cow to 7 ji 0zu rin 1 rabbit f to V: ri O pudding, human to 7ri 0 pudding ) Proteins extracted from roundworms (Ascaris extract, patent application 1972-
92781), polylysine 1 polyglutamic acid 1
Examples include a copolymer containing Rigi-Sicurtaethyl-9, a copolymer containing Rigi-Si or ornithine, and the like.
The B. Ascaris extract will be described in detail below.
アスカ−リス抽出物は、ブタ回虫(Azcarizzu
um ) の粉砕物より通常の蛋白抽出法に従い抽出
される。抽出溶媒としては例えば水、生理食塩水、50
%メタノールまたはエタノール水溶液、中性付近の緩衝
液等の公知の各種蛋白抽出溶媒を使用でき、特に生理食
塩水を用いるのが好ましい。Ascaris extract is an extract of Ascaris spp.
It is extracted from the pulverized product of um) according to the usual protein extraction method. Examples of the extraction solvent include water, physiological saline, and
Various known protein extraction solvents can be used, such as % methanol or ethanol aqueous solution, buffer solutions around neutrality, etc., and it is particularly preferable to use physiological saline.
上記抽出物は、より具体的には、例えば次の如くして製
造される。即ちブタ回虫の内容物を除去し、生理食塩水
で洗浄後、抽出を容易とするため好ましくは細断し、該
細断物を例えば生理食塩水等の蛋白抽出溶媒中に添加し
、ホモジネートしながら抽出する。この抽出は通常低温
下において行なわれ、好ましくは約2〜10℃で有利に
行なわれる。More specifically, the above extract is produced, for example, as follows. That is, after removing the contents of the porcine roundworm and washing it with physiological saline, it is preferably shredded to facilitate extraction, and the shredded material is added to a protein extraction solvent such as physiological saline and homogenized. while extracting. This extraction is usually carried out at low temperatures, preferably at about 2 DEG to 10 DEG C.
かくして得られる抽出液を次いで遠心分離し、上清を採
取し透析液透析液を凍結乾燥するか又は更に上記透析液
を再度遠心分離し、上清を採取し、浮遊物を除去後凍結
乾燥することによって1目的とするアスカ−リス抽出物
が製造される。これは更に必要に応じて通常の蛋白精製
手段例えば透析法、ゲル濾過法、吸着法、り0マドグラ
フ法等により精製後、本発明に利用することができる。The extract thus obtained is then centrifuged, the supernatant is collected, and the dialysate is freeze-dried, or the dialysate is centrifuged again, the supernatant is collected, and the suspended matter is removed, followed by freeze-drying. In this way, a desired Ascaris extract is produced. This protein can be used in the present invention after being further purified by conventional protein purification methods such as dialysis, gel filtration, adsorption, and chromatography, if necessary.
また本発明に用いるアスカ−リス抽出物は、例えばJ、
Immuno、IIl、260〜268(1973)、
J、Immun、。Further, the Ascaris extract used in the present invention is, for example, J.
Immuno, III, 260-268 (1973),
J. Immun.
122.302〜308(1979)、J、Immun
、、 98゜893〜900(+967)及びAm、J
、Pkyxial、。122.302-308 (1979), J. Immun.
,, 98°893~900 (+967) and Am, J
,Pkyxial,.
199.575〜578(、+960)に記載されたも
のまたはこれらを更に精製したものであってもよい0ハ
づテン−担体結合試薬としては通常抗原の作成に当り慣
用されているものを広く使用でき、具体的にはアミノ基
とアミノ基とを架橋結合させる、例えばタリオ士す−ル
、マロンジアルデヒド、クルタールアルデヒド、スクシ
シアルデヒド、アジポアルデしド等の脂肪族ジアルデヒ
ド類、チオール基とチオール基とを架橋結合させる)例
えばN、” −’ −フエ:17 :J 、7 ? L
’ イE ) % 7vI” −” −’:フェニレシ
ジマレイ三ミドのシマレイミド化合物、″p三ソノ基チ
オール基とを架橋結合させる、例えばメタマレイミドベ
シリイルーN−ヒト0牛シスクシンイミドエステル54
−(マレイ三トメチル)−シフ0へ士サンー1−カルボ
+シル−y−しド0牛シスクシンイミドエステル等のマ
レイミドカルボ牛シルーN−eFo+シスクシンイ三ド
エステル化合物1ア三ノ基とカルボ士シル基とをアミド
結合させる通常のペプチド結合形成反応に用いられる試
薬、例えばN、N−シシク0へ士ジルカルボシイミド、
N−エチル−N′−ジメチルアエノカルボジイミド、l
−エチル−3−ジイソづ0ピルアエノカルボジイ三ド、
l−シフ0へ牛シル−3−(2−v:ルホリニルー4−
エチル)カルボシイミド等のカルボシイミド類等の脱水
縮合剤を挙げることができるが、さらには−一ジアリニ
ウムフェニル酢酸等のシアリニウムアリールカルポジ酸
類と通常のべづチド結合形成反応試薬、例えば上記脱水
縮合剤とを組み合わせたものも使用可能である。199.575-578 (, +960) or further purified versions thereof.As the carrier-binding reagent, those commonly used in the preparation of antigens are widely used. Specifically, aliphatic dialdehydes such as thaliosulfate, malondialdehyde, coulteraldehyde, succicialdehyde, adipaldehyde, and thiol groups can be used to crosslink amino groups. For example, N, "-'-fe:17:J,7?L
'IE) % 7vI"-"-': A cimaleimide compound of phenylecidimaleimide, which cross-links the p-3sono thiol group, for example, metamaleimide besiliyl N-human 0 bovine cissuccinimide ester 54
-(Maletritomethyl)-Schiff0hesan-1-carbo+sil-y-sido0 Maleimidocarboxyl-N-eFo+cissuccinimide ester compound 1 Trino group and carboxysil group Reagents used in the usual peptide bond forming reaction to form an amide bond between
N-ethyl-N'-dimethylaenocarbodiimide, l
-ethyl-3-diiso-pyraenocarbodiide,
l-schiff0 to bovine syl-3-(2-v: luforinyl-4-
Examples include dehydration condensation agents such as carbosiimides such as ethyl)carbosiimide, but further examples include dehydration condensation agents such as carbosiimides such as -mono-dialinium phenylacetic acid and ordinary betutide bond-forming reaction reagents, such as the above-mentioned dehydration condensation agents. It is also possible to use a combination with a condensing agent.
本発明の抗原は上記ハづテンと担体とを八づテ8〜9の
緩衝液中で0〜40℃好ましくは室温付近で行なわれ、
約1〜24時間、好ましくは3〜5時間で反応は完結す
る。上記において用いられる代表的緩衝液としては、次
のようなものを例示できる。The antigen of the present invention is produced by combining the above-mentioned compound and carrier in a buffer solution of Steps 8 to 9 at 0 to 40°C, preferably at around room temperature,
The reaction is completed in about 1 to 24 hours, preferably 3 to 5 hours. Typical buffer solutions used in the above may include the following.
0.2N水醗化ナトリウム−0,2Mホウ醗−0.2M
塩化カリウム緩衝液、
0.2M炭酸fト@J’)L−0,2M*’)m−0,
2M塩化カリウム緩衝液、
0.05M四ホウ醗ナトリウムー0.2Mホウl?−0
,05MN化ナトリウム緩衝液、
0.1Mリン醗二水素カリウムー0.05M西ホウ酸ナ
トリウム緩衝液
上記においてハプテン、八づテン−担体結合試薬及び担
体の使用割合は適宜に決定できるが、通常ハプテンに対
して担体を2〜6倍重量好ましくは3〜5倍重量、及び
ハづテシー担体結合試薬5〜10倍七ルとするのがよい
。上記反応によりハづテン−担体結合試薬を仲介させて
担体とハプテンとが結合した本発明のペプチド−担体複
合体がら成るヒトβ型イシターフエ0シの抗原が収得さ
れる。反応終了後得られる抗原は常法に従い、例えば透
析法、ゲル濾過法、分別沈殿法等により容易に単離精製
できる。また該抗原は通常の凍結乾燥法により保存でき
る。かくして得られる本発明の抗原は、通常蛋白質1t
ルに対しペプチドが平均5〜20vニル結合したもので
あり、いずれも引き続き再現性よく、シトβ型インター
フエ0ンに対する特異性の高い抗体の作成を可能とする
ものであるが、特に上記蛋白質に対するぺづチドの結合
上ル比が1:8〜15のものは、特異性が一層高く高力
価、高感度の抗体を作成し得るものであり好ましい。0.2N Sodium aqueous solution - 0.2M Sodium chloride - 0.2M
Potassium chloride buffer, 0.2M carbonate @J')L-0, 2M*')m-0,
2M potassium chloride buffer, 0.05M sodium tetraboron-0.2M boron 1? -0
, 05M sodium dihydrogen buffer, 0.1M potassium dihydrogen phosphorus-0.05M sodium borate buffer In the above, the proportions of the hapten, the 8-carrier binding reagent and the carrier can be determined as appropriate; On the other hand, it is preferable that the carrier is 2 to 6 times the weight, preferably 3 to 5 times the weight, and the carrier binding reagent is 5 to 10 times the weight. Through the above reaction, an antigen of human β-type Ishita protein comprising the peptide-carrier complex of the present invention, in which a carrier and a hapten are bound, is obtained through the mediation of a hapten-carrier binding reagent. The antigen obtained after completion of the reaction can be easily isolated and purified according to conventional methods, such as dialysis, gel filtration, and fractional precipitation. Moreover, the antigen can be preserved by conventional freeze-drying methods. The antigen of the present invention thus obtained is usually a protein 1t.
The peptide has an average of 5 to 20 v-nyl bonds to the protein, and all of them continue to be reproducible and enable the production of highly specific antibodies against cytoβ-type interferon. A binding ratio of peptide to peptide of 1:8 to 15 is preferable because it allows production of antibodies with higher specificity and high titer and high sensitivity.
上記で得られる抗原による抗体の作成に当っては、常法
に従い抗原を哺乳動物に投与し、生体内に産生される抗
体を採取する方法を採用できる。In producing antibodies using the antigen obtained above, a conventional method can be employed in which the antigen is administered to a mammal and the antibodies produced in vivo are collected.
抗体の製造に供せられる哺乳動物としては特に制限はな
いが、通常兎や℃ル七ットを用いるのが望ましい。抗体
の産生に当っては、上記により得られる抗原の所定量を
生理食塩水で適当濃度に希釈し、フ0イ、ドの補助液(
Complete Frzund’zAdjuvant
) と混合して懸濁液を調整し1之を哺乳動物体に
投与すればよい。例えば兎に上記懸濁液を皮肉注射(抗
原の量として0.5〜511qI/回)し、以後2週間
毎に2〜10ケ月好ましくは4〜6ケ月間投与し免疫化
させればよい。抗体の採取は、上記懸濁液の最終投与後
抗体が多量産出される時期、通常上記最終投与1〜2週
間経過後、免疫化された動物から採血し、之を遠心分離
後血清を分離採取することにより行なわれる。殊に本発
明方法によれば、用いる抗原の特殊性に基づいて、常に
安゛定してしトのβ型イシターフエ0シに対して非常に
優れた特異性を有し、高力価、高感度の抗体を再現性よ
く収得できる利点がある。There are no particular restrictions on the mammal used for antibody production, but it is usually desirable to use rabbits or rats. For antibody production, dilute a predetermined amount of the antigen obtained above with physiological saline to an appropriate concentration, and add auxiliary solutions (
Complete Frzund'zAdjuvant
) to prepare a suspension and administer it to a mammal. For example, rabbits may be immunized by subcutaneously injecting the above suspension (antigen amount: 0.5 to 511 qI/dose), followed by administration every two weeks for 2 to 10 months, preferably 4 to 6 months. Antibodies are collected by collecting blood from the immunized animal at a time when large amounts of antibodies are produced after the final administration of the suspension, usually 1 to 2 weeks after the final administration, and centrifuging the blood, followed by separating and collecting the serum. It is done by doing. In particular, according to the method of the present invention, based on the specificity of the antigen used, it always has excellent specificity against the existing β-type isiter enzyme, and has high titer and high It has the advantage of being able to obtain sensitive antibodies with good reproducibility.
上記で得られるヒトβ型イシターフエ0シを不溶性支持
体上に固定化するに際しては、従来公知の生体物質の固
定化方法をいずれも使用でき、これらのうちでも臭化ジ
アジ活性化多糖体性を使用するのが好適である。この臭
化ジアジ活性化多糖体性は不溶性支持体を臭化ジアジで
処理し、′次いで得られる活性化物を生体物質と緩和条
件下にカ 9゛ツプリシクさせ、生体物質を固定化
する方法である。不溶性支持体を臭化ジアジで処理する
に当っては、例えば水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリ
ウム等の塩基性化合物を用いてl’H11〜12に保ち
室温下水、アセトニトリル等の溶媒中にて約1〜12分
間程度処理すればよい。不溶性支持体に対する臭化ジア
ジの使用量としては通常およそ等門量とするのがよい。When immobilizing the human β-type isiterfue obtained above on an insoluble support, any of the conventional methods for immobilizing biological substances can be used. It is preferred to use This diazibromide-activated polysaccharide is a method in which an insoluble support is treated with diazibromide, and the resulting activated product is combined with a biological material under mild conditions to immobilize the biological material. . When treating an insoluble support with diazibromide, for example, using a basic compound such as sodium hydroxide or sodium hydrogen carbonate, the insoluble support is kept at l'H11 to 12 and heated at room temperature in a solvent such as water or acetonitrile for about 1 It is sufficient to process for about 12 minutes. The amount of diazibromide to be used relative to the insoluble support is usually approximately equal.
