JPS5823631A - 安定な固体の人血漿コリンエステラ−ゼ製剤の製法 - Google Patents
安定な固体の人血漿コリンエステラ−ゼ製剤の製法Info
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- JPS5823631A JPS5823631A JP57119162A JP11916282A JPS5823631A JP S5823631 A JPS5823631 A JP S5823631A JP 57119162 A JP57119162 A JP 57119162A JP 11916282 A JP11916282 A JP 11916282A JP S5823631 A JPS5823631 A JP S5823631A
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- cholinesterase
- human plasma
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ゼ水溶液から安定な固体のコリンエステラーゼ製剤を製
造する方法に係わる。
造する方法に係わる。
コリンエステラーゼ（以下ｃｈｍと記す）は人血漿中に
微量存在する酵素であり、外科手術時頻用される筋弛緩
剤壇化サクシエールコリンによる無呼吸状態の発現に対
しその投与が有効である。
微量存在する酵素であり、外科手術時頻用される筋弛緩
剤壇化サクシエールコリンによる無呼吸状態の発現に対
しその投与が有効である。
（第２４回日本輸血学会発表）
また有機燐中毒の際生体のｃｈｉは不活性化されること
からｃｈｍ製剤を投与することにより中毒症の治療にも
有効なことが考えられる。
からｃｈｍ製剤を投与することにより中毒症の治療にも
有効なことが考えられる。
一般に人血漿；リンエステラーゼの水溶液は安定性に乏
しく、その製剤は凍結乾燥により固体として提供される
のが好ましい。しかし、凍結乾燥時ならびにその後の固
体においても活性の低下が認められる。
しく、その製剤は凍結乾燥により固体として提供される
のが好ましい。しかし、凍結乾燥時ならびにその後の固
体においても活性の低下が認められる。
本発明の目的は、コリンエステラーゼの安定化、特にそ
の凍結乾燥時ならびに固化製剤の安定化にある。
の凍結乾燥時ならびに固化製剤の安定化にある。
本発明により、人血漿コリンエステラーゼ水溶液にコリ
ンエステラーゼを含む蛋白質の１重量部に対し、安定剤
としての中性アミノ酸、単糖、類、二糖類、糖アルコー
ル類またはそ、れらの混合物を０．４−９重量部添加し
、次いで凍結乾燥することからなる安定な固体コリンエ
ステラーゼ製剤の製法が提供される。
ンエステラーゼを含む蛋白質の１重量部に対し、安定剤
としての中性アミノ酸、単糖、類、二糖類、糖アルコー
ル類またはそ、れらの混合物を０．４−９重量部添加し
、次いで凍結乾燥することからなる安定な固体コリンエ
ステラーゼ製剤の製法が提供される。
従来人血漿からｃｈｍを製法するには各種の方法が報告
されており、エタノール分画法〔ジャーナル・オプ・ジ
アメリカンケミカル・ソサイエテイ（、ｙ、＊ｍ、ｃｈ
ｅｍ、ｓｏｃ、 ） ７０ ＃ ６０４９ ｍ （１９
５４）、ＤＩＥＡＩＣセルロースクロマトグラフィー法
〔カナディアン・ジャーナル・オデ・バイオケミカル・
フイジオロジー（Ｃａｎ＊Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ＊ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、 ） ３９ 。
されており、エタノール分画法〔ジャーナル・オプ・ジ
アメリカンケミカル・ソサイエテイ（、ｙ、＊ｍ、ｃｈ
ｅｍ、ｓｏｃ、 ） ７０ ＃ ６０４９ ｍ （１９
５４）、ＤＩＥＡＩＣセルロースクロマトグラフィー法
〔カナディアン・ジャーナル・オデ・バイオケミカル・
フイジオロジー（Ｃａｎ＊Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ＊ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、 ） ３９ 。
