JPS5818080B2 - コレステリンの測定法及び測定試薬 - Google Patents
コレステリンの測定法及び測定試薬Info
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- JPS5818080B2 JPS5818080B2 JP56196400A JP19640081A JPS5818080B2 JP S5818080 B2 JPS5818080 B2 JP S5818080B2 JP 56196400 A JP56196400 A JP 56196400A JP 19640081 A JP19640081 A JP 19640081A JP S5818080 B2 JPS5818080 B2 JP S5818080B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はコレステリンオキシダーゼを使用してコレステ
リンを測定するための方法及び試薬に関する。
リンを測定するための方法及び試薬に関する。
コレステリンを、場合によりあらかじめ化学的又は酵素
的な鹸化によりそのエステルから遊離させた後、分子状
酸素の存在下にコレステリンオキシダーゼを用いて、コ
レステノン及びＨ２Ｏ２に変換させ、この定量的に経過
する反応をコレステリンの測定に使用することは公知で
ある。
的な鹸化によりそのエステルから遊離させた後、分子状
酸素の存在下にコレステリンオキシダーゼを用いて、コ
レステノン及びＨ２Ｏ２に変換させ、この定量的に経過
する反応をコレステリンの測定に使用することは公知で
ある。
この際、生じたコレステノンもしくはＨ２０□、又は消
費された酸素を測定する。
費された酸素を測定する。
この酵素的コレステリン−測定法はたしかにその特異性
により、従来常用されていた化学的測定法にくらべて大
きな進歩をもたらしたのではあるが、この方法は現在ま
で迅速で、実用的な動力学的な実施法に適していない。
により、従来常用されていた化学的測定法にくらべて大
きな進歩をもたらしたのではあるが、この方法は現在ま
で迅速で、実用的な動力学的な実施法に適していない。
反応工程の最も特異的な部分工程を触媒するコレステリ
ンオキシダーゼのＫＭ−値が低いために、コレステリン
測定に重要な１３ミリモル／ｌまでの濃度範囲でこの反
応は１次もしくは擬１次的に進行しないのである。
ンオキシダーゼのＫＭ−値が低いために、コレステリン
測定に重要な１３ミリモル／ｌまでの濃度範囲でこの反
応は１次もしくは擬１次的に進行しないのである。
この種の反応経過は、従来必要であった終点法もしくは
動力学的法に対し何個の分析あたりの必要時間を著しく
短縮する、試料空位を必要としない、迅速で、実用的な
動力学的な測定法にとって必要なことである。
動力学的法に対し何個の分析あたりの必要時間を著しく
短縮する、試料空位を必要としない、迅速で、実用的な
動力学的な測定法にとって必要なことである。
従来の測光法に必要な時間は１０〜６分であったが、動
力学的な方法により１〜３分の分析時間が得られる。
力学的な方法により１〜３分の分析時間が得られる。
新しい時代の自動分析機は高い試料通過量を想定。
しており、コレステリン検出の分野における従来の方法
では達成することのできない短かい培養時間を可能とす
る。
では達成することのできない短かい培養時間を可能とす
る。
従って、今日常用の高い分析量を有する自動分析機は十
分に使用されていないのである。
分に使用されていないのである。
； 従って、本発明の課題は擬１次に進行するコレステ
リンオキシダーゼ反応の動力学的測定法を見い出すこと
である。
リンオキシダーゼ反応の動力学的測定法を見い出すこと
である。
関与する酵素のＫＭ値が低くすぎる際に人工的なＫＭ値
上昇によりこの種の反応経過を達成する１ことが多くの
場合可能であることは公知である。
上昇によりこの種の反応経過を達成する１ことが多くの
場合可能であることは公知である。
ミヒヤエリス（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ）及びメントン（Ｍ
ｅｎｔｏｎ）の理論によれば、酵素のミヒヤエリス定数
