JPS5818080B2 - コレステリンの測定法及び測定試薬 - Google Patents
コレステリンの測定法及び測定試薬Info
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- JPS5818080B2 JPS5818080B2 JP56196400A JP19640081A JPS5818080B2 JP S5818080 B2 JPS5818080 B2 JP S5818080B2 JP 56196400 A JP56196400 A JP 56196400A JP 19640081 A JP19640081 A JP 19640081A JP S5818080 B2 JPS5818080 B2 JP S5818080B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はコレステリンオキシダーゼを使用してコレステ
リンを測定するための方法及び試薬に関する。
リンを測定するための方法及び試薬に関する。
コレステリンを、場合によりあらかじめ化学的又は酵素
的な鹸化によりそのエステルから遊離させた後、分子状
酸素の存在下にコレステリンオキシダーゼを用いて、コ
レステノン及びH2O2に変換させ、この定量的に経過
する反応をコレステリンの測定に使用することは公知で
ある。
的な鹸化によりそのエステルから遊離させた後、分子状
酸素の存在下にコレステリンオキシダーゼを用いて、コ
レステノン及びH2O2に変換させ、この定量的に経過
する反応をコレステリンの測定に使用することは公知で
ある。
この際、生じたコレステノンもしくはH20□、又は消
費された酸素を測定する。
費された酸素を測定する。
この酵素的コレステリン−測定法はたしかにその特異性
により、従来常用されていた化学的測定法にくらべて大
きな進歩をもたらしたのではあるが、この方法は現在ま
で迅速で、実用的な動力学的な実施法に適していない。
により、従来常用されていた化学的測定法にくらべて大
きな進歩をもたらしたのではあるが、この方法は現在ま
で迅速で、実用的な動力学的な実施法に適していない。
反応工程の最も特異的な部分工程を触媒するコレステリ
ンオキシダーゼのKM−値が低いために、コレステリン
測定に重要な13ミリモル/lまでの濃度範囲でこの反
応は1次もしくは擬1次的に進行しないのである。
ンオキシダーゼのKM−値が低いために、コレステリン
測定に重要な13ミリモル/lまでの濃度範囲でこの反
応は1次もしくは擬1次的に進行しないのである。
この種の反応経過は、従来必要であった終点法もしくは
動力学的法に対し何個の分析あたりの必要時間を著しく
短縮する、試料空位を必要としない、迅速で、実用的な
動力学的な測定法にとって必要なことである。
動力学的法に対し何個の分析あたりの必要時間を著しく
短縮する、試料空位を必要としない、迅速で、実用的な
動力学的な測定法にとって必要なことである。
従来の測光法に必要な時間は10〜6分であったが、動
力学的な方法により1〜3分の分析時間が得られる。
力学的な方法により1〜3分の分析時間が得られる。
新しい時代の自動分析機は高い試料通過量を想定。
しており、コレステリン検出の分野における従来の方法
では達成することのできない短かい培養時間を可能とす
る。
では達成することのできない短かい培養時間を可能とす
る。
従って、今日常用の高い分析量を有する自動分析機は十
分に使用されていないのである。
分に使用されていないのである。
; 従って、本発明の課題は擬1次に進行するコレステ
リンオキシダーゼ反応の動力学的測定法を見い出すこと
である。
リンオキシダーゼ反応の動力学的測定法を見い出すこと
である。
関与する酵素のKM値が低くすぎる際に人工的なKM値
上昇によりこの種の反応経過を達成する1ことが多くの
場合可能であることは公知である。
上昇によりこの種の反応経過を達成する1ことが多くの
場合可能であることは公知である。
ミヒヤエリス(Michaelis)及びメントン(M