１０１３、（１９６１））、硫安分画および電気泳動法
の組合せ（Ｂｉｏｅｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃ
ｔ、ａ、） ６７゜４４１、（１９６３）］、リリンー
ル分画、硫安分画、アル建ニウム・ハイｒμオキサイｒ
ゲルによる吸着、ψ−ン電気泳動およびゲルろ過の組合
せによる方法〔デリュート（Ｂｌｕｔ） １４ ｍ ６
５ ｍ（１９６６）１、ＤＩｅＡＩ！−セルロースクロ
マトグラフィー、電気泳動（エレクトロフォーカシング
）およびゲルろ過による方法〔バイオケミカル・ジャー
ナル（Ｂｉｏｅｈｅｍ＊ ｓ ） １１６ ｅ ８７５
＃（１９７０）”３などが主なものである。
の組合せ（Ｂｉｏｅｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃ
ｔ、ａ、） ６７゜４４１、（１９６３）］、リリンー
ル分画、硫安分画、アル建ニウム・ハイｒμオキサイｒ
ゲルによる吸着、ψ−ン電気泳動およびゲルろ過の組合
せによる方法〔デリュート（Ｂｌｕｔ） １４ ｍ ６
５ ｍ（１９６６）１、ＤＩｅＡＩ！−セルロースクロ
マトグラフィー、電気泳動（エレクトロフォーカシング
）およびゲルろ過による方法〔バイオケミカル・ジャー
ナル（Ｂｉｏｅｈｅｍ＊ ｓ ） １１６ ｅ ８７５
＃（１９７０）”３などが主なものである。
更に工業的に大量製造に有利な方法としては、本発明者
等の発明になる特開昭５４−９８３０６号（被分割出願
）の方法がある。
等の発明になる特開昭５４−９８３０６号（被分割出願
）の方法がある。
この方法は、人の血漿またはコリンエステラーゼを含む
人の血漿蛋白画分を、 ピ）その蛋白濃度０−５−５ Ｔｏ （ｖ／ｖ ）にお
いて含む水性媒質ｋｐＨ３−７においてポリエチレング
リコールを加えポリエチレングリコールの濃度を３−５
４ （ｖ／ｖ ）とし、生ずる沈澱を除去し、上清を得
、上清にポリエチレングリコールを加えポリエチレング
リコールの濃度を５係より大で２５係（ｖ、／ｖ ）ま
でとし、生ずる沈澱を集める工程、（ロ） イオン強度
０．０５以下の低塩濃度、モして−４−６において陰イ
オン交換体に接触させコリンエステラーゼを吸着させ、
次いでイオン強度０．０５−〇、５のｐＨ４−１０の壇
溶液で溶離する工程、および ｅ→ その蛋白濃度０．０１−５憾（ｖ／ｖ ’）にお
いて含む水性媒質よりｐＨ４−１０において硫安の３０
−４０係飽和量および芒硝６−１０係（ｖ／ｖ ’）濃
度量の添加により生ずる沈澱を除去し、次いで上清より
硫安の３０−６０１飽和量および芒硝１０−２０４ （
ｖ／ｖ ）濃度量の添加により生ずる沈澱画分を集める
工程 上記ヒ）（ロ）および（ハ）の工程を任意の順序におい
て含むことよりなる。
人の血漿蛋白画分を、 ピ）その蛋白濃度０−５−５ Ｔｏ （ｖ／ｖ ）にお
いて含む水性媒質ｋｐＨ３−７においてポリエチレング
リコールを加えポリエチレングリコールの濃度を３−５
４ （ｖ／ｖ ）とし、生ずる沈澱を除去し、上清を得
、上清にポリエチレングリコールを加えポリエチレング
リコールの濃度を５係より大で２５係（ｖ、／ｖ ）ま
でとし、生ずる沈澱を集める工程、（ロ） イオン強度
０．０５以下の低塩濃度、モして−４−６において陰イ
オン交換体に接触させコリンエステラーゼを吸着させ、
次いでイオン強度０．０５−〇、５のｐＨ４−１０の壇
溶液で溶離する工程、および ｅ→ その蛋白濃度０．０１−５憾（ｖ／ｖ ’）にお
いて含む水性媒質よりｐＨ４−１０において硫安の３０
−４０係飽和量および芒硝６−１０係（ｖ／ｖ ’）濃
度量の添加により生ずる沈澱を除去し、次いで上清より
硫安の３０−６０１飽和量および芒硝１０−２０４ （
ｖ／ｖ ）濃度量の添加により生ずる沈澱画分を集める
工程 上記ヒ）（ロ）および（ハ）の工程を任意の順序におい
て含むことよりなる。
この方法−に用いられる原料としては人血漿そのものお
よびコリンエステラーゼを含むその各種蛋白分画、特に
α−およびβ−グロデリン画分を用いることが好ましい
。α−およびβ−グロデリン画分は人の血漿よりフィブ
