JPS5825658B2 - デスアシル−ペプシジン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なデスアシルーペプシジン（以下ＤＡ−ペ
プシジンと称す）に関する。 本発明のＤＡ−ペプシジンは、次の構造式（Ｉ） を有するペンタペプタイド、即ちバリル−バリル−４−
アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタノイル−
アラニル−４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチル−
ヘプタン酸である。 本発明のＤＡ−ペプシジンは、以後に定義するＮ−７シ
ルーペンタペプタイトニ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｐ、 ）に属し、該Ｎ−アシル−ペン・タペプ
タイドの脱アシル化能を有する細菌の培養液、菌体、ま
たはそれらの処理生成物を作用させることによって製造
することができる。 ＤＡ−ペプシジンの製造において出発物質として使用さ
れるＮ−アシルーペンタペプタイドは、次の一般式（Ｔ
Ｉ） Ｃ式中、Ｒはアシル基である〕を有するペンタペプタイ
ド、即ちＮ−アシル−バリル−バリル−４−アミノ−３
−ヒドロキシ−６−メチル−へブタノイル−アラニル−
４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタン酸
である。 Ｎ−アシルーペンタペプタイド（ＩＩ）としては、アシ
ル部分の異なった士数種の化合物が既に知られている。 たとえば、Ｒがアセチルである化合物は本発明の発間者
の１人である桑名等によって発見され、”５−ＰＩ’”
または１ペプシジンＣ９１として特願昭４５−３５９０
０号および特願昭４８−３９４４６号中に記載されてい
る。 特願昭４８−３９４４６号中には、またＲがブチリルお
よびプロピオニルである化合物がそれぞれ゛ペプシジン
ＡＩＩおよび”ペプシジンＢ ９＋として示されている
。 他方、悔涙等は、特公昭４７−８９９６号、特開昭４７
−２９５８２号および特開昭４９−４１５９０号中に、
Ｒがインバレリルほか炭素原子５個ないし１６個の直鎖
状または分枝鎖状の脂肪族アシル基であるＮ−アシルー
ペンタペプタイドを１ペプスタチン類°”として開示し
ている。 これらのＮ−アシルーペンタペグタイド類は、各種の放
線菌ノ培養によって得られる。 たとえば上記ペプシジン類は、ストレプトマイセス・ナ
ニワエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎａｎｉ
ｗａｅｎｓｉｓ ） Ｅ Ｆ ４４−２０１株〔工発
研菌寄第２７８号〕の培養によって得られている。 また、ペプスタチン類は、たとえばストレプトマイセス
・テスタセウス （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｅｓｔａｃｅｕｓ
）の培養によって得られている。 本発明のＤＡ−ペプシジンの製造に用いラレる細菌とし
ては、本発明者等が山梨県河口湖町の土壌から分離した
新菌株バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）ＥＦ４９−２１
０株が特に好適である。 その菌学的性状を以下に示す： 〔０顕微鏡的観察（肉汁寒天培地） １、形態：両端丸みを帯びた桿菌で、単独または２連、
まれに３連。 ２、大きさ；０．４〜０．７Ｘ１．Ｏ〜４．０μ３、運
動性；あり。 ４、べん毛；あり（周べん毛）。 ５、胞子；形成する。 ６、ダラム染色；陽性。 ７、抗酸性；陰性。 叩 培養所見 １、肉汁寒天斜面培地（３０℃、１日） 平らに拡がって生育、乳黄色〜微黄色で、弱い光沢があ