ここで不溶性支持体とじては、生体物質一般に対する非
特異的吸着が低く、高い多孔性を有し、緩和条件下に生
体物質を固定化し得る官能基を有し、しかも化学的・物
理的に十分安定なものであれば従来公知の不溶性支持体
をいずれも使用でき、例えばア三ノエチルセル〇−ス、
カルボ士ジメチルセル0−ス、プ〇七アtチルセル0−
ス、戸−アニリノセル0−ス等のセル0−ス糸支持体、
セファデックス、CM−セファデックス(ファルマシア
社製)等の架橋ダ十ストラシ系支持体、tフチ0−スフ
B1セファ0−フ48
等のツガ0ース糸支持体等を挙げることができる。Insoluble supports have low nonspecific adsorption to biological substances in general, high porosity, functional groups that can immobilize biological substances under mild conditions, and chemically and physically Any conventionally known insoluble support can be used as long as it is sufficiently stable, such as athinoethylcellulose,
Carboxyl dimethyl cell 0-su, 7-dimethyl cell 0-
cell 0-su yarn support such as s, door-anilino cel 0-su,
Examples include cross-linked fiber-based supports such as Sephadex and CM-Sephadex (manufactured by Pharmacia), and hemlock fiber supports such as T Edge 0-Screen B1 Sepha 0-F 48.
斯くして得られる臭化ジアジ活性化支持体を”ヒトβ型
インターフエ0シ抗体とカッブリジグさせるに際しては
、例えばヒトβ型イシターフェ0シ抗体に対して臭化ジ
アジ活性化支持体を30〜80倍重量用い、適当な溶媒
、例えば0.1 ’tニル戻戻水水素ナトリウム 0.
5 1ニル塩化ナトリウム含有、13H8.4>水溶液
中、通常0〜40℃程度、好ましくは2〜8℃にて約1
0〜20時間反応させればよい。このようにして本発明
のアフィニティークロマドクラフィー用吸着体が製造さ
れる。この吸着体は適当な溶媒、例えば生理食塩水中に
て保存され得る。When the thus obtained diazidibromide-activated support is coupled with a human β-type interfacial antibody, for example, the diazibromide-activated support is added at a concentration of 30 to 80% of the human β-interfacial antibody. Using twice the weight, use a suitable solvent, such as 0.1't sodium hydrogen reconstituted water 0.
5 Contains 1-nyl sodium chloride, 13H8.4> In an aqueous solution, usually about 0 to 40°C, preferably about 1 to 8°C
The reaction may be carried out for 0 to 20 hours. In this way, the adsorbent for affinity chromatography of the present invention is manufactured. The adsorbent may be stored in a suitable solvent, such as physiological saline.
また上記で得られるヒトβ型イシターフエ0ン抗体は、
上記の通り殊に優れたしトのβ型インターフエ0シ特異
性を有するものであり、斯界で要望されているEIA法
によるしトのβ型イシターフェ0シの定量を高精度をも
って可能とする有用なものである。また該抗体は、これ
に酵素または螢光物質で標識することによってエンザイ
ムイムノアツセイ(EIA)法、フ0−レツtシスイム
ノアッtイ(FIG)法等に使用できる。さらに該抗体
は公知の不溶化させる物質と反応させて不溶化抗体とす
ることもできる。In addition, the human β-type isiterfeon antibody obtained above is
As mentioned above, it has particularly excellent specificity for β-type interferon in livestock, and enables the quantitative determination of β-interface in livestock using the EIA method, which is desired in this field, with high precision. It is useful. Further, the antibody can be used in enzyme immunoassay (EIA) method, fluorescence immunoassay (FIG) method, etc. by labeling it with an enzyme or a fluorescent substance. Furthermore, the antibody can be made into an insolubilized antibody by reacting with a known insolubilizing substance.
、 ”−″
以下本発明を更に詳しく説明するための参考例及び実施
例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない
。, ``-'' Below, reference examples and examples are given to explain the present invention in more detail, but the present invention is not limited thereto.
尚参考例におけるRf値はシリカゲル上の薄層り0マド
タラフイーにて下記混合溶媒を用いて測定したものであ
る。The Rf value in the reference example was measured using a thin layer of silica gel using the following mixed solvent.
Rf ・・・1−ブタノール−酢酸−水(4:1:5
)■
Rf ・・・1−ブタノールーヒリジンーg[−水(
15:10:3:12)
〈ペプチドの合成〉
参考例!
ず梗
Z−5tr−5tr −OMz f)製造Z−!yr−
NHNH25,Q 6fを50m1のジメチルホルムア
ミドおよび6.66+wlの6 N −HCI / 、
;オ+サンに溶解し、−15℃に冷却後イソアミルすイ
トライト2.68s+jを加え、5分間攪拌する。Rf...1-butanol-acetic acid-water (4:1:5
)■ Rf...1-butanol-hyridine-g[-water(
15:10:3:12) <Peptide synthesis> Reference example! Zukyou Z-5tr-5tr -OMz f) Manufacturing Z-! yr-
NHNH25,Q 6f with 50ml dimethylformamide and 6.66+wl 6N-HCI/,
; Dissolve in O+san, cool to -15°C, add isoamylsuitolite 2.68s+j, and stir for 5 minutes.
次いで5.60g/のトリエチルアミンを加えて中和す
る。この溶液をH−5zr−OMz−HCI3,11
fとトリエチルアミン2.80g+/を含有する30耐
のジメチルホルムアミド溶液に加え、4℃で20時間攪
拌する。ジメチルホルムアミドを留去し、得られた残留
物を酢酸エチルで抽出し、水洗後芒硝で乾燥する0酢酸
エチルを留去後)エーテルを加え結晶化し、再沈殿を酢
酸エチル−エーテルで行ない、Z−5zr−5zr −
Oug 3.75 fを得る。Then 5.60 g/triethylamine is added to neutralize. This solution was mixed with H-5zr-OMz-HCI3,11
Add to a 30-proof dimethylformamide solution containing f and 2.80 g+/ of triethylamine, and stir at 4°C for 20 hours. Dimethylformamide was distilled off, the resulting residue was extracted with ethyl acetate, washed with water, and dried with sodium sulfate. -5zr-5zr-
Obtain Oug 3.75 f.
Rf値=0.6今、Rf値:0.7?
元素分析値(CL5H2゜N207として)CHN
計算値(%”) 52,94 5.92 8.2
3実測値(幻 52.67 5,89 8.35参
考例2
Z−Arq(Tag)−5zr−5tr−OMzの製造
Z−5tr−5tr −0ut 2.5 fを50m
1のメタノール及び7.34g/のI N −MCIに
溶解し、500哩のパラジウム黒の存在下20℃、水素
圧1気圧で接触還元を行ナイ、H−5z r−5z r
−0Mg を得るORf値?0.08
Z ’、−Arg(Tos ) −OH3,399を4
0m1のテトラしドロフラン及び0.75m+/のN−
メチル七ルホリシに加え、−15℃に冷却後0.97−
のイソプチルク00ホルメイトを加え30秒間激しく攪
拌する。Rf value = 0.6 Now, Rf value: 0.7? Elemental analysis value (as CL5H2°N207) CHN Calculated value (%”) 52,94 5.92 8.2
3 Actual measurement value (phantom 52.67 5,89 8.35 Reference example 2 Production of Z-Arq (Tag)-5zr-5tr-OMz Z-5tr-5tr -0ut 2.5 f for 50 m
H-5z r-5z r was dissolved in 1 part of methanol and 7.34 g of IN-MCI and subjected to catalytic reduction at 20°C and 1 atm of hydrogen pressure in the presence of 500 m of palladium black.
ORf value to obtain -0Mg? 0.08 Z', -Arg(Tos) -OH3,399 to 4
0m1 of tetrahydrofuran and 0.75m+/N-
In addition to methyl hexafluoride, after cooling to -15°C, 0.97-
Add isoptiluc 00 formate and stir vigorously for 30 seconds.
上記テfl ラhルH−5py−5ir−Ohh、HC
I S=; メチルホルムアミド2o寓/及びトリエチ
ルアミンLO3mlを加えて1分間攪拌し、次いでo
’cで5分間、40℃で2分間、室温で15分間それぞ
れ攪拌する。テトラしドロフラン及びジメチルホ′ルム
アミドを留去後酢醗エチルで抽出し為IN−りIシ酸で
3回、次いで水で5回洗浄後芒硝で乾燥する。溶媒を留
去し、メタノール−酢酸エチル、エーテルで再沈殿を行
ない、Z−Ary(Tax )−5et−5zr −O
ug 3,659を得る。The above Tefl Rahle H-5py-5ir-Ohh, HC
IS=; Add 2ml of methylformamide and 3ml of triethylamine LO, stir for 1 minute, and then add 2ml of methylformamide and 3ml of triethylamine.
Stir for 5 minutes at 'C, 2 minutes at 40°C, and 15 minutes at room temperature. After distilling off tetrahydrofuran and dimethylformamide, the extract was extracted with ethyl acetate, washed three times with IN-I silicic acid, then five times with water, and dried over sodium sulfate. The solvent was distilled off and reprecipitation was performed with methanol-ethyl acetate and ether to give Z-Ary(Tax)-5et-5zr-O
Obtain ug 3,659.
Rf 値: 0.5 I、Rf”値:0.73元素分
析値(’251H36N6’□。Sとして)CH’
#
計算値(%) 51.68 5.88 J2.9J
実測値(%)51,62 5.82 12.73参考例
3
Z−Arg(Tax )−5tr−5ty −OHC7
)製造Z−Arg(Tax) −5er−5tr−Ou
g 3,5 fをメタ)−ル50m1及び水IC)a
tに溶解し、l N −NaOH8,06+w/を加え
、室温下に45分間攪拌し、次いでI N−MCI 7
.24簿lを加えて中和し、メタノールを留去後n−ブ
タノールで抽出する。水洗後n−ブタノール及び水を留
去し、残渣にエーテルを加え結晶化し、メタノール−酢
酸エチルより再沈殿を行ない、Z−Ar g (TOx
)−5t r−5t r −OR2,6Qfを得る。Rf value: 0.5 I, Rf" value: 0.73 Elemental analysis value ('251H36N6'□. As S) CH'
# Calculated value (%) 51.68 5.88 J2.9J
Actual value (%) 51.62 5.82 12.73 Reference example 3 Z-Arg(Tax)-5tr-5ty-OHC7
) Manufacturing Z-Arg (Tax) -5er-5tr-Ou
g 3,5 f m) 50 ml and water IC) a
Add lN-NaOH8,06+w/, stir at room temperature for 45 minutes, then lN-MCI7
.. Add 24 liters of water for neutralization, and after distilling off methanol, extract with n-butanol. After washing with water, n-butanol and water were distilled off, ether was added to the residue to crystallize it, reprecipitation was performed from methanol-ethyl acetate, and Z-Ar g (TOx
)-5t r-5t r -OR2,6Qf is obtained.
Rf値:0.2B、Rf It値;0.57元素分析値
(C2ワH36N60工。S・%H20として)CHN
イ窄
計算値(%) 50,22 5.77 13.02★
測値(幻 50.2今 5.62 13.20参考例4
H−Ary(Tax)−5zr−5er−OHの製造P
d存在下20℃、常圧にて接触還元してH−Arg(T
17s )−8Ir−5ty−ORを得る。Rf value: 0.2B, Rf It value: 0.57 Elemental analysis value (C2 wa H36N60 engineering. As %H20) CHN
Calculated value (%) 50,22 5.77 13.02★
Measured values (phantom 50.2 current 5.62 13.20 Reference example 4 Production of H-Ary(Tax)-5zr-5er-OH P
H-Arg(T
17s)-8Ir-5ty-OR is obtained.
Rf値:0.034
参考例5
2−Arg−Ltu−OEI (7)製造Z−Axn
−ON 5.32fttテト5シトO”)ラン60m
+Z%ジメチルホルムア!ド10鱈l及びN−メチルセ
ルホリシ2.0+11Itに溶解し、イソプチルク00
ホルメイト2.64111 S//−Lx u−OE
/ −EC13,91F及びトリエチルアミン2.80
g/を含む4C)tlのジメチルホルムアミド溶液を用
い、参考例2の方決に準じて反応を行なう。溶媒を留去
後1モルクエン酸水溶液を加え、沈殿物を炉取、水洗、
減圧乾燥して、酢酸エチルにて再結晶してZ−Azn−
Law−OEt 6. l lを得る。Rf value: 0.034 Reference example 5 2-Arg-Ltu-OEI (7) Production Z-Axn
-ON 5.32ftttet5sitO") run 60m
+Z% dimethylformua! Dissolved in 10 liters of cod and 2.0 + 11 It of N-methyl cellulose,
Formate 2.64111 S//-Lx u-OE
/ -EC13,91F and triethylamine 2.80
The reaction is carried out according to the procedure of Reference Example 2 using a dimethylformamide solution of 4C)tl containing g/. After distilling off the solvent, 1 molar aqueous citric acid solution was added, and the precipitate was collected in a furnace, washed with water,
Dry under reduced pressure and recrystallize from ethyl acetate to obtain Z-Azn-
Law-OEt 6. Get l l.
Rf値:0.71、R1値: o、s O元素分析値(
C2♂29N306として)CHN
計算値(%) 58.95 7.17 10.31実
測値(%) 58,99 7.23 10.26参考
例6
Z−Tyr−Asn−Lzu−OEtの製造Z−Azn
−Ltu−OE13.Q l fをメul)−7115
0ゴ及びI N −MCI 7.4 mlに溶解し、パ
ラジウム黒5004の存在下室温、常圧にて接触還元を
行ない、H−Ax n−Lg u−OEI −HClを
得る。Rf value: 0.71, R1 value: o, s O elemental analysis value (
(as C2♂29N306) CHN Calculated value (%) 58.95 7.17 10.31 Actual value (%) 58,99 7.23 10.26 Reference example 6 Production of Z-Tyr-Asn-Lzu-OEt Z- Azn
-Ltu-OE13. Q l f mul)-7115
The mixture was dissolved in 7.4 ml of Ogo and I N -MCI, and subjected to catalytic reduction at room temperature and normal pressure in the presence of Palladium Black 5004 to obtain H-Ax n-Lgu-OEI -HCl.
