JPS58183092A - Debranching enzyme product - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、澱粉をＩＩ類に酵素変換する酵素の分野に属
する。詳述すれば、本発８Ａｈアミロペクチン及びプル
ランにおけるアルファー１．６−グリコシド結合を加水
分解しうる新規板切シ酵累に関する。この新規酵素はプ
ルラナーゼ型の板切シ酵素として分類することができる
。本発明は更に新規板切シ酵素の製造方法及び澱粉をデ
キストロース及び／またはマルトースを含む澱粉加水分
解生成物、Ｎ、ｊばｆキストロース及ヒマルトースシロ
、ｆに変換するための該＃木の用途に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention is in the field of enzymes that enzymatically convert starch to Group II. More specifically, the present invention relates to a novel Itagiri fermentation system capable of hydrolyzing alpha-1,6-glycosidic bonds in 8Ah amylopectin and pullulan. This new enzyme can be classified as a pullulanase-type cutting enzyme. The present invention further provides a method for producing a novel board cutting enzyme and the use of the wood for converting starch into starch hydrolysis products containing dextrose and/or maltose, N, j, xtrose and himaltose, f. Regarding.

過去１０年の間に、澱粉をシロ、プに変える全酵素加水
分解は澱粉処理工業に広く、常に増加して受容されてき
た。世界的には、澱粉からデキストロースシロ、グの酵
素による生産鉱、１０都前の約４０万トンに比べて現在
では１年当＃）３００万トン（乾物として計算）を越え
ると思われる。Over the past decade, total enzymatic hydrolysis, which converts starch to starch, has gained wide and ever-increasing acceptance in the starch processing industry. Worldwide, production from starch to dextrose and gu enzymes is thought to now exceed 3 million tons (calculated as dry matter) per year, compared to about 400,000 tons 10 years ago.

澱粉の酵素−酵素加水分解に一般に採用される方法は、
液化及び糖化の連続工程を含み、液化工程はアルファー
アミラーゼ、例えば熱安定性バチルス・リヘニフォルミ
ス（ｉｌ、１１ｃｈ＠ｎｉｆ＠ｒｍｉｓ）アルファーア
ミラーゼ、例えばアンマークのノグオ・インダストリイ
社（ＮＯＶＯＩｎｄｕｓｔｒＩ　Ａｌ１）によって供給
されたターマミル（ＴＥＲＭＡｌｆｆＬ）　＠　Ｋよっ
て接触サレ、デキストロース（Ｄ−グルコース）への糖
化は前記の会社からも得られるＡＭＣ−１５０Ｌのよう
な、通常、菌に白米するグルコアミラーゼの存在で行な
われる。デキストロースシロ、グ製造者が、酵素及びエ
ネルギーの消費量をできるだけ少なくしながら出来るだ
け高いデキストロース収率を得ることを０指しているこ
とは明らかである。Enzymatic-enzymatic hydrolysis of starch is a commonly adopted method:
The liquefaction step comprises a continuous step of liquefaction and saccharification, the liquefaction step being supplied by an alpha amylase, e.g. thermostable Bacillus licheniformis (il, 11ch@nif@rmis) alpha amylase, e.g. Saccharification to dextrose (D-glucose) is usually carried out in the presence of glucoamylase, such as AMC-150L, also available from the above-mentioned company, which is added to the bacteria. It is clear that dextrose gel manufacturers aim to obtain as high a dextrose yield as possible with as little enzyme and energy consumption as possible.

３０〜４ＯＳ（重量）の澱粉懸濁液を用いて出発し、３
０％の乾物（Ｄ、Ｓ、）で糖化する従来法により得られ
る最高Ｏｆ′キスドロースレベルは約９６％（重量）Ｏ
ｆ＋スト０−ス（９６ＤＸ）テある。従来の澱粉変換法
がその限度をほとんど越えない理由は本質的に２つある
。Starting with a starch suspension of 30 to 4 OS (by weight), 3
The highest Of' kiss drawose level obtained by the conventional method of saccharification with 0% dry matter (D, S,) is about 96% (by weight) O
There is f+st0-s(96DX). There are essentially two reasons why conventional starch conversion methods rarely exceed their limits.

第一に１アミロペクチン（トウモロコシ澱粉を含めて、
多くの工業的に重量な澱粉の約８０％を構成する）は、
相当数のアルファー１，６−グリコシド結合を含む点で
分枝鎖構造を示す。アルファーアミラーゼは実際にアル
ファー１，６−ゲルコジメーゼ活性を有しないので、ア
ミロペクチンはアルファーアミラーゼによって部分的に
しか分解されないので、アルファー１．６−グリコシド
結合をも加水分解するグルコアミラーゼによって触媒さ
れるその後の糖化工１において、アルファー制限デキス
トリンを含めて分枝オリが糖の実質的加水分解が起る。Firstly, 1 amylopectin (including corn starch,
(constituting about 80% of most industrial weight starches)
It exhibits a branched chain structure in that it contains a significant number of alpha 1,6-glycosidic bonds. Since alpha-amylase does not actually have alpha-1,6-gelcodimase activity, amylopectin is only partially degraded by alpha-amylase, so the subsequent reaction catalyzed by glucoamylase, which also hydrolyzes alpha-1,6-glycosidic bonds, In saccharification process 1, substantial hydrolysis of branched sugars, including alpha-limited dextrins, occurs.

しかしながら、糖化反応はアルファー１，４−結合の対
応する加水分解よシ著しく低い速度で進行し、これによ
シ完全な糖化が妨げられる。それより多くのグルコアミ
ラーゼを添加することによって状況を解決する試み社第
二の障害（より高い酵素費を要することを別として）、
即ちデキストロース重合（いわゆる逆反応）を触媒する
グルコアミラーゼの能力と衝突する。However, the saccharification reaction proceeds at a significantly slower rate than the corresponding hydrolysis of alpha 1,4-linkages, which prevents complete saccharification. The second hurdle (apart from requiring higher enzyme costs) is that attempting to resolve the situation by adding more glucoamylase,
That is, it conflicts with the ability of glucoamylase to catalyze dextrose polymerization (the so-called reverse reaction).

ちなみに、澱粉の変換を約９６ＤＸから約９８　ＤＩに
増加すると（これはデキストランのある用途には著しい
改良とみなされる）、非デキストロース狭雑物の含有率
が約５０％だけ減少するが、このような澱粉の変換は、
基質を約１５％Ｄ、８．に希釈すると共に、比較的高レ
ベルのグルコアミラーゼを使用することによって達成す
ることができる（米国特許第４０１７３６３号明細書参
照）、シかしこのようなデキストロース溶液を後に一層
高い常用の乾物レベルに濃縮するには、エネルギーを消
費する。Incidentally, increasing the starch conversion from about 96 DX to about 98 DI (which is considered a significant improvement for some dextran applications) reduces the content of non-dextrose contaminants by about 50%; The conversion of starch is
8. Substrate at approximately 15% D. This can be achieved by using relatively high levels of glucoamylase (see US Pat. No. 4,017,363), but such dextrose solutions can later be concentrated to higher conventional dry matter levels. To do so consumes energy.

先行文献は、デキストロ−スレベルを着しく増加するた
めグルコアミラーゼ及び板切シ酵素を同時に使用するこ
とを示咬しておシ、板切シｗＩ嵩が分枝鎖オリプ糖中に
存在する特殊なアルファ＝１．６−グリコシド結晶及び
一定のアルファー制限デキストリンを有効に加水分解す
ることが判ったことを根拠にしている。この点について
、米国特許１ｇ３８９７３０５号明細書はグルコアミナ
ーゼ及びエアロバクター・エアログネス（Ａｅｒｏｂａ
ｃｔ＠ｒ＠＠ｒａｇ＠１１＠ｌ）　（クレプシーラーニ
ューモニアエ（Ｋ１＊ｂｓｉｅｌｌａ　ｐｍ＠ａｍｏｎ
ｌａ＊））ゾルラナーゼを併用し、それによシ少なくと
も３０％の乾物を含むシロップに関して２％までのＤＸ
の顕著な増加を達成しうろことを開示している。グルコ
アミラーゼ及び別の板切シ＃票、即ち英国特許出願第８
１０７２８７号明細書に記載されているシュードモナス
・アミロ５ｐラモーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａａａｍｙ
ｌ＠ｄ＠ｒａｍｏｓａ）イソアミラーゼの作用を合せて
も同様の結果が証明された。Prior literature has suggested the simultaneous use of glucoamylase and cleavage enzymes to steadily increase dextrose levels; It is based on the fact that it has been found to effectively hydrolyze alpha=1,6-glycoside crystals and certain alpha-limited dextrins. In this regard, U.S. Patent No. 1g3897305 discloses that glucoaminase and
ct@r@@rag@11@l) (K1*bsiella pm@amon
la*)) DX up to 2% for syrups containing at least 30% dry matter in combination with zollanase;
discloses that the scales have achieved a significant increase in Glucoamylase and another board-cutting sheet, namely British Patent Application No. 8
Pseudomonas amylo 5p Ramosa (Pseudomonas amylo
Similar results were demonstrated when the action of isoamylase (l@d@ramosa) was combined.