る。 培地色変化なし。２、肉汁寒天平板培地（３０℃、１〜
７日）樹枝様に平らに拡がって生育、乳黄色〜微黄色で
、コロニーは滑面、やや光沢があり半透明〜不透明。 拡散性色素なし。３、肉汁液体培地（３０℃、２日） 表面に菌膜を形成。 液内の濁りは弱（均一。４ ゼラチン培地（２０℃、２
７℃、３０℃、３日）生育は弱いが、ゼラチンを液化す
る。 穿刺では、明瞭でない。 ５、 リトマスミルり（３０℃、６日） ６日間培養で、やや酸性を示し、弱い液化がおこる。 凝固なし。６、ポテト（３０℃、２日） 湿潤、粘液状に拡がり、ポテトは褐変する。 亜 生理的性質 ■、硝酸還元性；陰性。 ２、脱窒反応；陰性。 ３ メチルレッド試験；陽性。 ４、ＶＰ反応；陽性。 ５、インドール生成；陰性。 ６、硫化水素生成；陰性。 ７、澱粉の加水分解；陰性。 ８、クエン酸の利用；コーザー培地陽性。 シモンズ培地陰性。 ９、無機窒素源の利用；硝酸カリウムでやや陽性、硫酸
アンモニウムでやや陽性。 １０、色素生成；陰性。 １１、ウレアーゼ；陰性。 Ｉ２．オキシダーゼ；陽性。 Ｉ３． カタラーゼ；陽性。 １４、生育の範囲； （ａ）ｐＨ（肉汁液体培地３０℃振盪２日）滅菌培地ｐ
Ｈ５〜９．８で生育する。 （ｂ） 温度（肉汁液体培地振盪２日） ２０℃〜４５℃で生育する。 （Ｃ）塩濃度（肉汁液体培地振盪３０℃）ＮａＣ１Ｏ，
５〜７．０％で１日で生育する。 ＮａＣ１１０％で２日で生育する。 １５、酸素要求性一通性嫌気性。 Ｉ６． ライフンン法糖代謝；好気、嫌気、ともに酸
を生成、ガス発生認めず。 １７、糖の発酵性および酸の生成は次のとおり；（糖）
酸生成（好気） （嫌気） ■ アラビノース ±■ キシ
ロース 士 士■ グルコース
＋ 十（糖） 酸生成（好気）
（、嫌気）■ マンノース ＋ 十
■ フラクトース 士 −十■ ガラクト
ース 士 士■ 麦芽糖
士■ ショ糖 十
＋■乳糖 士 ［相］ トレハロース 士 十〇 ン
ルビット ±＠ マンニット
十＠ イノジット
士 十〇 グリセリン 士
±０ デンプン 士い
ずれもガス発生は認めない。 以上の諸性質を、パージエイズ・マニュアル・オブ・デ
ターミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙｙ
ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｖｅ１３ａｃｔｅｒｉｅｌｏｇｙ ）第７版の記載と比
較検討すると、本菌はバチ／１／ス−プミルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）に属すると考えられ、本
発明者らは本菌をバチルス・プミルス・カワグチ（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｎ ｉｌｕｓｋａｗａｇｕｃｈｉ
） と命名した。 尚、本菌ＥＦ４９−２１０株は、工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第２６７７号として寄託され
ている。 財団法人発酵研究所に保持されている公知菌バチルス・
プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ ）
Ｉ ＦＯ−１２０９２およびＩＦＯ−１２１１０もまた
ＤＡ−ペプシジンの製造に好適に利用し得ることが認め
られた。 ＤＡ−ペプシジンの製造に用いる微生物を培養する場合
、培地組成および培養条件は微生物が生育し目的とする
活性を充分発現するものであれば、いずれも使用し得る
。 たとえば、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー
