JPS58224687A - Plasminogen-activation enzyme agent and novel process for preparation thereof - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain a high-purity plasminogen-activation enzyme in high recovery, minimizing the loss of activity, by preparing crude enzyme by the acetone fractionation of bile, and purifying the enzyme with Sepharose bonded with fibrin. CONSTITUTION:A crude material containing plasminogen-activation enzyme and prepared by the acetone-fractionation of bile, is purified by chromatography using Sepharose bonded with fibrin and preferably a resin having molecular sieve property. The solvent in the obtained fraction is substituted with purified water or physiological saline water, preferably mixed with a compound selected from polyoxyethylene sorbitan monooleate, hydrolyzed gelatin, dextran, gelatin, mannitol, dextrin, glycine, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, and albumin, and if ncessary, the product is freeze-dried.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はプラスミノーゲン活性化酵素剤及びその新規製
造方法に関し、更に詳しくはプラスミノーゲン活性化酵
素を含む粗原料を処理するに当り、活性の損失を最小限
に抑え、高純度の目的酵素を回収するための製造方法と
得られる酵素剤に関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a plasminogen activating enzyme agent and a new method for producing the same, and more specifically, the present invention relates to a plasminogen activating enzyme agent and a new method for producing the same, and more specifically, a method for minimizing loss of activity when processing crude raw materials containing plasminogen activating enzyme. The present invention relates to a production method for recovering a target enzyme of high purity and the resulting enzyme preparation.

酵素は動・植物界に広く分布し、その生命の維持に重要
な位置を占めるものが多く、特に近来２人体に関しても
循環器関係、抗悪性腫瘍などの分野に於ても広く酵素製
剤の活性が認めらｔ＋、多種類の酵素が分離され薬剤と
して臨床に供され、卓効を示すものも多く知られ販売も
されて来ている。酵素を人体に適用する場合はその効果
を発揮させるために、高純度及びその維持が要求される
処、酵素はそれ自体不安定な性質を有するものが多く、
特に熱、水分の如く普遍的に存在する要素によって大巾
な活性低下を来ブζし、そのため９種々の酵素について
その製造方法と共に安定化方法が開発されているが。Enzymes are widely distributed in the animal and plant kingdoms, and many of them play an important role in maintaining life.Especially in recent years, the activity of enzyme preparations has been widely used in fields such as the human body, circulatory system, and anti-malignant tumors. Since t+ has been recognized, many types of enzymes have been isolated and put into clinical use as drugs, and many of them are known to be highly effective and are also on sale. When applying enzymes to the human body, high purity and maintenance are required in order to exert their effects, but many enzymes themselves have unstable properties.
In particular, ubiquitous elements such as heat and moisture can cause a drastic reduction in activity, and for this reason, methods for producing and stabilizing nine different enzymes have been developed.

酵素組成は千差万別であり、そのため酵素の性質も全て
異なり、同じ系統に属する酵素であってもその処理方法
、安定化物の種類及濃度によっても得られた目的物の活
性が犬きく相違し。Enzyme compositions vary widely, and as a result, the properties of enzymes are also all different, and even if enzymes belong to the same family, the activity of the target product obtained can vary greatly depending on the processing method, type and concentration of stabilizers. death.

製造方法も酵素毎に開発しなけれはならないのが現状で
ある。Currently, a manufacturing method must be developed for each enzyme.

従来、開発されて来た技術の一部を略載する。Some of the technologies that have been developed so far are briefly listed below.

■特公昭４０−１０９５３ 細菌性グロテアーゼに７０％以上のソルビットを存在さ
せる。■Special Publication No. 40-10953 Presence of 70% or more sorbitol in bacterial grotease.

（２）特公昭４１−１５２ 細菌アミラーゼに１）ゼラチンかカゼイン、１１）多価
アルコ−シカ１ＩＸＬｉｉｉｌエヂルアルコールの３者
を存在させる。(2) Japanese Patent Publication No. 41-152 Bacterial amylase contains three substances: 1) gelatin or casein, and 11) polyhydric alcohol.

■特公昭４１−４３９４ 肝臓カタラーゼをグリシン、乳糖１食塩、クエン酸Ｎａ
の内の１と冷凍乾燥する。■Special Publication No. 41-4394 Liver catalase with glycine, lactose 1 salt, citrate Na
Freeze-dry with one of the following.

■特公昭４１−１６５４１ α−アミラーゼにリジン、アルギニ／、ヒスチジン、グ
ルタミン酸Ｎａの内の１と乾燥する。■Special Publication No. 41-16541 α-Amylase is dried with lysine, arginine/histidine, and one of glutamate Na.

■特公昭４４−８０７２ 肝カタラーゼをタマリ／ド種子多糖類、コンドロイチン
硫酸Ｎａ　＋　可溶性デンフ゛ン、アルギン酸の内の１
と凍結乾燥する。■Special Publication No. 44-8072 Liver catalase is combined with tamari seed polysaccharide, chondroitin sulfate Na + soluble starch, and one of alginic acid.
and lyophilize.

■特公昭４６−２９７８６ Ｌ−アスパラギナーゼにＥＤＴＡ　、ジピコリン酸など
の錯化合物を存在させる。■Japanese Patent Publication No. 46-29786 A complex compound such as EDTA and dipicolinic acid is present in L-asparaginase.

■特公昭４６−４１５９３ Ｌ−アスパラキナーゼにＬ−アスノくラギン酸。■Tokuko Showa 46-41593 L-asparakinase and L-asunochragic acid.

Ｌ−グルタミン酸など酸性アミノ酸の塩を存在させる。A salt of an acidic amino acid such as L-glutamic acid is present.

■特公昭４７−８９９’ Ｌ−アスパラギナーゼにクリシン又はアラニンを存在さ
せる。(1) Japanese Patent Publication No. 47-899' Presence of chrysine or alanine in L-asparaginase.

■特公昭４８−７７９７ アミターゼにα−アミノ酸を存在させる。■Tokuko Showa 48-7797 Presence of α-amino acid in amitase.

（り特公昭４Ｒ−３２３４７ 細菌プロテアーゼにＰＶＡ　、　ＣＭＣ、ヒトｐキシプ
ロピルスターチ、デキストリンの内の１を存在させる。(Patent Publication No. 4R-32347) Presence of one of PVA, CMC, human p-xypropyl starch, and dextrin in bacterial protease.

■特開昭５ｆ＋−１４２７９０ コエンザイムＡにβ−サイクロテキスト１ノンを存在さ
せる。■JP-A-5F+-142790 Presence of β-cyclotext 1 non in coenzyme A.

０特開昭５２−４７９８４ エラスターゼをテキストランと凍結乾燥する。0 Japanese Patent Publication No. 52-47984 Textran and lyophilize elastase.

０特開昭５６−４３２３３ ウロキナーゼをゼラチン又はアルブミンの存在下に加熱
処理する。0 JP-A-56-43233 Urokinase is heat treated in the presence of gelatin or albumin.

従来技術は上記の如くであるが、明細書中の記載によっ
て ０社７０チ以下の濃度では活性の維持が極端に落ちる。The prior art is as described above, but as stated in the specification, the maintenance of activity is extremely poor at concentrations below 0.70%.

■はゲルコールは無効である。■Gelcol is ineffective.

■はマンノース、ソルボース、リボースなトハ無効。■: Mannose, sorbose, and ribose are invalid.

■はグリシン、６価アルコール、食塩、クエン酸Ｎａは
無効。■Glycine, hexahydric alcohol, salt, and sodium citrate are ineffective.

■は同量を添加してもアミノ酸の種類により回収率は２
０数チから７０数チまτ一定しない。■Even if the same amount is added, the recovery rate is 2 depending on the type of amino acid.
τ is not constant from 0-plus to 70-plus.

Ｏはイノジット、デンプン、タマリンド種子多糖類は無
効。O is inojit, starch, and tamarind seed polysaccharide are ineffective.

Ｏは蔗糖、マンニット、リジン、　ＥＤＴＡ、食塩は無
効。O is sucrose, mannitol, lysine, EDTA, and salt are ineffective.

などの事が明らかであり、上記の事実が現状をも裏付け
ている。It is clear that the above facts support the current situation.

本発明者らは先に従来の物質より顕著な効果と低毒性を
有するプラスミノーゲン活性化酵素を発見した。The present inventors have previously discovered a plasminogen activating enzyme that has more pronounced effects and lower toxicity than conventional substances.

その物質の更なる製造方法に関して種々研究を重ねてい
た処、Ｓ著な回収率と純度向上を示す製造方法を開発し
１本発明を完成させたものである。すなわち、精製工程
のうち２分子篩効果を有する樹脂による操作の段階でプ
ラスミノーゲン活性化酵素の回収が２０〜４０％と極端
に低下する事及び尿素の存在下での操作、凍結乾燥によ
っても活性が低下する事からこの工程について改良した
のが本発明である。従って本発明の特徴とする処は１本
酵素の製造方法にフィブリンを結合させたセファロース
（以下フィブリン−セファロースと称する）のクロマト
を利用した事と、上記の製造工程の段階に於ていくつか
の安定化のだめの物質を共存させた事である。As a result of various research into further methods for producing this substance, we developed a production method that significantly improved the recovery rate and purity of S, and completed the present invention. That is, during the purification process, the recovery of plasminogen activating enzyme is extremely reduced to 20-40% during the operation using a resin that has a bimolecular sieve effect, and the activity is also reduced by operation in the presence of urea and freeze-drying. The present invention improves this process because of the decrease in Therefore, the characteristics of the present invention are as follows: 1. The method for producing this enzyme utilizes chromatography of fibrin-bonded Sepharose (hereinafter referred to as fibrin-Sepharose), and several steps in the above production process. This is because a stabilizing substance coexists.