enton)の理論によれば、酵素のミヒヤエリス定数
が最大基質濃度より著しく犬である場合、酵素により触
媒される一基質反応は広い濃度範囲ノにおいて一次的に
経過する。
enton)の理論によれば、酵素のミヒヤエリス定数
が最大基質濃度より著しく犬である場合、酵素により触
媒される一基質反応は広い濃度範囲ノにおいて一次的に
経過する。
ノカルディア(Nocardia)、ブレビバクテリウ
ム(Bre−ribacterium )又はストレプ
トマイセチン(Streptmyceten)のような
種々の微生物属からの従来公知のコレステリンオキシダ
ーゼは;10−’〜10−5モル/lのKM値を示すの
で、非常に僅かなコレステリン濃度でのみ動力学的に測
定することができる。
ム(Bre−ribacterium )又はストレプ
トマイセチン(Streptmyceten)のような
種々の微生物属からの従来公知のコレステリンオキシダ
ーゼは;10−’〜10−5モル/lのKM値を示すの
で、非常に僅かなコレステリン濃度でのみ動力学的に測
定することができる。
競合的阻害剤を添加すること(こよりコレステリンオキ
シダーゼ゛のKMイ直を自体公知方法で人工的に上昇さ
せるという実験は無)効であることを示した。
シダーゼ゛のKMイ直を自体公知方法で人工的に上昇さ
せるという実験は無)効であることを示した。
しかしながら、一定の起源のコレステリンオキシダーゼ
及び一定のフェノール誘導体の選択により擬1次的反応
経過を達成することができることが意外にも判明した。
及び一定のフェノール誘導体の選択により擬1次的反応
経過を達成することができることが意外にも判明した。
シ 従って、コレステリンオキシダーゼ及び場合により
コレステリンエステラーゼを用いて酸素消費量、生じた
過酸化水素又は生じたコレステノンを測定することによ
り遊離又は結合した形のコレステリンを測定するための
本方法はストレプトマインセス属の微生物から得られた
コレステリンオキシダーゼを使用し、かつ3,4−ジク
ロルフェノールの添加下に、この測定を動力学的に実施
することを特徴とする。
コレステリンエステラーゼを用いて酸素消費量、生じた
過酸化水素又は生じたコレステノンを測定することによ
り遊離又は結合した形のコレステリンを測定するための
本方法はストレプトマインセス属の微生物から得られた
コレステリンオキシダーゼを使用し、かつ3,4−ジク
ロルフェノールの添加下に、この測定を動力学的に実施
することを特徴とする。
従来コレステリン測定に常用のノカルジア又はブレビバ
クテリアからのコレステリンオキシダーゼを用いず、か
つ競合的阻害剤として先ず第1に考えられるコレステリ
ン類似ステロイド又は胆汁酸を用いることもなく、動力
学的測定をはじめて可能とした、そのような反応経過を
達成することができた。
クテリアからのコレステリンオキシダーゼを用いず、か
つ競合的阻害剤として先ず第1に考えられるコレステリ
ン類似ステロイド又は胆汁酸を用いることもなく、動力
学的測定をはじめて可能とした、そのような反応経過を
達成することができた。
ジクロルフェノールの他の異性体も反応経過に全く影響
を与えないか、又は不十分にしか影響を与えない。
を与えないか、又は不十分にしか影響を与えない。
従って、3,4−ジクロルフェノールとストレプトマイ
セス属の微生物からの酵素との間に特別な相互作用が生
じると思われる。
セス属の微生物からの酵素との間に特別な相互作用が生
じると思われる。
ストレフトマイセス属のものからコレステリンオキシダ
ーゼを得ることは西ドイツ国特許公開第2924875
.7号公報に記載されている。
ーゼを得ることは西ドイツ国特許公開第2924875
.7号公報に記載されている。
好適な種類の例はストレプトマイセス・グリセオフスカ
ス(Streptomyces griseofus
cus。
ス(Streptomyces griseofus
cus。
DSM40191 )、ストレフトマイセス・ヒゲロス
