JPS5816682A - セルラ−ゼの製造法 - Google Patents
セルラ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS5816682A JPS5816682A JP11523381A JP11523381A JPS5816682A JP S5816682 A JPS5816682 A JP S5816682A JP 11523381 A JP11523381 A JP 11523381A JP 11523381 A JP11523381 A JP 11523381A JP S5816682 A JPS5816682 A JP S5816682A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cellulase
- enzyme
- culture
- coprinus
- range
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は担子菌によるセルラーゼの製造法に関する。
従来よシセルラーゼは、繊維質を分解する酵素として食
品工業、飼料、下水処理及び医薬等の分野に於いて広く
利用されている。
品工業、飼料、下水処理及び医薬等の分野に於いて広く
利用されている。
そこで本発明者等は、植物繊維質に対し強い酵素活性を
示すセルラーゼを生産する微生物を見い出すべく、広く
自然界よシセルラーゼ生産菌の検索を行なった結果、農
家の稲わら堆肥中よシ分離したコプリナス(Copri
nus)属−に属する担子菌が′極めて強い酵素活性を
示すセルラーゼを生産することを知シ、本発明を完成し
た。
示すセルラーゼを生産する微生物を見い出すべく、広く
自然界よシセルラーゼ生産菌の検索を行なった結果、農
家の稲わら堆肥中よシ分離したコプリナス(Copri
nus)属−に属する担子菌が′極めて強い酵素活性を
示すセルラーゼを生産することを知シ、本発明を完成し
た。
即ち本発明は、コプリナス属に属し、セルラーゼ生産能
を有する菌株をセルロース含有培地に接種、培養し、培
養物よシセルラーゼを採取することを特徴とするセルラ
ーゼの製造法である。
を有する菌株をセルロース含有培地に接種、培養し、培
養物よシセルラーゼを採取することを特徴とするセルラ
ーゼの製造法である。
以下本発明を詳述する。
先ず本発明に使用される菌としてはコブIJ −7ス(
Coprinus )属に属しセルラーゼ生産能を有す
る菌であれば如何なる菌でも良く、またこれらの菌の変
種もしくは変異株でも良い。そしてコプリナス属に属し
セルラーゼ生産能を有する菌の具体例としては、例えば
コプリナス・シネレウス(Coprinus* cin
ereus ) KK−J17M等が挙げられる。
Coprinus )属に属しセルラーゼ生産能を有す
る菌であれば如何なる菌でも良く、またこれらの菌の変
種もしくは変異株でも良い。そしてコプリナス属に属し
セルラーゼ生産能を有する菌の具体例としては、例えば
コプリナス・シネレウス(Coprinus* cin
ereus ) KK−J17M等が挙げられる。
上記コプリナス・シネレウス37Mの菌学的性質は以下
に示す通シである。なお菌学的性質は概ね「The F
ungi ■B (Chapter 、13 ) J
AlexanderHoSmith (Academi
c press、/ 973 )および「標準原色図鑑
全集/4L1菌類」今関六也、本郷次雄、椿啓介共著(
保育社出版、/977)に記載の方法に準拠した。
に示す通シである。なお菌学的性質は概ね「The F
ungi ■B (Chapter 、13 ) J
AlexanderHoSmith (Academi
c press、/ 973 )および「標準原色図鑑
全集/4L1菌類」今関六也、本郷次雄、椿啓介共著(
保育社出版、/977)に記載の方法に準拠した。
コプリナス・シネレウスKK−37Mの菌学的性質(1