リノーゲン、γ−グロデリン、アルブミンなど生物学的
薬剤を製造する際、一般に用いられる血漿蛋白分画法に
おける副産物であることは本方法の工業的意義を高くす
る。
よびコリンエステラーゼを含むその各種蛋白分画、特に
α−およびβ−グロデリン画分を用いることが好ましい
。α−およびβ−グロデリン画分は人の血漿よりフィブ
リノーゲン、γ−グロデリン、アルブミンなど生物学的
薬剤を製造する際、一般に用いられる血漿蛋白分画法に
おける副産物であることは本方法の工業的意義を高くす
る。
このα−およびβ−グロデリン画分は例えば周知のコー
ンの低温アルコール分画法の画分■又は■−４〔ジャー
ナル・オデ・ジアメリカンケミカル・ソサイエテイ（Ｊ
ａＡｆｆｉａＣｈｅｌｌｌ−８０ｅｓ ）、６８．４５
９（１９４６）〕に相当する。
ンの低温アルコール分画法の画分■又は■−４〔ジャー
ナル・オデ・ジアメリカンケミカル・ソサイエテイ（Ｊ
ａＡｆｆｉａＣｈｅｌｌｌ−８０ｅｓ ）、６８．４５
９（１９４６）〕に相当する。
人血漿あるいはコリンエステラーゼを含む血漿蛋白画分
例えばα−およびβ−グロブリン画分を蛋白濃度０．５
−５１好ましくは２−３％に懸濁し−を３〜７、好まし
くは４〜６に調整する。これ１１Ｃ１１？リエチレング
リコールを３−５ ｖ／ｖ ％となるように加え生じた
沈澱を遠心分離機を用いて分離除去し、得られた上清に
さらにポリエチレングリコールを終濃度５−２０ ｖ／
ｖ ’１となるように加え沈澱する両分を分取する。こ
の沈澱は非常に上清と分離し易く一般に用いられる分画
法の場合に必要な遠心分離機による分離やろ紙あるいは
ろ過剤を用いての分離の必要はなく単に容器を傾斜させ
上清を除去できる点で簡便であり大量製造において有利
である。
例えばα−およびβ−グロブリン画分を蛋白濃度０．５
−５１好ましくは２−３％に懸濁し−を３〜７、好まし
くは４〜６に調整する。これ１１Ｃ１１？リエチレング
リコールを３−５ ｖ／ｖ ％となるように加え生じた
沈澱を遠心分離機を用いて分離除去し、得られた上清に
さらにポリエチレングリコールを終濃度５−２０ ｖ／
ｖ ’１となるように加え沈澱する両分を分取する。こ
の沈澱は非常に上清と分離し易く一般に用いられる分画
法の場合に必要な遠心分離機による分離やろ紙あるいは
ろ過剤を用いての分離の必要はなく単に容器を傾斜させ
上清を除去できる点で簡便であり大量製造において有利
である。
得られる沈澱を純水に溶解しｐＨ４−６に調整し、同じ
−を示すイオン強度０．０５以下の低イオン強度の緩衝
液例えば酢酸緩衝液で平衡とした陰イオン交換体例えば
ＤＲＡＢ−セファデックス、ＤＩ人Ｅ−セルロースまた
はＴＦｊＡＩ！−セルロースと接触させる。ｃｈｍを吸
着した陰イオン交換体は要すれば前記低イオン強度のｉ
衝液の少量で洗浄し次いでイオン強度０．０５−０．５
、ｐＨ４−１０の緩衝液で溶離処理し溶離液を得る。
−を示すイオン強度０．０５以下の低イオン強度の緩衝
液例えば酢酸緩衝液で平衡とした陰イオン交換体例えば
ＤＲＡＢ−セファデックス、ＤＩ人Ｅ−セルロースまた
はＴＦｊＡＩ！−セルロースと接触させる。ｃｈｍを吸
着した陰イオン交換体は要すれば前記低イオン強度のｉ
衝液の少量で洗浄し次いでイオン強度０．０５−０．５
、ｐＨ４−１０の緩衝液で溶離処理し溶離液を得る。
この工程で大部分の不純物、血圧降下作用物質およびＨ
ＢａＡｇが除去される他、陰イオン交換処理前に比して
著しくその液量が少なくなるので大量処理が非常に容易
となる。
ＢａＡｇが除去される他、陰イオン交換処理前に比して
著しくその液量が少なくなるので大量処理が非常に容易
となる。
得られた溶離液をｐＨ４−１０に調整し硫安の３０−４
０１飽和に相当する量および芒硝３−１０ ｖ／ｖ ％
に相当する量を加えて沈澱する両分を除去する。さらに
その上清に硫安３０−６０４飽和相当量芒硝１０−２０
ｖ／ｖ ４相当量を添加し沈澱する両分を得る。
０１飽和に相当する量および芒硝３−１０ ｖ／ｖ ％
に相当する量を加えて沈澱する両分を除去する。さらに
その上清に硫安３０−６０４飽和相当量芒硝１０−２０
ｖ／ｖ ４相当量を添加し沈澱する両分を得る。
この工程で溶離液中に残存している不純物の大部分およ