が最大基質濃度より著しく犬である場合、酵素により触
媒される一基質反応は広い濃度範囲ノにおいて一次的に
経過する。
ｅｎｔｏｎ）の理論によれば、酵素のミヒヤエリス定数
が最大基質濃度より著しく犬である場合、酵素により触
媒される一基質反応は広い濃度範囲ノにおいて一次的に
経過する。
ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ブレビバクテリウ
ム（Ｂｒｅ−ｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）又はストレプ
トマイセチン（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｔｅｎ）のような
種々の微生物属からの従来公知のコレステリンオキシダ
ーゼは；１０−’〜１０−５モル／ｌのＫＭ値を示すの
で、非常に僅かなコレステリン濃度でのみ動力学的に測
定することができる。
ム（Ｂｒｅ−ｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）又はストレプ
トマイセチン（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｔｅｎ）のような
種々の微生物属からの従来公知のコレステリンオキシダ
ーゼは；１０−’〜１０−５モル／ｌのＫＭ値を示すの
で、非常に僅かなコレステリン濃度でのみ動力学的に測
定することができる。
競合的阻害剤を添加すること（こよりコレステリンオキ
シダーゼ゛のＫＭイ直を自体公知方法で人工的に上昇さ
せるという実験は無）効であることを示した。
シダーゼ゛のＫＭイ直を自体公知方法で人工的に上昇さ
せるという実験は無）効であることを示した。
しかしながら、一定の起源のコレステリンオキシダーゼ
及び一定のフェノール誘導体の選択により擬１次的反応
経過を達成することができることが意外にも判明した。
及び一定のフェノール誘導体の選択により擬１次的反応
経過を達成することができることが意外にも判明した。
シ 従って、コレステリンオキシダーゼ及び場合により
コレステリンエステラーゼを用いて酸素消費量、生じた
過酸化水素又は生じたコレステノンを測定することによ
り遊離又は結合した形のコレステリンを測定するための
本方法はストレプトマインセス属の微生物から得られた
コレステリンオキシダーゼを使用し、かつ３，４−ジク
ロルフェノールの添加下に、この測定を動力学的に実施
することを特徴とする。
コレステリンエステラーゼを用いて酸素消費量、生じた
過酸化水素又は生じたコレステノンを測定することによ
り遊離又は結合した形のコレステリンを測定するための
本方法はストレプトマインセス属の微生物から得られた
コレステリンオキシダーゼを使用し、かつ３，４−ジク
ロルフェノールの添加下に、この測定を動力学的に実施
することを特徴とする。
従来コレステリン測定に常用のノカルジア又はブレビバ
クテリアからのコレステリンオキシダーゼを用いず、か
つ競合的阻害剤として先ず第１に考えられるコレステリ
ン類似ステロイド又は胆汁酸を用いることもなく、動力
学的測定をはじめて可能とした、そのような反応経過を
達成することができた。
クテリアからのコレステリンオキシダーゼを用いず、か
つ競合的阻害剤として先ず第１に考えられるコレステリ
ン類似ステロイド又は胆汁酸を用いることもなく、動力
学的測定をはじめて可能とした、そのような反応経過を
達成することができた。
ジクロルフェノールの他の異性体も反応経過に全く影響
を与えないか、又は不十分にしか影響を与えない。
を与えないか、又は不十分にしか影響を与えない。
従って、３，４−ジクロルフェノールとストレプトマイ
セス属の微生物からの酵素との間に特別な相互作用が生
じると思われる。
セス属の微生物からの酵素との間に特別な相互作用が生
じると思われる。
ストレフトマイセス属のものからコレステリンオキシダ
ーゼを得ることは西ドイツ国特許公開第２９２４８７５
．７号公報に記載されている。
ーゼを得ることは西ドイツ国特許公開第２９２４８７５
．７号公報に記載されている。