)各培地における生育状態(何れも、2j’Cで培養)
■麦芽エキス寒天培地 7日目で旺盛な生育を示し、集落−の直径は1!;Xj
jmmで、白く柔かいふわふわした綿毛状を呈する。/
≠日目ではシャーレ(c5’ j x r 3 tm
)全面に生育し、中心部は直径!;0tran程度の円
形で綿毛状の菌糸が盛り土シ、その周辺は極めて短い菌
糸が培地上を覆う。
)各培地における生育状態(何れも、2j’Cで培養)
■麦芽エキス寒天培地 7日目で旺盛な生育を示し、集落−の直径は1!;Xj
jmmで、白く柔かいふわふわした綿毛状を呈する。/
≠日目ではシャーレ(c5’ j x r 3 tm
)全面に生育し、中心部は直径!;0tran程度の円
形で綿毛状の菌糸が盛り土シ、その周辺は極めて短い菌
糸が培地上を覆う。
■バレイショ・ブドウ糖寒天培地
7日目で極めて旺盛な生育を示し、集落は(5’ 3
X J’ 3 mm (直径)程度で、白く柔かい極め
て密に集合した綿毛状を呈する。/≠日目では直径(S
’ 3 X r j mmで、厚さが2〜3霧、白色洋
毛状の菌糸が密生し、集落の周縁部に褐色の0. /
mm程度の菌核を形成する。
X J’ 3 mm (直径)程度で、白く柔かい極め
て密に集合した綿毛状を呈する。/≠日目では直径(S
’ 3 X r j mmで、厚さが2〜3霧、白色洋
毛状の菌糸が密生し、集落の周縁部に褐色の0. /
mm程度の菌核を形成する。
■ツアペック寒天培地
7日目の生育は不良で、希薄な菌糸が?3×r3tun
程度まで広がってはいるが、集落の形成は認められない
。1ll−日目でも菌糸の生育にはほとんど変化は見ら
れ々いが、シャーレの全面に褐色で0. / mm程度
の菌核をまばらに形成する。
程度まで広がってはいるが、集落の形成は認められない
。1ll−日目でも菌糸の生育にはほとんど変化は見ら
れ々いが、シャーレの全面に褐色で0. / mm程度
の菌核をまばらに形成する。
■サブロー寒天培地
7日目では小程度の生育を示し、集落は≠j×≠!瓢程
度で、白く柔かい長毛の菌糸がやや粗く集合した集落を
形成する。1Il−日目では中程度の生育(7!r×7
3;tpm)を示し、菌糸は白色でやや長く、中央部が
盛シ上シ、全体として花びらを重ねた状態となシ、裏面
は黄色を呈する。
度で、白く柔かい長毛の菌糸がやや粗く集合した集落を
形成する。1Il−日目では中程度の生育(7!r×7
3;tpm)を示し、菌糸は白色でやや長く、中央部が
盛シ上シ、全体として花びらを重ねた状態となシ、裏面
は黄色を呈する。
■Yp8s寒天培地
7日目で極めて旺盛な生育を示し、集落はr3×r3■
程度で白く柔かい綿毛状を呈し、培地中に褐色の0.
/ m程度の菌核を多数形成する。
程度で白く柔かい綿毛状を呈し、培地中に褐色の0.
/ m程度の菌核を多数形成する。
/≠日目ではシャーレの全面(J’ J’ X (5’
j mm )に生育し、菌糸は灰白色の綿毛状を呈し
、菌核は全面に形成し、裏面は褐色を呈し、集落の表面
に子実体形成の為の白色の原基をlθ個程度形成する。
j mm )に生育し、菌糸は灰白色の綿毛状を呈し
、菌核は全面に形成し、裏面は褐色を呈し、集落の表面
に子実体形成の為の白色の原基をlθ個程度形成する。
(2)生理的性質
■最適生育条件
pH;乙、o−g。
温度;2j−≠θ℃
■生育の範囲
pH;44j〜10.j
温度;20−4’J”C
次に上記した菌学的性質を有するコプリナス・シネレウ
スKK−37Mの分類学上の位置について「The F
ungi ■B(Chapter2J)Alexand
erH。
スKK−37Mの分類学上の位置について「The F
ungi ■B(Chapter2J)Alexand
erH。
Sm1th (Acaaemic press、 /
973 )および「標準原色図鑑全集/≠、菌類」今関
六也、本郷次雄、椿啓介共著(保育社出版、/977)
の分類と対比検討した結果、本菌株は菌糸の隔膜部にカ
スガイ状突起を有し、YpS s培地上に形成された子