Rf値:0.26
上記”C’ 得うh 6 H−Ax n−Lt b−O
El−ECJ ft =、 、!チルホルムアミド5o
Mt及びトリエチルアミン1.03*/に溶、解し、次
ニ2−T y r−ONNS 3.35 fを加え、
室温下に20時間放置する。ジメチルホ沈殿してZ−T
yr−Azn−Ltu−OEt 3.58 f ’lt
得;S。Rf value: 0.26 Above “C’ Obtain h 6 H-Ax n-Lt b-O
El-ECJ ft =, ,! Chilformamide 5o
Dissolve in Mt and triethylamine 1.03*/, then add 2-Tyr-ONNS 3.35 f,
Leave at room temperature for 20 hours. Precipitate with dimethylpolyte and Z-T
yr-Azn-Ltu-OEt 3.58 f'lt
Profit; S.
R/値:0.73、R/値:0.82
元素分析値(C29H351N401!lとして)HN
計算値(%> 61.04 6.71 9.82実測
値(%) 60,84 6,70 9.39参考例7
Z−Tyr−Azn−Ltu−NHNH2ノ製造Z−T
yr−Axn−Ltu−OEt 2,73 fをj9)
−Lノールにて洗浄してZ−Ty r−Ax n−Lt
u −NHNH23,10fを得る。R/value: 0.73, R/value: 0.82 Elemental analysis value (as C29H351N401!l) HN Calculated value (%> 61.04 6.71 9.82 Actual value (%) 60,84 6,70 9.39 Reference Example 7 Z-Tyr-Azn-Ltu-NHNH2 production Z-T
yr-Axn-Ltu-OEt 2,73 fj9)
- Wash with L alcohol and Z-Tyr-Ax n-Lt
u-NHNH23,10f is obtained.
Bt I値:0.56、 Rf]1値:0.75元素分
析値−(C27H36N607として)CHN
計算値(%) 58,26 6.52 15.10実
測値(%) 57,91 6.56 15.12実施
例1
(a) Boc−Ltu−Gin−Ary(Tax)
−5ty−5ir −011の製造
BoC−Ltu−Gin −OHQ、g 4 fをテト
ラしドロフラン3C)ml及びN−メチル七ルホリン0
.24m1に溶解し、イソづチルクロ0ホルメイト0.
31履Iを用い、参考例2の方法に準じて行なう。テト
ラし酸で洗浄後ブタノールを留去し、メタノール−酢酸
エチルで再沈殿してBat−Ltu−Gin−Arg(
Tax)−5ir−5zr −OH1,54j’ヲ得ル
。Bt I value: 0.56, Rf]1 value: 0.75 Elemental analysis value - (as C27H36N607) CHN Calculated value (%) 58,26 6.52 15.10 Actual value (%) 57,91 6.56 15.12 Example 1 (a) Boc-Ltu-Gin-Ary (Tax)
-5ty-5ir -Production of -011
.. Dissolved in 24 ml of isobutylchloride formate 0.
The procedure is carried out in accordance with the method of Reference Example 2 using No. 31 I. After washing with tetrachloric acid, butanol was distilled off and reprecipitated with methanol-ethyl acetate to give Bat-Ltu-Gin-Arg (
Tax) -5ir-5zr -OH1,54j'.
Rf値:0.18、Rf値:0.57
元素分析値(C35H57N90.、S−H2Oトリ−
c )CHN
計算値(%) 48.77 6.90 14.62実
測値(%) 48.76 6.61 14.78(b
) H−Ltu−Gin−Ary−5zr−5tr−
OHノ製造Bo c−Lz u−Gl n−Arq (
To z )−5t r−5t r −0H1,50f
を10*/のトリ’7 JL、オ0酢酸中15分間室瀉
で放置して脱Bat化し、乾燥エーテルを加えて結晶化
し、H−Lzu−Gin−Ary(Tax)LSzr
−5tr−ORを得る。Rf値:0.04上記で得られ
るH−Ltu−Gl n’−Arg(Tax )、−5
zr−5zr−ONを液体アンモニア25m1に溶解し
・金属すトリウムのタルを加える。反応液が青色を呈し
たとき、乾燥塩化アン七ニウム1gを添加し、次いでア
ンモニアを留去する。残渣を50%酢酸に溶解し、セフ
ァデックスG−10(2,2X851、溶出液50%酢
酸)、さらにLH−20(2,2X80α、溶出液0.
001 N−HCl )にてゲJIF濾過し、精製して
H−Lzu−Gl n−Arf−5ir −5zr−O
Hを得る。Rf value: 0.18, Rf value: 0.57 Elemental analysis value (C35H57N90., S-H2O tri-
c) CHN Calculated value (%) 48.77 6.90 14.62 Actual value (%) 48.76 6.61 14.78 (b
) H-Ltu-Gin-Ary-5zr-5tr-
OH production Bo c-Lz u-Gl n-Arq (
To z )-5t r-5t r-0H1,50f
Tori'7 JL of 10 * / 000 acetic acid was allowed to stand for 15 minutes at room temperature to remove Bat, and then crystallized by adding dry ether to H-Lzu-Gin-Ary (Tax) LSzr.
-5tr-OR is obtained. Rf value: 0.04 H-Ltu-Gl n'-Arg (Tax) obtained above, -5
Dissolve zr-5zr-ON in 25 ml of liquid ammonia and add metal storium barrel. When the reaction solution turns blue, 1 g of dry am7ium chloride is added, and then the ammonia is distilled off. The residue was dissolved in 50% acetic acid, Sephadex G-10 (2,2X851, eluent 50% acetic acid) and then LH-20 (2,2X80α, eluent 0.
001 N-HCl) and purified to obtain H-Lzu-Gl n-Arf-5ir-5zr-O.
Get H.
Rf値: 0.0+、 Rf値:0.34(cv)
: −42,5°CCO,250,0,001N−MC
I )元素分析値(C23H4,N909.4 N20
. 、CH,C0OHとして)CHN
計算値(%)今1.60 7.68 17.46実測値
(%) 41.20 7.93 17.91実施例2
(a) Z−Pkt−Ltu−Gln−Arg(Ta
x) −5et−5tr −ONの製造
実施例1)”t’得られるH−Lzu−Gl n−Ar
y(Ttyz )−5ty−5tr −ON をジメ
チルホルムアミド30ゴ及びトリエチルアミン0.24
g/に溶解し、次いでZ−Pkv −0NH5Q、
77 fを加え、室温で20時間放置する0ジメチルホ
ルムアミドを留*後残渣をブタノールにて抽出し、2%
酢酸で洗浄する。ブタノール層を濃縮し、エーテルを加
えて結晶化し、得られた結晶を戸数し、熱エタノールよ
り結晶を洗浄してZ−Pke−Lzu−Gin−Arg
(Toe)−5’Jr −5zr−ON 1.40 g
を得る。Rf value: 0.0+, Rf value: 0.34 (cv)
: -42,5°CCO,250,0,001N-MC
I) Elemental analysis value (C23H4, N909.4 N20
.. , CH, COOH) CHN Calculated value (%) Now 1.60 7.68 17.46 Actual value (%) 41.20 7.93 17.91 Example 2 (a) Z-Pkt-Ltu-Gln- Arg(Ta
x) -5et-5tr -ON Production Example 1) "t' Obtained H-Lzu-Gl n-Ar
y(Ttyz)-5ty-5tr-ON with 30% of dimethylformamide and 0.24% of triethylamine.
g/, then Z-Pkv-0NH5Q,
Add 77 f and leave it at room temperature for 20 hours. After distilling off dimethylformamide*, extract the residue with butanol and dilute with 2%
Wash with acetic acid. The butanol layer was concentrated, ether was added to crystallize, the obtained crystals were separated, and the crystals were washed with hot ethanol to give Z-Pke-Lzu-Gin-Arg.
(Toe)-5'Jr-5zr-ON 1.40 g
get.
Rf値:0.22、Rf値:0.59
元素分析値(C47H64N工。O工4S−N20とし
て)CHN
計算値(%) 54,12 6.28 13.43実
測値(%) 54,42 6.38 13.84(b
) H−Pkz−Ltu−Ginl−Ary−5tr
−5zr−ORの製造
Z−Phz−Leu−Gln−Arg(Tax)−5z
r−5zr−ON20IIfを液体アシ七ニア中金厨ナ
トリウム片にて実施例1(b)と同様の方法で脱Z化、
脱Tera化し、tファy”7クスG−19、(2,2
X85cIII、溶出液10%酢酸)、さらにLH−2
0(2,2X 80nls ’溶出液0.00
1 # −HCOによるゲル濾過で精製してII−Pk
t−Lest−Gin−Ary−5et、−5zr −
OHl’ 2岬を得る。Rf value: 0.22, Rf value: 0.59 Elemental analysis value (C47H64N engineering. O engineering 4S-N20) CHN Calculated value (%) 54,12 6.28 13.43 Actual value (%) 54,42 6.38 13.84 (b
) H-Pkz-Ltu-Ginl-Ary-5tr
-Production of 5zr-ORZ-Phz-Leu-Gln-Arg(Tax)-5z
Z-removal of r-5zr-ON20IIf was carried out in the same manner as in Example 1(b) using a piece of sodium chloride in a liquid acidic solution.
De-Tera, tfay"7x G-19, (2,2
X85cIII, eluent 10% acetic acid), and further LH-2
0 (2,2X 80nls' eluate 0.00
Purified by gel filtration with 1 #-HCO to obtain II-Pk.
t-Lest-Gin-Ary-5et, -5zr -
OHL' Get 2 capes.
Rf値: 0.01 、Rf”値:0.35(a)
ニー37.36C00,249,0,001N−H(
4)
元素分析値(C32H52N工。O工。・7 N20.
CH,C00Nとして)
HN
計算値(%) 44.24 7.64 15.17実
測値(%) 44.27 ?、10 15.60実
施例3
(a) Z−Lzu−Gly−Pkz−Lzu−Gi
n−Ary(’ryz) −5zr−5zr−OHの製
造
Z−L z u −G l −y −NHNH2Q、
39 fをジメチルホルムア三ド5 ml及び6 N
−HC1/″:11士サン0.58dに溶解し1イソア
ミルナイトライド0−15g/sトリエチルア三シ0.
49wt1及びH−Pke−Ltu −Gln−Ary
(Tax)−5tr−8tr −OHl、Q Q fの
ジメチルホルムアミド30g/溶液を用いて参考例■と
同様に反応を行ない、さらにZ−Lest−Gly N
3を当量加えて4℃にて20時間反応を行なう。ブタノ
ールで抽出し、2%酢酸で洗浄後ブタノール及び酢酸を
留去し、エーテルを加えて結晶化する。Rf value: 0.01, Rf” value: 0.35 (a)
Knee 37.36C00,249,0,001N-H(
4) Elemental analysis value (C32H52N engineering. O engineering. 7 N20.
As CH, C00N) HN Calculated value (%) 44.24 7.64 15.17 Actual value (%) 44.27 ? , 10 15.60 Example 3 (a) Z-Lzu-Gly-Pkz-Lzu-Gi
Production of n-Ary('ryz)-5zr-5zr-OH Z-Lz u -G l -y -NHNH2Q,
39 f with 5 ml of dimethylformamide and 6 N
-HC1/'': 0-15 g/s of triethyl nitride dissolved in 0.58 d of triethyl nitride.
49wt1 and H-Pke-Ltu-Gln-Ary
(Tax)-5tr-8tr -OHl, Q
3 was added in an equivalent amount and the reaction was carried out at 4°C for 20 hours. After extraction with butanol and washing with 2% acetic acid, butanol and acetic acid are distilled off, and ether is added to crystallize.
結晶を枦取して熱メタノールにて結晶を洗浄し、Z−L
zu−Gly−Phz−Lzu−Gl n−Arg(T
ax )−5z、r−5zr −OHO,65fを得る
。Separate the crystals, wash them with hot methanol, and add Z-L.
zu-Gly-Phz-Lzu-Gl n-Arg(T
ax )-5z, r-5zr -OHO, 65f are obtained.