本発明は主に昭和５４年３月３０日に出願した特開昭５
５−１３０９１吋に係る豚の胆汁より得られたプラスミ
ノーゲン活性化剤を被検酵素として用いた。The present invention is mainly based on the Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 1973-1992, filed on March 30, 1975.
A plasminogen activator obtained from pig bile according to No. 5-13091 inch was used as the test enzyme.

本酵素は従来行って来たボビンフィブリノーゲン（シグ
マ社製）に加え、新たにヒユーマンフィブリノーゲン（
イムコ社製）によってフィブリン平板をつく９．ウロキ
ナーゼとの線維素溶解活性の特異性の有無について試験
した処。In addition to the conventional bobbin fibrinogen (manufactured by Sigma), this enzyme has been newly added to human fibrinogen (manufactured by Sigma).
9. Make a fibrin plate using the Imco Co., Ltd. product. The presence or absence of specificity of fibrinolytic activity with urokinase was tested.

予め、リジンセファロースによってプラスミノーゲンを
完全に除去したフィブリン平板では両者とも線溶活性を
全く示さなかったが、プラスミノーゲンを含む状態では
ウロキナーゼがボビン由来のフィブリン平板に於て線溶
活性を強く示Ｌ（１４，５Ｘ１２）、　　ヒユーマン由
来のフィブリン平板では弱い活性しか示さなかった（６
Ｘ６１のに対し９本酵素はボビン由来のフィブリ／平板
（１１，５Ｘ９．５）、　　ヒユーマン由来のフィブリ
ン平板（９Ｘ９１ともほぼ同様な線溶活性を示し、各々
のフィブリン平板に対しても両者顕著な特異性を示した
。Fibrin plates from which plasminogen had been completely removed using lysine sepharose showed no fibrinolytic activity in either case, but urokinase showed strong fibrinolytic activity in bobbin-derived fibrin plates when plasminogen was present. L(14,5X12), human fibrin plates showed only weak activity (6
Compared to showed specificity.

本発明で用いた）（プリン−セファロースは以下の如く
にして製造した。Purine-Sepharose (used in the present invention) was produced as follows.

スウェーデン国ファルマシア社製のセファロース４Ｂ５
００ｍ／を洗浄ののち＋　　１１の水を加えて、攪拌下
にＩＯＭの水酸化ナトリウムでｐＨを１１〜１２に病弊
し、水２．５Ｉ！に溶解したシアン化臭素１２５ｇを徐
々に株加し＋ｐＨ１１〜１２となるように水酸化、ナト
リウムの添加を続け９反応終了後は速やかにガラスフィ
ルター上で冷水洗浄し、０．１Ｍの硼酸緩衝液でｐＨを
９．３に調整した。次いでｐＨ９，３の０、ＩＭ硼酸緩
衝液１５０ｍ／で平衡化したりジン−セファロースによ
りプラスミノーゲンを除去されたボビン由来のフィブリ
ノーゲン１５ｇを加え、４℃で１２時間処理しプラスミ
ノーゲンを除去したフィブリノーゲン結合のセファロー
ス４Ｂを得た。更に得られたフィブリノーゲン−セファ
ロース４Ｂヲｐｎ７．４の０．１ＭＩＪン酸緩衝液で洗
浄し、１０−のトロンビン（５０００単位、２５チグリ
セリン、持田社製）で室温下１〜２時間処理ののち、ｐ
Ｈ７，４の０．０２Ｍ　Ｉ７７酸緩衝液、２Ｍの尿素を
含むｐＨ８，０のパリラッシュ氏緩衝液で順次洗浄して
完了した。Sepharose 4B5 manufactured by Pharmacia, Sweden
After washing 00ml, add 11 liters of water, adjust the pH to 11-12 with IOM sodium hydroxide under stirring, and add 2.5 liters of water! Gradually add 125 g of bromine cyanide dissolved in the solution and continue adding hydroxide and sodium so that the pH becomes +11 to 12.9 After the reaction is completed, immediately wash the glass filter with cold water and add 0.1M borate buffer. The pH was adjusted to 9.3. Next, 15 g of fibrinogen derived from a bobbin that had been equilibrated with 150 m/m of IM borate buffer at pH 9.3 or from which plasminogen had been removed with Gin-Sepharose was added, and the fibrinogen was treated at 4°C for 12 hours to remove plasminogen. A combined Sepharose 4B was obtained. The resulting fibrinogen-Sepharose 4B opn 7.4 was further washed with 0.1 MIJ acid buffer, and treated with 10-thrombin (5000 units, 25 tiglycerin, manufactured by Mochida) for 1 to 2 hours at room temperature. , p
Washing was completed by sequentially washing with 0.02M I77 acid buffer of H7.4 and Parisash's buffer of pH 8.0 containing 2M urea.

この明細書中で使用されている略記号の解説”　ＰＥＧ
　”はポリエチレングリコールであり、その後の数字は
大体の分子量を表わす。Explanation of abbreviations used in this specification” PEG
” is polyethylene glycol, and the numbers after it represent the approximate molecular weight.

”Ｔｗｅｅｎ８０”はポリオキシエチレン・ソルビタン
・モノオレイトである。"Tween80" is polyoxyethylene sorbitan monooleate.

Ｗ″ＤＭＳＯ”はジメチルスルフオキシドである。W"DMSO" is dimethyl sulfoxide.

″ＰＶＡ　’　　はポリビニルアルコールである。"PVA" is polyvinyl alcohol.

１ＥＧ　’はエチレングリコールである。1EG' is ethylene glycol.

”ＳＤＳ’ｕドデシル硫酸ナトリウムである。``SDS'u Sodium Dodecyl Sulfate.

”　ＦＪＤＴＡ　”はエチレンジアミン四酢酸である。"FJDTA" is ethylenediaminetetraacetic acid.

’　ｐｖｐ　”　　はポリビニルピロリドンである。'pvp' is polyvinylpyrrolidone.

”　ＣＭＣ−Ｎａ　’はカルボキシメチルセルローズナ
トリウムである。"CMC-Na' is sodium carboxymethyl cellulose.

“ゼラチン加水分解物”はゼラチンをｐＨ２きしたのち
オートクレーブで１２０℃３０分処理し、水酸化ナトリ
ウムでｐＨを８に戻し。The "gelatin hydrolyzate" was prepared by raising the pH of gelatin to 2, treating it in an autoclave at 120°C for 30 minutes, and returning the pH to 8 with sodium hydroxide.

食塩濃度を生理的食塩水濃度に合わせるか、ゼラチンを
そのままオートクレー１９１２０３３０分処理したもの
を用いた。The salt concentration was adjusted to the physiological saline concentration, or gelatin treated with autoclay 19120330 for 30 minutes was used as it was.

実施例２以降の線溶活性はフィブリン平板法を用い測定
した。フィブリン平板は次のようにして製造した。The fibrinolytic activity from Example 2 onwards was measured using the fibrin plate method. Fibrin plates were manufactured as follows.

ボビンフィブリノーゲン（シグマ社製フラクシ目ンＩ）
４００ｑを３７℃に保温したパリラッシュ氏緩衝（ｐＨ
７，４１１００ｍ１に溶解せしメツコレをｒ遇する。Ｃ
液を１０１ｆｆＪづつシャーレに分注し。Bobbin fibrinogen (Flaximeta I manufactured by Sigma)
400q was kept at 37℃ in Paris-Rasch buffer (pH
7,41100ml of water was dissolved and treated. C
Dispense the liquid into petri dishes in amounts of 101 ffJ.

０．５Ｍの塩化カルシウムを１−づつ添加し、よく混合
する。すげやくトロンビン（持田社１１１２５ユニット
／−を０．２−づつ添加し、よく混合し。Add 0.5M calcium chloride in portions and mix well. Add Thrombin (Mochida Co. 11,125 units/-) in 0.2-unit increments and mix well.

室温で１〜２時間放置して調製し、４℃で保存し、１チ
月以内に使用した。It was prepared by standing at room temperature for 1 to 2 hours, stored at 4°C, and used within one month.

線溶活性は各々の被検液１０μＥを上記の如く調製した
フィブリン平゛板にマイクロシリンジにて滴下し、３７
℃に維持し、２１時間後の活性を測定し、長径×短径（
ｆｆｉｌｌＸＩＩＩ）で表示した。Fibrinolytic activity was determined by dropping 10μE of each test solution onto the fibrin plate prepared as above using a microsyringe.
The activity was measured after 21 hours, and the major axis x minor axis (
ffillXIII).

実施例中に用いられている略語及び用法を説明する。Abbreviations and usage used in the Examples are explained.