実体は、幼時には長卵形で、極めて脱落し易い白色の毛
で被われ、ヒダは茎に離生じ刃状を呈すること、胞子は
成熟すると傘が一夜のうちに液化して線条に沿い裂片状
と々ること、更に胞子紋は黒紫褐色で傘には大形の側シ
スチジアを有することよシ、コプリナス属に属する菌株
であると判定される。
973 )および「標準原色図鑑全集/≠、菌類」今関
六也、本郷次雄、椿啓介共著(保育社出版、/977)
の分類と対比検討した結果、本菌株は菌糸の隔膜部にカ
スガイ状突起を有し、YpS s培地上に形成された子
実体は、幼時には長卵形で、極めて脱落し易い白色の毛
で被われ、ヒダは茎に離生じ刃状を呈すること、胞子は
成熟すると傘が一夜のうちに液化して線条に沿い裂片状
と々ること、更に胞子紋は黒紫褐色で傘には大形の側シ
スチジアを有することよシ、コプリナス属に属する菌株
であると判定される。
更に本菌株の子実体の茎は、絹糸状の細鱗片に被われ、
茎の根本はや\ふくれ、上方に向ってやや細まっている
こと、更に−っの担子器に≠個の胞子を付け、該胞子は
楕円形(乙〜7×9〜//μ)で発芽孔を有することか
らコプリナス・シネレウスと判定される。
茎の根本はや\ふくれ、上方に向ってやや細まっている
こと、更に−っの担子器に≠個の胞子を付け、該胞子は
楕円形(乙〜7×9〜//μ)で発芽孔を有することか
らコプリナス・シネレウスと判定される。
そして上記傘は幼時に於いてクリーム色から除徐に濃い
紫色になり、成熟すると黒紫色になること、更に生育最
適温度は37〜≠θ℃で、特に37℃付近で子実体の形
成が旺盛となることよシ、本菌株はコプリナス・シネレ
ウスの新菌株であると同定し、本菌株をコプリナス・シ
ネレウスKK−37Mと命名した。
紫色になり、成熟すると黒紫色になること、更に生育最
適温度は37〜≠θ℃で、特に37℃付近で子実体の形
成が旺盛となることよシ、本菌株はコプリナス・シネレ
ウスの新菌株であると同定し、本菌株をコプリナス・シ
ネレウスKK−37Mと命名した。
なお上記コプリナス・シネレウスKK−37Mは工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第乙θ7.2号
(FKRMP−4072)として寄託されている。
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第乙θ7.2号
(FKRMP−4072)として寄託されている。
次に、本発明に於けるセルラーゼ生産に使用される培地
としては、例えば濾紙、アビセル、脱脂綿、オガクズ、
おから、稲わら、醤油粕、コーヒー粕、落下生殻等のセ
ルロースを含有させることが必須で、これに必要により
殿粉等の多糖類、単糖類および少糖類、窒素源としてペ
プトン、肉エキス、コーンステイープリカー、酵母、ア
ンモニウム塩類、尿素等の有機もしくは無機の窒素化合
物、その他リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩等の無機塩
類、ビタミン類、生長促進物質等を適宜添加した培地が
用いられる。また培養培地としては、液体培地、固体培
地の何れでも良く、培養pHは通常、3′、5以上、好
ましくは6〜9の範囲である。そして培養温度は、2!
〜4t0℃、好ましくは30〜37℃付近であシ、また
培養期間としては通常λ〜IO日間程度である。
としては、例えば濾紙、アビセル、脱脂綿、オガクズ、
おから、稲わら、醤油粕、コーヒー粕、落下生殻等のセ
ルロースを含有させることが必須で、これに必要により
殿粉等の多糖類、単糖類および少糖類、窒素源としてペ
プトン、肉エキス、コーンステイープリカー、酵母、ア
ンモニウム塩類、尿素等の有機もしくは無機の窒素化合
物、その他リン酸塩、マグネシウム塩、鉄塩等の無機塩
類、ビタミン類、生長促進物質等を適宜添加した培地が
用いられる。また培養培地としては、液体培地、固体培
地の何れでも良く、培養pHは通常、3′、5以上、好
ましくは6〜9の範囲である。そして培養温度は、2!