R/値i0.19、Rf値:0.60
元素分析値(C55H781′1.2’よ、S、N20
として)CHN
計算値(%) 54,44 6.64 13.85実
測値(%) 54.74 6.6j13.98(b)
H−Ltu−Gly−Pkz−Lzu−Gin−A
ry−5ir−5zr−OHの製造
Z−Lt u−Gl y −Ph t−Lt u−Gl
n−Ar q (To z )−5t r−5tr
−OH’l Q 1151を実施例1(b)と同様の方
法で脱Z化、脱Tos化し、tファデックス(1;−1
0′″=(2,2X85cIII、溶出液10%酢酸)
、さらにLH−20C2,2×80CIIl、溶出液0
.0OIA’−HCl)によるゲル濾過で精製してH−
Ltu−Gly−Pht−Ltu−Gln−Ary−5
zr−5zr−OHl l qを得るO
Rf値: 0.01、Rf値:0.40〔山〕20ニー
27.6°CCO,228,0,001N−MCI )
元素分析値(C4゜H66N工、O工、・6 H20,
CH3CO0Hとして)
CHN
計算値(%) 46.92 7.68 15.63実
測値(%) 46.89 7.25 15.51実施
例4
(a) //−Tyr−Azn−Ltu−Ltu−G
ly−Pkt−Lzaz −Gl n−Ary(Tax
)−5tr−5et−ORの製造Z−Lzu−Gl
y−Phz−Leu−Gl n−Arg(Tax )
−5zr−5zr −OH600qを)9)−JLI5
0m1/及び10%酢酸10 mlに溶解しパラジウム
50011gの存在下室温常圧下にて接触還元を行ない
H−Lzu−Gl y−Pkz−Ltu−Gl n−A
ry(Tax )−5zr−5Ir −OHを得る。
Rf値:O,Ig
Z−Tyr−Axn−Lz(、u−NHNH242Qq
lをジメチルホルムアミド5IId及び6N ++ H
CI /ジオ+寸ン 7”0.37mに溶解し、イソ
ア三ルナイトライト0、、IOg/及び) !J 工f
Jl/ 7 E :/ 0..31 ml ヲ用い、
参考例1の方法に準じてアジド体を生成させ、この溶液
をH−Ltu−Gl y−Pkz−Lzu−Gl n−
Ary(Tas )−5zr−5tr−OHのへ+サメ
チ11.リン酸トリア三ドIOg/とジメチルホルムア
ミドIoII/の混合溶液に加え、4℃にて20時間攪
拌する。ジメチルホルムアミドを留去して、残渣をブタ
ノールで抽出し、2%酢酸で洗浄後ブタノールを留去A
ry(Tos )−5t、r−5zr−OHヲメタ)
−JL、 30 、/及び10%酢酸10+/に溶解し
、室温、常圧にてパラジウムの存在下に接触還元した後
tファデックスG−25(3XI203、溶出液50%
酢酸)にてゲL il)”i過してH−Tyr−Asn
−Lzu−Lzu−Gl y −Fire−Lzu−G
l n−Arg(Tos )−5ir−5et−OH6
50岬を得る。R/value i0.19, Rf value: 0.60 Elemental analysis value (C55H781'1.2', S, N20
) CHN Calculated value (%) 54.44 6.64 13.85 Actual value (%) 54.74 6.6j13.98 (b)
H-Ltu-Gly-Pkz-Lzu-Gin-A
Production of ry-5ir-5zr-OH Z-Ltu-Gly -Ph t-Ltu-Gl
n-Ar q (Toz)-5t r-5tr
-OH'l Q 1151 was de-Zed and de-Tosized in the same manner as in Example 1(b), and tfadex (1; -1
0′″=(2,2X85cIII, eluent 10% acetic acid)
, further LH-20C2, 2 x 80CIIl, eluent 0
.. Purified by gel filtration with 0OIA'-HCl)
Ltu-Gly-Pht-Ltu-Gln-Ary-5
OR to obtain zr-5zr-OHl lq Rf value: 0.01, Rf value: 0.40 [mountain] 20 knee 27.6°CCO, 228, 0,001N-MCI)
Elemental analysis value (C4゜H66N engineering, O engineering, ・6 H20,
CHN Calculated value (%) 46.92 7.68 15.63 Actual value (%) 46.89 7.25 15.51 Example 4 (a) //-Tyr-Azn-Ltu-Ltu-G
ly-Pkt-Lzaz-Gl n-Ary(Tax
)-5tr-5et-OR production Z-Lzu-Gl
y-Phz-Leu-Gln-Arg(Tax)
-5zr-5zr -OH600q)9)-JLI5
H-Lzu-Gly-Pkz-Ltu-Gln-A was dissolved in 10 ml of 0ml/10% acetic acid and subjected to catalytic reduction at room temperature and normal pressure in the presence of 50011g of palladium.
ry(Tax)-5zr-5Ir-OH is obtained.
Rf value: O, Ig Z-Tyr-Axn-Lz (, u-NHNH242Qq
l to dimethylformamide 5IId and 6N ++ H
CI/Geo+Dimension 7" Dissolved in 0.37m, Isooatrinitrite 0,, IOg/and) !J Engineering f
Jl/7 E:/0. .. Use 31 ml,
An azide compound was produced according to the method of Reference Example 1, and this solution was converted into H-Ltu-Gly-Pkz-Lzu-Gl n-
Ary(Tas)-5zr-5tr-OH+Samechi11. It is added to a mixed solution of phosphoric acid triazide IOg/ and dimethylformamide IoII/ and stirred at 4°C for 20 hours. Dimethylformamide was distilled off, the residue was extracted with butanol, and after washing with 2% acetic acid, the butanol was distilled off.
ry(Tos)-5t, r-5zr-OH ometa)
- JL, 30, / and 10% acetic acid 10 + /, after catalytic reduction in the presence of palladium at room temperature and normal pressure, Fadex G-25 (3XI203, eluent 50%
H-Tyr-Asn
-Lzu-Lzu-Gly -Fire-Lzu-G
ln-Arg(Tos)-5ir-5et-OH6
Obtain 50 capes.
Rf値:0.05、Rf値:0.53
元素分析値(C66H98N♂60工、S・2H20と
して)CHN
計算値(%) 53,28 6.91 15.06実
測値(%”) 53,10 6.43 14.84(
b) H−Tyr−Asn−Lzu−Gly−Phi
−Ltu−Gin−Arq、−5tr−5zr−OH(
D製造
上記(a)で得られるH−Tyr−As n−Lzu−
Lzu−Gl y−Pht−Ltu−Gl n−Arq
(Tos )−5t r−5zr −OR・を実施例t
<b>と同様の方法で脱Tos化し、tファデックス
G−10(2,2X85cIII、溶出液10%酢酸)
、さらニLH−20(2,2X80CM%0.001
N−MCI >によるゲル沖過で精製してH−Tyr−
Asn−Lzu−C1y−Phi−Lz、u−Gln−
Ary−5tr−5tr−OH9qを得る。Rf value: 0.05, Rf value: 0.53 Elemental analysis value (as C66H98N♂60 engineering, S・2H20) CHN Calculated value (%) 53,28 6.91 15.06 Actual value (%") 53, 10 6.43 14.84 (
b) H-Tyr-Asn-Lzu-Gly-Phi
-Ltu-Gin-Arq, -5tr-5zr-OH (
D Production H-Tyr-As n-Lzu- obtained in above (a)
Lzu-Gl y-Pht-Ltu-Gl n-Arq
(Tos)-5t r-5zr -OR
Tos was removed in the same manner as <b>, and tFadex G-10 (2,2X85cIII, eluent 10% acetic acid)
, Sarani LH-20 (2,2X80CM%0.001
Purified by gel filtration with N-MCI > H-Tyr-
Asn-Lzu-C1y-Phi-Lz, u-Gln-
Ary-5tr-5tr-OH9q is obtained.
RyI値 : 0.0+S R1”値 :0.42〔
出) ニー24.3°CCO,078、O,0OI
N−11CI )元素分析値(C59H92N□。O工
、、 15 R20,CH3CO0Hとして)
CHN
計算値(%) 45.01 ?、80 13.77
実測値(%) 45.21 7.31 14.22実
施例5
(a) Z−Mzl−5tr−Tyr−Asn−Lt
u−Ltu−Gly −Phg−Ltu−Gl n−A
rq(Tax )−5tr−5zr−OHの製造
Z−M、1−5t’r−NHNHl 59 q/をジメ
チJL、ホルムアミド5 ml及び6N、HC4/ジオ
+サン0.21M/に溶解し、イソア三ルナイトライト
0.055m1及゛びトリエチルアミン0.17g/を
用いて参考例1の方法に準じてアジド体を生成させ、次
いでこの溶液をH−Ty r−As n−Lx u−L
x u−Gl y−Pkt−Lx u −Gln−Ar
g(Tax)−5ty−5zr−OH3Q Q Ilg
、ジメチルホルムアミド5 ml 及びへ十すメチルリ
ン酸トリアミド5譚lの混合溶液に加え、4°Cにて2
4時間攪拌する。さらにZ−Net−5et−NHNH
2ヲ31811v加え、4°Cにて72時間攪拌する。RyI value: 0.0+S R1” value: 0.42 [
Out) Knee 24.3°CCO,078,O,0OI
N-11CI) Elemental analysis value (C59H92N□.O engineering,, 15 R20, CH3CO0H) CHN Calculated value (%) 45.01? ,80 13.77
Actual value (%) 45.21 7.31 14.22 Example 5 (a) Z-Mzl-5tr-Tyr-Asn-Lt
u-Ltu-Gly-Phg-Ltu-Gl n-A
Preparation of rq(Tax)-5tr-5zr-OH Z-M, 1-5t'r-NHNHl 59 q/ was dissolved in dimethyJL, formamide 5 ml and 6N, HC4/dio+san 0.21 M/ An azide compound was produced according to the method of Reference Example 1 using 0.055 ml of trinitrite and 0.17 g of triethylamine, and then this solution was converted into H-Tyr-As n-Lx u-L.
x u-Gly-Pkt-Lx u-Gln-Ar
g(Tax)-5ty-5zr-OH3Q Q Ilg
, 5 ml of dimethylformamide, and 5 liters of dimethylphosphoric acid triamide, and heated at 4°C for 2 hours.
Stir for 4 hours. Furthermore, Z-Net-5et-NHNH
Add 2.31811v and stir at 4°C for 72 hours.
実施例4(a)と同様にして精製を行ない、Z−Hz
t −5t r−Tyr−Azn−Lzu−Ltu−G
l y−Pkz−Lzu−Gl n −Ary(Tos
)−5tr−5zr−ONを得る。Purification was carried out in the same manner as in Example 4(a), and Z-Hz
t -5t r-Tyr-Azn-Lzu-Ltu-G
ly-Pkz-Lzu-Gln-Ary(Tos
)-5tr-5zr-ON is obtained.
(h) H−Met−5zr−Tyr−Asn−Lz
u−Lzu−Gly −Pkz−Lx u−Gl n−
Arg−5t r−5t r −ON (7)製造上記
(a)で得られるZ−Hz 1−5t r−Ty r−
Ax n−Lx u=Lz u−Gl y−Pit−L
x u−Gl n−Arg、(To x )−5t r
−5zr −ORを実施例1 (b)と同様の方法で
脱Z化、脱Tax化を行ない、tファデックスG−25
C3X12(111、溶出液50%酢酸)、さらにLH
・−20(2X85c!II、溶出液0.001N−H
CII )にて精製し、H,−Me t−5tr−Ty
r−Axn−Lzu−Lzu−Gl y−Pht、−L
zu−Gln−Ary−5Ir−5tr−OHI I
9qを得る。(h) H-Met-5zr-Tyr-Asn-Lz
u-Lzu-Gly -Pkz-Lx u-Gl n-
Arg-5t r-5t r -ON (7) Production Z-Hz 1-5t r-Tyr- obtained in above (a)
Ax n-Lx u=Lz u-Gly-Pit-L
x u-Gl n-Arg, (T x )-5tr
-5zr-OR was de-Zed and de-taxed in the same manner as in Example 1 (b), and tfadex G-25
C3X12 (111, eluent 50% acetic acid), plus LH
・-20 (2X85c!II, eluent 0.001N-H
H,-Me t-5tr-Ty
r-Axn-Lzu-Lzu-Gly-Pht, -L
zu-Gln-Ary-5Ir-5tr-OHI I
Get 9q.
Rf値: 0.01、Rf値: 0.45(d、)20
: −15,7°(CQ、25今、0.001N−
MCI)元素分析値(C67H工。6N工8’2゜S、
5 R20,CH3CO0Hとして)
CHN
計算値(%) 49.75 7.26 15.13実
測値(%) 49.80 6.92 14.91アミ
ノ酸分析値
All: 0.95、Str:3.15、Gl n
: 1.03、Met: 0.92、Gly:1.05
、Lzu:3.08、TFr: 1.00、Phi
:Q、 98、Art:0.96く抗原の製造〉
実施例6
上記実施例I Cb)で得られるペプチド(以下「ぺづ
チドA」と略記する)loIlF及び牛血清アルづミシ
(以下「BSA」と略記する)50gIgを酢酸アyf
ニウム緩衝液(0,Ivニル、/’H7,0) 2ml
にとかす。この溶液に0.1tルのタルタールアルヂし
ド溶液0.11g/を加え、室温で5時間攪拌する。そ
の後反応混合物を48時間、4°Cで水14で透析する
。透析中5回水を交換する。その後、ぺづチドー蛋白質
複合体を含有する溶液を凍結乾燥してしトβ型インター
フエ0ン抗原(以下「抗原I」と略記する)45III
Iを得る0実施例7
上記実施例2(b)で得られるペプチド(以下「ペプチ
ドB」と略記するン5呼及びB5A25q/を酢酸アン
モニウム緩衝液(0,1tル、戸#7.0)2 mlに
とかす。この溶液に0.1モルのタルタールアルデヒド
溶液0.11g/を加え、室温で5時間攪ドー蛋白質複
合体を含む溶液を凍結乾燥してしトβ型インター2工0
:J抗原(以下「抗原罵」と略記する)23Wを得る。Rf value: 0.01, Rf value: 0.45 (d,)20
: -15,7°(CQ, 25 now, 0.001N-
MCI) Elemental analysis value (C67H engineering. 6N engineering 8'2°S,
5 R20, CH3CO0H) CHN Calculated value (%) 49.75 7.26 15.13 Actual value (%) 49.80 6.92 14.91 Amino acid analysis value All: 0.95, Str: 3.15, Gl n
: 1.03, Met: 0.92, Gly: 1.05
, Lzu: 3.08, TFr: 1.00, Phi
:Q, 98, Art: 0.96 Preparation of Antigen> Example 6 The peptide (hereinafter abbreviated as "Pettide A") obtained from the above Example I Cb) loIIF and bovine serum Alzumishi (hereinafter " (abbreviated as “BSA”) 50gIg
Ni buffer (0, Iv nil, /'H7,0) 2ml
Laugh. 0.1 t of tartar aldide solution (0.11 g) was added to this solution, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. The reaction mixture is then dialyzed for 48 hours at 4° C. against water 14. Change the water 5 times during dialysis. Thereafter, the solution containing the protein complex was lyophilized to obtain β-type interferon antigen (hereinafter abbreviated as "antigen I") 45III.