コピカス(Streptomyces hygros
−copicus、DSM40771 )及びストレプ
トマイセス・アシドマイセチカス(Str6ptom−
yses acidomycetjcus、DSM4
0798)である。
コピカス(Streptomyces hygros
−copicus、DSM40771 )及びストレプ
トマイセス・アシドマイセチカス(Str6ptom−
yses acidomycetjcus、DSM4
0798)である。
この所望の一次の反応経過は広い濃度範囲の3゜4−ジ
クロルフェノール及びコレステリンオキシダーゼにおい
て達成することができる。
クロルフェノール及びコレステリンオキシダーゼにおい
て達成することができる。
3,4−ジクロルフェノール0.5〜10ミリモル/l
)及びストレプトマイセスからのコレステリンオキシダ
ーゼ0.1〜20 X 103U/11を使用するのが
有利である。
)及びストレプトマイセスからのコレステリンオキシダ
ーゼ0.1〜20 X 103U/11を使用するのが
有利である。
その他の点では本発明の実施方法は動力学的測定に常用
の方法で行なわれた。
の方法で行なわれた。
あらかじめ決めた時間範囲内に少なくとも2回の測定を
実施するのが有利である。
実施するのが有利である。
この測定はストレプトマイセスからのコレステリンオキ
シダーゼが活性である全pH値範囲で実施することがで
きる、但し使用した補助酵素がこのpH範囲で同様に活
性であることを前提とする。
シダーゼが活性である全pH値範囲で実施することがで
きる、但し使用した補助酵素がこのpH範囲で同様に活
性であることを前提とする。
6.5〜8のpH値で緩衝させた溶液中で、この測定を
実施するのが有利である。
実施するのが有利である。
すでに記載したように、コレステリンオキシダーゼを使
用してコレステリンを測定するすべての公知法を原則的
に使用することができる。
用してコレステリンを測定するすべての公知法を原則的
に使用することができる。
しかし、230〜250nmでのコレステノン形成の測
定は、3,4−ジクロルフェノールがコレステノンの測
定光において吸収を行なうので、高濃度の3゜4−ジク
ロルフェノールにおいてはあまり好適ではない。
定は、3,4−ジクロルフェノールがコレステノンの測
定光において吸収を行なうので、高濃度の3゜4−ジク
ロルフェノールにおいてはあまり好適ではない。
従って、本発明方法のこの実施形式において、3,4−
ジクロルフェノールの濃度は15ミリモル/lを越える
べきではない。
ジクロルフェノールの濃度は15ミリモル/lを越える
べきではない。
本発明方法の有利な実施形式は生じた過酸化水素を4−
アミノアンチピリン、フェノール、ペルオキシダーゼ及
びこれらの混合系に好適な緩衝剤の添加により測定する
こさよりなる。
アミノアンチピリン、フェノール、ペルオキシダーゼ及
びこれらの混合系に好適な緩衝剤の添加により測定する
こさよりなる。
ここで燐酸塩緩衝剤、へペス緩衝剤(HEPES :
4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエクン
ースルホン酸)又はトリス緩衝剤は好適である。
4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエクン
ースルホン酸)又はトリス緩衝剤は好適である。
本発明のこの実施形式において、更に非イオン系界面活
性剤及び場合により付加的にコール酸グループの界面活
性剤を添加する場合最高の結果が得られる。
性剤及び場合により付加的にコール酸グループの界面活
性剤を添加する場合最高の結果が得られる。
本発明のもの1つの課題はコレステリンオキシダーゼ及
びH20□又はコレステノンの測定用混合系並びに場合
によりコレステリンエステラーゼを含有するコレステリ
ンの動力学的測定用試薬であり、これは付加的に3,4
−ジクロルフェノールを含有し、このコレステリンオキ
シダーゼはストレプトマイセス属の微生物からのもので