好適な種類の例はストレプトマイセス・グリセオフスカ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓ
ｃｕｓ。
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓ
ｃｕｓ。
ＤＳＭ４０１９１ ）、ストレフトマイセス・ヒゲロス
コピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓ
−ｃｏｐｉｃｕｓ、ＤＳＭ４０７７１ ）及びストレプ
トマイセス・アシドマイセチカス（Ｓｔｒ６ｐｔｏｍ−
ｙｓｅｓ ａｃｉｄｏｍｙｃｅｔｊｃｕｓ、ＤＳＭ４
０７９８）である。
コピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓ
−ｃｏｐｉｃｕｓ、ＤＳＭ４０７７１ ）及びストレプ
トマイセス・アシドマイセチカス（Ｓｔｒ６ｐｔｏｍ−
ｙｓｅｓ ａｃｉｄｏｍｙｃｅｔｊｃｕｓ、ＤＳＭ４
０７９８）である。
この所望の一次の反応経過は広い濃度範囲の３゜４−ジ
クロルフェノール及びコレステリンオキシダーゼにおい
て達成することができる。
クロルフェノール及びコレステリンオキシダーゼにおい
て達成することができる。
３，４−ジクロルフェノール０．５〜１０ミリモル／ｌ
）及びストレプトマイセスからのコレステリンオキシダ
ーゼ０．１〜２０ Ｘ １０３Ｕ／１１を使用するのが
有利である。
）及びストレプトマイセスからのコレステリンオキシダ
ーゼ０．１〜２０ Ｘ １０３Ｕ／１１を使用するのが
有利である。
その他の点では本発明の実施方法は動力学的測定に常用
の方法で行なわれた。
の方法で行なわれた。
あらかじめ決めた時間範囲内に少なくとも２回の測定を
実施するのが有利である。
実施するのが有利である。
この測定はストレプトマイセスからのコレステリンオキ
シダーゼが活性である全ｐＨ値範囲で実施することがで
きる、但し使用した補助酵素がこのｐＨ範囲で同様に活
性であることを前提とする。
シダーゼが活性である全ｐＨ値範囲で実施することがで
きる、但し使用した補助酵素がこのｐＨ範囲で同様に活
性であることを前提とする。
６．５〜８のｐＨ値で緩衝させた溶液中で、この測定を
実施するのが有利である。
実施するのが有利である。
すでに記載したように、コレステリンオキシダーゼを使
用してコレステリンを測定するすべての公知法を原則的
に使用することができる。
用してコレステリンを測定するすべての公知法を原則的
に使用することができる。
しかし、２３０〜２５０ｎｍでのコレステノン形成の測
定は、３，４−ジクロルフェノールがコレステノンの測
定光において吸収を行なうので、高濃度の３゜４−ジク
ロルフェノールにおいてはあまり好適ではない。
定は、３，４−ジクロルフェノールがコレステノンの測
定光において吸収を行なうので、高濃度の３゜４−ジク
ロルフェノールにおいてはあまり好適ではない。
従って、本発明方法のこの実施形式において、３，４−
ジクロルフェノールの濃度は１５ミリモル／ｌを越える
べきではない。
ジクロルフェノールの濃度は１５ミリモル／ｌを越える
べきではない。
本発明方法の有利な実施形式は生じた過酸化水素を４−
アミノアンチピリン、フェノール、ペルオキシダーゼ及
びこれらの混合系に好適な緩衝剤の添加により測定する
こさよりなる。
アミノアンチピリン、フェノール、ペルオキシダーゼ及
びこれらの混合系に好適な緩衝剤の添加により測定する
こさよりなる。
ここで燐酸塩緩衝剤、へペス緩衝剤（ＨＥＰＥＳ ：
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエクン
ースルホン酸）又はトリス緩衝剤は好適である。
４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエクン
ースルホン酸）又はトリス緩衝剤は好適である。
本発明のこの実施形式において、更に非イオン系界面活
性剤及び場合により付加的にコール酸グループの界面活
性剤を添加する場合最高の結果が得られる。
性剤及び場合により付加的にコール酸グループの界面活
性剤を添加する場合最高の結果が得られる。