Example 7: The peptide obtained in Example 2(b) above (hereinafter abbreviated as "Peptide B") and B5A25q/ were added to ammonium acetate buffer (0.1 t, #7.0). Add 0.11 g of 0.1 molar tartaraldehyde solution to this solution, stir at room temperature for 5 hours, and freeze-dry the solution containing the protein complex.
:J antigen (hereinafter abbreviated as "antigen") 23W is obtained.
実施例8
上記実施例3(b)で得られるぺづチド(以下「ペプチ
ドC」と略記する)4q及びB5A15qを酢酸アシ七
ニウム緩衝液(0,1tル、戸//7.0)2漏lにと
かす。この溶液に0.1七ルのタルタールアルデヒド溶
液0.11gtを加え、室温で5時間攪拌する。その後
反応混合物を48時間、4℃で水2で透析する。透析中
5回水を來換する。その後、ペプチド−蛋白質複合体を
含む溶液を凍結乾燥してヒトβ型インターフエ0ン抗原
(以下「抗原璽」と略記する)17岬を得る。Example 8 Peptide (hereinafter abbreviated as "peptide C") 4q and B5A15q obtained in Example 3(b) above were added to acetate buffer solution (0.1 t//7.0) 2 Dissolve the leakage. Add 0.11 gt of 0.17 l tartaraldehyde solution to this solution and stir at room temperature for 5 hours. The reaction mixture is then dialyzed for 48 hours at 4° C. against 2 portions of water. Water was replaced 5 times during dialysis. Thereafter, the solution containing the peptide-protein complex is freeze-dried to obtain human β-type interferon antigen (hereinafter abbreviated as "antigen tablet") 17 cape.
実施例9
上記実施例4(b)で得られるペプチド(以下「ぺづチ
ドD」と略記する)今ダ及びB5A12q/を酢酸アシ
七ニウム緩衝液(0,1’Eル、pHT、0)211j
に溶かす。この溶液に0.1モルのタルタール オ。Example 9 The peptide obtained in Example 4(b) above (hereinafter abbreviated as "Peptide D") and B5A12q/ were added to acetanium acetate buffer (0,1'El, pHT, 0). 211j
dissolve in Add 0.1 mol of tartar to this solution.
アルデヒド溶液0.11−を加え、室温で5時間攪拌す
る。その後反応−合物を48時間、4℃で水1gで透析
する。透析中5回水を交換する。その後、ペプチド−蛋
白質複合体を含む溶液を凍結乾燥してヒトβ型イシター
フエ0ン抗原(以下「抗原■」と略記する)14ダを得
る。Add 0.11 - of aldehyde solution and stir at room temperature for 5 hours. The reaction mixture is then dialyzed for 48 hours at 4 DEG C. against 1 g of water. Change the water 5 times during dialysis. Thereafter, the solution containing the peptide-protein complex was freeze-dried to obtain 14 d of human β-type isitaphen antigen (hereinafter abbreviated as "antigen 2").
実施例10
上記実施例5(b)で得られるペプチド(以下「ぺづチ
ドE」と略記する)811jg及びB5A12q/を酢
酸アンモニウム緩衝液(0,l七ル為戸H7,O)2
mlに溶かす。この溶液に0.1七ルのりルタールアル
デヒド溶液0.11g/を加え、室温で5時間攪拌する
。その後、反応混合物を48時間、今°Cで水11で透
析する。透析中5回水を交換する。その後、べづチドー
蛋白質複合体を含む溶液を凍結乾燥してヒトβ型インタ
ーフエ0ン抗原(以下「抗原V」と略記する)31岬を
得る。Example 10 811jg of the peptide obtained in Example 5(b) above (hereinafter abbreviated as "petutide E") and 12q/B5A were added to an ammonium acetate buffer (0.1 L Tamedo H7,O)2
Dissolve in ml. To this solution was added 0.11 g of 0.17 rutal aldehyde solution, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. The reaction mixture is then dialyzed for 48 hours at 11°C in water. Change the water 5 times during dialysis. Thereafter, the solution containing the beta-protein complex is freeze-dried to obtain human β-type interferon antigen (hereinafter abbreviated as "antigen V") 31 cape.
実施例11
ぺづチドE8■及びB5A25q)を水4s+/ニ溶解
する。この溶液にジシク0゛へ+シルカーネジイミド(
DCC)を加え1室温で5時間攪拌する。Example 11 Peptide E8■ and B5A25q) are dissolved in 4s+/2 of water. Add silica diimide to this solution + silcaredimide (
DCC) and stirred at room temperature for 5 hours.
次に反応混合物を水21用い4℃にて48時間要して透
析する。透析中5回水を交換する。その後ペプチド−蛋
白質複合体を含む溶液を凍結乾燥してヒトβ型インター
フエ0シ抗原(以下「抗原■」と略記する)29岬を得
る。The reaction mixture is then dialyzed against water at 4° C. for 48 hours. Change the water 5 times during dialysis. Thereafter, the solution containing the peptide-protein complex is freeze-dried to obtain human β-type interferon antigen (hereinafter abbreviated as "antigen 2") 29 cape.
く抗体の製造〉
実施例12
実施例6で得られる抗原I 250μfを1.5m+1
の生理食塩水に溶解後2にフロイシドの補助液1.5m
lを加えて調製した懸濁液を、4羽の兎(2,5〜3.
Okg)に皮下投与し、2週間毎に6回同量投与する。Production of antibodies> Example 12 250 μf of antigen I obtained in Example 6 was added to 1.5 m+1
After dissolving in physiological saline, add 1.5 m of Furuiside auxiliary solution.
The suspension prepared by adding 1.1 liters of
The same amount is administered 6 times every 2 weeks.
更にその後1カ月毎に3回、最初投与した量と同量e投
与する。最終投与後7日経過してのち試験動物から採血
し、遠心分離して抗血清を採取し、本発明のしトβ型イ
シターフェ0シ抗体(以下「抗体!」と略記する)を得
る。Thereafter, the same amount as the first dose was administered three times every month. Seven days after the final administration, blood is collected from the test animal and centrifuged to collect antiserum to obtain the β-type isitafe antibody of the present invention (hereinafter abbreviated as "antibody!").
実施例13
実施例7で得られる抗原II 25μfを1.5s/
の糟理食塩水に溶解後之にフロイシドの補助液1.5s
/を加えて調製した懸濁液を、4羽の兎(2,5〜3、
0 kg )に皮下投与し、2週間毎に6回同量投与す
る。更にその後1カ月毎に3回、最初投与した量と同量
を投与する。最終投与後7日経過してのち試験動物から
採血し、遠心分離して抗血清を採取し、本発明のしトβ
型イシターフエOシ抗体(以下「抗体■」と略記する)
を得る。Example 13 Antigen II 25 μf obtained in Example 7 was heated for 1.5 s/
After dissolving in saline solution, add 1.5 s of fluoroside auxiliary solution.
The suspension prepared by adding / to 4 rabbits (2, 5 to 3,
(0 kg) subcutaneously, and the same amount is administered 6 times every 2 weeks. Thereafter, the same amount as the first dose was administered three times every month. Seven days after the final administration, blood was collected from the test animals and centrifuged to collect antiserum.
Type Ishitafue Oshi antibody (hereinafter abbreviated as “antibody ■”)
get.
実施例14
実施例8で得られる抗原III 25μfを1.5s
/の生理食塩水に溶解後之にフロイシドの補助液1.5
s/を加えて調製した懸濁液を、4羽の兎(2,5〜3
.0#)に皮下投与し12週間毎に6回同量投与する。Example 14 Antigen III obtained in Example 8 25 μf for 1.5 s
/ After dissolving in physiological saline, add 1.5 ml of Supplementary Solution of Furuiside.
The suspension prepared by adding s/
.. 0#), and the same amount is administered 6 times every 12 weeks.
更にその後1カ月毎に3回、最初投与した量と同量を投
与する。最終投与後7日経過してのち試験動物から採血
し、遠心分離して抗血清を採取し、本発明のしトβ型イ
シターフエ0ン抗体(以下「抗体■」と略記する)を得
る。Thereafter, the same amount as the first dose was administered three times every month. Seven days after the final administration, blood is collected from the test animal and centrifuged to collect antiserum to obtain the β-type isiterfeon antibody of the present invention (hereinafter abbreviated as "antibody ■").
実施例15
実施例9で得られる抗原N 25μfを1.5s/の
生理食塩水に溶解後之に70インドの補助液1.5s/
を加えて調製した懸濁液を、4羽の兎(2,5〜3.0
#)に皮下投与し、2週間毎に6回同量投与する。更に
その後1カ月毎に3回1最初投与した量と同量を投与す
る。最終投与後7日経過してのち試験動物から採血し、
遠心分離して抗血清を採取し、本発明のヒトβ型イシタ
ーフエ0ン抗体(以下「抗体■」と略記する)を得る。Example 15 After dissolving 25 μf of the antigen N obtained in Example 9 in 1.5 s/ of physiological saline, an auxiliary solution of 70 indica (1.5 s/) was added.
The suspension prepared by adding
#), and the same amount is administered 6 times every 2 weeks. Thereafter, the same amount as the initial dose is administered three times every month. Blood was collected from the test animals 7 days after the final administration,
The antiserum is collected by centrifugation to obtain the human β-type isiterfeon antibody of the present invention (hereinafter abbreviated as "antibody ■").
実施例16
実i例10r116t14抗原V 251tfltt
1.5s/の生理食塩水に溶解後之に70インドの補助
液1.5s/を加えて調製した懸濁液をS4羽の兎(2
,5〜3.0 kg )に皮下投与し、2週間毎に6回
同量投与する。更にその後1カ月毎に3回、最初投与し
た量と同量を投与する。最終投与後7日経過してのち試
験動物から採血し1.遠心分離して抗血清を採取し、本
発明のしトβ型イシターフエ0シ抗体(以下「抗体■」
と略記する)を得る。Example 16 Example 10r116t14 antigen V 251tfltt
After dissolving in physiological saline at 1.5 s/mL, a suspension prepared by adding 1.5 s/mL of 70% Indian auxiliary solution was added to S4 rabbits (2
, 5-3.0 kg), and the same amount is administered six times every two weeks. Thereafter, the same amount as the first dose was administered three times every month. Seven days after the final administration, blood was collected from the test animals.1. The antiserum was collected by centrifugation, and the antiserum was collected, and the antiserum was collected, and the antiserum was collected, and the antiserum was collected.
) is obtained.
実施例17
実施例11で得られる抗原■を用い、上記実施例12と
同様に処理すると、高力価でヒトβ型インターフエ0ン
に特異性を有する抗体(以下[抗体Y」と略記する)が
得られる。Example 17 Using antigen 1 obtained in Example 11 and treating in the same manner as in Example 12, a high titer antibody (hereinafter abbreviated as [antibody Y]) having specificity for human β-type interferon was produced. ) is obtained.
実施例18
0標識ペプチドの製造
(1) //−Met−5tr−Tyr−Asn−L
zu−Ltu−Gly −Phe−Law−Gl n−
Arg−5tr−5zr−ORをり0ラミシTを用いる
方法で標識化する。Example 18 Production of 0-labeled peptide (1) //-Met-5tr-Tyr-Asn-L
zu-Ltu-Gly -Phe-Law-Gl n-
Arg-5tr-5zr-OR is labeled using a method using RomiT.
即ち上記へプチド5μfの0.2tルのリシ酸塩緩衝液
(戸H7,4) 20μlに〔125夏) No (M
EN)lマイク0+ユーリーの0.25ルリシ酸塩緩衝
液を加え・次にりOラE y 73.5 */mlo
O,2’e Lリシ酸塩緩衝液20μlを加える。室温
で20秒間放置して2.4岬/ゴの0.2ルリシ酸塩緩
衝液のメタ重亜硫酸ナトリウム(# a2 s2 o5
)の50μ1012Mリシ酸塩緩衝液を加えること
で反応を終わらせる。反応混合物をディージ(DEAE
)−七ファデックスA−25のカラム(1,OX3(1
m)にかける(溶出液0.1%BSA及び0.O1%#
a7”3 を含む0.1七ルトリスー塩醗緩衝液、戸
H8,6)。第1フラクシヨンをイオン交換り0マドシ
ラフイーで精製して Iで標識された上記ぺづチドを
得る。That is, add 5 μf of the above heptide to 20 μl of 0.2 t of lysinate buffer (door H7, 4) [125 Summer] No (M
EN) l Mike 0 + Add Ury's 0.25 luricate buffer, then Ola E y 73.5 */mlo
Add 20 μl of O,2'e L lysinate buffer. Sodium metabisulfite (#a2 s2 o5
Terminate the reaction by adding 50 μl of 10 M lysinate buffer. The reaction mixture was diluted with DEAE
) - Seven Fadex A-25 columns (1, OX3 (1
m) (eluent 0.1% BSA and 0.01% #
0.17 lutris-salt buffer containing a7''3 (H8,6). The first fraction was purified by ion exchange using 0.0-molecular fluoride to obtain the above peptide labeled with I.
(2) H−Met−5zr−Tyr−Azn−Lz
u−Ltsi−Gly −Pkt−Lzu−Gl n−
Arg−5t r−5t r−ONをり0ラミシTを用
いる方法で標識化する。(2) H-Met-5zr-Tyr-Azn-Lz
u-Ltsi-Gly-Pkt-Lzu-Gl n-
Arg-5t r-5t r-ON is labeled by a method using rayic acid T.
即ち上記ペプチド5μfの0.2七ルのリン酸塩緩衝液
(///7.4)20μlに(1)JVa(MEN)1
?イクO牛11J−の0.21mルリン削塩緩衝液を加
え、次にり6ラミシT3.5W/ゴの0.2七ルリン酸
塩緩衝液20μlを加える◎ 室温で20秒間放置し寸
。That is, (1) JVa (MEN) 1 was added to 20 μl of 0.27 μl phosphate buffer (///7.4) containing 5 μf of the above peptide.