しかし第一の例では、クレプシーラ・ニエーモニアエの
ゾルラナーゼの一最適範囲によシ糖化を比較的高いｐＨ
（５，５〜６）で行なうことを余儀なくされ、この−で
紘グルコアミラーゼの活性は急激に減少するので、グル
コアミラーゼは実際には節約されない。However, in the first example, one optimal range of zollanase from Klepsilla neemoniae allows siglycation to be carried out at relatively high pH.
No glucoamylase is actually spared, since one is forced to do so at (5, 5-6) and at this - the activity of Hiro glucoamylase decreases sharply.

同じ問題は、グルコアミラーゼの最適Ｐ）（Ｋ著しく接
近した最適−を有するイソアミラーゼを用いる場合には
起らず、従ってグルコアンラーゼの用量を実質的に減少
（約５０％だけ）することができ、同時に１〜２−のＤ
Ｉ値の増加を達成しうる。The same problem does not occur when using isoamylases with glucoamylase optima (P) (K) that are significantly closer to the optimum, so the dose of glucoanlase can be substantially reduced (by about 50%). possible, and at the same time 1-2-D
An increase in I value can be achieved.

しかしながらイソアミラーゼ法（及び現実に社公知のプ
ルラナーゼ法にもある）の重大な欠点は文献に公知の板
切シ酵素が熱に不安定なことである。However, a significant drawback of the isoamylase method (and indeed also of the pullulanase method known in the art) is that the cutting enzymes known in the literature are thermally unstable.

このことは、従来校切シ酵素の存在での糖化が約５５℃
以上では工業的に行なわれず、グルコアミラーゼ自体が
６０℃でさえ適切に安定であシ、この温度水準で基質の
微生物汚染の危険がそれより低い温度と比べて着しく減
少することを意味する。This means that saccharification in the presence of conventional proof-cutting enzymes is approximately 55°C.
The above is not carried out industrially, meaning that the glucoamylase itself is adequately stable even at 60° C., meaning that at this temperature level the risk of microbial contamination of the substrate is significantly reduced compared to lower temperatures.

ベーターアミラーゼを用いて澱粉を高いマルトースシロ
ップに変換する際にも前記と同様の障害に遭遇する。ア
ルファーアミラーゼと同様に、ペーターアきラーゼは、
１，６−アルファ分校ＡＫ近づくに従って加水分解が停
止するので、アミロペクチンを部分的にしか分解できな
い。ベーターアミラーゼの作用を板切シ酵素、例えばプ
ルラナーゼまたはインアンラーゼの作用と組合せること
によって、英ｆｆｌ特許第１１４４９５０号及び米国特
許第３６１７８９５号明細書に開示されているように、
マルトース含有率の着しい増加を達成することができる
。しかし５５℃以上の糖化温度は枝切り酵素が熱に不安
定であるため適当でなく、これによｐ細菌汚染の危険が
着しく増加する。Similar obstacles are encountered when converting starch to high maltose syrup using beta-amylase. Similar to alpha amylase, Peter amylase is
Since hydrolysis stops as the 1,6-alpha branch approaches AK, amylopectin can only be partially degraded. By combining the action of beta-amylase with the action of cutting enzymes such as pullulanase or inanlase, as disclosed in UK patent no. 1,144,950 and US patent no. 3,617,895,
Significant increases in maltose content can be achieved. However, a saccharification temperature of 55° C. or higher is not suitable because the debranching enzyme is unstable to heat, which significantly increases the risk of contamination with p-bacteria.

本発明の目的は、グルコアミラーゼの温度安定性に匹敵
する温度安定性を有し、更にグルコアミラーゼの最適−
に接近した一最適域を有する新規波切シ酵素を供給する
ことによって従来公知の板切シ酵素の欠点を解消するこ
とである。The object of the present invention is to have a temperature stability comparable to that of glucoamylase, and furthermore to have an optimal temperature stability of glucoamylase.
The object of the present invention is to overcome the drawbacks of the conventionally known plate-cutting enzymes by providing a new wave-cutting enzyme having an optimum range close to .

本発明は、このような性質を有するプルラナーゼ型の新
規板切り酵素が日本特許出願番号５６−８８３１９に規
定された分類に属するバチルス属の新しく発見された微
生物によって産生されるという意外な発見に基づく。The present invention is based on the unexpected discovery that a novel cut-off enzyme of the pullulanase type having such properties is produced by a newly discovered microorganism of the genus Bacillus belonging to the classification defined in Japanese Patent Application No. 56-88319. .

本発明は第一〇Ｉｔ橡によシ、下記の特性を有する； 、）１株バチルスアシドグルリティクス（Ｂａｃｌｌｌ
ｕｓ　ａｅｌｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｌｅｕｍ）ＮＣＩＢ
　１１６３９又はその変異株もしくは突然変異株を適当
な栄養培地中で培養することによって製造された発酵液
から得られ、 ｂ）バチルスアシドグルリティクス基準株ＮＣＩＢ　１
１６０７から誘導され九板切シ＃素と部分的に同一の酵
素化学的性質を示し、 ｃ）ＰＨ４〜５で酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）中チ一定
して最適活性が６５℃〜７０℃にあり、ｄ）最適−が、
約６０℃の酢酸塩緩衝ｉ［（０，０５Ｍ）中で測定して
３５〜５，５の範囲にあシ、・）少なくとも５０−のＰ
Ｈ５のデキストロース溶液（３０重量−乾物として）中
で１１］定して７２時間後６０℃で残留活性を有する、 プルラナーゼ型の新規波切シ酵素を含む板切シ酵素製品
を提供するものである。The present invention is based on a strain of Bacillus acidoglulyticus and has the following characteristics;
us aeldopullulytleum) NCIB
11639 or a variant or mutant strain thereof in a suitable nutrient medium, b) Bacillus acidoglulyticus type strain NCIB 1
It is derived from 1607 and shows partially the same enzymatic chemical properties as the nine-plate cleavage cylindrical c), and has a constant optimum activity in acetate buffer (0.05M) at pH 4-5 at 65°C-70°C. ℃, and d) optimal - is
P of at least 50-
The present invention provides a plate-cutting enzyme product containing a novel wave-cutting enzyme of the pullulanase type, which has residual activity at 60° C. after 72 hours of determination in a dextrose solution of H5 (30 wt. - dry matter).

板切シ酵素製品は固体または液体の形であってよく、一
般ＫＩｇ当ｊ）１０〜３５０，０００’ルｊす一ゼ単位
（以下に定義する）の範囲に活性を有する。The enzyme product may be in solid or liquid form and has an activity in the range of 10 to 350,000 units (defined below) per KIg.

本発明０ＩＦｆましい夾施馳様では、枝切り酵素製品の
活性＃ｉ１　ｊｍＤ　１００〜１５，０００グルラナー
ゼ単位の範囲にある。In a preferred embodiment of the present invention, the activity of the debranching enzyme product is in the range of 100 to 15,000 glulanase units.