本発明のもの１つの課題はコレステリンオキシダーゼ及
びＨ２０□又はコレステノンの測定用混合系並びに場合
によりコレステリンエステラーゼを含有するコレステリ
ンの動力学的測定用試薬であり、これは付加的に３，４
−ジクロルフェノールを含有し、このコレステリンオキ
シダーゼはストレプトマイセス属の微生物からのもので
あることを特徴とする。
びＨ２０□又はコレステノンの測定用混合系並びに場合
によりコレステリンエステラーゼを含有するコレステリ
ンの動力学的測定用試薬であり、これは付加的に３，４
−ジクロルフェノールを含有し、このコレステリンオキ
シダーゼはストレプトマイセス属の微生物からのもので
あることを特徴とする。
Ｈ２０□の測定用混合系は４−アミノアンチピリン又は
その誘導体、フェノール又はフェノール誘導体、緩衝剤
及び界面活性剤の組み合わせ（しばしばこれは’ＰＡＰ
”−混合系として表４つされる）が有利である。
その誘導体、フェノール又はフェノール誘導体、緩衝剤
及び界面活性剤の組み合わせ（しばしばこれは’ＰＡＰ
”−混合系として表４つされる）が有利である。
ＰＡＰ−混合系及びその変化したものは、その生じた色
素がＵＶにおいて３，４−ジクロルフェノールと異なる
波長を吸収し、これにより吸光の重なりによる精度に対
する妨害が生じないので特に有利である。
素がＵＶにおいて３，４−ジクロルフェノールと異なる
波長を吸収し、これにより吸光の重なりによる精度に対
する妨害が生じないので特に有利である。
非イオン系界面活性剤を単一で又は場合によりコール酸
グループの界面活性剤と一諸に使用するのが特に好適で
ある。
グループの界面活性剤と一諸に使用するのが特に好適で
ある。
、本発明による試薬は緩衝剤を含有するのが有利であり
、この際関与した酵素の活性範囲、有利に６．５〜８の
ｐＨ範囲で緩衝作用を有する、すべての緩衝剤をあげる
ことができる。
、この際関与した酵素の活性範囲、有利に６．５〜８の
ｐＨ範囲で緩衝作用を有する、すべての緩衝剤をあげる
ことができる。
燐酸塩緩衝剤、ヘペス緩衝剤及びトリス緩衝剤は特に好
適である。
適である。
Ｈ２０□の測定用混合系としてＰＡＰ−混合系を含有す
る本発明の試薬は有利に次の組成を示す：コレステリン
オキシダ ーゼ ０．１〜１０ Ｘ １０３Ｕ／Ｉｔ
１コレステリンエステラ ーゼ ｏ、ｉ〜２０×１０３Ｕ／１１ペル
オキシダーゼ ０．１〜５ Ｘ １０３Ｕ／ｌ。
る本発明の試薬は有利に次の組成を示す：コレステリン
オキシダ ーゼ ０．１〜１０ Ｘ １０３Ｕ／Ｉｔ
１コレステリンエステラ ーゼ ｏ、ｉ〜２０×１０３Ｕ／１１ペル
オキシダーゼ ０．１〜５ Ｘ １０３Ｕ／ｌ。
３，４−ジクロルフェ
ノール １〜１０ミリモル／１１゜４−
アミノアンチピリ ン ０．５〜１０ミリモル／１３
１フェノール又はフエ／ 一ル誘導体 ５〜２０ミリモル／Ｌ非イオン
系界面活性剤 １〜１０ｇ／ｌ。
アミノアンチピリ ン ０．５〜１０ミリモル／１３
１フェノール又はフエ／ 一ル誘導体 ５〜２０ミリモル／Ｌ非イオン
系界面活性剤 １〜１０ｇ／ｌ。
コール酸グループの界
面活性剤 Ｏ〜１５ミリモル／ｌ及び緩衝音Ｉ
Ｊ、 ｐＨ６，５〜 ５０〜２００ ’、 ’Ｊ ’：
：）’／ １３ 。
Ｊ、 ｐＨ６，５〜 ５０〜２００ ’、 ’Ｊ ’：
：）’／ １３ 。
その他に、本発明による試薬は酵素試薬に常用の添加剤
、例えば安定化剤、例えばマンニット、殺菌剤、例えば
アジ化物、無機塩を含有していてよい。
、例えば安定化剤、例えばマンニット、殺菌剤、例えば
アジ化物、無機塩を含有していてよい。
前記トリツプ−（Ｔｒｉｎｄｅｒ）によるＰＡＰ−混合
系において、フェノールのかわりにフェノール誘導体、
アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフ
チルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリン、
ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及び類
似に反応する物質を使用することができる。
系において、フェノールのかわりにフェノール誘導体、
アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフ
チルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリン、
ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及び類
似に反応する物質を使用することができる。
４−アミノアンチピリンハ例エバフェニレン−ジアミン
−スルホン酸、メチルベンゾチアゾロン−ヒドラゾン、
スルホン化メチルベンゾチアソ泊ンーヒドラゾン誘導体
及び類似構造の化合物により置換することができる。
−スルホン酸、メチルベンゾチアゾロン−ヒドラゾン、
スルホン化メチルベンゾチアソ泊ンーヒドラゾン誘導体
及び類似構造の化合物により置換することができる。
本発明範囲においてＰＡＰ混合混合化わりに、他の公知
のＨ２Ｏ２−測定混合系を使用することもできる。
のＨ２Ｏ２−測定混合系を使用することもできる。
これらの中では、蛍光又は化学的発光を測定する発光法
（Ｌｕｍｉｎｅｓｚｅｎｚｍｅｔｈａｄｅ））例工ばペ
ルオキシダーゼ／ルミノール−混合系が有利である。
（Ｌｕｍｉｎｅｓｚｅｎｚｍｅｔｈａｄｅ））例工ばペ
ルオキシダーゼ／ルミノール−混合系が有利である。
他の好適な混合系はカタラーゼ、β−ジケトン、例えば
、アセチルアセトン、及びアルコール、例えばメタノー
ル、エタノール又はメチレングリコールからなる。
、アセチルアセトン、及びアルコール、例えばメタノー
ル、エタノール又はメチレングリコールからなる。
その他の好適な混合系はペルオキシダーゼ及び２，３′
−アミノベンズチアゾリン−スルホン酸のような発色団
からなる。
−アミノベンズチアゾリン−スルホン酸のような発色団
からなる。
本発明による試薬がコレステノンの測定のための混合系
を含有しているならば、このためには公知の検出用混合
系カζ好適である。
を含有しているならば、このためには公知の検出用混合
系カζ好適である。
前記のように、３．４−ジクロルフェノールも２４０ｎ
ｍの波長で吸収を行なうので、ある程度の感度の損失を
甘受するならば、コレステノン形成を２４０ｎｍで直接
測定することもできる。
ｍの波長で吸収を行なうので、ある程度の感度の損失を
甘受するならば、コレステノン形成を２４０ｎｍで直接
測定することもできる。
本発明による試薬は固体の担体上に含浸されて′Ｊ）で
もよい。
もよい。
その場合、この測定をａ）試薬で含有させた担体を試料
中に漬けるか、又は ｂ）試薬担体上に一定の試料量を滴下するか、又は Ｃ）一定の試料容量でこの試薬を担体から溶離すること
により行なう。
中に漬けるか、又は ｂ）試薬担体上に一定の試料量を滴下するか、又は Ｃ）一定の試料容量でこの試薬を担体から溶離すること
により行なう。
反応速度を担体上で直接測定するならば、例え：ずこれ
は反射測定又は発光測定により可能である。
は反射測定又は発光測定により可能である。
試薬の溶離後、測定を行なうならば、測定は担体を有さ
ない試薬におけると同様に行なわれる。
ない試薬におけると同様に行なわれる。
担持材料としては分析用検出試薬に常用の担体、例えば
紙、セルロース、繊維ブリース、多孔性プラスチックｌ
莫等が好適である。
紙、セルロース、繊維ブリース、多孔性プラスチックｌ
莫等が好適である。
本発明方法により著しく迅速なコレステリン量の確認が
達成され、これは従来の分析法に対し大きな時間の倹約
に導ひく。
達成され、これは従来の分析法に対し大きな時間の倹約
に導ひく。
多くの場合自動分析システムにとっては、これによりは
じめて酵素的コレステリン測定が可能となる。
じめて酵素的コレステリン測定が可能となる。
次に実施例につき本発明の詳細な説明する。
例１
次の試薬を使用したニ
スプレブトマイセスからの
コレステリンオキシダーゼ ５００ Ｕ／１３゜ペ
ルオキシダーゼ １５００ Ｕ／Ｖ。
ルオキシダーゼ １５００ Ｕ／Ｖ。
コレステリンエステラーゼ ８００Ｕ／Ｖ３．４−
ジクロルフェノール ５ミリモル／１１フェノール
５ミリモル／１３゜４−アミノフェナ