、大豆蛋白分解物、大豆浸出液、酵母エキス、無機アン
モニウム塩等のような有機または無機の窒素源；精密、
ブドウ糖、澱粉およびその加水分解物等のような炭素源
；ならびに無機塩を適当に含有する培地を選ぶことがで
きる。 培養は通常、振盪または通気攪拌により２０〜４５℃で
１〜７日間行う。 これによって得られる培養液、培養除菌液、生菌体、乾
燥菌体、培養除菌液からの塩析物または有機溶媒による
沈澱物、あるいはその他種々の段階の処理生成物をＤＡ
−ペプシジンの製造に用いることができる。 原料Ｎ−アシルーペンタペプタイドは分離精製された特
定の単一のＮ−アシルペンターペプタイドである必要は
ない。 前記放線菌の培養に際しては、通常アシル部分の異なっ
た数種ないし士数種のＮ−アシルーペンタペグタイド類
が同時に生成するが、そのような混合物も原料として使
用でき、従って実際には、たとえばＮ−アシルーペンタ
ペプタイド生産菌の培養ｒ液またはその塩析物、あるい
はその有機溶媒による抽出乾固物等、結晶に至る各精製
段階のＮ−アシルーペンタペプタイド含有物が好適に用
いられる。 ＤＡ−ペプシジン製造の実施に当っては、反応条件、た
とえば、濃度、温度、ｐＨ等は使用する菌株の種類、原
料Ｎ−アシルーペンタペプタイドの組成等により広い範
囲で適宜変化させることができる。 たとえば、バチルス・プミルス−カワクチシルーペンタ
ペプタイド混合物の脱アシル化反応を行う場合には、ｐ
Ｈ約４−１０、特にｐＨ６−９および約３０−５０℃の
温度で約３ないし６０時間反応するのが好ましい。 ｃｏ＋士化金化合物えばＣｏＣ１２、ＣＯＳ０４等の添
加によりＤＡ−ペプシジンの生成率は増加する傾向を有
する。 反応混合物からの目的ＤＡーペプシジンの分離精製は、
通常の方法により行うことができる。 たとえば、反応混合物を、必要によっては予め濾過して
固形物を除去した後、有機溶媒たとえばｎ−ブタノール
で抽出し、ついで溶媒を除去することにより目的物を分
離することができる。 粗製ＤＡーペプシジンの精製は、たとえば陽イオン交換
樹脂またはシリカゲル等を用いたカラムクロマトグラフ
ィー、有機溶媒たとえばメタノール、エタノール等を用
いた分別結晶化、あるいは再結晶等の通常の方法によっ
て行うことができる。 本発明のＤＡ−ペプシジンの生成を確認するには、次の
如き方法を用いることができる：すなわち、試料溶液を
シリカゲルＧ（メルク製、商品名）の薄層板に添付し、
ｎ−ブチルアルコール：酢酸：水（容量比３：Ｉ：Ｉ）
の混合溶媒（Ｉ）、またはｎ−ブチルアルコール：酢酸
：水：酢酸ブチル（容量比４：Ｉ：Ｉ：４）の混合溶媒
（ＩＩ）で展開する薄層クロマトグラフィーを行う。 ＤＡ−ペプシジンは、Ｒｆ＝０．４８［混合溶媒（Ｉ）
］に、ニンヒドリン反応陽性、ライドン・スミス反応陽
性のスポットとして検出される。 更に、このように展開乾燥した薄層板を、カゼインを含
む寒天平板に転与した後、この平板に、ペプシン溶液を
含有した沢紙を張りつけて、３０℃で一夜反応させるこ
とによって、カゼイン未分解スポットとして検出するこ
ともできる（この方法を以下カゼインプレート法と略称
する）。 本発明のＤＡ−ペプシンは以下の理化学的性質を有する
： （＋） 外観 白色の針状結晶 （ｎ） 溶解性 酢酸、メタノールに易溶、エタノール、ｎ −ブタノー
ル、ピリジンに溶解、アセトン、エチルエーテルに難溶
。 （ｍ） 呈色反応 ニンヒドリン反応およびライドン・スミス反応に陽性。 ６Ｖ） 紫外線吸収スペクトル ０．１％メタノール溶液はペプタイド結合に基く末端吸
収のみで、２５０〜３７０ｍμの間に吸収極大を示さな
い。 （ｖ）赤外線吸収スペクトル 第１図に示す。 保１）アミノ酸組成 ６Ｎ−ＨＣＩ で７２時間加水分解した後、アミノ酸