び血圧降下作用物質が除かれるとともにｃｈｉｉの濃縮
が行える。本方法における諸工程の組み合せは、上記の
ようにぎりエチレングリコール分画け）−イオン交換ク
ロマトグラフィー（口＞−ｖ、安芒硝併用（ハ）の順序
による分画が最も望ましいが、都合によりいかなる組み
合せも適用できる。例えばイオン交換り四マトグラフイ
ーーポリエチレング１Ｊコール分画−硫安芒硝併用によ
る分画ある（Ｓは、硫安芒硝分画−イオン交換クロマト
グラフィー−ポリエチレングリコール分画等である。上
記（イ）、（ロ）（ハ）の工程の順序が好ましいのは、
ポリエチレングリコールはイオン強度に影響を与えない
ので、続いて行うイオン交換法の工程を行う場合でも一
般に用いられる分画法例えば硫安分画あるいは芒硝分画
の場合に必要な脱塩操作力１不要となることである。
び血圧降下作用物質が除かれるとともにｃｈｉｉの濃縮
が行える。本方法における諸工程の組み合せは、上記の
ようにぎりエチレングリコール分画け）−イオン交換ク
ロマトグラフィー（口＞−ｖ、安芒硝併用（ハ）の順序
による分画が最も望ましいが、都合によりいかなる組み
合せも適用できる。例えばイオン交換り四マトグラフイ
ーーポリエチレング１Ｊコール分画−硫安芒硝併用によ
る分画ある（Ｓは、硫安芒硝分画−イオン交換クロマト
グラフィー−ポリエチレングリコール分画等である。上
記（イ）、（ロ）（ハ）の工程の順序が好ましいのは、
ポリエチレングリコールはイオン強度に影響を与えない
ので、続いて行うイオン交換法の工程を行う場合でも一
般に用いられる分画法例えば硫安分画あるいは芒硝分画
の場合に必要な脱塩操作力１不要となることである。
この様にして得られた沈澱を適当な溶媒好ましくは生理
学的に受入れられる水性溶媒、例え！ｆ生理食堪水の適
量に溶解し同じ溶媒で透析し硫安および芒硝を除去する
。得られたＣｈＢ水溶液ｉｔ生狸学的に受入れられる製
剤である。
学的に受入れられる水性溶媒、例え！ｆ生理食堪水の適
量に溶解し同じ溶媒で透析し硫安および芒硝を除去する
。得られたＣｈＢ水溶液ｉｔ生狸学的に受入れられる製
剤である。
本発明の安定化方法は上記すべての方法により得られる
コリンエステラーゼ水溶液より固体製部ｊを製造する際
に適用される。
コリンエステラーゼ水溶液より固体製部ｊを製造する際
に適用される。
本発明に用いられる安定化剤としては、グ１】シン、ア
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの中性ア
ミノ酸（モノアミノモノカル筺ン酸）、グルコース、マ
ンノース、がラクトース、果糖などの単糖類、ショ糖、
麦芽糖、乳糖などの三糖類およびマンニット、キシリッ
トなどの糖アルコール類が有効である。安定化剤の添加
量）−ｉｌＣｈｌＣを含む蛋白質の１重量部に対し？
０．４〜９重量部を含有させることで十分であり、さら
に既知賦形４１を０〜０．５重量部含有させてもよ０゜
これらの添加物は相応する量を適当な水溶液に溶解し混
合する。なお添加する安定化剤を２種以上混合して使用
する場合においても添加量は総量として上記幅であれば
よい。
ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンなどの中性ア
ミノ酸（モノアミノモノカル筺ン酸）、グルコース、マ
ンノース、がラクトース、果糖などの単糖類、ショ糖、
麦芽糖、乳糖などの三糖類およびマンニット、キシリッ
トなどの糖アルコール類が有効である。安定化剤の添加
量）−ｉｌＣｈｌＣを含む蛋白質の１重量部に対し？
０．４〜９重量部を含有させることで十分であり、さら
に既知賦形４１を０〜０．５重量部含有させてもよ０゜
これらの添加物は相応する量を適当な水溶液に溶解し混
合する。なお添加する安定化剤を２種以上混合して使用
する場合においても添加量は総量として上記幅であれば
よい。
凍結乾燥時の濃度として規定すると、安定化剤は、０−
５４ ｖ／ｖ〜１０←φの水溶液として処理する。水溶
液の−は６．０〜９．０特に好ましくは−７〜８に調整
し、必要あれば除菌ｒ過を行った後、包装単位に従い１
００〜１０００単位のｃｈｍを含むように分注する。
５４ ｖ／ｖ〜１０←φの水溶液として処理する。水溶