〜4t0℃、好ましくは30〜37℃付近であシ、また
培養期間としては通常λ〜IO日間程度である。
培養終了後、固体培養の場合は該培養物を常法により水
もしくは緩衝液等で抽出し、液体培養の場合は該培養液
を常法によシ濾過もしくは遠心分離し粗酵素液を得る。
もしくは緩衝液等で抽出し、液体培養の場合は該培養液
を常法によシ濾過もしくは遠心分離し粗酵素液を得る。
上述の操作によシ得られる本酵素(粗酵素液)の理化学
的性質を示すと、以下の過多である。
的性質を示すと、以下の過多である。
(1)作用および基質特異性
濾紙、アビセル、CMC−Na 、脱脂綿、オガクズ、
おから、稲わら、醤油粕、もみ殻、ピーナツ殻、コーヒ
ー粕等に作用し・、還元糖を生成させる。
おから、稲わら、醤油粕、もみ殻、ピーナツ殻、コーヒ
ー粕等に作用し・、還元糖を生成させる。
(2)¥適pHおよび安定pH
本酵素の至適pHは第1図に示す如く、pI(A、θ(
30℃)でアわ、安定pHの範囲は第2図の如くpHQ
〜9(30℃、2≠時間処理)である。
30℃)でアわ、安定pHの範囲は第2図の如くpHQ
〜9(30℃、2≠時間処理)である。
なおpHj〜?の範囲では、50℃で≠時間加熱処理を
行っても30%以上の活性が残存した。
行っても30%以上の活性が残存した。
(3)力価の測定法
セルラーゼ活性の測定は、濾紙を基質として生成する還
元糖の増加量を測定する方法を用いた(M。
元糖の増加量を測定する方法を用いた(M。
Manaels & D、Sternberg 、 J
、Ferment、Technol、。
、Ferment、Technol、。
j≠、2t7./976)。
即ち濾紙(ワットマンJf6./)!i−0■を基質と
して、これに酵素液0. j m/とクエン酸緩衝液(
pHt、θy O−/ M) / mA’を加え!−0
℃で10分間酵素反応を行なった後、ジニトロサリチル
酸試薬3mlを加え、沸騰浴中で!分間加熱して発色さ
せる。
して、これに酵素液0. j m/とクエン酸緩衝液(
pHt、θy O−/ M) / mA’を加え!−0
℃で10分間酵素反応を行なった後、ジニトロサリチル
酸試薬3mlを加え、沸騰浴中で!分間加熱して発色さ
せる。
これに水/1mlを加えssonmに於ける吸光度を測
定し、グルコース量として表わしだ。
定し、グルコース量として表わしだ。
酵素単位は、jθ℃/時間の反応で/μVのグルコース
に相当する還元力を生成する酵素活性を/単位とした。
に相当する還元力を生成する酵素活性を/単位とした。
(4)作用適温の範囲
本酵素の作用適温の範囲は、第3図の如く4L!〜jj
℃(pHA、Q)である。
℃(pHA、Q)である。
+5)pH,温度などによる失活の条件はぼ!O
第≠図の如く、pHA、θの条件下で##Is#匁℃ま
で安定である。
で安定である。
(6)阻害および活性化
本酵素は水銀、銀等の重金属により阻害を受け、マンガ
ン、コバルト、バリウム等により活性化される。
ン、コバルト、バリウム等により活性化される。
(7)精製方法
本酵素の精製方法は、本菌の培養液を遠心分離して得ら
れた濾液(粗酵素液)を、Q、Oj; M NaxHP
Oダ(クエン酸でpH1,0に調整)溶液で充分に平衡
化したDEAE−セファデックス(スエーデン、ファル
マシア社製)に吸着させる。次いで前記緩衝液で充分に
洗った後、0..3−M食塩を含む前記緩衝液で溶出す
る。溶出液を限外濾過膜UM−IOC米国、アミコン社
製)を用いて脱塩、濃縮し、この濃縮液を前記緩衝液で
平衡化したセファデックスG=/30(スエーデン、フ
ァルマシア?1IJ)でゲル濾過を行い精製する。
れた濾液(粗酵素液)を、Q、Oj; M NaxHP
Oダ(クエン酸でpH1,0に調整)溶液で充分に平衡
化したDEAE−セファデックス(スエーデン、ファル
マシア社製)に吸着させる。次いで前記緩衝液で充分に
洗った後、0..3−M食塩を含む前記緩衝液で溶出す
る。溶出液を限外濾過膜UM−IOC米国、アミコン社
製)を用いて脱塩、濃縮し、この濃縮液を前記緩衝液で
平衡化したセファデックスG=/30(スエーデン、フ
ァルマシア?1IJ)でゲル濾過を行い精製する。
(8)分子量
本酵素はC7−酵素、Cx−酵素、β−グルコシダーゼ
等の酵素群よシなシ、分子量は平均/ψθθ〜10oJ
000である。
等の酵素群よシなシ、分子量は平均/ψθθ〜10oJ
000である。
本発明により得られるセルラーゼは、その安定pH範囲
がtl−〜9と極めて広く、殊にpHJ’付近に於いて
も強い酵素活性を有する為、例えば消化薬等の医薬品工
業、その他食品工業等に広く使用され、本発明は工業的
に極めて有意義である。
がtl−〜9と極めて広く、殊にpHJ’付近に於いて
も強い酵素活性を有する為、例えば消化薬等の医薬品工
業、その他食品工業等に広く使用され、本発明は工業的
に極めて有意義である。
以下実施例によυ本発明を具体的に示す。
実施例
アビセル;・1%−(W/V )、(NHI’ )J
5O4tHQ、/’l−%(W/V ’)、KHJPO
I ;0.2θ%(W/V)、尿素; 0.03 %
(、W/V )、CaC1z + 0.03% (W/
V)、Mg5O4t・7HコO:0.03%(W/V
)、ペプトン;% (W/V )、Mn80p 響HJ
O;0.00θ#%(W/V)、ZnS0g −7H:
lO; Q、(7θθ/1% CW/V )及びCoC
1x; o、ooo、2チ(W/■)を含有する液体培
地jOmlを300m1容ヒダ付きフラスコに投入し、