? Add 0.21 ml of Iku Ogyu 11J- lurin salt reduction buffer, then add 20 µl of 0.27 lurin phosphate buffer of 6 Lamisi T3.5W/G. Leave it for 20 seconds at room temperature.
2、、4sf/鱈lの0.2Mリン酸塩緩衝液のメタ重
亜硫酸tトリ、l’)&、(NL!S、、05) (D
50 p l 0.2 M !J :/酸塩緩衝液を
加えることで反応を終わらせる。反応混合物を5p−p
ファデックスC−25のカラム(1,OX3(1m)に
かける(溶出液50ミリtルリン醗塩緩衝液)0第4フ
ラクシヨンが125 I で標識された上記へづチド
のフラクションである。2,,4sf/l of cod in 0.2M phosphate buffer, metabisulfite tri,l')&,(NL!S,,05)(D
50 pl 0.2 M! J:/Terminate the reaction by adding acid salt buffer. 5p-p reaction mixture
The fourth fraction was applied to a Fadex C-25 column (1, OX3 (1 m) (eluent: 50 ml lurine salt buffer)), which was the fraction of the above heptide labeled with 125 I.
0℃価の測定 上記で得られる抗体の力価を次の通り測定する。Measurement of 0℃ value The titer of the antibody obtained above is measured as follows.
即ち抗体をそれぞれ生理食塩水で10% 102.10
’、10 .10 ・・・・倍に希釈(イニシャル)
し1こ工25
れらの夫々100゛μ4に、! 標識ペプチド(上記
で得られる標識ペプチドを約1万ppmになるように希
釈したもの) O,I ml及び0.1七ルリン酸塩緩
衝液(pH−7,4) (0,1%、BSA、 Q、1
5モル塩化ナトリウム及び0.01%NaN3 を含
む〕0.2g/を加え、4℃で24時間イン士ユベート
し、工25
生成した抗体と1 標識抗原との結合体を、ヂ+スト
ランー活性炭法及び遠心分離法(4℃、15分間、30
00 rplpl )により未反応(結合し25
ない)I 標識ペプチドから分離し、その放射線をカ
ウントし、各希釈濃度における抗体のl標識ペプチドと
の結合率(幻を測定する。縦軸に工25
抗体のl 標識ペプチドとの結合率(%)及び横軸に
抗体の希釈倍率(イニシャル濃度)をとり、各々の濃度
において結合率をづ0ツトする。結合率が50%とな、
る抗体の希釈倍率即ち抗体の力価を求めると各々次の通
りである。That is, each antibody was dissolved in physiological saline at 10% 102.10
', 10. 10...Diluted by 2 times (initial)
100゛μ4 of each of them! Labeled peptide (the labeled peptide obtained above was diluted to about 10,000 ppm) O.I ml and 0.1 heptaphosphate buffer (pH-7.4) (0.1%, BSA , Q, 1
0.2 g/containing 5 mol sodium chloride and 0.01% NaN3 was added and incubated at 4°C for 24 hours. and centrifugation method (4°C, 15 minutes, 30 minutes)
00 rplpl) to separate from the unreacted (unbound) I-labeled peptide, count the radiation, and measure the binding rate (illusion) of the antibody to the I-labeled peptide at each dilution concentration. Take the binding rate (%) with the labeled peptide and the dilution factor (initial concentration) of the antibody on the horizontal axis, and calculate the binding rate at each concentration.When the binding rate is 50%,
The dilution ratio of each antibody, that is, the titer of the antibody, is determined as follows.
抗体 力価
抗体V 52000
抗体Vl 100000以上
O抗体のしトβ型イシターフエ0シ特異性試験供試試料
として各種濃度のしトβ型インターフェロン(東京都総
合臨床研究所製、比活性3X106U/WIIプロテイ
ン)−、シトβ型インターフエ0ンの第1〜13番のべ
づチド鎖及びしトロ型インターフエ0ン(林原研究所製
、L−戸hablazlaid IntIrferes
、 Let、No、800928 )を使用する。Antibody titer Antibody V 52,000 Antibody Vl 100,000 or higher )-, the 1st to 13th betutide chains of cytoβ-type interferon and cytoto-β-type interferon (manufactured by Hayashibara Research Institute, L-dohablazlaid IntIrferes)
, Let, No. 800928).
また標準希釈剤として0.1%BSA。Also, 0.1% BSA as a standard diluent.
0.15eLNaC6及び0.01%のNaN5 を含
む、0.1モルリン酸ナトリウム緩衝液(戸#7.4)
を使用する。0.1 molar sodium phosphate buffer containing 0.15 eL NaC6 and 0.01% NaN5 (door #7.4)
use.
各々の試験管に、標準希釈剤0−2 me s供試試料
0− I ml %実施例16で得られる抗体V O,
l ml (カニ2う
価52000)及びl 標識ペプチド(上記で得られ
る標識ペプチドを約17jrpmになるように希釈した
もの) 0.1 dを入れ、4°Cで48時間イン士ユ
ベートした後、ノーマルヒツジ血清(ntyrmal
5heep slrum ) を0.1 ml加え、
次いでデ+ストラシで被膜した活性炭の懸濁液0.5
mlを加え、4°Cで30分間放置し、次に4℃、30
00rpmの条件下に30分間遠心分離を行ない、抗体
工25
とl 標識ペプチドとの結合体及び未反応(結25
合しない)l 標識ぺづチドを分離し、その放射線を
カウントし、用いた抗体の力価に相当する結合率(Bo
) を100%′として、各供試試料の濃125′
□
度及び希釈率における抗体と1 標識ペプチドとの結
合体■の百分率を求める。得られる結果を第1図に示す
。第1図中縦軸は結合%(B / B 。In each test tube, add standard diluent 0-2 mes test sample 0-I ml% antibody VO obtained in Example 16,
After adding 0.1 ml of lml (labeled peptide obtained above and diluting the labeled peptide obtained above to approximately 17 rpm) and incubating at 4°C for 48 hours, Normal sheep serum (ntyrmal)
Add 0.1 ml of 5heep slrum),
Then a suspension of activated carbon coated with De+Strashi 0.5
ml, leave at 4°C for 30 minutes, then incubate at 4°C for 30 minutes.
Centrifugation was performed for 30 minutes at 00 rpm to separate the conjugate of the antibody 25 and the l-labeled peptide and the unreacted (non-binding) l-labeled peptide, and the radiation was counted, and the amount of the antibody used was determined. The binding rate (Bo
) as 100%', the concentration of each test sample is 125'
□ Determine the percentage of the conjugate ■ between the antibody and the labeled peptide at each concentration and dilution rate. The results obtained are shown in FIG. The vertical axis in Figure 1 is the binding percentage (B/B).
X100)を、横軸は供試試料(しトβ型インターフエ
0ン第1−第13番ペプチド鎖、ヒトβ型インターフエ
0シ及びしトd型イシターフエ0ン)の濃度を示す。ま
た該図において曲S(イ)はしトβ型インターフェ0ン
の第1−13番のペプチド鎖を、曲線Oはしトβ型イシ
ターフエ0ンを、曲線09はしトη型インターフエ0ン
を夫々示す。第1図より抗体Vは、ヒトd型イシターフ
エ0シに対する反応性としトβ型イシターフェ0ンに対
する反応性において明確に区別される曲線を示し、この
ことよりヒト品型インターフェ0ンとは3.7×10
ユニット/譚jまで、交叉しない特異性の高い抗体であ
ることが判る。X100), and the horizontal axis shows the concentration of the test sample (human β-type interferon 1 to 13th peptide chains, human β-type interferon and human d-type interferon). In addition, in the figure, the song S (a) represents the 1st to 13th peptide chains of the β-type interferon 0, the curve O represents the peptide chain of the β-type interferon 0, and the curve 09 represents the peptide chains of the η-type interferon 0. 0n is shown respectively. From FIG. 1, antibody V shows clearly distinct curves in its reactivity to human d-type interferon and to β-type interferon. .7×10
It can be seen that it is a highly specific antibody with no cross-over up to the unit/tan.
また上記と同様にして抗体■についてもヒトβ型イシタ
ーフエ0シ特異性試験を行なう。得られる結果を第2図
に示す。Further, in the same manner as above, antibody (2) is also tested for specificity of human β-type protein. The results obtained are shown in FIG.
第2図は抗体■の特異性を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the specificity of antibody ■.
第2図中縦軸は結合96CB/BO×100 ) を
、横軸は供試試料(ヒトβ型イシターフエ0シ第1〜1
3番ぺづチド鎖、しトβ型インターフエ0シ及びヒトα
型イシターフエ0シ)の濃度を示し、また曲線に)はヒ
トβ型イシターフェ0シの第1〜13番のべづチド鎖を
、曲線(へ)はヒトβ型イ、ターフエ0シを、曲線(へ
)はヒトα型インターフエ0シを夫々示す。In Fig. 2, the vertical axis represents the bond 96CB/BO x 100), and the horizontal axis represents the test sample (human β-type
3rd peptide chain, human β-type interferon 0 and human α
In addition, the curve () shows the concentration of human β-type Isitafe 0, the 1st to 13th bezutide chains of human β-type Isitafe 0, and the curve (H) shows the concentration of human β-type I, Taaffe 0. (f) indicates human α-type interferon 0, respectively.
また各々の試験管に前記で述べた標準希釈剤Q、2g1
1実施例2.3及び今で得たべづチド0.1ml、抗体
V又1dMO,Im及び1251 標識ペプチド0.1
g+/を入れ、前記と同じ条件で反応させる。しトβ型
イシターフェ0シ第1〜13番のペプチド鎖から得られ
た抗体V又は■としトβ型イ7シターフエ0シ第1−1
3番のペプチドとの結合反応性を100%としたときの
、それぞれのペプチドの結合形を第1表に示す。Also, add 2 g of the standard diluent Q mentioned above to each test tube.
1 Example 2.3 and now obtained Bezutide 0.1 ml, antibody V or 1 dMO, Im and 1251 labeled peptide 0.1
Add g+/ and react under the same conditions as above. Antibody V obtained from peptide chains Nos. 1 to 13 of β-type Isitaphe 0 or 1-1
Table 1 shows the binding form of each peptide, assuming that the binding reactivity with peptide No. 3 is 100%.
第 1 表
0感度測定
各々の試験管に、標準希釈剤0.21dlニドβ型イン
ターフエ0ン第1−13番ペプチド鎖0.1g/、実施
例16で得られる抗体■又は実施例17で得られる抗体
MO,Ig/及び■125標識ペプチド(上記で得られ
る標識ペプチドを約1万tpmになるように希釈したも
の)O,I+wlを入れ、4°Cで48時間イシ+ユベ
ートした後、ノーマルヒツジ血清を0.1 m加え、次
いでヂ+ストランで被膜した活性炭の懸濁液0.5wl
を加え、4°Cで30分間放置し、次に4°CC130
00rpの条件下に30分間遠心分離を行ない、抗体と
1125標識ペプチドとの結合体及び未反応(結合しな
い)l 標識べづチ25
ドを分離し、その放射線をカウントし、用いた抗体の力
価に相当する結合率(Bo )を100%として、各供
試試料の濃度及び希釈率における抗体と1125標識□
ペプチドとの結合竺■の百分率を求める。得られる結果
を第3図に示す。第3図中縦軸は結合%(−B/Box
lQO)を、横軸はヒトβ型イシターフエ0シ第1〜1
3番ぺづチド鎖の濃度を示す。原図において曲線(ト)
は抗体■を用いたもの、曲線(イ)は抗体■を用いたも
のである。Table 1 Sensitivity measurement In each test tube, add 0.21 dl of standard diluent, 0.1 g of peptide chains 1 to 13 of Nido β-type interferon, and the antibody obtained in Example 16 or the antibody obtained in Example 17. The obtained antibodies MO, Ig/ and ■125-labeled peptide (the labeled peptide obtained above was diluted to about 10,000 tpm) O, I + wl were added and incubated at 4°C for 48 hours. Add 0.1 m of normal sheep serum, then add 0.5 wl of activated carbon suspension coated with Di+Stran.
was added, left at 4°C for 30 minutes, then heated at 4°C at 130°C.
Centrifugation was performed for 30 minutes at 00 rpm to separate the conjugate of the antibody and the 1125-labeled peptide and the unreacted (unbound) l-labeled peptide, and the radiation was counted to determine the power of the antibody used. The binding rate (Bo ) corresponding to the titer is 100%, and the antibody and 1125 label at each concentration and dilution rate of each test sample are
Determine the percentage of bonding with the peptide. The results obtained are shown in FIG. The vertical axis in Figure 3 is the bonding percentage (-B/Box
lQO), and the horizontal axis is human β-type
The concentration of the 3rd peptide chain is shown. Curve (G) in the original drawing
The curve (A) is the one using the antibody ■, and the curve (A) is the one using the antibody ■.
第3図よシ明らかなように最小検出感度は抗体■で13
ヒコグラム/ m s抗体■で5ヒコクラム/ weで
ある。As is clear from Figure 3, the minimum detection sensitivity is 13 for antibody ■.
hicogram/m s antibody ■ is 5 hicogram/we.
く吸着体の製造〉
実施例19
(、a)実施例16で得られる抗体V 0.74m1
を蒸留水 2.26m1に溶解し、次いで飽和硫酸アシ
七ニウム水溶液3 g/を加え、4°Cにて3時間放置
する。次に蒸留水3 @/を加え、4℃で3時間放置−
t−ル。4℃−t’15分間遠心分離(3500rpH
1)し、沈殿物を蒸留水に溶解し、抗体水溶液8 d
ゞ゛を得る( 0D2190= 1 、157 )
。次に蒸留水で3回透析し、さらに0.5 M食塩含有
0.1M炭酸水素すトリウム(pH8,4)で透析して
、抗体水溶液7震lを得る(OD280=0.923)
。Production of adsorbent> Example 19 (a) Antibody V obtained in Example 16 0.74ml
was dissolved in 2.26 ml of distilled water, then 3 g of a saturated aqueous acinanium sulfate solution was added, and the mixture was left at 4°C for 3 hours. Next, add 3 ml of distilled water and leave at 4℃ for 3 hours.
t-le. Centrifugation at 4℃-t' for 15 minutes (3500rpH
1) Dissolve the precipitate in distilled water and add 8 d of antibody aqueous solution.