液の−は６．０〜９．０特に好ましくは−７〜８に調整
し、必要あれば除菌ｒ過を行った後、包装単位に従い１
００〜１０００単位のｃｈｍを含むように分注する。
この分注液は急速に凍結乾燥し、凍結乾燥粉末製剤とす
る。
る。
この得られたｃｈｇを主成分とする凍結乾燥製剤の組成
は少なくともｃｈｍを含む蛋白質の１重量部に対して０
．４〜９重量部の安定化剤、必要に応じ０．５重量部ま
での賦形剤を含有するものである。
は少なくともｃｈｍを含む蛋白質の１重量部に対して０
．４〜９重量部の安定化剤、必要に応じ０．５重量部ま
での賦形剤を含有するものである。
本発明製剤の使用に際しては、注射用蒸溜水によってｃ
ｈｍの約１〜１０ ’１６ 、ｖ／ｖ溶液に調整し、静
脈内に投与する。投与量は、必要に応じて適時選択でき
るものであり、一般的には包装単位に従って使用できる
。
ｈｍの約１〜１０ ’１６ 、ｖ／ｖ溶液に調整し、静
脈内に投与する。投与量は、必要に応じて適時選択でき
るものであり、一般的には包装単位に従って使用できる
。
本発明を参考例及び実施例によって詳細に説明するが、
これらは本発明を何んら限定するものではない。
これらは本発明を何んら限定するものではない。
実施例中のＣｈＥの活性はへストリンらの方法に従ッテ
測定し１単位は３７°０１時間で１ミリモルのアセチル
コリンを分解する酵素量である。〔ジャーナル・オデ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｓ
ｍ）１８０．２４９（１９４９）１急性毒性はマウスお
よびラットに静脈内注射した場合のＬＤ５ｏより求め血
圧障子作用物質の測定は成犬を用い薬液投与前の平均動
脈圧に対する降下率によって行った。Ｈｐｓ＊ｇの測定
はＫＫミｙ ＩＪ 十字製試薬アンティヘデセル（商品
名）ヲ用いたＲＰＨＡ法（逆受身赤血球凝集反応法）に
より行った。
測定し１単位は３７°０１時間で１ミリモルのアセチル
コリンを分解する酵素量である。〔ジャーナル・オデ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｓ
ｍ）１８０．２４９（１９４９）１急性毒性はマウスお
よびラットに静脈内注射した場合のＬＤ５ｏより求め血
圧障子作用物質の測定は成犬を用い薬液投与前の平均動
脈圧に対する降下率によって行った。Ｈｐｓ＊ｇの測定
はＫＫミｙ ＩＪ 十字製試薬アンティヘデセル（商品
名）ヲ用いたＲＰＨＡ法（逆受身赤血球凝集反応法）に
より行った。
参考例１
人血漿よりコーンの低温エタノール分画法で得た画分Ｉ
Ｖ３０に９に水２５０Ｊを加え懸濁した。この懸濁液を
１Ｎ−塩酸でｐｉ−１６とした後ポリエチレングリコー
ル＃４０００を４ ｖ／ｖ ４となるように加え１時間
かきまぜ２時間静置後シャープレス遠心分離機を用いて
沈澱を分離除去し、得られた上清にさらにｆリエチレン
グリコール＃４０００を終濃度１０ ｖ／ｖ ％に加え
て１時間かきまぜ３時間静置した。容器を傾斜させて上
清を除去し沈澱を分取した。この沈澱を水２５ノで溶解
し１Ｈ−酢酸で−４，３にした後あらかじめｐ）１４・
６．０．０１ Ｍ＝酢酸緩衝液で平衡化したＤＩＥＡＢ
−セファデックスＡ−５０（乾燥重量１５０．９）を加
えて６０分間かきまぜｃｔｍを吸着させた。ｃｈｇを吸
着した上記り冨ｋＷ−セファデックスＡ−５０をｐＨ４
−４０，０１Ｍ酢酸緩衝液３１で洗った後ｐ）１６．０
．０．２Ｍ食塩を含む０．０１ Ｍ−酢酸緩衝液でＣｂ
ｌを溶離した。溶離液を１Ｎ −ＮａＯＨでｐＨ７，０
にした後硫安３５嗟飽和量および芒硝５ ｗ／ｖ ＜加
えて生じた沈澱を遠心分離機によって分離除去した。得
られた上清はさらに終濃度として硫安５０係飽和憧およ
び芒硝１５ ｖ／ｖ ４量加えて生じた沈澱を遠心分離
機によって分取した。得られた沈澱を生理食塩水２００
１に溶解後生即食塩水に対し透析を行った。透析後０．
２μのミリポアフィルタ−でろ過しＣｈＫ水溶液を得た
。
Ｖ３０に９に水２５０Ｊを加え懸濁した。この懸濁液を
１Ｎ−塩酸でｐｉ−１６とした後ポリエチレングリコー
ル＃４０００を４ ｖ／ｖ ４となるように加え１時間
かきまぜ２時間静置後シャープレス遠心分離機を用いて
沈澱を分離除去し、得られた上清にさらにｆリエチレン