あることを特徴とする。
びH20□又はコレステノンの測定用混合系並びに場合
によりコレステリンエステラーゼを含有するコレステリ
ンの動力学的測定用試薬であり、これは付加的に3,4
−ジクロルフェノールを含有し、このコレステリンオキ
シダーゼはストレプトマイセス属の微生物からのもので
あることを特徴とする。
H20□の測定用混合系は4−アミノアンチピリン又は
その誘導体、フェノール又はフェノール誘導体、緩衝剤
及び界面活性剤の組み合わせ(しばしばこれは’PAP
”−混合系として表4つされる)が有利である。
その誘導体、フェノール又はフェノール誘導体、緩衝剤
及び界面活性剤の組み合わせ(しばしばこれは’PAP
”−混合系として表4つされる)が有利である。
PAP−混合系及びその変化したものは、その生じた色
素がUVにおいて3,4−ジクロルフェノールと異なる
波長を吸収し、これにより吸光の重なりによる精度に対
する妨害が生じないので特に有利である。
素がUVにおいて3,4−ジクロルフェノールと異なる
波長を吸収し、これにより吸光の重なりによる精度に対
する妨害が生じないので特に有利である。
非イオン系界面活性剤を単一で又は場合によりコール酸
グループの界面活性剤と一諸に使用するのが特に好適で
ある。
グループの界面活性剤と一諸に使用するのが特に好適で
ある。
、本発明による試薬は緩衝剤を含有するのが有利であり
、この際関与した酵素の活性範囲、有利に6.5〜8の
pH範囲で緩衝作用を有する、すべての緩衝剤をあげる
ことができる。
、この際関与した酵素の活性範囲、有利に6.5〜8の
pH範囲で緩衝作用を有する、すべての緩衝剤をあげる
ことができる。
燐酸塩緩衝剤、ヘペス緩衝剤及びトリス緩衝剤は特に好
適である。
適である。
H20□の測定用混合系としてPAP−混合系を含有す
る本発明の試薬は有利に次の組成を示す:コレステリン
オキシダ ーゼ 0.1〜10 X 103U/It
1コレステリンエステラ ーゼ o、i〜20×103U/11ペル
オキシダーゼ 0.1〜5 X 103U/l。
る本発明の試薬は有利に次の組成を示す:コレステリン
オキシダ ーゼ 0.1〜10 X 103U/It
1コレステリンエステラ ーゼ o、i〜20×103U/11ペル
オキシダーゼ 0.1〜5 X 103U/l。
3,4−ジクロルフェ
ノール 1〜10ミリモル/11゜4−
アミノアンチピリ ン 0.5〜10ミリモル/13
1フェノール又はフエ/ 一ル誘導体 5〜20ミリモル/L非イオン
系界面活性剤 1〜10g/l。
アミノアンチピリ ン 0.5〜10ミリモル/13
1フェノール又はフエ/ 一ル誘導体 5〜20ミリモル/L非イオン
系界面活性剤 1〜10g/l。
コール酸グループの界
面活性剤 O〜15ミリモル/l及び緩衝音I
J、 pH6,5〜 50〜200 ’、 ’J ’:
:)’/ 13 。
J、 pH6,5〜 50〜200 ’、 ’J ’:
:)’/ 13 。
その他に、本発明による試薬は酵素試薬に常用の添加剤
、例えば安定化剤、例えばマンニット、殺菌剤、例えば
アジ化物、無機塩を含有していてよい。
、例えば安定化剤、例えばマンニット、殺菌剤、例えば
アジ化物、無機塩を含有していてよい。
前記トリツプ−(Trinder)によるPAP−混合
系において、フェノールのかわりにフェノール誘導体、
アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフ
チルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリン、
ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及び類
似に反応する物質を使用することができる。
系において、フェノールのかわりにフェノール誘導体、
アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフ
チルアミン、ナフチルアミン誘導体、アミノキノリン、