Ｓｌｉｇｈｔ　　　溶解は認められるが真１測不能であ
るもの。Slight: Dissolution is observed but cannot be determined.

ｉ、ｄ、　　　　溶解とは認められないもの。i, d, Those that cannot be recognized as dissolving.

Ｃ１ｏｕｄｙ　　　溶解は認められるが溶解面が不明瞭
で計測不能であるもの。C1oudy Dissolution is observed, but the dissolution surface is unclear and cannot be measured.

−溶解は認められない。- No dissolution observed.

実施例１゜ ■　豚Ｗ　汁２．５　ｔの５０％アセトン分画により得
られた５０ｇの原末に常法通り３０〜５０％アセトン分
画を施し、得られた沈澱物を５Ｍ尿素。Example 1゜■ 50 g of bulk powder obtained by fractionating 2.5 tons of pork juice with 50% acetone was subjected to 30 to 50% acetone fractionation in a conventional manner, and the resulting precipitate was diluted with 5M urea.

１０％の硫安、１チの食塩を含有する０、０５Ｍ）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に浴解し、不溶物を除去した
。The mixture was dissolved in a 0.05M) lithium-hydrochloric acid buffer (pH 8.0) containing 10% ammonium sulfate and 1% common salt to remove insoluble matter.

■　この溶液を上記緩衝液で平衡化したフェニル−セフ
ァロースＣＬ−４Ｂを充填し九カラムに注入し、同緩衝
液で洗浄ののち濃度を３チに下けた同緩衝液で浴出する
部分と硫安を含有しない同緩衝液で溶出する部分を集め
、限外濾過により濃縮し、２Ｍ尿素を含むパリラッシュ
氏緩衝液（ｐＨ８，０）で置換し、全景を１００ｍ１と
した。■ This solution was filled with phenyl-Sepharose CL-4B equilibrated with the above buffer solution, injected into a 9-column, washed with the same buffer solution, and then bathed with the same buffer solution whose concentration was lowered to 3. The fraction eluted with the same buffer containing no urea was collected, concentrated by ultrafiltration, and replaced with Parisash's buffer (pH 8,0) containing 2M urea, making the total volume 100 ml.

■　この溶液を上記緩衝液で平衡化したフィブリン−セ
ファロース４Ｂを充填したカラムに注入し。(2) This solution was injected into a column filled with fibrin-Sepharose 4B equilibrated with the above buffer.

同緩衝液で洗浄ののち、１Ｍ食塩を含む、同緩衝液て溶
出する部分を集め、限外濾過により１００１まで濃縮し
た。After washing with the same buffer, the portion containing 1M sodium chloride and eluted with the same buffer was collected and concentrated to 1001 by ultrafiltration.

■　この溶液を２Ｍ尿素、１チの食塩、　　Ｏ，ＯＳチ
のＴｗｅｅｎ　８０を含有する０、０５Ｍ）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ８，０）で平衡化した庵ファデックスＧ−１
５０に注入し、同緩衝液で溶出する部分を集め。■ This solution was equilibrated with 0.05M) Lis-HCl buffer (pH 8.0) containing 2M urea, 1T of common salt, and 0.05M of Tween 80.
50, and collect the part that elutes with the same buffer.

限外濾過により１００＊Ｊまで濃縮した。Concentrated to 100*J by ultrafiltration.

■　■の工程を再度繰り返し、プラスミノーゲン活性化
酵素を含むｘｏｏｍｌの緩衝溶液を得た。② Step ② was repeated again to obtain xooml buffer solution containing plasminogen activating enzyme.

対象として■の工程で１％のグリシンを含有させた製造
例との線溶活性を比較した。As a control, the fibrinolytic activity was compared with a production example in which 1% glycine was added in step (2).

０．０５％Ｔｗｅｅｎ　８０を用いたもの　　１％グリ
シンを用いたもの実施例２゜ 実施例１の■工程で得られた活性留分に各種物質を所定
の濃度を添加して４℃に維持し、１０日後、１５日後、
２３日後、４０日後の線溶活性を測定した。Using 0.05% Tween 80 Using 1% glycine Example 2 Various substances were added at predetermined concentrations to the active fraction obtained in step 1 of Example 1 and maintained at 4°C. , 10 days later, 15 days later,
Fibrinolytic activity was measured after 23 days and 40 days.

対象　　０日後　　１０日後　　１５日後　　２３日後
　　４０日後６ｘ６　　　４Ｘ４．５　　４５Ｘ５．５
　　　４Ｘ４　　　　Ｓｌ１ｇｈｔ５ｘ５．５　　　３
．５ｘ３．５　　　４．５ｘ４．５　　　３．５ｘ４　
　　　２ｘ２ＥＧ４００ ０．０１チ　　４．５Ｘ５．５　　　５Ｘ５　　　３Ｘ
３．５　　　４Ｘ４０．１％　　５　ｘ５．５　　　５
ｘ５　　　　Ｃ１ｏｕｄｙ　　　　ｋ、ｄ−０，５％　
　４．５ｘ４．５　　　４ｘ４　　　　　ｉ、ｄ、　　
　　　ｉ、ｄ。Target 0 days later 10 days later 15 days later 23 days later 40 days later 6x6 4X4.5 45X5.5
4X4 Sl1ght5x5.5 3
．． 5x3.5 4.5x4.5 3.5x4
2x2EG400 0.01chi 4.5X5.5 5X5 3X
3.5 4x40.1% 5 x5.5 5
x5 C1oudy k, d-0,5%
4.5x4.5 4x4 i, d,
i, d.

１％　　３．５ｘ　４　　　１．ｃＬ　　　　　１．ｄ
、Ｌ−ｄ。1% 3.5x 4 1. cL 1. d
, L-d.

ＰＥＧ１５００ ０．０１％　　４．５ｘ　５　　４．５Ｘ　５　　　３
　Ｘ３．５　　　ＳｌｉｇｈｔＯ０１チ　　４　ｘ　５
　　３．５ｘ３．５　　　１−ｄ−１−ｄ・０．５％　
　４　Ｘ４３　　３．５Ｘ　４　　　１．ｄ、　　　　
　１．ｄ。PEG1500 0.01% 4.5x 5 4.5x 5 3
X3.5 SlightO01chi 4 x 5
3.5x3.5 1-d-1-d・0.5%
4 X43 3.5X 4 1. d,
1. d.

１　％　　４．ｓｘ　ｓ　　　　４　ｘ　４　　　　ｉ
−ｄ、ｉ、ｄ。1% 4. sx s 4 x 4 i
-d, i, d.

ＰＥＧ４０００ ０．０１％　　　４．５Ｘ５．５　　５Ｘ５　　　４　
Ｘ５　　　３　Ｘ３．５ｏ、ｉ％　　６Ｘ６　　　６Ｘ
６　　３．５Ｘ４　　　５Ｘ５０５％　　５．５Ｘ６　
　　６ｘ６　　４．５Ｘ４．５　　６Ｘ６１％　　５　
Ｘ　６　　６　Ｘ　６　　　３　Ｘ３３　　　Ｃ１ｏｕ
ｄｙＰＥＧ６０００ ０．０１％　　６　Ｘ６．５　　５　ｘ　５　　　　ｉ
、ｄ、　　　　　１．ｄ。PEG4000 0.01% 4.5X5.5 5X5 4
X5 3 X3.5o, i% 6X6 6X
6 3.5X4 5X505% 5.5X6
6x6 4.5X4.5 6X61% 5
X 6 6 X 6 3 X33 C1ou
dyPEG6000 0.01% 6 x 6.5 5 x 5 i
,d,1. d.

０．１　％　　　５　ｘ　６　　　５　ｘ　５　　　Ｃ
１ｏｕｄｙ　　　４　ｘ　４０．５％　　６Ｘ６　　　
５ｘ５　　　　　＃　　　　　３Ｘ３．５１０日後　　
　１５日後　　２３日後　　４０日後Ｔｗｅｅｎ　８０ ０．０１％　　　　６　Ｘ　７　　　７　ｘ　７　　　
４３Ｘ４．５　　　　Ｃ１ｏｕｄｙＯ４０５％　　　６
　Ｘｌ）５　　　６　Ｘ　６　　　５．５Ｘ５．５　　
　４　Ｘ４．５０．１％　　　６Ｘ６　　　４．５Ｘ５
．５　　　４Ｘ６　　　４．５Ｘ５ＭＳＯ １％　　　　６ｘ６５　　５Ｘ５　　　３５Ｘ３Ｂ　　
　　　＋、ｄ−ｉｏ％　　　５　ｘ５．５　　　４　Ｘ
４．５　　　３　Ｘ３．５　　　　　ｉ−ｄ。0.1% 5 x 6 5 x 5 C
1oudy 4 x 40.5% 6X6
5x5 #3x3.510 days later
15 days later 23 days later 40 days later Tween 80 0.01% 6 x 7 7 x 7
43X4.5 C1audyO405% 6
Xl) 5 6 X 6 5.5X5.5
4 X4.50.1% 6X6 4.5X5
．． 5 4X6 4.5X5MSO 1% 6x65 5X5 35X3B
+, d-io% 5 x5.5 4 X
4.5 3 X3.5 i-d.