本発明Ｏ別の態様によれば、約６０Ｃ又はそれ以上で最
適活性、３．５〜５．５の声範囲で最適−及び６０℃で
棗釘な熱安定性を示す板切シ＃素を含む板切シｉ１１票
＃晶を製造する方法が提供され、該方法は訳隼源、窒素
源及び無機塩類を含む適当な栄養培地中で、全ての奥施
上の目的に対し、適当な栄養培地中でバチルス・アシド
ゾルリティクス（Ｉｌａｅｉｌｌｉｓ　　ａｗｉｄｅｐ
ｍｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）Ｎ：’ＩＢ　　１１６３９又
は板切シ酵素童生のその突然変異株を培養し、続いて常
法によシ板切）酵素生成物を回収することから成る。In accordance with another aspect of the present invention, it is possible to provide a sheet-cutting silicone which exhibits optimum activity at or above about 60°C, optimum temperature in the 3.5-5.5 range, and excellent thermal stability at 60°C. A method is provided for producing a plate-cutting crystal containing a suitable nutrient for all application purposes in a suitable nutrient medium containing a nitrogen source, a nitrogen source and inorganic salts. Bacillus acidozorlyticus (Ilaeillis awidep) in culture medium.
mllulyticus) N:'IB 11639 or its mutant strain of the P. mllulyticus enzyme.

更に別の態様によれば、本発明はデキストロース及び／
またはマルトースを含むシロ、グに澱粉を変換する方法
を提供するものであシ、該方法は鳩舎によ〉、シかし好
ましくは予め液化工程を行なって澱粉加水分解組成物を
形成してから、前記の新規板切シ＃素の有効量並びにグ
ルコアンラーゼ及びベーターアミラーゼから成る群から
遍択され九糖化醇票から成る酵素系の存在で糖化を行な
うことから成る。According to yet another aspect, the invention provides dextrose and/or
Alternatively, the present invention provides a method for converting starch into starch containing maltose, which method is carried out in a pigeon house, preferably by performing a liquefaction step in advance to form a starch hydrolyzed composition. , carrying out the saccharification in the presence of an effective amount of the above-mentioned novel cylindrical saccharide and an enzyme system selected from the group consisting of glucoanlase and beta-amylase and consisting of a nonasaccharified alcohol.

本発明Ｏ板切シＩＩ素を使用する好ましい態様において
は、澱粉加水分解生成物の乾燥固彫分は少なくとも３０
重量−であシ、その糖化は５５〜６５℃の範囲、好まし
くは６３℃以下の温度で３．５〜５．５の声範囲で集施
する。グルコアミラーゼ及びベーターアミラーゼの好ま
しい用量はそれぞれ０．０５〜０．５ＡＧ　４位及び０
．００５〜Ｑ、３ヘーターアミラーぜ単位の範囲にあシ
、板切ｒ＊素の好ましい用量は澱粉加水分解生成物中の
乾物１９ＡＤ０００５〜５プルラナ一ゼ単位（以下に定
義する）の範囲にある。In a preferred embodiment of the present invention, using the plate-cutting silicon II element of the present invention, the dry solid fraction of the starch hydrolyzate is at least 30
By weight, the saccharification is carried out in the range of 3.5-5.5 at a temperature in the range of 55-65°C, preferably below 63°C. Preferred doses of glucoamylase and beta-amylase are 0.05-0.5AG 4 and 0, respectively.
．． Preferred dosages of the Itagiri r* elements are in the range of 19AD0005 to 5 pullulanase units (defined below) on dry matter in the starch hydrolysis product.

好ましい付加的態様では、糖化酵素はグルコアミラーゼ
であシ、これにょ夛澱粉を高いＤＸデキストロースシロ
、グに変える。In a preferred additional embodiment, the saccharifying enzyme is glucoamylase, which converts starch to high DX dextrose.

微生物 単離；本発明の板切シ酵素を産生ずる微生物は、日本特
許出願第５６−８８３１９号に開示される方法によって
選択した： 微生物及びその突然変異株を、スコツトランド、アバデ
ィーン０ナシ冒ナル・コレクシ冒ン・オプ・インメスト
リアル・バクテリア、トリイ・リサーチ・スティシ冒ン
（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｌｏｎ　ｏｆＩｍ
ｄｕｔｒｉｍｌ　Ｂａ＠ｔ＠ｒｉａ　＊　Ｔｏｒｒｙ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ）に寄託し、下記の
第１表に示す受託番号を得た。Microorganism isolation: Microorganisms producing the plate cutting enzyme of the present invention were selected by the method disclosed in Japanese Patent Application No. 56-88319. National Colectlon of Immeastrial Bacteria, Tory Research Institute
dutriml Ba@t@ria * Torry
Research 5tation), and the accession numbers shown in Table 1 below were obtained.

第　　　■　　　表 ＮＣｌ１ｌム　　寄託年月日　　　　起　　源１１６３
９　　１９８２年３月３１日　デΔ−り、ヒレロッド（
Ｈ１ｌｌ＠ｒｏｄ）で集め た土壌 １１７７７　　１９８坪９月２９日　　ＮＣＩＢ　１１
６３９の突然変異株 本発明の微生物０黴生物学的性質は、日本特許出願第５
６−８８３１９号で開示した微生物のそれと適合し、そ
れらはその基準株がＮＣＩＢ　１１６０７であるバチル
スアシドグルリティクスとして該出願中Ｋｍ定された分
類ダルーゾに属する。Chapter ■ Table NCl1lm Date of Deposit Origin 1163
9 March 31, 1982 De-delta, filler rod (
Soil collected at H1ll@rod) 11777 198 tsubo September 29th NCIB 11
The biological properties of the 639 mutant microorganisms of the present invention are disclosed in Japanese Patent Application No. 5.
No. 6-88319, they belong to the classification Daruso, identified in that application as Bacillus acidoglulyticus, the type strain of which is NCIB 11607.

以十示白 プルラナーゼ活性の測定 １プルラナ一ゼ単位（ＰＵ）は、標準条件（温度６０℃
及びｐ）（５，０）下で毎分１μモルのグルコースと当
量の還元性基の形成に相当する速度でノルランを加水分
解する酵素の量と定義する。Measurement of pullulanase activity 1 pullulanase unit (PU) was measured under standard conditions (temperature 60°C).
and p) is defined as the amount of enzyme that hydrolyzes norlan at a rate corresponding to the formation of reducing groups equivalent to 1 μmol of glucose per minute under (5,0).

酢酸塩緩衝液（０，ＩＭ、ｐ）（５）中のプ５ルラン〔
シグマ・ケミカル社（Ｓｌｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、　）　ＶＣよって供給される〕の４重量チ溶液（
１ｄ）を６０℃で１０分間予め加熱し、続いてｌ　ｍｌ
当り０．０４〜０．１５ＰＵに押当する濃度で脱イオン
水に溶かした酵素の溶液（１ｍ１）を添加する。カーボ
ネート緩衝液、Ｐｌ（１０（０，５Ｍ溶液３ｍ１）を添
加することにより３０分後に反応を停止する。次に、遊
離した還元性基の濃度をソモギイーネルソン（Ｓｏｍｏ
ｇｙｉ−Ｎｏｌａｏｎ）法（Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、
１５３（１９４４）３７５−８０　、同、　１６０（１
９４５）、６１−６８により測定する。Pullulan in acetate buffer (0, IM, p) (5)
Sigma Chemical Company
Co, ) supplied by VC] in a 4-wt.
1d) at 60 °C for 10 min, followed by l ml
A solution (1 ml) of the enzyme dissolved in deionized water at a concentration of 0.04-0.15 PU/ml is added. The reaction is stopped after 30 minutes by adding carbonate buffer, Pl (10 (3 ml of 0.5 M solution). The concentration of the free reducing groups is then determined by Somogyi-Nelson (Somogyi Nelson).
gyi-Nolaon) method (J, Blol, Chem,
153 (1944) 375-80, 160 (1)
945), 61-68.