アナライザーで測定した結果、試料中のアラニンとバリ
ンの比はＩ：２であった。 Ｑゆ 分子量および構造式 試料を酸クロライド法でアセチル化し、ついでジアゾメ
タン法でメチルエステル化して得た化合物についてのマ
ススペクトル分析結果ハ、Ｍ＋＝６５７を示し、原試料
の分子量はＤＡ−ペプシジンの計算値６０１と〒致した
。 またフラグメントのピークについても、ＤＡ−ペプシジ
ンの構造式（Ｉ）からの計算値と一致した。 尚、上記試料のアセチル化体は薄層クロマトグラフィー
において、ペプシジンＣと一致し、同様にそのエステル
化生成物はペプシジンＣメチルエステルと一致した。 Ｖｉｌ ペプシン阻害活性 村尾および里井がＡｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。 Ｊａｐａｎ ３４（８） １２６５−（１９７０）
に報告した方法に従い測定した結果、ＤＡ−ペプシジン
は０．８２μｙ−６ペプシン１００μグの活性を５０％
阻害することが認められた。 本発明のＤＡ−ペプシジンは上記の如（強力なペプシン
阻害活性を有しており、従ってペプシンの分泌元通に基
づ（諸疾患、たとえば消化管潰瘍の予防治療に有用であ
る。 ＤＡ−ペプシジンはまた通常のアシル化法を適用するこ
とによって容易ニ種々のアシル基を有するＮ−アシルー
ペンタペプタイド誘導体に変換することが可能であり、
これら誘導体はペプシン阻害活性等の有用な性質を有す
ることが期待され、従ってそれらの中間体としても有用
である。 以下に実施例をもって本発明の実施の態様を示すが、こ
れ等は単なる例示であって本発明をそれ等に限定するも
のではない。 実施例 Ｉ 肉エキス１％、ペプトン１％、ＮａＣ１Ｏ，５％を含む
ｐＨ７の液体培地０．１Ｊを０．５ Ｊ容坂ロフラスコ
に仕込み、１２０℃で１０分間加熱滅菌した。 ゛上記の如（調製したフラスコ２０本に、予め同じ組成
の培地で３０℃、２４時間培養したバチルス・プミルス
・カワグチＥＦ ４９−２１０株］培養液１ｍｌずつを
接種し、３０℃で７２時間、振盪培養した。 培養終了後、遠心分離により菌体を除去して得た培養除
菌液を合せ、冷却下、冷アセトン４１を滴下した。 生成した沈澱を分離採取し、蒸留水に懸濁して５０ｒｎ
ｌの懸濁液とした。 一方、原料として、ペプシジンＣ，ペプシジンＢ及びペ
プシジンＡを重量比９４：４：２で含むＮ−アシルーペ
ンタペプタイド混合物ＩＯｙを６Ｎ−ＮａＯＨで中和溶
解した水溶液５００ｍ１を調製し、これに前記アセトン
沈澱物の懸濁液１０ｄを加えて、３７℃、ｐＨ８，５で
５時間攪拌した。 得られた反応液をｎ−ブチルアルコール５００ｒＩＬｌ
スつで３回抽出し、このｎ−ブチルアルコール層を合せ
減圧濃縮乾固して残渣９．８１を得た。 ついでこの残渣をｎ−ブチルアルコール：酢酸：水：酢
酸エチル（４：Ｉ：Ｉ：４容量比）からなる混合溶媒９
０ｒｎｌに溶解し、シリカゲル５００グを含むカラムに
負荷した後、上記と同じ混合溶媒で展開溶出するカラム
・クロマトグラフィーを行った。 得られたクロマト主画分約０．７５Ｊを減圧濃縮乾固し
て残渣０．７２を得た。 この残渣からエチルアルコールによる結晶化を行って粗
結晶０．：ｌを得、更にこれをエチルアルコールから再
結晶して、ＤＡ−ペプシジンの白色針状結晶０．１７１
を得た。 融点：１９３〜１９９℃で分解し、明瞭な融点を示さな
し・。 〔α〕賃−−５７〜−６０° （Ｃ＝１．メタノール） 元素分析値：Ｃ２９Ｈ５５Ｎ５０８・Ｈ２Ｏとして０％
Ｎ％ Ｎ％ 計算値 ５６．１９ ９．２６ １１．２９測定値 ５
６．３９ ８．９９ １１．２７実施例 ２ 肉エキス１％、ペプトン１％および塩化ナトリウム０．
５％を含有する液体培地（ｐＨ７）Ｉ５１を３０１容の