２５％　　　３．５Ｘ　５　　　５　Ｘ　５　　　３．
５Ｘ３．５　　　　　ｉ−ｄ。25% 3.5X 5 5 X 5 3.
5X3.5 i-d.

デキストランＴ−１０ ｏ、ｏｉ％　　５ｘ５．５　　４Ｘ４　　　３Ｘ３　　
　４Ｘ４０．１％　　４．５Ｘ５　　　４Ｘ４　　３．
５Ｘ３．５　　３Ｘ３０５％　　５Ｘ５．５　　４Ｘ４
　　３．５Ｘ４．５　　３Ｘ３１％　　６　Ｘ　６　　
　４　Ｘ　４　　　４　Ｘ　４　　　Ｃ１ｏｕｄｙゼラ
チン加水分解物 ０゜０１％　　５　Ｘ５．５　　３．５Ｘ　４　　　　
　　　　　５　Ｘ５，５０１％　　５．５Ｘ６　　　５
Ｘ５．５　　４．５Ｘ５　　　５Ｘ５０．５チ　　６Ｘ
７　　　７Ｘ７　　５．５Ｘ６　　　５Ｘ５．５１　％
　　６Ｘ７　　　５Ｘ６　　５．５Ｘ６　　　５Ｘ５ゼ
ラチン ０．０１％　　５．５ｘ６　　４３ｘ５　　　３ｘ４．
５　　４ｘ４０１％　　５Ｘ５．５　　５ｘ５．５　　
４ｘ４　　．５ｘ５０．５チ　　６Ｘ６　　　６ｘ６　
　　６ｘ６　．６Ｘ６１％　　　６Ｘ６　　　７Ｘ７　
　　６Ｘ６　　　６Ｘ６１Ｏ日後　　　１５日後　　　
２３日後　　　４０日後マンニット ０．０１係　　５．５Ｘ６　　５．５Ｘ５．５　　３Ｘ
３　　４．５Ｘ４．５０１％　　６．５Ｘ　７　　５．
５Ｘ５．５　　４　ｘ４，５　　５　ｘ５．５０．５％
　　５．５ｘ５．５　　５　Ｘ５．５　　３　Ｘ　４　
　３．５ｘ３．５１　チ　　　　トｄ、　　　　　　＋
−ｄ−−一ソルビット ０．０１％　　５　Ｘ５．５　　５　Ｘ５．５　　４　
Ｘ　４　　　４　Ｘ　４ｏ、ｉ％　　５Ｘ５　　４．５
ｘ５．５　　　　　　　　４ｘ４０５チ　　５Ｘ５　　
４．５Ｘ４．５　　３Ｘ３　　　４ｘ４１％　　ｉ−ｄ
、Ｉ−ｄ、−− ＭＣ−Ｎａ ０Ｄ１２５％　　５　Ｘ５．５　　５　Ｘ　５　　　３
　Ｘ　４　　　Ｃ１ｏｕｄｙＯ９２５％　　５　Ｘ５．
５　　５　ｘ　６　　３．５ｘ３．５　　　Ｓｌｉｇｈ
ｔＶＰ ０．０１％　　５　Ｘ５．５　　４．５Ｘ５．５　　３
．５Ｘ　４　　　３　Ｘ３５０．１％　　４．５Ｘ　５
　　　５　Ｘ　６　　　３　Ｘ３．５　　３．５Ｘ４．
５０．５％　　５　Ｘ５，５　　５　Ｘ５．５　　　Ｃ
１ｏｕｄｙ　　　４　ｘ４．５１％　　５Ｘ５　　　５
Ｘ５　　３．５Ｘ：３５　　４ｘ４．５デキストリン ０．０１％　　　５　Ｘ５．５　　５　Ｘ　６　　　　
Ｃ１ｏｕｄｙ　　　５１１ｇＭ０．１　％　　　６．５
Ｘ　７　　５．５ｘ５．５　　　　　　　　　５Ｏ３５
％　　５．５Ｘ５５５．５Ｘ５．５　　　　＊　　　　
４ｊ）Ｘ４．５１　％　　５　Ｘ　５　　　５　ｘ５．
５　　３．５Ｘ　４　　４．５Ｘ４．５１０日後　　　
１５日後　　　２３日後　　　４６日後ｎ−プロピルパ
ラベン ０．０２％　　　５Ｘ５．５　　　５Ｘ５　　　４Ｘ４
　　　　ＳｌｉｇｈｔＯ，１％　　　　５　ｘ　５　　
　４．５ｘ　６　　　　Ｃ１ｏｕｄｙ　　　　　１．ｄ
−グリシン ０．０１％　５　Ｘ５．５　４　Ｘ　５　　　ｉ、ｄ、
ＳｌｉｇｈｔＯ１％　６．５ｘ　７　４．５Ｘ　６　　
Ｃ１ｏｕｄｙ　　３　Ｘ　３０．５％　５．５Ｘ５．５
　５　Ｘ５．５　　　　３　Ｘ　３１％　５ｘ５　５ｘ
５　３．５ｘ４　４ｘ４ＤＴＡ ００２％　４　ｘ　５　４．５Ｘ　５　　Ｃ１ｏｕｄｙ
　　３　Ｘ　３ｏ、２ｑｂ　　４Ｘ４．５　５Ｘ５．５
　　　　３Ｘ３１％　４．５ｘ　５　５　ｘ　５　　　
　　Ｃ１ｏｕｄｙ５％　４．５ｘ５　５．５ｘｆ、　　
　＃アルブミン ０ΩＯ１％　４　Ｘｔ５　５　ｘｓ５　２．５ｘ　３　
　３　Ｘ３．５０．０１％　　５．５Ｘ６．５　６　Ｘ
６．５　５　Ｘ５．５　４．５Ｘ　５０．５チ　６．５
ｘ７　　６．５ｘ７　　５　ｘ５　　５．５Ｘ６１％　
６Ｘ６　　６Ｘ６．５　５Ｘ５．５　５Ｘ５Ｇ １％　６Ｘ６　　５Ｘ６　　３Ｘ３　　４Ｘ４１０％　
３．５ｘ　４　　３　ｘ３．５　２．５Ｘ　３　　−ア
プロチニン １０Ｌｌｎｉｔ　　　２　Ｘ２　　　３　ｘ４　　　Ｃ
１ｏｕｄｙ　　　　ｉ、ｄ。Dextran T-10 o, oi% 5x5.5 4X4 3X3
4X40.1% 4.5X5 4X4 3.
5X3.5 3X305% 5X5.5 4X4
3.5X4.5 3X31% 6 X 6
4 X 4 4 X 4 C1oudy gelatin hydrolyzate 0°01% 5 X5.5 3.5X 4
5 X5,501% 5.5X6 5
X5.5 4.5X5 5X50.5chi 6X
7 7X7 5.5X6 5X5.51%
6X7 5X6 5.5X6 5X5 gelatin 0.01% 5.5x6 43x5 3x4.
5 4x401% 5x5.5 5x5.5
4x4. 5x50.5chi 6x6 6x6
6x6. 6X61% 6X6 7X7
6×6 6×610 days later 15 days later
23 days later 40 days later Mannitol 0.01 5.5X6 5.5X5.5 3X
3 4.5X4.501% 6.5X 7 5.
5X5.5 4 x4, 5 5 x5.50.5%
5.5x5.5 5 x5.5 3 x 4
3.5x3.51 chitod, +
-d--Sorbit 0.01% 5 X5.5 5 X5.5 4
X 4 4 X 4o, i% 5X5 4.5
x5.5 4x405chi 5X5
4.5X4.5 3X3 4x41% i-d
, I-d, -- MC-Na 0D125% 5 X5.5 5 X 5 3
X 4 C1oudyO925% 5 X5.
5 5 x 6 3.5x3.5 Slight
tVP 0.01% 5 X5.5 4.5X5.5 3
．． 5X 4 3 X350.1% 4.5X 5
5 X 6 3 X3.5 3.5X4.
50.5% 5 X5, 5 5 X5.5 C
1 oudy 4 x4.51% 5X5 5
X5 3.5X: 35 4x4.5 Dextrin 0.01% 5 X5.5 5 X 6
C1oudy 511gM0.1% 6.5
X 7 5.5x5.5 5O35
% 5.5X555.5X5.5 *
4j) X4.51% 5 X 5 5 x5.
5 3.5X 4 4.5X4.510 days later
15 days later 23 days later 46 days later n-propylparaben 0.02% 5X5.5 5X5 4X4
SlightO, 1% 5 x 5
4.5x 6 C1oudy 1. d
- Glycine 0.01% 5 X5.5 4 X 5 i, d,
SlightO1% 6.5x 7 4.5X 6
C1ody 3 X 30.5% 5.5X5.5
5 X5.5 3 X 31% 5x5 5x
5 3.5x4 4x4DTA 002% 4 x 5 4.5X 5 C1oudy
3 X 3o, 2qb 4X4.5 5X5.5
3x31% 4.5x 5 5 x 5
C1oudy5% 4.5x5 5.5xf,
#Albumin 0ΩO1% 4 Xt5 5 xs5 2.5x 3
3 X3.50.01% 5.5X6.5 6 X
6.5 5 X5.5 4.5X 50.5chi 6.5
x7 6.5x7 5 x5 5.5X61%
6X6 6X6.5 5X5.5 5X5G 1% 6X6 5X6 3X3 4X410%
3.5x 4 3 x3.5 2.5X 3 -Aprotinin 10Llnit 2 X2 3 x4 C
1 oudy i, d.