ヒドロキシキノリン、ジヒドロキシフェニル酢酸及び類
似に反応する物質を使用することができる。
4−アミノアンチピリンハ例エバフェニレン−ジアミン
−スルホン酸、メチルベンゾチアゾロン−ヒドラゾン、
スルホン化メチルベンゾチアソ泊ンーヒドラゾン誘導体
及び類似構造の化合物により置換することができる。
−スルホン酸、メチルベンゾチアゾロン−ヒドラゾン、
スルホン化メチルベンゾチアソ泊ンーヒドラゾン誘導体
及び類似構造の化合物により置換することができる。
本発明範囲においてPAP混合混合化わりに、他の公知
のH2O2−測定混合系を使用することもできる。
のH2O2−測定混合系を使用することもできる。
これらの中では、蛍光又は化学的発光を測定する発光法
(Lumineszenzmethade))例工ばペ
ルオキシダーゼ/ルミノール−混合系が有利である。
(Lumineszenzmethade))例工ばペ
ルオキシダーゼ/ルミノール−混合系が有利である。
他の好適な混合系はカタラーゼ、β−ジケトン、例えば
、アセチルアセトン、及びアルコール、例えばメタノー
ル、エタノール又はメチレングリコールからなる。
、アセチルアセトン、及びアルコール、例えばメタノー
ル、エタノール又はメチレングリコールからなる。
その他の好適な混合系はペルオキシダーゼ及び2,3′
−アミノベンズチアゾリン−スルホン酸のような発色団
からなる。
−アミノベンズチアゾリン−スルホン酸のような発色団
からなる。
本発明による試薬がコレステノンの測定のための混合系
を含有しているならば、このためには公知の検出用混合
系カζ好適である。
を含有しているならば、このためには公知の検出用混合
系カζ好適である。
前記のように、3.4−ジクロルフェノールも240n
mの波長で吸収を行なうので、ある程度の感度の損失を
甘受するならば、コレステノン形成を240nmで直接
測定することもできる。
mの波長で吸収を行なうので、ある程度の感度の損失を
甘受するならば、コレステノン形成を240nmで直接
測定することもできる。
本発明による試薬は固体の担体上に含浸されて′J)で
もよい。
もよい。
その場合、この測定をa)試薬で含有させた担体を試料
中に漬けるか、又は b)試薬担体上に一定の試料量を滴下するか、又は C)一定の試料容量でこの試薬を担体から溶離すること
により行なう。
中に漬けるか、又は b)試薬担体上に一定の試料量を滴下するか、又は C)一定の試料容量でこの試薬を担体から溶離すること
により行なう。
反応速度を担体上で直接測定するならば、例え:ずこれ
は反射測定又は発光測定により可能である。
は反射測定又は発光測定により可能である。
試薬の溶離後、測定を行なうならば、測定は担体を有さ
ない試薬におけると同様に行なわれる。
ない試薬におけると同様に行なわれる。
担持材料としては分析用検出試薬に常用の担体、例えば
紙、セルロース、繊維ブリース、多孔性プラスチックl
莫等が好適である。
紙、セルロース、繊維ブリース、多孔性プラスチックl
莫等が好適である。
本発明方法により著しく迅速なコレステリン量の確認が
達成され、これは従来の分析法に対し大きな時間の倹約
に導ひく。
達成され、これは従来の分析法に対し大きな時間の倹約
に導ひく。
多くの場合自動分析システムにとっては、これによりは
じめて酵素的コレステリン測定が可能となる。
じめて酵素的コレステリン測定が可能となる。
次に実施例につき本発明の詳細な説明する。
例1
次の試薬を使用したニ
スプレブトマイセスからの
コレステリンオキシダーゼ 500 U/13゜ペ
ルオキシダーゼ 1500 U/V。
ルオキシダーゼ 1500 U/V。
コレステリンエステラーゼ 800U/V3.4−
ジクロルフェノール 5ミリモル/11フェノール
5ミリモル/13゜4−アミノフェナ
ジン 1ミリモル/11非イオン系界面活性剤 (Gena、pol OX 100) 、 4
.8 g/131ナトリウムデスオキシコ レート 9.4ミリモル/L燐酸
塩緩衝剤、pH7,8200ミリモル/20市販自動分