ジン １ミリモル／１１非イオン系界面活性剤 （Ｇｅｎａ、ｐｏｌ ＯＸ １００） 、 ４
．８ ｇ／１３１ナトリウムデスオキシコ レート ９．４ミリモル／Ｌ燐酸
塩緩衝剤、ｐＨ７，８２００ミリモル／２０市販自動分
析機（ＣＥＮＴＲＩ’ＦＩＣＨＥＭ ４００という名称
で市販）を用いて、次の調整で血清中のコレステリン測
定を実施する： 温度：２５°Ｃ；フィルター：５００ｎｍ：ｔ。
ジクロルフェノール ５ミリモル／１１フェノール
５ミリモル／１３゜４−アミノフェナ
ジン １ミリモル／１１非イオン系界面活性剤 （Ｇｅｎａ、ｐｏｌ ＯＸ １００） 、 ４
．８ ｇ／１３１ナトリウムデスオキシコ レート ９．４ミリモル／Ｌ燐酸
塩緩衝剤、ｐＨ７，８２００ミリモル／２０市販自動分
析機（ＣＥＮＴＲＩ’ＦＩＣＨＥＭ ４００という名称
で市販）を用いて、次の調整で血清中のコレステリン測
定を実施する： 温度：２５°Ｃ；フィルター：５００ｎｍ：ｔ。
−タイム−プレイ：６０秒；△を−間隔：１分間；ブラ
ンク、オート；テストモード：ターム；プリントアウト
：濃：標準値：ゾ゛ル値Ｐｒｅｃ １ｌｉ４；テスト
コード：００；試薬容量＝３５０μｌ；試量：５μｌ；
試量及び水：３０μｌ。
ンク、オート；テストモード：ターム；プリントアウト
：濃：標準値：ゾ゛ル値Ｐｒｅｃ １ｌｉ４；テスト
コード：００；試薬容量＝３５０μｌ；試量：５μｌ；
試量及び水：３０μｌ。
この測定は少なくとも１３ミリモル／ｌまで直！線であ
る。
る。
使用したコレステリンオキシダーゼはストレプトマイセ
ス・グリセオフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ−ｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ ）ＤＳＭ４０１９１から
得られた。
ス・グリセオフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ−ｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ ）ＤＳＭ４０１９１から
得られた。
１例２
次の試薬を用いた：
ストレプトマイセスからの
コレステリンオキシダーゼ ５００Ｕ／Ａ’１ペル
オキシダーゼ １５００Ｕ／ｌご３．４−ジ
クロルフェノール ５ミリモル／１１フェノール
５ミリモル／１１゜４−アミノフェナジン
１ミリモル／１１イソトリデシルエーテル
４ｇ／ｌ。
オキシダーゼ １５００Ｕ／ｌご３．４−ジ
クロルフェノール ５ミリモル／１１フェノール
５ミリモル／１１゜４−アミノフェナジン
１ミリモル／１１イソトリデシルエーテル
４ｇ／ｌ。
トリス緩衝剤、ｐＨ７，７１００ミリモル／１０この試
薬を例１に記載されているように市販の自動分析機（Ｃ
ＥＮＴＲＩＦＩＣＨＥＭ ４００ ）で血清中のコレ
ステリンの測定に使用した。
薬を例１に記載されているように市販の自動分析機（Ｃ
ＥＮＴＲＩＦＩＣＨＥＭ ４００ ）で血清中のコレ
ステリンの測定に使用した。
ここでも、２少なくとも１３ミリモル／ｌまで直線であ
ることが判明した。
ることが判明した。
同様な結果が他の自動分析機（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆｆＡ
ＣＰ ５０４０）で達せられた。
ＣＰ ５０４０）で達せられた。
この場合にはコレステリンオキシダーゼ５Ｕ／ｒｒＬｌ
を含有する出３発試薬を使用した。
を含有する出３発試薬を使用した。
例３
次の試薬を使用した：
ストレプトマイセスからの
コレステリンオキシダーゼ ５００Ｕ／ｌ、３コレ
ステリンエステラーゼ １５００Ｕ／７゜ペルオキシ
ダーゼ １５００Ｕ／１１３．４−ジクロル
フェノール ５ミリモル／１１サリチルアルコール
１４ ミＩＪモル／１１４−アミノフエナゾン
０．５ミリモル／ｌ、４イソトリデシルエーテル
４ｇ／ｌ。
ステリンエステラーゼ １５００Ｕ／７゜ペルオキシ
ダーゼ １５００Ｕ／１１３．４−ジクロル
フェノール ５ミリモル／１１サリチルアルコール
１４ ミＩＪモル／１１４−アミノフエナゾン
０．５ミリモル／ｌ、４イソトリデシルエーテル
４ｇ／ｌ。