２５Ｕｎｌｔ　　　　１−ｄ−ｋ−ｄ−１１実施例１の
■工程で得られた活性留分の溶媒を純水買換′したのち
各枠物質を所定濃度加え■。25Unlt 1-d-k-d-11 After replacing the solvent of the active fraction obtained in step (1) of Example 1 with pure water, each frame substance was added at a predetermined concentration (2).

凍結乾燥ののち０．８５％食塩溶液に溶解して４°Ｃで
１日保存■、５日保存■、１４日保＃■したものの線溶
活性を測定した。After lyophilization, the solution was dissolved in a 0.85% saline solution and stored at 4°C for 1 day (■), 5 days (■), and 14 days (#), and the fibrinolytic activity was measured.

乾燥前　　１日後　　５日後　　１４日後対象 ８．５Ｘ　９　５　Ｘ５．５　４　Ｘ４．５　４　Ｘ４
．５９ｘ１０　５ｘ６　５ｘ５　４．５ｘ５Ｐ団４００ ０．０１％　９Ｘ１０　５Ｘ６　５Ｘ５　５Ｘ５０．１
％　８．５Ｘ９．５　４　ｘ　４　５．５ｘ　６　５．
５Ｘ　６０．５％　７．５Ｘ８．５　　Ｓｌｉｇｈｔ　
　４　Ｘ　４　　Ｂ、５Ｘ３．５１％　７　×７　　　
”　　Ｓｌｉｇｈｔ　　Ｃ１ｏｕｄｙＰＩＧ１５００ ０．０１％　　７．５Ｘ　８　　Ｓｌｉｇｈｔ　　Ｃ１
ｏｕｄｙ　　ｉ−ｄ。Before drying 1 day later 5 days later 14 days later Target 8.5X 9 5 X5.5 4 X4.5 4 X4
．． 59x10 5x6 5x5 4.5x5P group 400 0.01% 9X10 5X6 5X5 5X50.1
% 8.5X9.5 4 x 4 5.5x 6 5.
5X 60.5% 7.5X8.5 Slight
4 x 4 B, 5 x 3.51% 7 x 7
” Slight C1audyPIG1500 0.01% 7.5X 8 Slight C1
oudy i-d.

０．１％　８．５Ｘ９　４Ｘ４　４ｘ４　４ｘ４０．５
　％　　　　　６．５ｘ６．５　　　　　２．５ｘ２．
５　　　　　　Ｃ１ｏｕｄｙ　　　　　　　　Ｉ−ｄ。0.1% 8.5X9 4X4 4x4 4x40.5
% 6.5x6.5 2.5x2.
5 C1oudy I-d.

１％　６．５ｘ　８　　Ｓｌｉｇｈｔ　　−−ＰＥＧ４
０００′ ０．０１％　８．５ＸＩＯ７Ｘ７．５　６Ｂ×７　６　
ｘ６．５０．１％　９Ｘ９　６．５Ｘ６．５　５．５Ｘ
６．５　６Ｘ６０．５チ　８．５Ｘ　９　６．５Ｘ　７
　５．５Ｘ　６　６　ｘ６．５１％　　９Ｘ１０　７ｘ
８　７ｘ８　７ｘ８乾燥前　　　１日後　　５日後　　
１４日後ＰＥＧ６０００ ０．０１％　　　８ｘ９．５　　６Ｘ７　　６５ｘ７　
　　７Ｘ７．５ｏ、１％　　　８ｘ１０　　５ｘ５　　
　５ｘ５　　　Ｃ１ｏｕｄｙＯ，５％　　　Ｂ、５ｘｌ
Ｏ７，５Ｘ７．５　　６．５ｘ　８　　６．５ｘ７．５
１　％　　９Ｘ１０　　７．５Ｘ９　　　７Ｘ８　　　
７Ｘ７．５Ｔｗｅｅｎ　８０ ０．０１％　　　９．５Ｘ１０　　４３ｘ　５　　　５
　ｘ　５　　６．５ｘ６．５０．０５％　　９Ｘ１１　
　７．５Ｘ９　　７．５Ｘ７．５　　８Ｘ８．５０．１
％　　　９Ｘ１１　　８Ｘ９．５　　７Ｘ７　　７．５
Ｘ８デキストランＴ−１０ ０，０１％　　Ｂ、５Ｘ１０５　　７Ｘ７　　　５Ｘ６
　　　５．５Ｘ６０．１チ　　　９　Ｘ９．５　　８　
Ｘ　８　　　７　Ｘ７．５　　　７　Ｘ７．５０．５　
％　　　ｌ０ＸＩＯ７，５ｘ８５７　ｘ７．５　　　７
　ｘ７．５１　％　　９．５Ｘ１１５　　８Ｘ９　　　
７Ｘ７　　　８Ｘ８ゼラチン加水分解物 ０．０１チ　　９．５ｘ１０５　　７　ｘ　８　　５５
ｘ　６　　６．５ｘ　７０．１チ　　９．５Ｘ９．５　
　７．５Ｘ　８　　　７　Ｘ７．５　　７．５Ｘ８ｊ）
０５チ　　ｌ０ＸＩＯ８Ｘ　８　　７．５Ｘ７．５　　
８　Ｘ８．５１　％　　９．５Ｘ１０　　８　Ｘ８．５
　　８　ｘ８．５　　９　ｘ　９ゼラチン ０．０１チ　　８ｘ９．５　　７ｘ８　　　６Ｘ６　　
　４．５Ｘ６０．１チ　　８ｘ１０　　８Ｘ９　　６Ｘ
６　　６Ｘ７．５０．５チ　　９　ｘｌｏ　　　６５Ｘ
　７　　　６．５Ｘ　７　　７．５Ｘ８．５乾燥前　　
１日後　　５日後　　１４日後マンニット ０．０１％　　８ｘｌＯ６ｘ６ｓ５ｘ５　　４ｘ４０１
％　　８Ｘ９．５　５．５Ｘ６．５　　５Ｘ５　　４Ｘ
４０．５％　　　８Ｘ１０　　５．５Ｘ６．５　　４Ｘ
５　　　４Ｘ５１　％　　　８．５Ｘ１０　　８Ｘ８　
　　６Ｘ６　　　６Ｘ６ＭＣ−Ｎａ ０．０１チ　　９　Ｘ９．５　　８　ｘ　８　　　７　
ｘ　７　　　５　ｘ６．５０．１チ　　９　Ｘ９．５　
　７　Ｘ７．５　　７　Ｘ　７　　５．５Ｘ６）０．２
５％　　９ｘ９　　　７ｘ７　　　７ｘ７．５　　６．
５ｘ７０．５　％　　　７．５Ｘ７．５　　６　Ｘ６．
５　　８　Ｘ　８　　　７　Ｘ７，５ｖＰ ０．０１％　　８　ＸＩＯ６，５Ｘ６．５　５．５Ｘ　
６　　６．５Ｘ　８０．１％　　　８．５ｘｌＯｓｘｓ
　　　　７Ｘ７　　６．５Ｘ７０．５％　　８　Ｘ　９
　　５．５Ｘ　６　　７　Ｘ　７　　６　Ｘ　７１　％
　　８　Ｘ８　　５．５Ｘ６　　７．５Ｘ７．５　　７
　Ｘ８デキストリン ０．０１％　　　９．５Ｘ９．５　　５Ｂ×５．５　　
６　Ｘ　６　　　５　Ｘ　６０．１％　　　８Ｘ１０　
　６Ｘ７．５　　６×６５　　６．５Ｘ８０．５％　　
９ｘ９　　７．５Ｘ７．５　　７ｘ７．５　　８ｘ８１
％　　　８．５Ｘ９　　　Ｂ、５Ｘ８５　　７．５Ｘ８
　　　７Ｘ８乾燥前　　１日後　　５日後　　１４日後
β−デキストリン ０．０１％　　　８Ｘ１０　　　５Ｘ６　　　６Ｘ６Ｓ
　　　　５Ｘ６０．１チ　　　８．５Ｘ１０５　　　６
Ｘ６　　　５．５Ｘ６　　　５Ｘ６０．５％　　　９　
Ｘ１０５　　　５　Ｘ　５　　　３　　′３．５　　　
　Ｃ１ｏｕｄｙ１　％　　　８．５Ｘ１０５　　　７　
Ｘ　７　　　６　Ｘ　６　　　６　Ｘ　６グリシン ０．０１％　　８　ｘｌｏ、５　７．５Ｘ　８　５．５
ｘ　６　５．５ｘ　７０．５％　８．５ｘｌ　１　６．
５Ｘ　７　３．５ｘ　４　３．５ｘ　４１％　８．５Ｘ
１１　７Ｘ８　５Ｘ５　５Ｘ５．５アルブミン ０００１％　　　８．５Ｘ１０．５　　７　Ｘ　８　　
　５　Ｘ５．５　　　４　Ｘ　４０．０１％　　　８．
５Ｘ１０　　７．５Ｘ　８　　　６　Ｘ　６　　　６　
Ｘ７．５０．１チ　　９Ｘ１１　　Ｌ）Ｘ９　　６Ｘ６
．５　６．５Ｘ８実施例４゜ 実施例１の■工程で得られた活性留分の溶媒を生理的食
塩水で置換ののち各種物質を所定濃度加えて４℃に維持
し、１日後、７日後、２５日後、４０日後の線溶活性を
測定した。1% 6.5x 8 Slight --PEG4
000' 0.01% 8.5XIO7X7.5 6B×7 6
x6.50.1% 9X9 6.5X6.5 5.5X
6.5 6X60.5chi 8.5X 9 6.5X 7
5.5X 6 6 x6.51% 9X10 7x
8 7x8 7x8 Before drying 1 day later 5 days later
14 days later PEG6000 0.01% 8x9.5 6X7 65x7
7x7.5o, 1% 8x10 5x5
5x5 C1oudyO, 5% B, 5xl
O7,5x7.5 6.5x 8 6.5x7.5
1% 9X10 7.5X9 7X8
7X7.5Tween 80 0.01% 9.5X10 43x 5 5
x 5 6.5x6.50.05% 9X11
7.5X9 7.5X7.5 8X8.50.1
% 9X11 8X9.5 7X7 7.5
X8 Dextran T-10 0,01% B, 5X105 7X7 5X6
5.5X60.1chi 9 X9.5 8
X 8 7 X7.5 7 X7.50.5
% l0XIO7,5x857 x7.5 7
x7.51% 9.5X115 8X9
7X7 8X8 gelatin hydrolyzate 0.01 9.5x105 7 x 8 55
x 6 6.5x 70.1chi 9.5X9.5
7.5X 8 7 X7.5 7.5X8j)
05chi l0XIO8X 8 7.5X7.5
8 X8.51% 9.5X10 8 X8.5
8 x 8.5 9 x 9 gelatin 0.01 inch 8 x 9.5 7 x 8 6 x 6
4.5X60.1chi 8x10 8X9 6X
6 6X7.50.5chi 9 xlo 65X
7 6.5X 7 7.5X8.5 before drying
1 day later 5 days later 14 days later Mannitol 0.01% 8xlO6x6s5x5 4x401
% 8X9.5 5.5X6.5 5X5 4X
40.5% 8X10 5.5X6.5 4X
5 4X51% 8.5X10 8X8
6X6 6X6MC-Na 0.01chi 9 X9.5 8 x 8 7
x 7 5 x6.50.1chi 9 x9.5
7 X7.5 7 X 7 5.5X6)0.2
5% 9x9 7x7 7x7.5 6.
5x70.5% 7.5X7.5 6 X6.
5 8 X 8 7 X7,5vP 0.01% 8 XIO6,5X6.5 5.5X
6 6.5X 80.1% 8.5xlOsxs
7X7 6.5X70.5% 8X9
5.5X 6 7 X 7 6 X 71%
8 X8 5.5X6 7.5X7.5 7
X8 dextrin 0.01% 9.5X9.5 5Bx5.5
6 X 6 5 X 60.1% 8X10
6x7.5 6x65 6.5x80.5%
9x9 7.5X7.5 7x7.5 8x81
% 8.5X9 B, 5X85 7.5X8
7X8 Before drying After 1 day After 5 days After 14 days β-dextrin 0.01% 8X10 5X6 6X6S
5X60.1chi 8.5X105 6
X6 5.5X6 5X60.5% 9
X105 5 X 5 3 '3.5
C1oudy1% 8.5X105 7
X 7 6 X 6 6 X 6 Glycine 0.01% 8 xlo, 5 7.5X 8 5.5
x 6 5.5x 70.5% 8.5xl 1 6.
5X 7 3.5x 4 3.5x 41% 8.5X
11 7X8 5X5 5X5.5 Albumin 0001% 8.5X10.5 7 X 8
5 X5.5 4 X 40.01% 8.
5X10 7.5X 8 6 X 6 6
X7.50.1chi 9X11 L)X9 6X6
．． 5 6.5X8 Example 4゜ After replacing the solvent of the active fraction obtained in step ① of Example 1 with physiological saline, various substances were added at predetermined concentrations and maintained at 4°C, and after 1 day and 7 days. , 25 days later, and 40 days later, fibrinolytic activity was measured.