常法によシ加熱殺菌後、これにj % NaaCO3溶
液2.θ−を加え培地のpHをr!に調整したものに、
コプリナス・シネレウスKK−37M(微工研菌寄第乙
θ72号、FIRM P−乙072)の菌糸を接種し、
30℃で3日間ロータリシェーカーで種培養して得られ
る培養液の全量(4AOrrtl)を、上記組成の液体
培地/lと共に21容三角フラスコに投入し、次いで該
培地のpHを!%Na、2CO3溶液でpH13に調整
した後、30℃で7日間ロータリシェーカーで培養を行
なった。
5O4tHQ、/’l−%(W/V ’)、KHJPO
I ;0.2θ%(W/V)、尿素; 0.03 %
(、W/V )、CaC1z + 0.03% (W/
V)、Mg5O4t・7HコO:0.03%(W/V
)、ペプトン;% (W/V )、Mn80p 響HJ
O;0.00θ#%(W/V)、ZnS0g −7H:
lO; Q、(7θθ/1% CW/V )及びCoC
1x; o、ooo、2チ(W/■)を含有する液体培
地jOmlを300m1容ヒダ付きフラスコに投入し、
常法によシ加熱殺菌後、これにj % NaaCO3溶
液2.θ−を加え培地のpHをr!に調整したものに、
コプリナス・シネレウスKK−37M(微工研菌寄第乙
θ72号、FIRM P−乙072)の菌糸を接種し、
30℃で3日間ロータリシェーカーで種培養して得られ
る培養液の全量(4AOrrtl)を、上記組成の液体
培地/lと共に21容三角フラスコに投入し、次いで該
培地のpHを!%Na、2CO3溶液でpH13に調整
した後、30℃で7日間ロータリシェーカーで培養を行
なった。
培養終了液を常法によシ遠心分離して得られた濾液♂0
0m1に冷アルコールを2’100m1を加えて/昼夜
放置後、沈澱する区分を補集し、次いで常法により減圧
下で乾燥し本粗酵素粉末jtを得た。
0m1に冷アルコールを2’100m1を加えて/昼夜
放置後、沈澱する区分を補集し、次いで常法により減圧
下で乾燥し本粗酵素粉末jtを得た。
該粗酵素の酵素活性は/、 II x /θ′U、/グ
であった。
であった。
第1図は本酵素の至適pH,第2図は安定、pH範囲、
第3図は作用適温の範囲、第≠図は温度による失活の条
件(pH,θ)を夫々示す。 特許出願人 キッコーマン株式会社 オ Il!l i λ 21!1 オ 3 口 オ今回
第3図は作用適温の範囲、第≠図は温度による失活の条
件(pH,θ)を夫々示す。 特許出願人 キッコーマン株式会社 オ Il!l i λ 21!1 オ 3 口 オ今回
Claims (1)
- コプリナス属に属し、セルラーゼ生産能を有する菌株を
セルロース含有培地に接種、培養し、培養物よシセルラ
ーゼを採取することを特徴とするセルラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11523381A JPS6024710B2 (ja) | 1981-07-24 | 1981-07-24 | セルラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP11523381A JPS6024710B2 (ja) | 1981-07-24 | 1981-07-24 | セルラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5816682A true JPS5816682A (ja) | 1983-01-31 |
JPS6024710B2 JPS6024710B2 (ja) | 1985-06-14 |
Family
ID=14657635
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP11523381A Expired JPS6024710B2 (ja) | 1981-07-24 | 1981-07-24 | セルラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6024710B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10511410A (ja) * | 1994-12-22 | 1998-11-04 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | セルロース分解活性を有する酵素製剤 |
-
1981
- 1981-07-24 JP JP11523381A patent/JPS6024710B2/ja not_active Expired
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH10511410A (ja) * | 1994-12-22 | 1998-11-04 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | セルロース分解活性を有する酵素製剤 |
US5972872A (en) * | 1994-12-22 | 1999-10-26 | Novo Nordisk A/S | Enzyme preparation with cellulytic activity |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6024710B2 (ja) | 1985-06-14 |
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