グリコール＃４０００を終濃度１０ ｖ／ｖ ％に加え
て１時間かきまぜ３時間静置した。容器を傾斜させて上
清を除去し沈澱を分取した。この沈澱を水２５ノで溶解
し１Ｈ−酢酸で−４，３にした後あらかじめｐ）１４・
６．０．０１ Ｍ＝酢酸緩衝液で平衡化したＤＩＥＡＢ
−セファデックスＡ−５０（乾燥重量１５０．９）を加
えて６０分間かきまぜｃｔｍを吸着させた。ｃｈｇを吸
着した上記り冨ｋＷ−セファデックスＡ−５０をｐＨ４
−４０，０１Ｍ酢酸緩衝液３１で洗った後ｐ）１６．０
．０．２Ｍ食塩を含む０．０１ Ｍ−酢酸緩衝液でＣｂ
ｌを溶離した。溶離液を１Ｎ −ＮａＯＨでｐＨ７，０
にした後硫安３５嗟飽和量および芒硝５ ｗ／ｖ ＜加
えて生じた沈澱を遠心分離機によって分離除去した。得
られた上清はさらに終濃度として硫安５０係飽和憧およ
び芒硝１５ ｖ／ｖ ４量加えて生じた沈澱を遠心分離
機によって分取した。得られた沈澱を生理食塩水２００
１に溶解後生即食塩水に対し透析を行った。透析後０．
２μのミリポアフィルタ−でろ過しＣｈＫ水溶液を得た
。
この場合のｃｈｉの回収率は画分■から７０係で比活性
は３２単位／■であった。この比活性は人血漿中のＣｈ
ｌｌｅのそれの約１１２００倍に相当する。
は３２単位／■であった。この比活性は人血漿中のＣｈ
ｌｌｅのそれの約１１２００倍に相当する。
得られたＣｈｌＥ水溶液の性状を表１に示す。
血圧降下率は画分■では３２憾であったが本発明の方法
により得られたｃｈｕ水溶液では１．２係にまで血圧降
下作用物質は除かれた。
により得られたｃｈｕ水溶液では１．２係にまで血圧降
下作用物質は除かれた。
またＨＢＩ！Ａｇも陰性であった。
表 １
人血漿１０ノに水１０／を加えた後ＩＮ−ｔＪｒ酸でｐ
Ｈ７，０とした。これにポリエチレングリコール＃４０
００を４ ｖ／ｖ ％加え１時間かきまぜ２時間静置後
遠心機を用いて沈澱を除去し、得られた上清にさらに＆
リエチレングリコール＃ ４０００ を終濃度６ ｖ
／ｖ 嗟加えて１時間かきまぜ３時間静置した。容器を
傾斜させて上清を除去し沈澱を分取した。この沈澱を水
で溶解して１Ｎ−酢酸テｐＨ４，３ニシタ後、あらカシ
メＰＨ４，３，０，００５Ｍ−酢酸緩衝液で平衡化した
ＴＲＡＥ−セルロース（乾燥重量７０ｇ）を加え３０分
間かきまぜｃｈｇを吸着させた。ｃｈｉを吸着した上記
ＴＥＡＲ−セルロースをｐＨ４，３，０，００５Ｍ酢酸
緩衝液１１で洗った後ｐ）ｌ ６．０．０．１５ Ｍ−
食頃を含む［１，００５Ｍ酢酸緩衝液でＣＩＪを溶離し
た。溶離液をＩ Ｎ −ＮａＯＨでｐＨ７，４にした後
硫安３５係飽和量および芒硝７ｖ／ｖ ｒｌｂ加えて生
じた沈澱を遠心分離機によって除去した。得られた上清
に終濃度として硫安５０チ飽和量および芒硝１５ ｖ／
ｖ ４量、に加えて生じた沈澱を遠心分離機によって分
欧した。得られた沈澱を生理食塩水３ｄに溶解後生理食
壇水に対して透析した。透析後０．２μのミリポアフィ
ルタ−でろ過しＣｈＦｉ水溶液を得た。
Ｈ７，０とした。これにポリエチレングリコール＃４０
００を４ ｖ／ｖ ％加え１時間かきまぜ２時間静置後
遠心機を用いて沈澱を除去し、得られた上清にさらに＆
リエチレングリコール＃ ４０００ を終濃度６ ｖ
／ｖ 嗟加えて１時間かきまぜ３時間静置した。容器を
傾斜させて上清を除去し沈澱を分取した。この沈澱を水
で溶解して１Ｎ−酢酸テｐＨ４，３ニシタ後、あらカシ
メＰＨ４，３，０，００５Ｍ−酢酸緩衝液で平衡化した
ＴＲＡＥ−セルロース（乾燥重量７０ｇ）を加え３０分
間かきまぜｃｈｇを吸着させた。ｃｈｉを吸着した上記
ＴＥＡＲ−セルロースをｐＨ４，３，０，００５Ｍ酢酸
緩衝液１１で洗った後ｐ）ｌ ６．０．０．１５ Ｍ−
食頃を含む［１，００５Ｍ酢酸緩衝液でＣＩＪを溶離し
た。溶離液をＩ Ｎ −ＮａＯＨでｐＨ７，４にした後
硫安３５係飽和量および芒硝７ｖ／ｖ ｒｌｂ加えて生
じた沈澱を遠心分離機によって除去した。得られた上清
に終濃度として硫安５０チ飽和量および芒硝１５ ｖ／
ｖ ４量、に加えて生じた沈澱を遠心分離機によって分
欧した。得られた沈澱を生理食塩水３ｄに溶解後生理食
壇水に対して透析した。透析後０．２μのミリポアフィ
ルタ−でろ過しＣｈＦｉ水溶液を得た。