析機(CENTRI’FICHEM 400という名称
で市販)を用いて、次の調整で血清中のコレステリン測
定を実施する: 温度:25°C;フィルター:500nm:t。
ジクロルフェノール 5ミリモル/11フェノール
5ミリモル/13゜4−アミノフェナ
ジン 1ミリモル/11非イオン系界面活性剤 (Gena、pol OX 100) 、 4
.8 g/131ナトリウムデスオキシコ レート 9.4ミリモル/L燐酸
塩緩衝剤、pH7,8200ミリモル/20市販自動分
析機(CENTRI’FICHEM 400という名称
で市販)を用いて、次の調整で血清中のコレステリン測
定を実施する: 温度:25°C;フィルター:500nm:t。
−タイム−プレイ:60秒;△を−間隔:1分間;ブラ
ンク、オート;テストモード:ターム;プリントアウト
:濃:標準値:ゾ゛ル値Prec 1li4;テスト
コード:00;試薬容量=350μl;試量:5μl;
試量及び水:30μl。
ンク、オート;テストモード:ターム;プリントアウト
:濃:標準値:ゾ゛ル値Prec 1li4;テスト
コード:00;試薬容量=350μl;試量:5μl;
試量及び水:30μl。
この測定は少なくとも13ミリモル/lまで直!線であ
る。
る。
使用したコレステリンオキシダーゼはストレプトマイセ
ス・グリセオフスカス(Streptom−yces
griseofuscus )DSM40191から
得られた。
ス・グリセオフスカス(Streptom−yces
griseofuscus )DSM40191から
得られた。
1例2
次の試薬を用いた:
ストレプトマイセスからの
コレステリンオキシダーゼ 500U/A’1ペル
オキシダーゼ 1500U/lご3.4−ジ
クロルフェノール 5ミリモル/11フェノール
5ミリモル/11゜4−アミノフェナジン
1ミリモル/11イソトリデシルエーテル
4g/l。
オキシダーゼ 1500U/lご3.4−ジ
クロルフェノール 5ミリモル/11フェノール
5ミリモル/11゜4−アミノフェナジン
1ミリモル/11イソトリデシルエーテル
4g/l。
トリス緩衝剤、pH7,7100ミリモル/10この試
薬を例1に記載されているように市販の自動分析機(C
ENTRIFICHEM 400 )で血清中のコレ
ステリンの測定に使用した。
薬を例1に記載されているように市販の自動分析機(C
ENTRIFICHEM 400 )で血清中のコレ
ステリンの測定に使用した。
ここでも、2少なくとも13ミリモル/lまで直線であ
ることが判明した。
ることが判明した。
同様な結果が他の自動分析機(EppendorffA
CP 5040)で達せられた。
CP 5040)で達せられた。
この場合にはコレステリンオキシダーゼ5U/rrLl
を含有する出3発試薬を使用した。
を含有する出3発試薬を使用した。
例3
次の試薬を使用した:
ストレプトマイセスからの
コレステリンオキシダーゼ 500U/l、3コレ
ステリンエステラーゼ 1500U/7゜ペルオキシ
ダーゼ 1500U/113.4−ジクロル
フェノール 5ミリモル/11サリチルアルコール
14 ミIJモル/114−アミノフエナゾン
0.5ミリモル/l、4イソトリデシルエーテル
4g/l。
ステリンエステラーゼ 1500U/7゜ペルオキシ
ダーゼ 1500U/113.4−ジクロル
フェノール 5ミリモル/11サリチルアルコール
14 ミIJモル/114−アミノフエナゾン
0.5ミリモル/l、4イソトリデシルエーテル
4g/l。
ナトリウムコレート 10ミリモル/11゜へペ
スー緩衝剤、pH6,950ミリモル/12゜この試薬
を用いて例1及び2と同様な結果が得られた。
スー緩衝剤、pH6,950ミリモル/12゜この試薬
を用いて例1及び2と同様な結果が得られた。
一連の、上記二個の自動分析機で得られた精度を次の表
に示す。
に示す。
表
CENTRIFICHEM 400 ACP 5
040n = 8 n = 8又
=311.3 又=285.68=6.