ナトリウムコレート １０ミリモル／１１゜へペ
スー緩衝剤、ｐＨ６，９５０ミリモル／１２゜この試薬
を用いて例１及び２と同様な結果が得られた。
スー緩衝剤、ｐＨ６，９５０ミリモル／１２゜この試薬
を用いて例１及び２と同様な結果が得られた。
一連の、上記二個の自動分析機で得られた精度を次の表
に示す。
に示す。
表
ＣＥＮＴＲＩＦＩＣＨＥＭ ４００ ＡＣＰ ５
０４０ｎ ＝ ８ ｎ ＝ ８又
＝３１１．３ 又＝２８５．６８＝６．
８４ ８＝２．１３ＶＫ＝２．２０％
ＶＫ＝０．８％例４ ２４０ｎｍでコレステノンの測定下に動力学的測定： 試薬ニドリス−緩衝剤 （ｐＨ７，６） ０．１モル／Ｌイソト
リデシル エーテル ３９／１１ ３．４−ジクロ ルフェノール １．０ミリモル／ｌ コール酸ナトリ ラム １０．０ミリモル／ｌ コレステリンオ キシダーゼ ０．２ Ｕ／ｍｌ配合：試薬
２ｍｌ、試量（コレステリンオキシダーゼ） １０
μｌ 試験条件： Ｔ ２５℃ Ｅｌ 反応開始後 １分 Ｅ２ 反応開始後 ２分 結果：コレステリン濃度／吸光度変化 ２．５９ミリモル／ＩＪ ３０ｍＥ ５．１７ミリモル７１３ ６０ｍＥ １０．３４ミリモル／／Ｊ １２０ｍＥ列５ 酸素消費量の測定 試薬ニドリス緩衝剤、ｐＨ７，６０，１モル／１１イソ
トリデシルエーテル ３ｇ／１３゜３．４−ジクロ
ル フェノール ３ミリモル／１１コール酸ナト
リウム １０ミリモル／１３、コレステリンオキシダー
ゼ ２ Ｕ ／ｒｄ配合：試薬 １．５ ｒｕｌ、試
料１０ｐ／１試験条件：Ｔ：２５℃ 酸素消費の速度を２分及び３分の間に測定する。
０４０ｎ ＝ ８ ｎ ＝ ８又
＝３１１．３ 又＝２８５．６８＝６．
８４ ８＝２．１３ＶＫ＝２．２０％
ＶＫ＝０．８％例４ ２４０ｎｍでコレステノンの測定下に動力学的測定： 試薬ニドリス−緩衝剤 （ｐＨ７，６） ０．１モル／Ｌイソト
リデシル エーテル ３９／１１ ３．４−ジクロ ルフェノール １．０ミリモル／ｌ コール酸ナトリ ラム １０．０ミリモル／ｌ コレステリンオ キシダーゼ ０．２ Ｕ／ｍｌ配合：試薬
２ｍｌ、試量（コレステリンオキシダーゼ） １０
μｌ 試験条件： Ｔ ２５℃ Ｅｌ 反応開始後 １分 Ｅ２ 反応開始後 ２分 結果：コレステリン濃度／吸光度変化 ２．５９ミリモル／ＩＪ ３０ｍＥ ５．１７ミリモル７１３ ６０ｍＥ １０．３４ミリモル／／Ｊ １２０ｍＥ列５ 酸素消費量の測定 試薬ニドリス緩衝剤、ｐＨ７，６０，１モル／１１イソ
トリデシルエーテル ３ｇ／１３゜３．４−ジクロ
ル フェノール ３ミリモル／１１コール酸ナト
リウム １０ミリモル／１３、コレステリンオキシダー
ゼ ２ Ｕ ／ｒｄ配合：試薬 １．５ ｒｕｌ、試
料１０ｐ／１試験条件：Ｔ：２５℃ 酸素消費の速度を２分及び３分の間に測定する。
結果：コレステリン濃度／比較反応速度
２．５９ミリモル／ｌ ２５
５．１７ミリモル７７１ ５０
１０．３４ミリモル／ｌ！ １００
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ コレステリン−オキシダーゼ及び場合によりコレス
テリン−エステラーゼを用いて、酸素消費量、生じた過
酸化水素又は生じたコレステノンを測定することにより
遊離又は結合した形のコレステリンを測定するために、
・ストレプトマイセス属の微生物から得られたコレステ
リン−オキシダーゼを使用し、かつ３，４−ジクロルフ
ェノールの添加下に、この測定を動力学的に実施するこ
とを特徴とするコレステリンの測定法。 ２３．４−ジクロルフェノール０．５〜５０ミリモル／
ｌ及びコレステリン−オキシダーゼ０．１〜５０Ｘ１０
３Ｕ／ｌを添加する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ あらかじめ決定した時間範囲内で測定を少なくとも
２回行なう特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法
。 ４ 反応を６．５〜８のｐＨ値で緩衝させた溶液中で実
施する特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれ１か１項