１日後　　　７日後　　２′５日後　　４０日後対象　
　８　ｘ　８　７．５Ｘ７．５　９．５ｘｌＯ９ｘ９．
５８　×Ｂ５　　　７．５Ｘ　８　　　９．５Ｘ１０．
５　　　９　Ｘ９．５１日後　　　７日後　　２５日後
　　４０日後ＥＧ４００ ０．０１％　　７．５Ｘ８．５　　７　Ｘ　８　　９．
５ｘｌＯ９Ｘ１００１チ　　８　ｘ９．５　　７．５ｘ
　９　　　９　Ｘ（Ｊ５　　８．５ｘ、９０．５　％　
　　７．５Ｘ８．５　　６．５Ｘ７．５　　８．５Ｘ　
９　　７．５Ｘ８．５１　％　　７ｘ８　　　６ｘ６　
　　７ｘ７　　５．５ｘ６ＰＥＧ　　１５００ ０．０１％　　７　Ｘ８　　　７　ｘ８　　９．５Ｘ９
．５　　９　ｘ９．５０．１％　　８ｘ９　　　７．５
Ｘ９　　８．５Ｘ９　　　８Ｘ８．５０．５％　　６　
Ｘ　７−−　　　　　−１％　　５　Ｘ　６　　　　−
　　　　−　　　　−ＰＥＧ　　４０００ ０．０１％　　　７ｘ８　　　７ｘ７．５　　９Ｘ９．
５　　９ｘ９０．１％　　？、５ｘ　８　　　７　ｘ　
８　　　１０ｘ１０Ｂ　　　９．５ｘｌＯ０，５％　　
８．５Ｘ９．５　　８　Ｘ９．５　　９．５Ｘ１０５　
　９　ｘｌｏｌ　％　　８Ｘ８５　８ｘ８　　　１０ｘ
ｌｌ　　　９．５ｘ１０５ＰＥＧ　　６０００ ０．０１％　　７　ｘ７．５　　７．５ｘ　８　　９．
５Ｘ９．５　　９　ｘ　９ｏ１ｆｙ　　　？、５Ｘ　ｓ
　　　　ｓ　ｘ　ｓ　　　９．５Ｘ１０　　９　Ｘ９．
５０５％　　ｓ、ｓＸ　９　　８．５ｘ８．５　　１０
ｘ１０５　　９　ｘ９．５１　チ　　９　Ｘ９．５　　
９　Ｘ　９　　１０５Ｘ１０５　　９．５ｘｌＯＴｗｅ
ｅｎ　８０ ０．０１％　　８　ｘ８５　　７．５ｘ７．５　　９．
５ｘ１０　　９　ｘ９．５０．０５％　　８　Ｘ８．５
　　７　Ｘ８．５　　１０ＸＩＯ９Ｘ　９０．１％　　
８　Ｘ８．５　　７　Ｘ　７　　　９．５Ｘ１０　　８
．５Ｘ　９１日後　　　７日後　　２５日後　　４０日
後デキストランＴ−１０ ０，０１％　　７．５ｘ８．５　　　７　ｘ　７　　　
１０ｘｌｌ　　　　９　ｘ９．５０．１％　　　８　ｘ
ｌＯ７ｘ７．５　　１０ｘ１０　　９．５ｘ９．５０．
５チ　　７．５Ｘ　９　　　８　Ｘ　８　　　１０ＸＩ
Ｏ９，５Ｘ１０１　％　　？、５ｘ８．５　　　８　ｘ
　８　　　１０ｘ１０　　９．５ｘ９．５ゼラチン加水
分解物 ００１％　　７Ｘ８　　　７Ｘ７　　９．５Ｘ１１　　
９．５Ｘ１００．１　％　　　６．５Ｘ７．５　　　　
　　　　７．５Ｘ　８　　７．５Ｘ　９０．５チ　　７
．５ｘ　９　　　５　ｘ　５　　９．５ｘ１０　　１０
ｘｌＯ１％　　６．５Ｘ７．５　　７　Ｘ７．５　　１
１５ＸＩＬ５　　１１×１４５ゼラチン ０．０！１　６．５ｘ　８　　Ｂ、５ｘ　９　１０ｘｌ
Ｏ８，５ｘｌ　１０．１％　　７　ｘ８．５　　Ｂ、５
ｘ８．５　１０ｘｌｌ　　９．５ｘｌ１５０．５％　７
ｘ８　　ｓｘｓ　　　− １％　８ｘ９　８ｘ８　　−　　− マンニトール ０．０１チ　　７Ｘ８　　８Ｘ８　　１０Ｘ１０５　９
Ｘ１１０．１％　６．５Ｘ　８　　７．５Ｘ　８　　１
０ＸＩＯ９Ｘｌ（１５０５９６６，５Ｘ８５　　８　Ｘ
　８　　９．５ｘｌＯｌ０ＸＩ１１＠　　ｅ、５ｘ　ｓ
　　　ｓ　ｘ　ｓ　　　ｃ＋、５ｘｘｏｓ　　９．５Ｘ
１１１日後　　　７日後　　２５日後　　４０日後ＣＭ
Ｃ＝Ｎａ ０１０１％　　７．５ｘ　９　　　８　ｘ　８　　１０
５ｘｌ−１９ｘ９．５０１％　　７．５ｘ　９　　　８
　ｘ８．５　　１０ＸＩＯ９Ｘ９．５０．２５％　　８
Ｘ９　　　７Ｘ７．５　　９．５Ｘ１０　　７．５Ｘ　
９０５チ　　７Ｘ８．５　　７×７　　　８Ｘ９　　７
．５Ｘ８　ｖ　Ｐ Ｏ，０１チ　　７Ｘ８　　７．５Ｘ８．５　　１０４）
Ｘｌｌ　　　９Ｘ１００１％　８　Ｘ　９　７．５Ｘ８
．５　９．５Ｘ１０　９　Ｘ１００．５％　　？、５Ｘ
　９　　７．５Ｘ８．５　　９　ＸＩＯ８，５Ｘ９．５
１　　　％　　　　　　７．５Ｘ７．５　　　　　　　
　　　　　　　　　　　９Ｘ９　　　　　　　フ、５Ｘ
８．５デキストリン ０．０１％　　７Ｘ８　　　８ｘ８　　　１１ｘ１２　
　１０ｘ１２０．１　％　　　８　Ｘ　９　　　８　Ｘ
８．５　　９．５Ｘ１０５　　９．５Ｘ１００．５　％
　　　８　Ｘ８．５　　７．５Ｘ　９　　　９　Ｘ１０
５９．５ｘ１０１　％　　７　ｘ８．５　　７．５ｘ　
９　　　−　　　８　ｘ８．５β−デキストリン ０．０１％　　　７　Ｘ　８　　　７．５ｘ　９　　　
１０ｘｌｌ　　　　１０ｘｌｌＯ，１％　　　　６．５
Ｘ　８　　　７．５Ｘ８．５　　　１０ＸＩＩ、５　　
１０Ｘ１１５０．５％　　　７　ｘ　８　　　７．５Ｘ
　８　　　９　ｘｌＯ９，５Ｘ１０５ｓ　　ｆｂ　　　
７．５Ｘ９　　　７．５Ｘ８　　　　ｃ＋ｘｔｏｓ　　
　　９Ｘ１０５１日後　　　７日後　　２５日後　　４
０日後グリシン ０．０１チ　７．５Ｘ９　７Ｘ８．５　９ｘｌｌ　　９
ｘ１２０．１　％　　７　ｘ　８　７　ｘ　８　９．５
Ｘ１０５　８．５ｘｌＬ５０．５％　　７Ｘ８　７Ｘ７
．５　１０ｘｔ０　９ｘｌＯ１％　７．５Ｘ　８　７　
Ｘ７．５　９．５Ｘ１０　８．５Ｘ１０アルブミン ０００１％　８　Ｘ９．５　７．５Ｘ８５　１０Ｘ１１
５　９．５Ｘ９．５０．０１％　７．５ｘ９．５　　７
　ｘ７．５　９．５Ｘ１２　１０ＸＩ（１５０、ｔ　％
　　７．５Ｘ８．５　７．５Ｘ　８　　９．５Ｘ１０５
　９．５Ｘ１０実施例５゜ 実施例１の０工程で得られた活性留分の溶媒を生理的食
塩水で置換ののち各種物質を所定濃度加えた■後、凍結
乾燥し鳴生理的食塩水に溶解して４℃に維持したものの
５日後虫１４日後０の線溶活性を測定し、その面積を百
分率に換算した。1 day later 7 days later 2'5 days later Target after 40 days
8 x 8 7.5X7.5 9.5xlO9x9.
58 x B5 7.5X 8 9.5X10.
5 9 X9. 51 days later 7 days later 25 days later 40 days later EG400 0.01% 7.5X8.5 7 X 8 9.
5xlO9X1001chi 8 x9.5 7.5x
9 9 X (J5 8.5x, 90.5%
7.5X8.5 6.5X7.5 8.5X
9 7.5X8.51% 7x8 6x6
7x7 5.5x6PEG 1500 0.01% 7 X8 7 x8 9.5X9
．． 5 9 x9.50.1% 8x9 7.5
X9 8.5X9 8X8.50.5% 6
X 7-- -1% 5 X 6-
- -PEG 4000 0.01% 7x8 7x7.5 9x9.
5 9x90.1%? , 5x 8 7x
8 10x10B 9.5xlO0,5%
8.5X9.5 8X9.5 9.5X105
9 xlol % 8X85 8x8 10x
ll 9.5x105PEG 6000 0.01% 7 x7.5 7.5x 8 9.
5X9.5 9 x 9o1fy? , 5X s
s x s 9.5X10 9 X9.
505% s, sX 9 8.5x8.5 10
x105 9 x9.51 Chi 9 x9.5
9 X 9 105X105 9.5xlOTwe
en 80 0.01% 8 x85 7.5x7.5 9.
5x10 9 x9.50.05% 8 x8.5
7 X8.5 10XIO9X 90.1%
8 X8.5 7 X 7 9.5X10 8
．． 5X 91 days later 7 days later 25 days later 40 days later Dextran T-10 0.01% 7.5x8.5 7 x 7
10xll 9 x9.50.1% 8 x
lO7x7.5 10x10 9.5x9.50.
5chi 7.5X 9 8 X 8 10XI
O9,5X101%? , 5x8.5 8x
8 10x10 9.5x9.5 gelatin hydrolyzate 001% 7X8 7X7 9.5X11
9.5X100.1% 6.5X7.5
7.5X 8 7.5X 90.5chi 7
．． 5x 9 5 x 5 9.5x10 10
xlO1% 6.5X7.5 7 X7.5 1
15XIL5 11x145 Gelatin 0.0!1 6.5x 8 B, 5x 9 10xl
O8,5xl 10.1% 7 x8.5 B,5
x8.5 10xll 9.5xl150.5% 7
x8 sxs - 1% 8x9 8x8 - - Mannitol 0.01 7X8 8X8 10X105 9
X110.1% 6.5X 8 7.5X 8 1
0XIO9Xl(1505966,5X85 8X
8 9.5xlOl0XI11@e, 5x s
s x s c+, 5xxos 9.5X
111 days later 7 days later 25 days later 40 days later CM
C=Na 0101% 7.5x 9 8 x 8 10
5xl-19x9.501% 7.5x 9 8
x8.5 10XIO9X9.50.25% 8
X9 7X7.5 9.5X10 7.5X
905chi 7X8.5 7×7 8X9 7
．． 5X8 v P O, 01chi 7X8 7.5X8.5 104)
Xll 9X1001% 8 X 9 7.5X8
．． 5 9.5X10 9X100.5%? , 5X
9 7.5X8.5 9 XIO8,5X9.5
1% 7.5X7.5
9X9 Fu, 5X
8.5 Dextrin 0.01% 7X8 8x8 11x12
10x120.1% 8 X 9 8 X
8.5 9.5X105 9.5X100.5%
8 X8.5 7.5X 9 9 X10
59.5x101% 7x8.5 7.5x
9 - 8 x8.5β-dextrin 0.01% 7 x 8 7.5x 9
10xll 10xllO, 1% 6.5
X 8 7.5X8.5 10XII, 5
10X1150.5% 7 x 8 7.5X
8 9 xlO9,5X105s fb
7.5X9 7.5X8 c+xtos
9X105 1 day later 7 days later 25 days later 4
0 days later glycine 0.01 7.5X9 7X8.5 9xll 9
x120.1% 7 x 8 7 x 8 9.5
X105 8.5xlL50.5% 7X8 7X7
．． 5 10xt0 9xlO1% 7.5X 8 7
X7.5 9.5X10 8.5X10 Albumin 0001% 8 X9.5 7.5X85 10X11
5 9.5x9.50.01% 7.5x9.5 7
x7.5 9.5X12 10XI (150, t %
7.5X8.5 7.5X 8 9.5X105
9.5×10 Example 5゜After replacing the solvent of the active fraction obtained in step 0 of Example 1 with physiological saline, various substances were added at specified concentrations.After that, it was freeze-dried and dissolved in physiological saline. Fibrinolytic activity was measured after 5 days and 14 days after dissolution and maintained at 4°C, and the area was converted into a percentage.