84 8=2.13VK=2.20%
VK=0.8%例4 240nmでコレステノンの測定下に動力学的測定: 試薬ニドリス−緩衝剤 (pH7,6) 0.1モル/Lイソト
リデシル エーテル 39/11 3.4−ジクロ ルフェノール 1.0ミリモル/l コール酸ナトリ ラム 10.0ミリモル/l コレステリンオ キシダーゼ 0.2 U/ml配合:試薬
2ml、試量(コレステリンオキシダーゼ) 10
μl 試験条件: T 25℃ El 反応開始後 1分 E2 反応開始後 2分 結果:コレステリン濃度/吸光度変化 2.59ミリモル/IJ 30mE 5.17ミリモル713 60mE 10.34ミリモル//J 120mE列5 酸素消費量の測定 試薬ニドリス緩衝剤、pH7,60,1モル/11イソ
トリデシルエーテル 3g/13゜3.4−ジクロ
ル フェノール 3ミリモル/11コール酸ナト
リウム 10ミリモル/13、コレステリンオキシダー
ゼ 2 U /rd配合:試薬 1.5 rul、試
料10p/1試験条件:T:25℃ 酸素消費の速度を2分及び3分の間に測定する。
040n = 8 n = 8又
=311.3 又=285.68=6.
84 8=2.13VK=2.20%
VK=0.8%例4 240nmでコレステノンの測定下に動力学的測定: 試薬ニドリス−緩衝剤 (pH7,6) 0.1モル/Lイソト
リデシル エーテル 39/11 3.4−ジクロ ルフェノール 1.0ミリモル/l コール酸ナトリ ラム 10.0ミリモル/l コレステリンオ キシダーゼ 0.2 U/ml配合:試薬
2ml、試量(コレステリンオキシダーゼ) 10
μl 試験条件: T 25℃ El 反応開始後 1分 E2 反応開始後 2分 結果:コレステリン濃度/吸光度変化 2.59ミリモル/IJ 30mE 5.17ミリモル713 60mE 10.34ミリモル//J 120mE列5 酸素消費量の測定 試薬ニドリス緩衝剤、pH7,60,1モル/11イソ
トリデシルエーテル 3g/13゜3.4−ジクロ
ル フェノール 3ミリモル/11コール酸ナト
リウム 10ミリモル/13、コレステリンオキシダー
ゼ 2 U /rd配合:試薬 1.5 rul、試
料10p/1試験条件:T:25℃ 酸素消費の速度を2分及び3分の間に測定する。
結果:コレステリン濃度/比較反応速度
2.59ミリモル/l 25
5.17ミリモル771 50
10.34ミリモル/l! 100
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 コレステリン−オキシダーゼ及び場合によりコレス
テリン−エステラーゼを用いて、酸素消費量、生じた過
酸化水素又は生じたコレステノンを測定することにより
遊離又は結合した形のコレステリンを測定するために、
・ストレプトマイセス属の微生物から得られたコレステ
リン−オキシダーゼを使用し、かつ3,4−ジクロルフ
ェノールの添加下に、この測定を動力学的に実施するこ
とを特徴とするコレステリンの測定法。 23.4−ジクロルフェノール0.5〜50ミリモル/
l及びコレステリン−オキシダーゼ0.1〜50X10
3U/lを添加する特許請求の範囲第1項記載の方法。 3 あらかじめ決定した時間範囲内で測定を少なくとも
2回行なう特許請求の範囲第1項又は第2項記載の方法
。 4 反応を6.5〜8のpH値で緩衝させた溶液中で実
施する特許請求の範囲第1項〜第3項のいずれ1か1項
に記載の方法。 5 生じた過酸化水素を測定するために4−アミノアン
チピリン、フェノール、ペルオキシダーゼ及び燐酸塩−
緩衝剤、へペス緩衝剤又はトリス緩衝剤を添加する特許
請求の範囲第1項〜第4項の・いずれか1項に記載の方
法。 6 非イオン系界面活性剤及び場合により付加的にコー
ル酸−グループの界面活性剤を添加する特許請求の範囲
第1項〜第5項のいずれか1項に記載の方法。 7 コレステリン−オキシダーゼ及びH2O2又はコレ
ステノンを測定するための混合系並びに場合によりコレ
ステリンエステラーゼを含有するコレステリンの動力学
的測定試薬において、付加的に3.4−ジクロルフェノ
ールを含有しており、かつコレステリン−オキシダーゼ
はストレプトマイセス属の微生物からのものであること
を特徴とするコレステリンの測定試薬。 8 H2O2を測定するための混合系とは4−アミノア
ンチピリン、フェノール又はその誘導体、緩衝剤及び界
面活性剤を含有する特許請求の範囲第7項記載の試薬。 9 非イオン系界面活性剤を単一で、又はコール酸−グ