枝切り酵素製品の製造 本発明の枝切り酵素を産生しうる微生物を通常、適当な
発酵培地中で好気性条件下で培養する前に固体基質上で
増殖させる。両方の培地は、コーンステイープ・リカー
および酵母エキス又はソイビーンミール（液体培地）ま
たはトリプトン（固体基質）のような生長促進栄養素と
一緒に、同化しつる炭素源（例えば液体培地用ＶＣグル
コース及び固体培地用にアミロペクチン〕及び望素源と
して例えば硫酸アンモニウムを含む基礎塩類組成物（前
記参照）を含む。発酵を少し高めた温度で、一般に３０
〜３５℃の範囲で、６以下、好１しくは５，０〜６０の
範囲の−で夷りするのが典型的であり、自動装置により
ほぼ一定に保持するのが好ましい。酵素は培地中に分泌
される。Preparation of Debranching Enzyme Products Microorganisms capable of producing debranching enzymes of the invention are typically grown on a solid substrate before culturing under aerobic conditions in a suitable fermentation medium. Both media contain an assimilable carbon source (e.g. VC glucose for liquid media and solid amylopectin] for the culture medium and a basic salt composition (see above) containing, for example, ammonium sulfate as a source of oxygen. Fermentation is carried out at a slightly elevated temperature, generally at 30
-35 DEG C., typically at -6 or less, preferably in the range 5.0 to 60, and preferably maintained approximately constant by automatic equipment. The enzyme is secreted into the medium.

生じる、通常的０．１〜５０　ＰＵ／ｍｌを含む発酵液
から細菌細胞、崩壊物を他の固形分と一緒に例えば遠心
分離により除去することができる。酵素を含む上澄液を
更に例えば濾過または遠心分離により清澄にし、次に必
要に応じνすえｒｌｆ：、限外濾過によるか、または減
圧下に蒸発器中で洟縮し、得られた濃縮液を必要に応じ
て、例えば凍結乾燥または噴霧乾燥によって乾燥するこ
とができる。生ずる粗製酵素製品は、１００−１５，０
００　ＰＵ／ｇの範囲の活性を示すのが代表的である。From the resulting fermentation broth, which typically contains 0.1 to 50 PU/ml, bacterial cells and debris can be removed together with other solids, for example by centrifugation. The supernatant containing the enzyme is further clarified, for example by filtration or centrifugation, and then optionally by ultrafiltration or condensed in an evaporator under reduced pressure, resulting in a concentrated liquid. can be dried if desired, for example by freeze-drying or spray-drying. The resulting crude enzyme product is 100-15,0
They typically exhibit activities in the range of 0.00 PU/g.

本発明の粗板切り酵素は、例えば下記の例１で得られる
濃縮液から、例えば例３で述べる方法を用い、電気泳動
的均質性まで精製できる。精製酵素は、ナトリウムドデ
シルスルフェートポリアクリルアミドダル電気泳動〔ブ
ラウン（Ｓ、Ｇ、Ｂｒａｕｎ）ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇ
）’、１０巻（１９７２年）２２１頁〕で、単一の蛋白
質バンドを示した。分子量は約９５．０００ダルトンす
なわち基準株ＮＣＩＢ　１１６０７によって産生される
枝切り酵素の分子量よりも約５０００ダル゛トン小さい
。The crude enzyme of the invention can be purified to electrophoretic homogeneity, for example, from the concentrate obtained in Example 1 below, using the method described in Example 3, for example. The purified enzyme was purified by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis [Braun, S.G., et al., J., Virolog
)', Vol. 10 (1972), p. 221] showed a single protein band. The molecular weight is approximately 95,000 Daltons or approximately 5000 Daltons less than the molecular weight of the debranching enzyme produced by the reference strain NCIB 11607.

本発明の酵素および日本特許出願第５６−８３１９号で
開示されたＮＣＩＢ　１１６０７　（又はそれらの突然
変異株、例えば株ＮＣＩＢ　１１６３８および基準株Ｎ
ＣＩＢ　１１６４７　）によって産生される酵素との差
異を実証するため、次の試験結果を示す。Enzymes of the invention and NCIB 11607 (or mutant strains thereof, such as strain NCIB 11638 and type strain N) disclosed in Japanese Patent Application No. 56-8319.
To demonstrate the differences with the enzyme produced by CIB 11647), the following test results are presented.

ん　等電点（ｐＩ）およびｐ−ヒドロキシ安息香酸水銀
（ＰＭＢ　）を用いて処理することによる抑制ＮＣＩＢ
　　１１６３９　　　　　５．６　　　　−ＮＣＩＢ　
　１１７７７　　　　　５．６　　　　−これらの結果
は、次の事実を示す。すなわち、本発明の酵素の活性は
、基準体からの醇累に反し、その活性部位付近のスルホ
ヒドリル基の存在と独立である、ということである。Isoelectric point (pI) and inhibition of NCIB by treatment with p-hydroxymercuric benzoate (PMB)
11639 5.6 -NCIB
11777 5.6 - These results demonstrate the following fact. That is, the activity of the enzyme of the present invention is independent of the presence of a sulfohydryl group near its active site, contrary to the accumulation from the reference body.

Ｂ、温度の関数としてのプルラナゼ活件（他の反応条件
は、プルラナーゼ活性の検査に対する上述の記載条件で
ある） 活性は６０℃の活性の７４−セントとして示される。B. Pullulanase activity as a function of temperature (other reaction conditions are those described above for testing pullulanase activity) Activity is expressed as 74 cents of activity at 60°C.

Ｃ１−および温度レベルを変化させた場合のグルコース
溶液（約３０％の乾物）中の熱安定性の比較 酵素製品を、脱イオン水に溶解もしくは脱イオン水で希
釈し、１ｄに対し約３　ＰＵ金含有る溶液を得た。酵素
溶液（１１）を、選定したーの０１Ｍミドレート−ホス
フェート緩衝液（１ｄ）と混合し次いでその溶液中にグ
ルコース（ｏ、ｓｙ）を溶解することにより試料を調製
した。選定した温度で試料を７２２時間インキュベージ
ンした後、残留アミロ硬りチン板切り活性（後記参照）
を測定した。残留アミロペクチンは、４℃で保持された
同＝の試料の活性度のパーセントとして示され６°　　
　　　　　　　　、Ｔ、。Comparison of thermostability in glucose solutions (approximately 30% dry matter) at varying C1- and temperature levels.Enzyme products dissolved in or diluted with deionized water yield approximately 3 PU per d. A gold-containing solution was obtained. Samples were prepared by mixing the enzyme solution (11) with the selected 01M amide-phosphate buffer (1d) and then dissolving glucose (o, sy) in the solution. After incubating the sample for 722 hours at the selected temperature, the residual amylo-hardening activity (see below)
was measured. Residual amylopectin is expressed as a percent of the activity of the same sample held at 4°C.
,T.

アミロ（クチンのアルファー１．６−結合の加水分屏は
、青色沃素−アミロペクチン錯体の色強度（６１０ｎｍ
で測定）の増加を起す。この増加は加水分解したアル７
７−１＋６−結合の量に左右される・ 枝切り酵素及びイソアミラーゼについてそれぞれ１〜２
　ＰＵ／ｄ及び２０〜４０　ＩＡ／ｍ／に相当する濃度
に脱イオン水で希釈した酵素溶液（１反）を酢酸塩緩衝
液（０，５Ｍ、ｐｉ−１４，５、ｌ　ｍｌ　）及びアミ
ロ（クチン〔ＣＰＣ１スノウ７Ｌ／（り（５ＮＯＷＦＬ
ＡＫＥ　）０４２０１澱粉〕のｌチ溶液（５１）と混合
する。混合物を５０℃で３００分間インキュページンす
る。The hydrolysis screen of the alpha 1.6-bond of amylo(cutin) is the color intensity of the blue iodine-amylopectin complex (610 nm
(measured at ). This increase is due to the hydrolyzed Al7
Depends on the amount of 7-1+6- bonds - 1 to 2 for debranching enzyme and isoamylase, respectively
An enzyme solution (1 volume) diluted with deionized water to a concentration corresponding to PU/d and 20-40 IA/m/m was added to an acetate buffer (0.5 M, pi-14.5, l ml) and amylo ( Kuching [CPC1 Snow 7L/(ri(5NOWFL)
AKE) 04201 starch] solution (51). The mixture is incubated at 50° C. for 300 minutes.

少量（０，５１１１１）を０．０２　Ｎ　Ｈ２ＳＯ４１
５Ｋｌ及び沃素溶液（０，２％沃化カリウム中の０．０
１Ｍ沃素）０．５１と混合する。A small amount (0,51111) of 0.02 N H2SO41
5 Kl and iodine solution (0.0 in 0.2% potassium iodide
1M iodine).

室温で１５分後、６１０　ｎｍでの光学密度を酵素を含
まないブランクのそれと比較する。After 15 minutes at room temperature, the optical density at 610 nm is compared to that of a blank without enzyme.