乾燥前■　乾燥後０（乾燥後５日■乾燥後１４日（ル対
象　　　　　１００　　　３７　　　２２　　　２５■
　　　　■　　　　（３）　　　　　■ＰＥＧ　４００
０ ０．０１％　　　　９４　　　　　６４　　　　　５６
　　　　　４８０．１チ　　　　９０　　　　　５２　
　　　　４４　　　　　４４０５％　　　　８５　　　
　　５６　　　　　４０　　　　　４８１　％　　　１
００　　　　６９　　　　　６９　　　　　６４Ｔｗｅ
ｅｎ　８０ ０．０１％　　　１２５　　　　　２８　　　　　３１
　　　　　　５２０．０５％　　　１３０　　　　　８
３　　　　　６９　　　　　８３０．１％　　　１３０
　　　　　９３　　　　　６０　　　　　７４デキスト
ランＴ−１０ ０、Ｏｌチ　　　１１７　　　　　６０　　　　　３７
　　　　　４００．１％　　　１１２　　　　　７９　
　　　　６４　　　　　６４０．５チ　　　１３１　　
　　　７８　　　　　６４　　　　　６４１　％　　　
１４３　　　　　８８　　　　　６０　　　　　７９ゼ
ラチン加水分解物 ０．０１％　　　１３１　　　　６９　　　　４０　　
　　５６０．１チ　　　１１８　　　　７４　　　　６
４　　　　６４０５％　　　１３１　　　　７９　　　
　６９　　　　６４１　％　　　１２５　　　　８３　
　　　８３　　　　７９■　　　　■　　　　■、　　
　■ マンニトール ０．０１％　　　　１０８　　　　４８　　　　　３１
　　　　　２００．１％　　　　１０３　　　　４４　
　　　３１　　　　２００５％　　　１０８　　　　４
４　　　　２５　　　　２５１％　　　１１５　　　　
７９　　　　４４　　　　４４ＭＣ−Ｎａ （）０１％　　　　　　　　　　７９　　　　　６０　
　　　　４００．１％　　　１１６　　　　６４　　　
　　６０　　　　　４４０．５チ　　　１０９　　　　
６０　　　　　６４　　　　　５６１　％　　　７６　
　　　　４８　　　　　７９　　　　　６４　ｖ　Ｐ ００１％　　　１０８　　　　５２　　　　　４０　　
　　　６４０．１チ　　　１１５　　　　７９　　　　
６０　　　　５６０５チ　　　９７　　　　４０　　　
　６０　　　　５２１％　　　８６　　　　４０　　　
　６９　　　　６９デキストリン ０．０１％　　　１２２　　　　３７　　　　４４　　
　　．３７０．１％　　　１０８　　　　５５　　　　
４８　　　　６４０．５チ　　　１０９　　　　６９　
　　　６４　　　　７９■　　　　■　　　　■　　　
　■ β−デキストリン ０．０１％　　　１００　　　　３７　　　　　４８　
　　　　３７０．１％　　　１１１　　　　４４　　　
　　４０　　　　　３７０．５％　　　１１８　　　　
３１　　　　　−−　　　　　−１　％　　　１１１　
　　　６０　　　　　４４　　　　　４４グリシン ０．０１％　１１４　　７４　　４０　　４７０．１％
　１３４　　−　　−−　　−０．５％　１２６　　５
６　　１７　　１７１％　１２６　　６９　　３１　　
３４アルブミンBefore drying ■ After drying 0 (5 days after drying ■ 14 days after drying (target 100 37 22 25 ■
■ (3) ■PEG 400
0 0.01% 94 64 56
480.1 chi 90 52
44 4405% 85
56 40 481% 1
00 69 69 64Twe
en 80 0.01% 125 28 31
520.05% 130 8
3 69 830.1% 130
93 60 74 Dextran T-10 0, Olchi 117 60 37
400.1% 112 79
64 640.5chi 131
78 64 641%
143 88 60 79 Gelatin hydrolyzate 0.01% 131 69 40
560.1chi 118 74 6
4 6405% 131 79
69 641% 125 83
83 79 ■ ■ ■,
■ Mannitol 0.01% 108 48 31
200.1% 103 44
31 2005% 108 4
4 25 251% 115
79 44 44MC-Na ()01% 79 60
400.1% 116 64
60 440.5chi 109
60 64 561% 76
48 79 64 v P 001% 108 52 40
640.1chi 115 79
60 5605chi 97 40
60 521% 86 40
69 69 Dextrin 0.01% 122 37 44
．． 370.1% 108 55
48 640.5chi 109 69
64 79 ■ ■ ■
■ β-dextrin 0.01% 100 37 48
370.1% 111 44
40 370.5% 118
31 ----1% 111
60 44 44 Glycine 0.01% 114 74 40 470.1%
134 - -- -0.5% 126 5
6 17 171% 126 69 31
34 albumin