Obtain ゞ゛ (0D2190=1,157)
. Next, it was dialyzed three times against distilled water and further dialyzed against 0.1M sodium bicarbonate (pH 8,4) containing 0.5M sodium chloride to obtain 7 liters of an aqueous antibody solution (OD280=0.923).
.
(b)乾燥臭化ジアジ活性化セファ0−ス4E 1g
を&I三りM塩酸水溶液200ゴで洗浄後、0.5M食
塩含有0.1M炭酸水素ナトリウム30vzl及び上記
(d)で得られる透析後の抗体水溶液7mlを加え、室
温で2時間イシ千ユベートする。(b) 1 g of dry diazibromide-activated Cephas 4E
After washing with 200ml of 3M hydrochloric acid aqueous solution, 30ml of 0.1M sodium bicarbonate containing 0.5M salt and 7ml of the dialyzed antibody aqueous solution obtained in (d) above are added, and incubated at room temperature for 2 hours. .
クラスフィルターで濾過し、得られるゲルを1M七ノエ
タノールア三シーCL(戸H8,36)40mlに溶解
し、室温で2時間イシ+ユベートする。0.5M食塩を
含有するO、1M7tデート緩衝液CI’H4,O>で
循環洗浄し、次いで0.5M食塩含有0.1 Mボレイ
ト緩衝液で4回洗浄する。生理食塩水中で懸濁させてし
トβ型イ、ターフエ0シーtファ0−ス4B吸着体を得
る。Filtrate through a class filter, dissolve the resulting gel in 40 ml of 1M hexaethanolamine CL (H8, 36), and incubate at room temperature for 2 hours. O, 1M 7t date buffer CI'H4,O> containing 0.5M NaCl, followed by four washes with 0.1M Borate buffer containing 0.5M NaCl. Suspend in physiological saline to obtain a β-type A, T-F0 sheet, T-F4B adsorbent.
尚ガラスフィルターで沖過した炉液35gtの0D28
0は0.004 であり、抗体は殆んどtノア0−ス4
Bに固定化されていることがわかる。In addition, 35gt of 0D28 furnace liquid was filtered through a glass filter.
0 is 0.004, and most of the antibodies are
It can be seen that it is fixed to B.
実施例20
(a) 実施例1−2で得られる抗体1 0.741
を蒸留水 2.26g/に溶解し、次いで飽和硫酸アン
モニウム水溶液3 mlを加え、今°Cにて3時間放置
する。次に蒸留水3 mlを加え、4℃で3時間放置す
る。4℃で15分間遠心分離C3500rl’W1)し
、沈殿物を蒸留水に溶解し、抗体水溶液8dを得る(
0D28o= 1.154 )。次に蒸留水で3回透析
し、さらに0.5 M食塩含有0.1 Np酸水素ナト
リウム(戸H8,4)で透析して、抗体水溶液7 ml
を得る( OD2&、 = 0.921 )。Example 20 (a) Antibody 1 obtained in Example 1-2 0.741
was dissolved in 2.26 g/distilled water, then 3 ml of saturated ammonium sulfate aqueous solution was added, and the mixture was left to stand at °C for 3 hours. Next, add 3 ml of distilled water and leave at 4°C for 3 hours. Centrifuge at 4°C for 15 minutes (C3500rl'W1) and dissolve the precipitate in distilled water to obtain an aqueous antibody solution 8d (
0D28o=1.154). Next, it was dialyzed three times against distilled water, and further dialyzed against 0.1 Np sodium hydrogen oxide containing 0.5 M sodium chloride (Toh H8,4) to prepare 7 ml of the antibody aqueous solution.
(OD2&, = 0.921).
(b)乾燥臭化ジアジ活性化セファD−ス4B If
をl\1ミリM塩酸水溶液200 mlで洗浄後、0.
5M食塩含有0.I M炭酸水素ナトリウム30m1及
び上記(a)で得られる透析後の抗体水溶液7IIlを
加え、室温で2時間イシ+ユベートする。(b) Dry diazibromide activated Cepha D-su 4B If
After washing with 200 ml of 1 mm HCl aqueous solution, 0.
Contains 5M salt 0. Add 30 ml of IM sodium bicarbonate and 7 ml of the dialyzed aqueous antibody solution obtained in (a) above, and stir at room temperature for 2 hours.
クラスフィルターで濾過し、得られるゲルを1Mv:)
工9)−1vアE:/−CL (fiH8,36)40
mlに溶解し、室温で2時間イシ+ユベートする。06
5M食塩を含有する0、1 Mアセテート緩衝液CI)
H4,O>で循環洗浄し、次いで0.5M食塩含有0.
1 Mボレイト緩衝液で4回洗浄する。生理食塩水中で
懸濁させてヒトβ型イシターフエ0シーtファ0−ス4
B吸・1着体を得る。Filter with a class filter and the resulting gel is 1Mv:)
Engineering9) -1vAE:/-CL (fiH8,36)40
ml and incubated at room temperature for 2 hours. 06
0, 1 M acetate buffer CI containing 5 M NaCl)
Circulating washing with H4, O>, then 0.5M salt containing 0.5M salt.
Wash 4 times with 1 M borate buffer. Suspend in physiological saline to obtain human β-type isitase 4
Obtain B sucking and 1 body.
尚ガラスフィルターで濾過した炉液35m1の0D28
1Oは帆004であり、抗体は殆んどセファ0−ス4B
に固定化されていることがわかる。In addition, 0D28 of 35ml of furnace liquid filtered with a glass filter
1O is Sail 004, and most of the antibodies are Sephas 0-4B
It can be seen that it is fixed.
実施例21
(2) 実施例13で得られる抗体II O,74
m/を蒸留水 2.26g/に溶解し、次いで飽和硫酸
アシをニウム水溶液3 mlを加え、4℃にて3時間放
置する。次に蒸留水3 mlを加え、4°Cで3時間放
置する。4°Cで15分間遠心分離(3500rplし
、沈殿物を蒸留水に溶解し、抗体水溶液8 mlを得る
( 0D280.= 1.155 )。次に蒸留水で3
回透析し、さらに0.5M食塩含有0.1M次酸水素ナ
トリウム(戸#8.4)で透析して、抗体水溶液7 m
lを得る(OD280=0.921)。Example 21 (2) Antibody II O,74 obtained in Example 13
m/ is dissolved in 2.26 g/distilled water, then 3 ml of a saturated aqueous sodium sulfate solution is added, and the mixture is left at 4°C for 3 hours. Next, add 3 ml of distilled water and leave at 4°C for 3 hours. Centrifuge at 4°C for 15 minutes (3500 rpm) and dissolve the precipitate in distilled water to obtain 8 ml of antibody aqueous solution (0D280.=1.155). Then, dilute with distilled water for 30 minutes.
The antibody aqueous solution was dialyzed twice and further dialyzed against 0.1M sodium hydrogen suboxide containing 0.5M sodium chloride (door #8.4).
(OD280=0.921).
Cb)乾燥臭化ジアジ活性化セファ0−ス4BIf↑9
を161三りM塩酸水溶液20011で洗浄後、0.5
M食塩含有0.1M炭酸水素ナトリウム30m1及び上
記(,2)で得られる透析後の抗体水溶液71jを加え
、室温で2時間イシ+ユベートする。Cb) After washing dry diazibromide-activated Cephas 4BIf↑9 with 161 M hydrochloric acid aqueous solution 20011, 0.5
Add 30 ml of 0.1 M sodium bicarbonate containing M sodium chloride and the dialyzed aqueous antibody solution 71j obtained in (2) above, and stir at room temperature for 2 hours.
グラスフィルターで濾過し、得られるゲルを1Mv:)
工9) LEE:/−CL(/’#8.36’)40
mlに溶解し、室温で2時間イン+ユベートする。0.
5M食塩を含有する0、1 M ”P tテート緩衝液
(7#4.0)で循環洗浄し、次いで0.5M食塩含有
0.I#ボレイト緩衝液で4回洗浄する。生理食塩水中
で懸濁させてヒトβ型イシターフエ0シーtファ0−ス
4B吸着体を得る。Filter with a glass filter, and the resulting gel is 1Mv:)
Engineering 9) LEE:/-CL(/'#8.36')40
ml and incubate for 2 hours at room temperature. 0.
Circulate wash with 0.1 M'' Pt tate buffer (7#4.0) containing 5M saline, then wash 4 times with 0.I# borate buffer containing 0.5M saline in saline. By suspending it, a human β-type isiter 4B adsorbent is obtained.
尚ガラスフィルターで濾過した炉液351の0D28o
は帆004であシ、抗体は殆んどセファ0−ス4Bに固
定化されていることがわかる。Furthermore, 0D28o of the furnace liquid 351 filtered with a glass filter
It can be seen that most of the antibodies are immobilized on Sephas 004B.
実施例22
(a)実施例14で得られる抗体璽 0.74 slを
蒸留水 2.26■lに溶解し、次いで飽和硫酸アシを
ニウム水溶液3 mlを加え、4℃にて3時間放置する
。次に蒸留水3 mlを加え、4℃で3時間放置する。Example 22 (a) Dissolve 0.74 sl of the antibody tablet obtained in Example 14 in 2.26 l of distilled water, then add 3 ml of a saturated aqueous solution of sodium sulfate, and leave at 4°C for 3 hours. . Next, add 3 ml of distilled water and leave at 4°C for 3 hours.
4℃で15分間遠心分離(35001ハ0し、沈殿物を
蒸留水に溶解し、抗体水溶液8 mlを得る( 0D2
80= I 、i 56 )。次に蒸留水で3回透析し
、さらに0.5M食塩含有0.IMp酸水素ナトリウム
(−H8,4)で透析して、抗体水溶液71jを得る(
OD2&)=0.922 )。Centrifuge at 4°C for 15 minutes (35001 × 0) and dissolve the precipitate in distilled water to obtain 8 ml of antibody aqueous solution (0D2).
80=I, i56). Next, dialysis was performed three times against distilled water, and further 0.5M salt-containing 0.5M sodium chloride solution was used. Dialyze with IMp sodium hydrogen pate (-H8,4) to obtain antibody aqueous solution 71j (
OD2&)=0.922).
(b) 乾燥臭化ジアジ活性化セファ0−ス4B
IIを一1三りM塩酸水溶液200 mlで洗浄後、0
.5M食塩含有0.I M炭酸水素ナトリウム30m1
及び上記(a)で得られる透析後の抗体水溶液7mlを
加え、室温で2時間イシ+ユベートする。(b) Dry diazibromide activated Cephas 4B
After washing II with 200 ml of 113 M hydrochloric acid aqueous solution,
.. Contains 5M salt 0. IM sodium bicarbonate 30ml
Then, 7 ml of the dialyzed antibody aqueous solution obtained in (a) above is added, and incubated at room temperature for 2 hours.
グラスフィルターで濾過し、得られるゲルを1M5ノエ
タノールア三シーCL(pH8,36)40mlに溶解
し、室温で2時間イシ十ユベートする。0.5M食塩を
含有する0、1 Mアセテート緩衝液CI’H4,O)
で循環洗浄し、次いで0.5M食塩含有O,+ Uボレ
イト緩衝液で4回洗浄する。生理食塩水中で懸濁させて
しトβ型イシターフエ0シーtファ0−ス4B吸着体を
得る。Filter through a glass filter, dissolve the resulting gel in 40 ml of 1M ethanolic acid CL (pH 8,36), and incubate at room temperature for 2 hours. 0,1 M acetate buffer CI'H4,O containing 0.5 M NaCl)
and then four times with O,+U borate buffer containing 0.5M NaCl. It is suspended in physiological saline to obtain a β-type isiterfue 0-sheet t-face 4B adsorbent.
尚ガラスフィルターで濾過LfcF液3511/の0D
280は0.004であり、抗体は殆んどtファD−ス
4Bに固定化されていることがわかる。In addition, filter LfcF liquid 3511/0D with a glass filter.
280 is 0.004, and it can be seen that most of the antibody is immobilized on tFase D-4B.
実施例23
(a)実施例15で得られる抗体W 0.74m1を
蒸留水 2.26g+/に溶解し、次□いで飽和硫酸ア
シ七ニウム水溶液3 mlを加え、4℃にて3時間放置
する。次に蒸留水3 mlを加え、4°Cで3時間放置
する。4°Cで15分間遠心分離C3C550Orl)
し、沈殿物を蒸留水に溶解し、抗体水溶液8 mlを得
る( on280= 1.!53 )。次に蒸留水で3
回透析し、さらに0.5M食塩含有0.1 M炭酸水素
すトリウム(pH8,4>で透析して、抗体水溶液7
mlを得る(OD28o=0.920)。Example 23 (a) Dissolve 0.74 ml of the antibody W obtained in Example 15 in 2.26 g+/ of distilled water, then add 3 ml of saturated aci7ium sulfate aqueous solution in □, and leave it at 4°C for 3 hours. . Next, add 3 ml of distilled water and leave at 4°C for 3 hours. Centrifuge for 15 minutes at 4°C (C3C550Orl)
Then, the precipitate was dissolved in distilled water to obtain 8 ml of an aqueous antibody solution (on280=1.!53). Next, add 3 with distilled water.
The antibody aqueous solution was dialyzed twice and further dialyzed against 0.1 M sodium bicarbonate containing 0.5 M sodium chloride (pH 8.4).
ml (OD28o=0.920).
