JPS58158183A - 改質蛋白質の製法 - Google Patents

改質蛋白質の製法

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JPS58158183A
JPS58158183A JP3668382A JP3668382A JPS58158183A JP S58158183 A JPS58158183 A JP S58158183A JP 3668382 A JP3668382 A JP 3668382A JP 3668382 A JP3668382 A JP 3668382A JP S58158183 A JPS58158183 A JP S58158183A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛋白質類は生物系において種々の役割をもつ生物学的に
合成された巨大分子である。酵素類は特定反応を接触す
るとりわけ種々の、生物学的に活性のある蛋白質類であ
る。現在、酵素技術は産業及び研究における多くの分野
、例えば医学研究、食料の加工と保存、醗酵飲料の製造
、医薬品の製造及び分析酵素技術による棟々の代謝産物
及び食料成分の鏝度の分析定、量において使用されてい
る。
酵素類はその生物学的活性が非常に特異であシ、概して
個別の反応を、生物学的触媒作用無しに室温で生ずる対
応の反応に比べて非常に高い速度で接触する。一つの酵
素はこのものが作用し得る多くの基質に関して触媒活性
を示し得る。従って、所与の酵素は一つよシ多い基質の
合成又は分解を接触できる。正統的酵素とみなされてい
ないいくつかの蛋白質、例えばウシ血清アルブミンは一
つ以上の基質に関して非常に限られた触媒活性しか示き
ない。
酵素の多くは自然界において極ぐ少量で見出されている
。従って、それらの単離、精製及び利用はこれらを通常
形状で単離するのに必要な費用と時間にかんがみ小規模
の操作σζ限られている。
酵素のいくつかは自然界において比較的多量存在してお
り、その単離、精製及び利用は比較的容易である。然し
なから、あいにく、これらの酵素の厳密な接触行動のた
め、大量入手できる酵素は成る選はれた反応を接触でき
るたけである。
最近、単離するには乏しいか又は高価な天然酵素類が示
す酵素挙動に類似の酵素挙動を示す合成、生物学的触媒
の合成に多大の努力がなされている。
更に、天然酵素類を改質して、それらがこれまで接触で
きなかった反応を接触するようにはたらくように、それ
らの酵素特異性を変えようとする試みがいくつかなされ
ている。
特定、所望の反応を接触する酵素挙動を達成することが
知られている一つの技術はいわゆる酵素模型分子の合成
である。例えは、低分子量化合物は酵素の活性坐席の活
性を示す官能基に共有的に結合できる。このような製法
の例は下記の出版物に記載されている: Advances In Chemistry 5er
ies )、 R6F、i−ルド(Gould )出版
、アメリカン・ケミカル・ソサIティ、ワシントン、D
、 C6,2/−グ3(/り7/)及びc、 c、タン
(Tang ) : D、ダグアリア。
(Davalian ) ; P、i□ウング(Hau
ng )及びR,プレ他の技術は、その主鎖に沿って改
質されて所与の酵素の活性坐席の慎能を示す官能基を与
える合成重合体マトリ、クスの使用を含む。このような
技術の例は下記の論文中に見出すことができる二G、ウ
ルフ(wutff)及び1.シュルツ7 (5chu1
.za )、J、ヌー(Suh )、10M、クロッ(
Klotz )、Bioorganic % 乙、/乙
j(/977)。
他の一つの技術は、新しい化学的部分を天然酵素にこの
酵素の活性坐席の近くに付加して、このような酵素を異
なった触媒活性によシ反応させようと試みることを含ん
でいる。このことの−例は、下記の論文中に例示されて
いるように、本来のパパイン酵素の活性全席の近くにフ