ジャーファメンターに充填し、ついで培地を１２０℃で
１０分間滅菌した。 一方、上記と同じ組成の培地中において３０℃で２４時
間振盪培養したＥＦ４９−２１０株の培養液０．２１を
上記ジャーファメンターに接種し、下記の条件下に培養
を行った。 培養時間 ２４時間 培養温度 ３０℃ 通気量 毎分１５Ｊ 攪拌回転数 毎分３５０回転 培養終了後、遠心分離により菌体を除去して得た培養除
菌液１２Ｊに硫安を飽和度８０％になるように加え、３
日間冷蔵した。 生成した沈澱を分離採取し、蒸留水に懸濁して７５０Ｉ
７１１の懸濁液を得た。 この懸濁液１００ｍ１．ペプシジンＣ３ｆＩを含有する
中和した水溶液４００ｒｒＬｌ、１７１５Ｍホスフェー
トバッファー（ｐＨ５，５）２ｃ＋２ｄおよびＣＯＣｌ
２溶液（５ＸＩＯ”Ｍ）８ｒｕｉからなる混合物を３７
℃で４０時間インキュベートした。 反応混合物をｎ−ブチルアルコール（８００ｗＬｌＸ３
）で抽出し、抽出液を合せ、蒸発乾固した。 残渣をできるだけ小量のｎ−ブタノール：酢酸：水：酢
酸ブチル（４：Ｉ ：Ｉ：４容量比）混合溶媒に溶かし
、そしてシリカゲルカラムクロマトグラフィーに対し、
同じ溶媒で溶出した。 主画分２１を採取し、蒸発乾固して、白色粉末６２を得
た。 この粉末をエタノールから２回再結晶して、ＤＡ−ペプ
シジン２１を白色針具として得た。 実ノ＾

【ぐ８２リ ３ 実施例Ｉの方法で得たＤＡ−ペプシジン１００■をピリ
ジン】ｏｒＩＬｌに溶解し、この溶液に水冷下、アセチ
ル・クロライドのアセトン２０倍稀釈液１．２ｒｎｌを
滴下し、一夜室温に放置した。 この反応液の１部をｎ−ブタノール：酢酸：水：酢酸ブ
チル（容量比４：Ｉ ：Ｉ ：４）で展開するシリカゲ
ル薄層クロマトグラフィーにかけ、ニンヒドリン反応、
ライドン・スミス反応及びカゼインプレート法により検
出した結果、生成物はＲｆ＝０．４９を示し、標品のペ
プシジンＣと、まったく一致した。 反応液を濃縮乾固し、残渣をメタノール１０ｍ１に溶か
した。 生成した溶液にジアゾメタンのエーテル溶液１７ｒｕｌ
を加え、室温で３時間放置した。 ついで反応液を濃縮乾固し、残渣をメタノールに溶かし
、エーテルを加えることにより、ペプシジンＣ１メチル
エステルの結晶３４部ｍｌを得た。 実施例 ４ 実施例Ｉと同じ方法で培養したＥＦ４９−２１０株の培
養液１ ｒＩｌｌと、ペプシジンＣｌ０ｍ９を６Ｎ−Ｎ
ａＯＨで中和溶解した水溶液１ ｍｌとを混合し、３７
℃で５時間振盪した。 この反応液についてｎ−ブタノール：酢酸：水（容量比
３：］：Ｉ）で展開するシリカゲル薄層クロマトグラフ
ィーを行った結果Ｒｆ＝０．４８のＤＡ−ペプシジンと
まった（一致する生成物スポットを確認した。 実施例 ５ 実施例４に従し・、ペプシジンＣの代わりにペプシジン
ＢまたはペプシジンＡを用いて反応を行い、いずれもＤ
Ａ−ペプシジンが生成していることを薄層クロマトグラ
フィーによって確認した。 実施例 ６ 実施例４に従い、ペプシジンＣの代わりに、Ｎ−インバ
レリルーペンタペプタイド（ペプスタチンＡ）を用いて
反応を行い、同じく薄層クロマトグラフィーによって、
ＤＡ−ペプシジンの生成を確認した。 実施例 ７ 実施例４に従い、ペプシジンＣの代わりに、Ｎ−ｎ−ヘ
キサノイルーペンタペプタイドまたはＮ−ｎ−デカノイ
ルーペンタペプタイドを用いて反応を行い、同じ（薄層
クロマトグラフィーによってＤＡ−ペプシジンの生成を
確認した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＡ−ペプシジンの赤外線吸収スペクトルを示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の構造式 を有する、デスアシルーペプシジン。