(b)乾燥臭化ジアジ活性化セファ0−ス4B If
をへ1三りM塩酸水溶液200禦jで洗浄後、0.5M
食塩含有0.1M炭酸水素すトリウム30m1及び上記
(a)で得られる透析後の抗体水溶液7dを加え、室温
で2時間イン+1ベートする。(b) Dry diazibromide activated Cephas 4B If
After washing with 13M hydrochloric acid aqueous solution 200g, 0.5M
Add 30 ml of 0.1 M sodium bicarbonate containing sodium chloride and 7 d of the dialyzed antibody aqueous solution obtained in (a) above, and incubate for 2 hours at room temperature.
クラスフィルターで濾過し、得られるゲルを1M七ノエ
タノールアミシーCL(戸#8.36 )40 weに
溶解し、室温で2時間イン+1ベートする。o、5Mf
k塩を含有する帆IMアセテート緩衝液<1’H4,o
>で循環洗浄し、次いで0.5M食塩含有0.1 Mボ
レイト緩衝液で4回洗浄する。生理食塩水中で懸濁させ
てじトβ型イシターフエ0シーセファ0−ス4B吸着体
を得る。Filter through a class filter, dissolve the resulting gel in 40 ml of 1M heptanoethanolic acid CL (#8.36), and incubate for 2 hours at room temperature. o, 5Mf
Sail IM acetate buffer containing k salt <1'H4,o
> and then four times with 0.1 M borate buffer containing 0.5 M saline. The suspension is suspended in physiological saline to obtain a β-type isiterphae0cephae0-su4B adsorbent.
尚ガラスフィルターで濾過した炉液35m1の0D28
0は0.004であり、抗体は殆んどセファロース4B
に固定化されていることがわかる。In addition, 0D28 of 35ml of furnace liquid filtered with a glass filter
0 is 0.004, and the antibody is mostly Sepharose 4B.
It can be seen that it is fixed.
実施例24
(a) 実施例!7で得られる抗体■0.74vtl
を蒸留水 2.26g/に溶解し、次いで飽和硫酸アシ
七ニウム水溶液3 mlを加え、4℃にて3時間放置す
る。次に蒸留水3fItを加え、4℃で3時間放置する
。4℃で15分間遠心分離C3500rfitPI)し
、沈殿物を蒸留水に溶解し、抗体水溶液8 mlを得る
(OD28o= 1.158 )。次に蒸留水で3回透
析し、さらに0.5Mf&塩含有0.1#戻酸水素ナト
リウム(−H8,4>で透析して、抗体水溶液7 ml
を得る( 0D280=0.924 )。Example 24 (a) Example! Antibody obtained in 7 ■0.74vtl
was dissolved in 2.26 g/distilled water, then 3 ml of a saturated acinanium sulfate aqueous solution was added, and the mixture was left at 4°C for 3 hours. Next, 3 fIt of distilled water was added and the mixture was left at 4°C for 3 hours. Centrifuge for 15 minutes at 4°C (C3500rfitPI) and dissolve the precipitate in distilled water to obtain 8 ml of an aqueous antibody solution (OD28o = 1.158). Next, it was dialyzed three times against distilled water, and further dialyzed against 0.5 Mf & salt containing 0.1 # sodium hydrogen oxide (-H8,4>) to give 7 ml of the antibody aqueous solution.
(0D280=0.924).
(b) 乾燥臭化シアン活性化セファ0−ス4B
IFを入1ミリM塩酸水溶液200 mlで洗浄後、0
.5M食塩含有0.I M炭酸水素ナトリウム30m1
及び上記(a)で得られる透析後の抗体水溶液7■tを
加え、室温で2時間イン+1ベートする。(b) Dry cyanogen bromide activated Cephas 4B
After adding IF and washing with 200 ml of 1mM hydrochloric acid aqueous solution,
.. Contains 5M salt 0. IM sodium bicarbonate 30ml
Then, add 7 t of the dialyzed aqueous antibody solution obtained in (a) above, and incubate for 2 hours at room temperature.
クラスフィルターで濾過し、得られるゲルを1’v:)
エタ) ItiPE:1−CL (///8.36
)4−Os+lに溶解し、室温で2時間イシ+ユベー
トする。0.5M食塩を含有する0、I Nアセテート
緩衝液(1)//4.0)で循環洗浄し、次いで0.5
M食塩含有0.1 Mボレイト緩衝液で4回洗浄する。Filter the resulting gel with a class filter at 1'v:)
eta) ItiPE:1-CL (///8.36
) Dissolve in 4-Os+l and incubate for 2 hours at room temperature. Circulating wash with 0.1 N acetate buffer (1)//4.0) containing 0.5 M NaCl, followed by 0.5 M NaCl.
Wash 4 times with 0.1 M borate buffer containing M NaCl.
生理食塩水中で懸濁させてしトβ型イシタ−フェロシー
セファ0−ス4B吸着体を得る。It is suspended in physiological saline to obtain a β-type ferrocycephae 4B adsorbent.
尚カラスフィルターで濾過した炉液35yxlの0D2
80は0.004であり、抗体は殆んど℃フッ0−ス4
Bに固定化されていることがわかる。In addition, 0D2 of 35yxl of furnace liquid filtered with a glass filter.
80 is 0.004, and most of the antibodies are
It can be seen that it is fixed to B.
実施例25
セル0−ス(東洋0!/A2)を0.5cIR角に切シ
、1f程度秤量する。このセル0−スを臭化ジアジry
の水100m1溶液に入れ、戸Hを11.0〜11.5
に保つように水酸化ナトリウム溶液を加え、室温で6〜
8分活性化を行なう。活性化を終えたのち、ガラスフィ
ルターで反応液を除きメ冷′し九\0.5M食塩含有0
.5M炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH8,4)で数回
洗浄し、洗浄後同緩衝液中に浮遊させ、実施例19(d
)と同様にして得られる抗体水溶液(□Z)280=0
.918 )を加え、実施例+9(b)と同様に処理し
てヒトβ型インターフエ0ンーtル〇−ス吸着体を得る
。尚ガラスフィルターで濾過した炉液の0D28oO1
004であり、抗体は殆んどセル0−スに固定化されて
いることがわかる。Example 25 Cell 0-su (Toyo 0!/A2) was cut into 0.5 c IR squares and weighed to about 1 f. This cellulose is diazibromide
11.0~11.5
Add sodium hydroxide solution to keep it at room temperature for 6~
Perform 8 minute activation. After activation, remove the reaction solution with a glass filter and cool.
.. Washed several times with 5M sodium bicarbonate buffer (pH 8,4), suspended in the same buffer after washing, and prepared in Example 19 (d
) Antibody aqueous solution (□Z)280=0 obtained in the same manner as
.. 918) and treated in the same manner as in Example +9(b) to obtain a human β-type interferase adsorbent. Furthermore, the furnace liquid filtered with a glass filter is 0D28oO1.
004, indicating that most of the antibody was immobilized on the cells.
実施例26
架llデ十ストラン(セファデックスG−25)IFを
水Ionlに懸濁させて架橋デ+ストラン水速度を高め
て臭化ジアジのアセトニトリル溶液C2f/ゴ)を50
0μl一度に加え、さらに激しく1〜2分間攪拌後ガラ
スフィルター上で反応液を除去する。a、5X*塩含有
0.1 M炭酸水素すトリウム緩衝液(戸H8,4)で
数回洗浄し、洗浄後同緩衝液中に浮遊させ、実施例19
(a)と同様にして得られる抗体水溶液(0D28o=
0.921 )を加え、実施例+9(b)と同様に処理
してヒトβ型イシターフエ0シー架橋ダ十ストラシ吸着
体を得る。Example 26 Suspending cross-linked de+strane (Sephadex G-25) IF in water to increase the water velocity of cross-linked de+tran
Add 0 μl at once and stir vigorously for 1 to 2 minutes, then remove the reaction solution on a glass filter. a, washed several times with 0.1 M sodium bicarbonate buffer containing 5X* salt (door H8, 4), and suspended in the same buffer after washing, Example 19
Antibody aqueous solution obtained in the same manner as in (a) (0D28o=
0.921 ) and treated in the same manner as in Example +9(b) to obtain a cross-linked human β-type isitase adsorbent.
尚4ガラスフイルターで濾過ルた炉液の0D28oは0
.004であり、抗体は殆んど架−チ+ストランに固定
化されていることがわかる。In addition, 0D28o of the furnace liquid filtered with 4 glass filters is 0.
.. 004, and it can be seen that most of the antibody is immobilized on the bridge.
実施例27
しトβ型イシターフエ0シ(東京都臨床医学総合研究所
、0D280= 11.8 ) 0.511(蛋白質5
.91F)を生理食塩水に溶解し、次にこの溶液を実施
例19(b)で得られるしトβ型イシターフエ0シーt
ファ0−ス4B吸着体を用いたアフィニティークロマド
グラフイーに充填し、 0.15 M食塩含有0.1
Mリシ酸塩緩衝液(戸#7.4)で溶出する。Example 27 β-type Ishitafue 0 (Tokyo Metropolitan Institute of Clinical Medicine, 0D280=11.8) 0.511 (Protein 5
.. 91F) in physiological saline, and then this solution was used to prepare the β-type isiterfue obtained in Example 19(b).
It was packed into an affinity chromatography using Fast 4B adsorbent, and 0.15 M salt containing 0.1
Elute with M lysinate buffer (door #7.4).
OD = 0.0002になったところで0.5M*
塩含有80
0.5・M酢酸緩衝液(戸H2,5)で溶出して精製し
トβ型イシターフエ0シを上記吸着体より分離する。0.5M* when OD = 0.0002
It is purified by elution with a salt-containing 800.5M acetate buffer (H2, 5), and β-type isiterfue is separated from the adsorbent.
アフィニティークロマドグラフ前のヒトβ型イシターフ
エ0シの換算OD値(OD28゜=1のときの蛋白質を
1IIIIとしたときの値、以下同じ)は5.9であシ
、またヒトβ型イシターフエ0シ免疫反応においては1
3240戸f/llt、 1.5 X 10ユニツト/
岬という活性を示すのに対し、アフイニテイーク0マト
ジラフ後のしトβ型イシターフエ0シの換算OD値は0
.059であり、またヒトβ型イシターフエ0ン免疫反
応においては+2050戸f/me、1.37xlO6
ユニツト/q という活性を示す。Before affinity chromatography, the converted OD value (value when protein is 1III when OD28° = 1, the same applies hereinafter) of human β-type Ishitafue was 5.9, and human β-type Ishitafue was 0. In the immune response, 1
3240 units/llt, 1.5 x 10 units/
In contrast, the converted OD value of Shito β-type Ishitafue after affinity take 0 is 0.
.. 059, and +2050 f/me, 1.37
It shows an activity of unit/q.
従って比活性についてはアフィニティークロマドグラフ
前は2.54 X I 051.ニット/IIgでちゃ
、一方アフィニティークロマ”トタラフ後・°は°2
、3′2ξ×107ユニツト/IIgという 91.3
倍に相当する値を示す。Therefore, the specific activity before affinity chromatography is 2.54 X I 051. Knit/IIg Decha, while Affinity Chroma “After Totaraf・° is °2
, 3'2ξ×107 units/IIg 91.3
Indicates the value equivalent to double.
以上の結果よシ本発明の吸着体の使用によシ、ヒトβ型
イシターフエ0シを一段階で91倍以上に精製し得、ま
た回収率もほぼ定量的であることがわかる。The above results show that by using the adsorbent of the present invention, it is possible to purify human β-type isiterphein 91 times or more in one step, and the recovery rate is almost quantitative.
また実施例20〜26で得られる本発明の吸着体を用い
、上記と同様にアフィニティークロマドグラフしたとこ
ろ、上記同様良好な分離・精製能を示す。Furthermore, when affinity chromatography was performed in the same manner as above using the adsorbents of the present invention obtained in Examples 20 to 26, they showed good separation and purification ability as above.
第1図及び第2図は本発明抗体の特異性を示すグラフで
ある。第3図は本発、、明・:抗体についてのしトβ型
インターフエ0シ第1〜13番のペプチド鎖の濃度と結
合%との関係を示すグラフである。
(以 上)
代理人 弁理士 三 枝 英 二+lFIGS. 1 and 2 are graphs showing the specificity of the antibodies of the present invention. FIG. 3 is a graph showing the relationship between the concentration of peptide chains 1 to 13 of β-type interference 0 and binding % for antibodies of the present invention. (The above) Agent: Patent attorney Eiji Saegusa +l
Claims (1)
Gly−Pht−基、H−Tyr−Asn−Leu−L
tu−Gly −Pkt−基又はH−Met−5tr−
Tyr−Axn−Lzu −Lzu−Gly−Phe−
基を示す。〕で表わされるヒトβ型インターフェロンの
N末端ペプチドと担体との複合体からなるヒトβ型イン
ターフェロン抗原を哺乳動物体に投与して得られるしト
β型インターフエ0シ抗体を不溶性支持体上に固定化し
てなることを特徴とするアフィニティー[Claims] ■ General formula [wherein R is a hydrogen atom, H-Pht- group, //-Ltu-
Gly-Pht- group, H-Tyr-Asn-Leu-L
tu-Gly -Pkt- group or H-Met-5tr-
Tyr-Axn-Lzu -Lzu-Gly-Phe-
Indicates the group. ] A human β-interferon antigen consisting of a complex of the N-terminal peptide of human β-interferon represented by Affinity characterized by being fixed
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SE8202012A SE457352B (en) | 1981-03-31 | 1982-03-30 | HUMAN INTERFERON-RELATED PEPTID, HUMAN INTERFERON ANTIBODY AND PREPARATION AND USE OF PURPOSE AND PREPARED PREPARATION |
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1981
- 1981-06-30 JP JP56102731A patent/JPS582749A/en active Granted
Patent Citations (1)
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JPH0243759B2 (en) | 1990-10-01 |
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