Ｄ、　　ｐＨおよび温度が予じめ定められた値に調整し
た反応混合物を用い、種々の温度レベルでの３．５〜５
．５の範囲におけるーに対する本発明の枝切り酵素の作
用の依存性を、上記のプルラナーゼ活性を測定するため
の方法によりて測定した。６０℃、６５℃、および７０
℃における声に対しプロ、トしたＮＣＩＢ　１１６３９
の枝切り酵素の相対的活性を示す添附図面を参照された
い。D. 3.5-5 at various temperature levels using a reaction mixture with pH and temperature adjusted to predetermined values.
．． The dependence of the action of the debranching enzyme of the present invention on - in the range of 5 was determined by the method for measuring pullulanase activity described above. 60°C, 65°C, and 70°C
NCIB 11639, which was performed professionally for the voice in °C.
See the accompanying drawings showing the relative activities of debranching enzymes.

これらの結果は次の内容を示している。すなわち、本発
明の枝切り酵素は日本特許願第５６−８８３１９に従っ
た基準体およびその突然変異株によって産生される酵素
よりも６０℃以上の温度でかつｐＨ４，５以下でより安
定である。These results show the following contents. That is, the debranching enzyme of the present invention is more stable at temperatures above 60° C. and below pH 4.5 than the enzyme produced by the standard and its mutant strains according to Japanese Patent Application No. 56-88319.

免疫学的性質 本発明の酵素製品を、基準法、すなわちＮＣｌＢ１１６
４７の突然変異株に対し生じた単因子抗血清を用い、日
本特許出願第５６−８８３１９号に開示した免疫学的試
験に委ねた。本発明の酵素のイムノグラムは、基準法の
それ［４！！２べ部分的免疫化学的同一性を示す。Immunological properties The enzyme products of the present invention were tested according to the standard method, namely NClB116.
Monofactorial antisera raised against the 47 mutant strains were used and subjected to immunological tests as disclosed in Japanese Patent Application No. 56-88319. The immunogram of the enzyme of the present invention is that of the standard method [4! ! 2 shows partial immunochemical identity.

次に、本発明の例を非制限的に示す。A non-limiting example of the invention will now be given.

例１ 菌株ＮＣＩＢ　１１６３９の増殖、培養および発酵を、
日本特許出ｌ！ｉ第５６−８８３１９号の例１で開示し
た如く行なった。Example 1 Growth, culture and fermentation of strain NCIB 11639
Japanese patent issued! It was carried out as disclosed in Example 1 of No. i 56-88319.

発酵培地は次の組成を有した。The fermentation medium had the following composition.

大豆ミールエキス杓　　　　　　　２０％コーンステイ
ープリカー　　　　　　　　　０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２００，０２５％ に２ＨＰＯ４０，１％ （ＮＨ４）　２Ｓｏ４０．０５％ 本）大豆ミールの抽出はｐ）１４．５および５０℃で４
時間で可能である。不溶性物質は遠心分離によって除去
さる。Soybean meal extract scoop 20% cornstarch liquor 05% MgSO4.7H
200,025% to 2HPO40,1% (NH4) 2So40.05% Book) Extraction of soybean meal p) 14.5 and 4 at 50℃
It is possible in time. Insoluble material is removed by centrifugation.

１３０℃で６０分、オートクレーブ処理する前に、−を
４．０に調整した。- was adjusted to 4.0 before autoclaving at 130°C for 60 minutes.

培養の間、水酸化ナトリウム溶液（２％）を添加して−
を５．６±０．１に保持した。温度は３０．０±０．１
℃であり、攪拌速［５３０〜５６５　ｒｐｎ＋のもと通
気速ｆは３２０１７／分であった。During the incubation, sodium hydroxide solution (2%) was added to -
was maintained at 5.6±0.1. Temperature is 30.0±0.1
℃, and the aeration rate f was 32017/min under stirring speed [530-565 rpm+.

発酵は、０．０３〜０．０５　ｈｒ　　の希釈速度で１
８６時間連続的に行なったが、その時溢流培養液の採取
が始ま・った。培養液（５１０Ｍ’、０．４７　ＰＵ／
１Ｌｔ）を、次の条件のもと更に９７時間ドライアイス
上に集めた； 希釈速ｆ　　　　Ｏ，０４９±０．００８　ｈｒ−’０
Ｄａｓｏ　　　　　　１０．６ｆ１．１細胞密度　　　
　２．９±１．５１／Ａ枝切り酵素活性　　　０５±０
．　Ｉ　ＰＵ／ｍｌ細胞を遠心分離により除去する。上
澄み液をワ、）　マｙ　（Ｗｈａｔｍａｎ　）　ＧＦＡ
ガラスフィルター（１１１）で−過し、次いでＨＩＰＩ
Ｏ膜を有するアミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）　ＤＣ２ホロ
ーファイ／Ｊ−モジュールで２００１に濃縮した。濁り
をＧＦＡフィルターで除去し、そしてＰ液を更［２０２
−ＤＤＳ　６００膜（ＤＤＳ、コインハーグン、デンマ
ーク）ヲ用い、アミコンモジュールで濃縮い　６５　Ｐ
Ｕｆｉｒｌの活性を有する最終濃縮物（３０ｍＡ）を得
た。この礎縮物を急速冷凍して保存した。Fermentation was carried out at a dilution rate of 0.03-0.05 hr.
This was carried out continuously for 86 hours, at which time collection of overflow culture fluid began. Culture solution (510M', 0.47 PU/
1 Lt) was collected on dry ice for an additional 97 hours under the following conditions; dilution rate f O, 049 ± 0.008 hr-'0
Daso 10.6f1.1 cell density
2.9±1.51/A debranching enzyme activity 05±0
．． I PU/ml cells are removed by centrifugation. Whatman GFA
Pass through a glass filter (111), then HIPI
It was concentrated to 2001 on an Amicon DC2 Holofi/J-Module with an O membrane. The turbidity was removed with a GFA filter, and the P solution was added [202
- Concentrated with Amicon module using DDS 600 membrane (DDS, Coinhagen, Denmark) 65 P
A final concentrate (30 mA) with Ufirl activity was obtained. This base product was quickly frozen and stored.

例２ 菌株ＮＣＩＢ　１１７７７からの砂切り製品の！Ｒ造全
溶ｆｆ５５Ｃ１のステンレス鋼ファーメンタ−内で発酵
を行なった。作東谷１ｉ３４０〜４３５！を用いた。Example 2 Sand-cut products from strain NCIB 11777! Fermentation was carried out in a stainless steel fermenter of R-made FF55C1. Saku Higashiya 1i340~435! was used.

培地組Ｍ、　　　　　　　　　　電池Ａ　　培地Ｂ酵母
抽出液ペースト（８０％乾物）３９大豆ミール　　　　
　　　　　２５９　　−コーンステイーグリカー（５０
％乾切）　　　５＆　　　１５ｇＫＨ２ＰＯ４１，８＃
　　　１．０Ｎ （ＮＩ（４）２８０４１．０．９　　１．３５ＩＣａＣ
１２，２Ｈ２０−０，２５１ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０−０，２５ｊ プルロニ、り（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）Ｌ６１　　　　０．
１１ＬｌＯ，１１１Ｌｌ水道水で　　　　　　　　　　
　　　１！　　　１！培地の−を水酸化ナトリウム溶液
・で５．４〜５．６に調節した。澱粉をターマミル（Ｔ
ＥＲＭＡＭＹＬ　）Ｌ　−６０（乾燥澱粉１ｋｌ？当た
ｖ２ｍｌ）で６０分間９０℃で液化した。くえん酸（乾
燥澱粉１ゆ当たｒ）１ｇ）を添加して液化を終了させ次
いで沸点まで加熱した。Medium set M, battery A medium B yeast extract paste (80% dry matter) 39 soybean meal
259 - Cornstay liquor (50
% dry cut) 5&15gKH2PO41,8#
1.0N (NI(4)28041.0.9 1.35ICaC
12,2H20-0,251 MgSO4,7H20-0,25j PLURONIC L61 0.
11LlO, 111Ll with tap water
1! 1! The − of the medium was adjusted to 5.4 to 5.6 with sodium hydroxide solution. Termamill the starch (T
ERMAMYL) L-60 (dry starch 1 kl/v2 ml) was liquefied at 90°C for 60 minutes. Liquefaction was terminated by adding citric acid (1 g per 1 liter of dry starch) and heating to boiling point.