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １）胆汁よりアセトン分画によって取得されたプラスミ
ノーゲン活性化酵素を含む原末をフィブリンを結合した
セファロースにより精製し。 得られた両分の溶媒を精製水又は生理的食塩水により置
換ののち、所望により凍結乾燥する事を特徴とするプラ
スミノーゲン活性化酵素及びその製剤の製造方法。 ２）精製方法としてヒドロギシアパタイト、陰イオ７交
換体、　　フェニールセファロースの内の少なくとも１
つを併用する特許請求の範囲１）の方法。 ３）精製方法として分子篩効果を有する樹脂を併用する
特許請求の範囲２）の方法。 ４）胆汁よりアセトン分画により取得されたプラスミノ
ーゲン活性化酵素を含む原末を分子篩効果を有する樹脂
により精製するに当りポリオキシエチレ／ソルビタ／・
モノオレイトを共存させる事を特徴とするプラスミノー
ゲン活性化酵素の製造方法。 ５）胆汁よりアセトン分画により取得されたプラスミノ
ーゲン活性化酵素を含む原末をフィブリンを結合したセ
ファロースにより精製し、得られた分画の溶媒を精製水
又は生理的食塩水により置換させたのちポリオキシエチ
レ／ソルビタ／・七ノオレイト、ゼラチン加水分解物、
デキストラン、ゼラチン、マンニトール、デギストリン
、グリシ／より選ばれた１つを共存させる事を特徴とす
るプラスミノーゲン活性化酵素剤の製造方法。 ６）プラスミノーゲン活性化酵素とボリオギシエチレン
ソルビタ／・モノオレイト、ゼラチン加水分解物、デキ
ストラン、ゼラチン、マンニトール、デキストリン、グ
リシンよね選ばれた１つを精製水又は生理的食塩水溶液
状下で共存させる事を特徴とするプラスミノーゲン活性
化酵素製剤。 ７）胆汁よりアセトン分画により取得されたプラスミノ
ーゲン活性化酵素を自む原末をフィフリンを結合したセ
ファロースにより精製し、得られた両分の溶媒を精製水
又は生理的食塩水により置換させたのちポリオキシエチ
レンソルビタン・モノオレイト、ゼラチン加水分解物、
デキストラフ　、　ＰＥＧ　４０００　、　ＰＥＧ　６
０００　、　））ＶＰ　ｌデキストリン、アルブミンよ
り選ばれた１つを共存させて凍結乾燥する事を特徴とす
るプラスミノーゲン活性化酵素剤の製造方法。 ８）プラスミノーゲン活性化酵素を精製水又は生理的食
塩水に溶解ののちポリオキシエチレンソルビタン・モノ
オレイト、ゼラチン加水分解物、デＡ’Ｘト５７　、　
ＰＥＧ　４０００　、　ＰＥＧ　６０００　、　ＰＶＰ
　。 デギストリン、アルブミンより選ばれた１つの存在下に
凍結乾燥する事を特徴とするプラスミノーゲン活性化酵
素製剤。[Claims] 1) A bulk powder containing plasminogen activating enzyme obtained from bile by acetone fractionation is purified using Sepharose bound to fibrin. A method for producing a plasminogen activating enzyme and its preparation, which comprises replacing both of the obtained solvents with purified water or physiological saline, and then freeze-drying if desired. 2) As a purification method, at least one of hydroxyapatite, anion 7 exchanger, and phenyl sepharose is used.
The method according to claim 1), in which the two are used in combination. 3) The method according to claim 2, in which a resin having a molecular sieve effect is used in combination as the purification method. 4) Polyoxyethylene/Sorbita/.
A method for producing a plasminogen activating enzyme characterized by the coexistence of monooleate. 5) A bulk powder containing plasminogen activating enzyme obtained from bile by acetone fractionation was purified using fibrin-bound Sepharose, and the solvent of the obtained fraction was replaced with purified water or physiological saline. Later, polyoxyethylene/sorbita/・7nooleite, gelatin hydrolyzate,
A method for producing a plasminogen activating enzyme agent, characterized in that one selected from dextran, gelatin, mannitol, degistrin, and glycine coexists. 6) Plasminogen activating enzyme and polyoxyethylene sorbita/monooleate, gelatin hydrolyzate, dextran, gelatin, mannitol, dextrin, glycine, and one selected one in purified water or physiological saline solution. A plasminogen activating enzyme preparation characterized by coexistence. 7) Purify the bulk powder containing plasminogen activating enzyme obtained from bile by acetone fractionation using fifrin-bound Sepharose, and replace both of the resulting solvents with purified water or physiological saline. Tanachi polyoxyethylene sorbitan monooleate, gelatin hydrolyzate,
Dextrough, PEG 4000, PEG 6
000, )) VP A method for producing a plasminogen activating enzyme agent, characterized in that it is freeze-dried in the coexistence of one selected from l-dextrin and albumin. 8) After dissolving plasminogen activating enzyme in purified water or physiological saline, polyoxyethylene sorbitan monooleate, gelatin hydrolyzate, DeA'Xt 57,
PEG 4000, PEG 6000, PVP
. A plasminogen activating enzyme preparation characterized by being freeze-dried in the presence of one selected from degistrin and albumin.