ループの界面活性剤と一諸に含有する特許請求の範囲第
7項又は第8項に記載の試薬。 10燐酸塩−緩衝剤、へペスー緩衝剤又はトリス−緩衝
剤を含有する特許請求の範囲第7項〜第9項のいずれか
1項に記載の試薬。 11 コレステリン−オキシ ダーゼ 0.1〜10 X’ 103U/1
コレステリン−エステ ラーゼ 0.1〜20 X 103U/11
ペルオキシダーゼ 0.1〜5×103U/13.4
−ジクロルフェ ノール 1〜10ミリモル/14−アミ
ノアンチピリ ン 0.5〜10ミリモル/lフェ
ノール又はフェノ ール誘導体 5〜20ミリモル/l非イオン
系界面活性剤 1〜10g/lコール酸グループ
の界 面活性剤 O〜15ミリモル/l緩衝剤(
pH6,5〜8) 50〜200ミリモル/l を含有する特許請求の範囲第8項〜第10項のいずれか
1項に記載の試薬。 12固体担体上に含浸されている特許請求の範囲第7項
〜第11項のいずれか1項に記載の試薬。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19803046241 DE3046241A1 (de) | 1980-12-08 | 1980-12-08 | Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS57122800A JPS57122800A (en) | 1982-07-30 |
JPS5818080B2 true JPS5818080B2 (ja) | 1983-04-11 |
Family
ID=6118631
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP56196400A Expired JPS5818080B2 (ja) | 1980-12-08 | 1981-12-08 | コレステリンの測定法及び測定試薬 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4503144A (ja) |
EP (1) | EP0053692B1 (ja) |
JP (1) | JPS5818080B2 (ja) |
AR (1) | AR227209A1 (ja) |
AT (1) | ATE5002T1 (ja) |
AU (1) | AU528296B2 (ja) |
CA (1) | CA1179243A (ja) |
DD (1) | DD201733A5 (ja) |
DE (2) | DE3046241A1 (ja) |
ES (1) | ES507307A0 (ja) |
YU (1) | YU44105B (ja) |
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DE3329387A1 (de) * | 1983-08-13 | 1985-02-21 | Flemming GmbH, 6204 Taunusstein | Verfahren und reagenz zur bestimmung von cholesterin |
US4680259A (en) * | 1984-09-26 | 1987-07-14 | Eastman Kodak Company | Analytical element and method for colorimetric determination of total cholesterol |
JPS61108400A (ja) * | 1984-10-31 | 1986-05-27 | Amano Pharmaceut Co Ltd | コレステロ−ルの定量法 |
DE3509238A1 (de) * | 1985-03-14 | 1986-09-18 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Stabilisierung der aktivitaet von peroxidase in loesung |
EP0223977B1 (en) * | 1985-11-25 | 1990-10-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Colour developing method in clinical examinations |
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