フェルンパッハ（Ｆｅｒｎｂａｃｈ）培養フラスコ中で
例１に使用した閤じ栄養寒天基質上で２日間生育した菌
株ＮＣＩＢ　１１７７７の培養物を、培地Ａの５８！を
接種するため使用した。発酵を３５℃で冥施したが、そ
の際攪拌機の速度は１０７　ｒｐｍで、通気速度は０．
５バールの圧力で毎分３０標準す、トルにした。A culture of strain NCIB 11777 grown for 2 days on the nutrient agar substrate used in Example 1 in a Fernbach culture flask was grown at 58% of medium A. was used to inoculate. Fermentation was carried out at 35°C, with a stirrer speed of 107 rpm and an aeration rate of 0.
30 standard torr per minute at a pressure of 5 bar.

この接種培養物が１０８時間のエイジに達したら、培地
Ａ３４０Ｊを含有する、５５０ｔのファーメンタ−を接
種するため核接袖培養物を用いた。When this inoculated culture reached an age of 108 hours, the nuclear graft culture was used to inoculate a 550 t fermentor containing medium A340J.

５５０ｊの７アーメンター内の湯度を２９〜３１℃に維
持した。攪拌速度を１２　Ｏｒ、ｐ、ｍ、に設定した。The hot water temperature in the 7-armenter of 550j was maintained at 29-31°C. The stirring speed was set at 12 Or,p,m.

空気流を、０．５パールの圧力で毎分１５０標準り、ト
ルに調節した。４４時間から１９４時間まで、培地Ａが
毎時１４〜１９！の速度でファーメンタ−に供給された
。プロスの容積が４３５１に達したら、培養液を自動的
に除去した。Air flow was adjusted to 150 standard torr per minute at a pressure of 0.5 par. From 44 hours to 194 hours, medium A is 14-19 every hour! was fed to the fermenter at a rate of When the volume of the prosthesis reached 4351, the culture medium was automatically removed.

接種１９４時間から実験の終了の５２５時間まで、培地
Ｂを毎時１１〜１９！の速度でファーメンタ−に供給し
た。容積物を上述のように４３５ｊＫ保持した。From 194 hours of inoculation until the end of the experiment at 525 hours, medium B was added every hour from 11 to 19 hours. was fed to the fermenter at a rate of The volume was held at 435jK as described above.

接種後約３８時間に激しい生長を００２の発生および顕
微鏡により観察した。プルラナーゼ活性は生成６９時間
ニ１１Ｒ１当たり０．２ＰＵＫ達りそして培地を交換す
るまでこのレベルにあった。接種後２１９時間に、プル
ラナーゼ活性は１　ｍｌ当たり１．４ＰＵ以上に達した
。活性は、接種後４９５時間に実験中の最大の１ｄ当た
り３．２ＰＵに達した。Approximately 38 hours after inoculation, intense growth was observed by 002 development and microscopy. Pullulanase activity reached 0.2 PUK per 11R1 after 69 hours of production and remained at this level until the medium was replaced. At 219 hours after inoculation, pullulanase activity reached more than 1.4 PU/ml. Activity reached an experimental maximum of 3.2 PU/d 495 hours after inoculation.

培養物のｐ）（は５．４〜５．８の範囲で変化した。２
２５時間から３１２時間まで、培養液を集めそして水中
で冷却した。The p) of the cultures varied from 5.4 to 5.8.2
From 25 hours to 312 hours, cultures were collected and cooled in water.

発酵液（ＩＦ当たり１．７３ＰＵの活性度を有する）１
４５（ｌを、塩化カルシウムの１５ｋｇ、フィルトｏッ
クス（Ｆｌ　１ｔｒｏｘ）　ＸＬ　Ｏ１の１ｋｇおよび
ナルコ（Ｎａｌｃｏ）　６７３の０．２５に＆を用いて
ｐＨ６，０で凝集させた。Fermentation broth (with an activity of 1.73 PU per IF) 1
45 (l) was flocculated at pH 6.0 using 15 kg of calcium chloride, 1 kg of Fl 1trox XL O1 and 0.25 & of Nalco 673.

スラッジを遠心分離で除去し、次いで最後のかすみ状の
ものを、濾過助剤として珪藻土を用いサプラ（５ｕｐｒ
ａ　）　１００　濾過板で濾過した。The sludge is removed by centrifugation, and the final haze is then filtered using diatomaceous earth as a filter aid (5upr).
a) Filtered through a 100 filter plate.

酢酸を用いＰ液をｐ）（４，８に調整し、次いでＧＲ６
０膜を備えたＤＤＳ　３５モジー−レを用いて濃縮した
。最終濃縮物（１５ｋｌＩ）は乾物１０．６チを含有し
ていた。Adjust the P solution to p) (4,8 using acetic acid, then GR6
Concentration was performed using a DDS 35 module equipped with a 0 membrane. The final concentrate (15klI) contained 10.6g dry matter.

珪藻土を用いて更に加圧濾過し、１膜当たり９５　ＰＵ
の活性度を有する酵素濃縮物（１２，８ｋｇ、乾物９．
８％を含有）を得た。Further pressure filtration using diatomaceous earth results in 95 PU per membrane.
Enzyme concentrate (12.8 kg, dry matter 9.0 kg) with an activity of
8%) was obtained.

例３ 出発材料は、上記例２で集められた冷却発酵液（３りで
あった。全ての連続工程は４℃〜８℃の温度範囲で行な
われた。Example 3 The starting material was the cooled fermentation liquor collected in Example 2 above. All sequential steps were carried out at a temperature range of 4°C to 8°C.

次いで、液体を、べ、クマンＪ６遠心機内で３００　Ｏ
ｒ、ｐ、ｍ、で遠心分離した。ＨＩＰ　１０膜を備えた
アミコンホローファイバーｍ縮ｓ、ｍＤ　Ｃ４（アミコ
ン社、マサッチューセット州、米国）を用いて、上澄み
液を２０００ｍ１に磁線した。The liquid was then incubated at 300 O in a Kuman J6 centrifuge.
Centrifuged at r,p,m. The supernatant was magnetized to 2000 ml using an Amicon hollow fiber mDC4 (Amicon, Massachusetts, USA) equipped with a HIP 10 membrane.

次いでＤＣ４の設定を、透析に変え次いで誘導率を２ｍ
５Ｉに低下させそしてｐ）ｌを酢酸で３８に調整した。Next, change the setting of DC4 to dialysis, and then set the induction rate to 2m.
5I and p)l adjusted to 38 with acetic acid.

次いで得られた酵素溶液を、酢酸ナトリウム緩衝液（０
，０２Ｍ、　Ｐｉ（３，８）　Ｔ平衡化したＣＭ−（！
ファロースＣＬ−６Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｓ
ｗｅｄｅｎ）カラムに供給し、これにより大部分の酵素
が吸収された。The resulting enzyme solution was then diluted with sodium acetate buffer (0
,02M, Pi(3,8) T-equilibrated CM-(!
Phallose CL-6B (Pharmacia, S
(Weden) column, which absorbed most of the enzyme.

ＮＪＬ２ＨＰＯ２緩衝液（０，０２Ｍ）と粉状に混合し
た同じ緩＃猷で溶離を実施して、３８〜７．２のｌ勾配
を得た。プルラナーゼ活性について、フラクシ目ンヲ分
析した。活性なフラクシｌンをプールシ、次いでＰＩＯ
ホローファイバー濃縮器で３５０１ｉｌに濃縮した。Elution was carried out with the same loose powder mixed with NJL2HPO2 buffer (0.02M) to obtain a 38-7.2 l gradient. Fracini were analyzed for pullulanase activity. Active fraxin was added to PIO, then PIO
It was concentrated to 3501 il using a hollow fiber concentrator.

濃縮物を同量の９６％の冷（４０’Ｃ）エタノールと混
合した。沈澱物を、ベックマン５６遠心器内で３０００
　ｒｐｒｎで遠心分離した。沈澱物を水（１５０ａ＋Ａ
り中に溶解した。The concentrate was mixed with an equal volume of 96% cold (40'C) ethanol. The precipitate was centrifuged at 3000 °C in a Beckman 56 centrifuge.
Centrifuged in rprn. Pour the precipitate into water (150a+A
It dissolved during the process.

ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｅｌｍ　）　（スウｘ−ｙ
ン）から購入されたクロマトフォーカシイング用キ。Pharmacia (Pharmaelm) (Suu x-y
Chromatofocusing key purchased from

トを、最後の精製工程に対し用いた。１５ｏＷＬｔのＰ
ＢＥ　９４を２５Ｘ４００■カラムに２５フアルマシア
中に充填し次いで流速１５０ｄ／ｈで２５ｍＭイミダゾ
ール緩衝液（ｐｉ−１７，４）で平衡化した。次いで１
；８に希釈したポリパワファー７４を適用しく１５０ｍ
ｊ）、絖いて試料（可溶化されるエタノール沈澱物を適
用した。次いで２０００ｄのポリバッファ７４（１：８
に希釈）を適用し勾配法を開始した。was used for the final purification step. 15oWLt P
BE 94 was packed into a 25×400 μ column in 25 Pharmacia and equilibrated with 25 mM imidazole buffer (pi-17,4) at a flow rate of 150 d/h. then 1
;Apply Polypower Fur 74 diluted to 150m
j) The sample (ethanol precipitate to be solubilized) was applied. Then 2000 d of polybuffer 74 (1:8
dilution) was applied and the gradient method was started.

１７０ｄの全量中、酵素をｐＨ５，４付近で溶出し、次
イでＤＤＳ５００膜を有するアミコン型２０２濃縮セル
で２０１Ｌｌに濃縮した。The enzyme was eluted at around pH 5.4 from the total amount of 170d, and then concentrated to 201Ll using an Amicon type 202 concentration cell with a DDS500 membrane.

ＩＷＬｌ当たりタン・臂り１０■を含有する、得られた
溶液は１１当た１５００ＰＵのゾルラナーゼ活性を有し
ており、従ってタン・やりＩＩ当たり１５０．０００の
特異活性を有した。The resulting solution, containing 10 μl of tongue lance per IWLl, had a zorlanase activity of 1500 PU per lWLl and thus a specific activity of 150.000 per tongue lance II.

例４ ＤＥ７．０を有する、噴霧乾燥したマルトデキストリン
のパッチを調製した。Example 4 A spray-dried maltodextrin patch was prepared having a DE of 7.0.

このマルトデキストリンの過当量を脱イオン水に再溶解
させ、約３０％Ｄ、　Ｓ、にすることにより糖化用基質
を調製した。次にこの基質の少量を６０℃に加熱し、−
を４．８．４．５又は４．’０１／ｌ：調節した。A substrate for saccharification was prepared by redissolving an excess of this maltodextrin in deionized water to approximately 30% D,S. A small amount of this substrate was then heated to 60°C and -
4.8.4.5 or 4. '01/l: Adjusted.

０．１１３ＡＧ単位／Ｉ　Ｄ　Ｓ　ｕｎ−ｊル、則用量
ノクルコアミラーゼについてこの７リーズの平行した糖
化実験を行なった。第一のシリーズでは、ＩＰＵ／１１
　ＤＳに対応する、ＮＣＩＢ　１１６４７からの枝切り
酵素の量を添加した。躯二のシリーズでは１ＰＵ／ｉ　
ＤＳ　Ｋ対応する、ＮＣＩＢ　１１７７７からの枝切り
＃累の量を添加した。試＃＋混合物を一定時間間隔で採
取し、各試料中のデキストロース含有率（＠をＨＰＬＣ
によって測定した。下記の結果が得られた。This 7-lead parallel saccharification experiment was performed with a standard dose of nocturnal coamylase of 0.113 AG units/ID Sun. In the first series, IPU/11
The amount of debranching enzyme from NCIB 11647 corresponding to the DS was added. 1PU/i in the series
An amount of branch cuttings from NCIB 11777 corresponding to DS K was added. Sample #+mixture was sampled at regular time intervals, and the dextrose content in each sample (@ is HPLC
Measured by. The following results were obtained.

ＮＣＩＢ　１１６４７からの枝切り酵素ＮＣＩＢ　１１
７７７からの枝切り酵素これらの結果は、次の事実を示
している。すなわち、…約４．４で糖化を開始した場合
、ＮＣｌＢ１１６４７およびＮＣＩＢ　１１７７７から
の枝切り酵素については、類似の結果を得ることができ
る。…約４．０以下では、ＮＣＩＢ　１１６４７からの
枝切り酵素とは異ってＮＣＩＢ　１１７７７からの板切
ジ酵素はその活性を保持している。Branch cutting enzyme NCIB 11 from NCIB 11647
Debranching enzyme from 777 These results indicate the following facts. That is, similar results can be obtained for the debranching enzymes from NCIB 11647 and NCIB 11777 if the saccharification is started at about 4.4. ... Below about 4.0, the debranching enzyme from NCIB 11777 retains its activity, unlike the debranching enzyme from NCIB 11647.

例５ 例４で記載した少量の基質を、ｐＨ４，５に調整し次い
で６０℃に加熱した。０．１１３ＡＣ単位／ｌ１Ｄｓに
相当する量およびＮＣＩＢ　１１６３９から得られた枝
切り酵素の変化量を添加した。反応混合物を採取し、実
施例４におけると同様に分析した。Example 5 A small amount of the substrate described in Example 4 was adjusted to pH 4.5 and heated to 60°C. An amount corresponding to 0.113 AC units/l1Ds and varying amounts of debranching enzyme obtained from NCIB 11639 were added. The reaction mixture was collected and analyzed as in Example 4.

以下余白 これらの結果は次の事実を示している。３０％Ｄ、　Ｓ
、マルトデキスト、リンを６６℃でかつｐＨ４〜４．５
で糖化することにより、９７０過剰ＤＸが、グルコアミ
ラーゼの１　＃Ｄ８当たり０．１１３ＡＧおよび本発明
の枝切り酵素ｌＩＤ８当たり少なくともＩＰＵからなる
酵素系について達成できる。These results show the following facts. 30%D, S
, maltodext, phosphorus at 66°C and pH 4-4.5
An excess of 970 DX can be achieved for an enzyme system consisting of 0.113 AG per #D8 of glucoamylase and at least IPU per ID8 of the debranching enzyme of the invention.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

図は、種々の−および温度における本発明の酵素のプル
ラナーゼ活性を示すグラフである。 特許出願人 ノボ　インダストリ　アクテイーゼルスカプ特許出願代
理人 弁理士　　青　木　　　朗 弁理士　西舘和之 弁理士　　内　１）幸　男 弁理士　　山　口　昭　之 図面の浄書（内存に変更なし） °へ全１へも−を約馴 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５７年特許顧　第１８３０２２号 ２、発明の名称 板切ｐ＃素製品 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　　　ノボインダストリ　アクテイーゼルスカブ４
、代理人 ６、補正の対象 図　　　面 ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 浄書図面　　　　　１通The figure is a graph showing the pullulanase activity of the enzyme of the invention at various temperatures. Patent applicant: Novo Industri ActeaselScap Patent agent Akira Aoki Patent attorney Kazuyuki Nishidate 1) Yukio male patent attorney Akira Yamaguchi Engraving of the drawing (no changes to the original) Go to all 1 1. Indication of the case Patent Consultant No. 183022 of 1983 2. Name of the invention Plate cut p # Raw product 3. Person making the amendment Relationship with the case Patent application Person name Novo Industries Acteasel Sub 4
, Agent 6, Drawings to be amended 7, Engraving of drawings to be amended (no change in content) 8, Engraving drawings of attached documents 1 copy

Claims (1)