に記載の方法。 ５ 生じた過酸化水素を測定するために４−アミノアン
チピリン、フェノール、ペルオキシダーゼ及び燐酸塩−
緩衝剤、へペス緩衝剤又はトリス緩衝剤を添加する特許
請求の範囲第１項〜第４項の・いずれか１項に記載の方
法。 ６ 非イオン系界面活性剤及び場合により付加的にコー
ル酸−グループの界面活性剤を添加する特許請求の範囲
第１項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。 ７ コレステリン−オキシダーゼ及びＨ２Ｏ２又はコレ
ステノンを測定するための混合系並びに場合によりコレ
ステリンエステラーゼを含有するコレステリンの動力学
的測定試薬において、付加的に３．４−ジクロルフェノ
ールを含有しており、かつコレステリン−オキシダーゼ
はストレプトマイセス属の微生物からのものであること
を特徴とするコレステリンの測定試薬。 ８ Ｈ２Ｏ２を測定するための混合系とは４−アミノア
ンチピリン、フェノール又はその誘導体、緩衝剤及び界
面活性剤を含有する特許請求の範囲第７項記載の試薬。 ９ 非イオン系界面活性剤を単一で、又はコール酸−グ
ループの界面活性剤と一諸に含有する特許請求の範囲第
７項又は第８項に記載の試薬。 １０燐酸塩−緩衝剤、へペスー緩衝剤又はトリス−緩衝
剤を含有する特許請求の範囲第７項〜第９項のいずれか
１項に記載の試薬。 １１ コレステリン−オキシ ダーゼ ０．１〜１０ Ｘ’ １０３Ｕ／１
コレステリン−エステ ラーゼ ０．１〜２０ Ｘ １０３Ｕ／１１
ペルオキシダーゼ ０．１〜５×１０３Ｕ／１３．４
−ジクロルフェ ノール １〜１０ミリモル／１４−アミ
ノアンチピリ ン ０．５〜１０ミリモル／ｌフェ
ノール又はフェノ ール誘導体 ５〜２０ミリモル／ｌ非イオン
系界面活性剤 １〜１０ｇ／ｌコール酸グループ
の界 面活性剤 Ｏ〜１５ミリモル／ｌ緩衝剤（
ｐＨ６，５〜８） ５０〜２００ミリモル／ｌ を含有する特許請求の範囲第８項〜第１０項のいずれか
１項に記載の試薬。 １２固体担体上に含浸されている特許請求の範囲第７項
〜第１１項のいずれか１項に記載の試薬。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19803046241 DE3046241A1 (de) | 1980-12-08 | 1980-12-08 | Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57122800A JPS57122800A (en) | 1982-07-30 |
| JPS5818080B2 true JPS5818080B2 (ja) | 1983-04-11 |
Family
ID=6118631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56196400A Expired JPS5818080B2 (ja) | 1980-12-08 | 1981-12-08 | コレステリンの測定法及び測定試薬 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4503144A (ja) |
| EP (1) | EP0053692B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5818080B2 (ja) |
| AR (1) | AR227209A1 (ja) |
| AT (1) | ATE5002T1 (ja) |
| AU (1) | AU528296B2 (ja) |
| CA (1) | CA1179243A (ja) |
| DD (1) | DD201733A5 (ja) |
| DE (2) | DE3046241A1 (ja) |
| ES (1) | ES507307A0 (ja) |
| YU (1) | YU44105B (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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