この場合のｃｈｉの人血漿からの回収率は６５係で比活
性は６量単位／１ｎ９であった。この比活性は人血漿の
約１０５００倍である。
性は６量単位／１ｎ９であった。この比活性は人血漿の
約１０５００倍である。
得られた水溶液の性状を表２に示す。
表 ２
参考例６
従来法（前述）の追試によってもコリンエステラーゼが
製造される。出発物は血漿を使用し回収率は血漿からの
値で示した。結果は表６に示される。
製造される。出発物は血漿を使用し回収率は血漿からの
値で示した。結果は表６に示される。
表 ６
実施例
ＣｈＥは比較的安定な酵素であるが、液状で長期−の保
存では徐々に失活してゆく。そこで参考例１で得たＣｈ
Ｅ水溶液を凍結乾燥したものおよび各種安定化剤を添加
し凍結乾燥したものについて保存安定性を見た。
存では徐々に失活してゆく。そこで参考例１で得たＣｈ
Ｅ水溶液を凍結乾燥したものおよび各種安定化剤を添加
し凍結乾燥したものについて保存安定性を見た。
安定化剤は、中性アミノ酸としてグリシンおよびアラニ
ンを、糖類としてグルコース、ショ糖、マンニットをそ
れぞれ表４に示す割合に添加して、凍結乾燥直後４℃お
よび室温で６ケ月間保存した後ｃｈＥ活性を測定し安定
剤を添加しない凍結乾燥前の値との比を％で示した。結
果を表４に示す。
ンを、糖類としてグルコース、ショ糖、マンニットをそ
れぞれ表４に示す割合に添加して、凍結乾燥直後４℃お
よび室温で６ケ月間保存した後ｃｈＥ活性を測定し安定
剤を添加しない凍結乾燥前の値との比を％で示した。結
果を表４に示す。
表 ４
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）人血漿コリンエステラーゼ水溶液にコリンエステ
ラーゼを含む蛋白質の１重量部に対し、安定剤としての
中性アミノ酸、単糖類、二糖類、糖アルコール類または
それらの混合物を０．４−９重量部添加し、次いで凍結
乾燥することからなる安定な固体コリンエステラーゼ製
剤の製法。 （２） 中性アミノ酸がグリシン、アラニン、バリン
、セイシンまたはイソロイシンである特許請求の範囲の
項第（１）項記載の方法。 （３）単糖類がグルコース、マンノース、ガラクトース
または果糖である特許請求の範囲の項第（１）項記載の
方法。 （４）二糖類が、ショ糖、麦芽糖または乳糖である特許
請求の範囲の項第（１）項記載の方法。 （５１１１アルコール類がマンニットまたはキシリット
である特許請求の範囲の項第（１）項記載の方法。 （６）人血漿コリンエステラーゼ水溶液が、人の血漿ま
たはコリンエステラーゼを含む人の血漿蛋白画分を、 （イ）その蛋白濃度０．５−５ ’１６ （ｖ／ｖ）に
おいて含む水性媒質にｐＨ３−７においてポリエチレン
グリコールを加えポリエチレングリコールの濃度を３−
５％（ｖ／ｖ）とし、生ずる沈澱を除去し、上清を得、
上清にポリエチレングリコールを加え、ポリエチレング
リコールの濃度を５係より大で２５ ％ （ｖ／ｖ ）
までとし、生ずる沈澱を集める工程、 （ロ）イオン強度０．０５以下の低塩濃度、そしてｐＨ
４−６において陰イオン交換体に接触させコリンエステ
ラーゼを吸着させ、次いでイオン強度０．０５−０．５
のｐＨ４−１０の塙溶液で溶離する工程、および ρ→ その蛋白濃度０．０ｌ−５４（ｖ／’ｖ）の水性
媒質よりｐＨ４−１０において硫安の３Ｏ−４（）’１
飽和量および芒硝３−１０４ （ｖ／ｖ ）濃度量の添
加により生ずる沈澱を除去し、次いで上清より硫安の３
０−６０１飽和量および芒硝１０−２０ ％ （ｖ／ｖ
）濃度量の添加により生ずる沈澱画分を集める工程 上記（イ）（ロ）およびＣ→の工程を任意の順序におい
て含むことにより製造されたものである特許請求の範囲