【特許請求の範囲】 ｌ　下記の特性を有する； 凰）パチルスアシドグルリティクス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｅｉｄｏｐｕ１１ｕｌｙｔｉｅ
ｕ＠）ＮＣＩＢ１１６３９又はその変異株もしく祉突然
変異株を適当な栄養培地中で培養することによって製造
された発酵液から得られ、 ｂ）バチルスアシドプルリティクス （ｉｌａｅｌｌｌａｓ　ａｃｉｄｏｐａｌｌｕｌｙｔｌ
ｃｕｓ）基準法ＮＣｌＢ１１６０７から誘導された枝切
り酵素と部分的に同一〇酵素化学的性質を示し、 ｃ）ｐａ４〜５で酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）中でイン
キ為ベージ璽ンすることによシ測定して最適活性が６５
℃〜７０℃にあり、 ｄ）最適−が、約６０℃の酢酸塩１１衝液（０，０５Ｍ
）中で掬定して３．５〜５．５の範囲にあシ、・）少な
くとも５０９６のＰ［（５のガキストロース溶液（３０
重量％・乾物として）中で橋」定して７２時間後６０℃
で残留活性を有する、ゾルラナーゼ型の新規枝切り酵素
を含むことを特徴とする枝切シ酵素製品。 ２、枝切り酵素活性がｌＩ轟クシ１０〜３５００００、
プルラナーゼ単位の範囲にある特許請求の範囲第２項記
載の枝切り酵素製品。 ３　活性が１ｇ轟クシ１００〜１５，０００ゾルラナー
ゼ単の範囲にある特許請求の範囲第２項記載の枝切シ酵
素製品。 ４、全ての実施上の目的に対し、適当な栄養培地中でバ
チルス・アシドグルリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
ｅｉｄｏｐ＠１ｌｕｌｙｔｉ暑ｕａ）ＮＣＩ８１１６３
９、又はその枝切シ酵素童生突然変異株と同一でありか
つそれに含まれる菌株の培養および培養物を會む培地か
ら枝切シ酵素の回収。 ５、下記の特性を有する； ａ）菌株バチルスアシドグルリティクス（Ｌａｅｌｌｌ
ｕｍ　ａｅｉｄｏｐｕｌｌｍｌｙｔｉｅｕｓ）ＮＣＩｉ
ｌ　１１６３９又はその変異株もしくは突然変異株を適
当な栄養培地中で培養することによって製造された発酵
液から得られ、 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｌｄｅｐｉｌｌｕｌｙｔｉｅ
ｕｓ）基準株ＮＣｌＢ１１６０７から誘導され九板切シ
酵素と部分的に同一の酵素化学的性質を示し、 ｃ）−４〜５で酢酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）中でインキ
エペーシ■ンすることにより測定して最適活性が６５℃
〜７０℃にあシ、 ｄ）１ｍ４が、約６０℃の酢ｗｋ塩ａＳ液（０，０５Ｍ
）中で測定して３．５〜５．５の範囲にあり、す少なく
とも５０チのｐＨ５のデキストロース溶液（３０重量−
・乾物として）中で測定して７２時間後６０℃で残留活
性を有する、プルラナーゼ型の新規板切シ酵累を含んで
なる板切シ酵素製品の製造方法であって、炭素源９ｇｉ
素源及び無機塩類を含む適当な栄養培地中で、菌株バチ
ルス・アシドプルリティクスＮＣＩＢ　１１６３９、又
はその板切シ陣嵩意生変異株もしくは突然変異株を培養
し、続いて板切シ′ｔ＃素生成物を回収することを特徴
とする板切シ酵素製品の製造方法。 ６　前記バチルス・アシドプルリテイクス曹株が突然変
異株ＮＣＩＢ　１１７７７である特許請求の範囲第５項
記載の方法。 ７、全ての実施上の目的に対し、適嶺な栄養培地中でバ
チルス・アシド！ルリティクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａ
ｃｌｄｅｐｉｌｌｕｌｙｔｉｅｕｓ）ＭＣＩ８１１６３
９、又はその板切り酵素産生突然変異株と同一でありか
つそれを含有する菌株の培養シに゛に培養物を含む培地
から板切シ酵素を回収することによって得られる新規板
切シ酵素の有効量並びにグルコアンラーゼ及びベータア
ミラーゼから成る群から選択した糖化酵素を含む酵素系
の存在で澱粉または澱粉加水分解生成物の糖化を行なう
ことを特徴とする、デキストロース及び／ｌたはマルト
ースを含むシロ、グに澱粉を変える方法。 ８、更に１乾物重量で少なくとも３０チＯ澱粉加水分解
生成物を糖化する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、糖化を４．０〜４．５の声範門で少なくとも６０℃
の温度で行なう特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０　　グルコアミラーゼ及びベータアミラーゼの用量
が乾物１ｇ当シそれぞれ００５〜０５ＡＧＭｉ位及びｏ
、ｏｏｓ〜０３ベータアミラーゼ巣位の範囲にある特許
請求の範囲第７項記載の方法。 １１　　板切）酵素の用量が乾物１ｇ当り０．００５〜
５プルラナ一ゼ単位の範囲にある特許請求の範囲第１０
項記載の方法。[Scope of Claims] l Having the following properties;
u@) Obtained from a fermentation broth produced by culturing NCIB11639 or its mutant strain or mutant strain in a suitable nutrient medium, b) Bacillus acidopallulytl
cus) exhibits partially identical enzymatic chemistry to the debranching enzyme derived from reference method NClB11607, and c) can be printed in acetate buffer (0.05M) at 4-5 p.a. Optimum activity is 65 when measured
d) Optimal - acetate 11 buffer (0.05 M
) in the range of 3.5 to 5.5, ・) at least 5096 P
After 72 hours at 60℃ (weight%, dry matter)
A debranching enzyme product characterized in that it contains a novel debranching enzyme of the zorlanase type, which has residual activity at . 2. Branch cutting enzyme activity is lI Todorokushi 10-350,000,
A debranching enzyme product according to claim 2 in the range of pullulanase units. 3. The debranching enzyme product according to claim 2, having an activity in the range of 100 to 15,000 sollanase per gram. 4. For all practical purposes, grow Bacillus acidoglulyticus in a suitable nutrient medium.
eidop@1lulytihotua)NCI81163
9, or a strain identical to and contained in the debranching enzyme mutant strain thereof, and recovery of the debranching enzyme from the medium containing the culture. 5. Has the following characteristics; a) Strain Bacillus acidoglulyticus (Laell.
um aeidopullmlytieus)NCIi
Bacillus acldepillulytie, obtained from a fermentation broth produced by culturing B. l 11639 or a variant or mutant strain thereof in a suitable nutrient medium;
us) derived from the reference strain NClB11607 and exhibiting enzymatic chemistry partially identical to the nine-plate cleavage enzyme, and c) by inkypecination in acetate buffer (0.05 M) at -4 to 5. Optimum activity measured at 65℃
d) 1 m4 of vinegar wk salt aS solution (0.05M
) and at least 50 grams of a pH 5 dextrose solution (30 wt.
・A method for producing an Itakiri enzyme product comprising a novel Itakiri fermentation product of the pullulanase type, which has residual activity at 60°C after 72 hours as measured in dry matter, the method comprising a carbon source of 9 gi
The strain Bacillus acidoplulyticus NCIB 11639, or its mutants or mutants, is cultured in a suitable nutrient medium containing raw materials and inorganic salts, followed by cultivation of the strain Bacillus acidoplulyticus NCIB 11639, or a variant or mutant strain thereof. A method for producing a board-cutting enzyme product, characterized by recovering elementary products. 6. The method according to claim 5, wherein the Bacillus acidopluriticus strain is a mutant strain NCIB 11777. 7. Bacillus acid in suitable nutrient media for all practical purposes! Luriticus (Bacillus a)
cldepillulytieus) MCI81163
9, or a novel plate-cutting enzyme obtained by recovering the plate-cutting enzyme from a medium containing the culture of a strain that is identical to and contains the plate-cutting enzyme-producing mutant strain. dextrose and/or maltose, characterized in that it carries out the saccharification of starch or starch hydrolysis products in an effective amount and in the presence of an enzyme system comprising a saccharifying enzyme selected from the group consisting of glucoanlase and beta-amylase. How to change starch into starch and starch. 8. The method of claim 7 further comprising saccharifying at least 30 thiO starch hydrolysis product by dry weight. 9. Saccharification at least 60℃ with a vocal range of 4.0 to 4.5
8. The method according to claim 7, which is carried out at a temperature of . 10 The doses of glucoamylase and beta amylase were 005 to 05 AGMi and o, respectively, per 1 g of dry matter.
, oos to 03 beta amylase concentration. 11 Itagiri) Enzyme dosage is 0.005 to 1 g of dry matter
Claim 10 in the range of 5 pullulanase units
The method described in section.