第（１）項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57119162A JPS5822445B2 (ja) | 1982-07-08 | 1982-07-08 | 安定な固体の人血漿コリンエステラ−ゼ製剤の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57119162A JPS5822445B2 (ja) | 1982-07-08 | 1982-07-08 | 安定な固体の人血漿コリンエステラ−ゼ製剤の製法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53005302A Division JPS5811929B2 (ja) | 1978-01-23 | 1978-01-23 | 人血漿コリンエステラ−ゼの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5823631A true JPS5823631A (ja) | 1983-02-12 |
| JPS5822445B2 JPS5822445B2 (ja) | 1983-05-09 |
Family
ID=14754447
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57119162A Expired JPS5822445B2 (ja) | 1982-07-08 | 1982-07-08 | 安定な固体の人血漿コリンエステラ−ゼ製剤の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5822445B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0221625U (ja) * | 1988-07-27 | 1990-02-14 | ||
| JPH0369184U (ja) * | 1989-11-13 | 1991-07-09 | ||
| CN1088583C (zh) * | 1994-05-04 | 2002-08-07 | 赛诺菲-圣德拉堡股份有限公司 | 包括蛋白质的稳定冻干配制剂和检定药包 |
| EP1189600B1 (en) * | 1999-06-30 | 2003-09-10 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Grf-containing lyophilized pharmaceutical compositions |
| JP2007326352A (ja) * | 2006-06-09 | 2007-12-20 | Ube Ind Ltd | 分離防止用器具およびセメント組成物施工用トラック |
-
1982
- 1982-07-08 JP JP57119162A patent/JPS5822445B2/ja not_active Expired
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0221625U (ja) * | 1988-07-27 | 1990-02-14 | ||
| JPH0369184U (ja) * | 1989-11-13 | 1991-07-09 | ||
| CN1088583C (zh) * | 1994-05-04 | 2002-08-07 | 赛诺菲-圣德拉堡股份有限公司 | 包括蛋白质的稳定冻干配制剂和检定药包 |
| EP1189600B1 (en) * | 1999-06-30 | 2003-09-10 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | Grf-containing lyophilized pharmaceutical compositions |
| US8431534B2 (en) | 1999-06-30 | 2013-04-30 | Merck Serono Sa | GRF-containing lyophilized pharmaceutical compositions |
| JP2007326352A (ja) * | 2006-06-09 | 2007-12-20 | Ube Ind Ltd | 分離防止用器具およびセメント組成物施工用トラック |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5822445B2 (ja) | 1983-05-09 |
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