ンビンを共有付加させることにより、蛋白質分解酵素で
あるパパインをオキシダーゼ型酵素に転化させることで
ある: H,L、レヴアイン(Levine )及びE、 T、
カイザー(Kaiser )、 J、Amer、Che
m、Soc、、100.7乙70(/P7g)及びT、
オーツキ:Y、ナカガワ及びE、T、カイザー、J、C
,S、Chem、Comm1、//、’l−37CI’
?7g)。このような酵素改質のその他の例は下記の論
文中に見出すことができる:M、E、ウイルソ7 (W
i l son )及びG、M、ホワイトサイズ(Wh
itesides ) % J+Amer、Chem、
 Soc、、100.30乙(797K)。
酵素の特異性を変えようとする更に他の試みは天然酵素
をケ゛ル・マトリックス中に固定することである。例え
ば、トリジシン酵素はポリアクリルアミドゲル中で固定
されている。ポリアクリルアミドグ9ルはアミノ酸エス
テルをグルーマトリックス中を拡散させて上記酵素と反
応させるが、一層犬きい蛋白質を拡散させないであろう
。かぐして、酵素の特異性は、基質分子の一つの、酵素
への接近を無くすことにより変えられる。このような特
異性の変化の例はウイリ・アンド・フン、インコーホレ
ーテッドから出版されたカーク−オスマーのエンサイク
ロペジア・オス・ケミカル・チクノロノー、3版、り、
/llt♂、CI’?IO)中に記載されている。
又、天然リノンモノ、オキシダナーゼを反応させて、こ
の酵素上のスルフヒドリル基を封鎖できることも知られ
ている。この特定酵素リジンモノオキシケ゛ナーゼがこ
のように処理されると、このものはアミノ酸に対して新
しい触媒活性を示し、その天然の酵素添加性脱炭酸反応
の代シに酸化性膜アミン反応を接触する。然しなから、
上記報告者/θ、37!0−37!2(/973)中の
T、ヤマウチ;S、ヤマモト及びO,ハヤイシの論文参
照。又、天然酵素、レリえばトリジシンをそれの天然抑
制剤と反応させ、ついでこの酵素を架橋することにより
、それの天然基質に関する活性を改変できることも報告
されている。Int、J、 Peptide Re58
、j12/、3−−/1fc7973)中のG、 H,
ビーヴン(Beaven )及びW、B、グラッツ7−
 (Gratzer )による論文参照。
これらの技術は多くの用途に適しているが、概して、高
度の触媒活性ではない改質天然酵素又は全合成酵素同族
体を生ずる。従って、費用のかからない、かつ市販の天
然酵素を化学的に改質して、これまで、天然酵素により
接触される商業的に有用な反応ではなかった、ある所望
の化学反応であって、かつこの新規な反応を体系的に予
め決定できる、かかる反応に関して、活性を示す半合成
酵素をつくる、簡単、効率的かつ経済的な方法が必要と
なる。上記文献類に記載の方法は単に酵素を一組の条件
に付し、その挙動を解明しようと試み性のある蛋白質を
、変性剤にさらして部分変性させ、上記蛋白質の配座構
造を部分的に開く(unfold )ことにより半合成
酵素を達成する。次に、この部分変性蛋白質を模型酵素
の抑制剤と接触させる。その後、この蛋白質を架橋し、
上記抑制剤によシ形が定められる新しい配座ノは半合成
の酵素の形を定める。ついで、上記抑制剤及び過剰の架
橋剤を上記の新しく生成した半合成酵素から除去すると
、上記模型酵素に対する機能的同族体を生ずる。このよ
うにして作った半合成酵素は上記模型酵素の活性特性を
示す。
本発明の目的と利点を達成するに当って、今回、蛋白質
は、本発明方法を実施することにより、その天然配座か
ら半合成配座に改変できることが見出された。この新し
い配座状態は触媒活性を示す半合成酵素の形を定める。
杢明細書に用いている°′酵素′″という語は特定てい
る様に、即ちアミノ酸から生成されて生物学上の分子を
生ずるポリペプチドと定義される。
本発明は、ある蛋白質を一つの配座から第二の配座に改
質し、かくして上記の選ばれた蛋白質にとって新し−酵
素活性を生ずるか、文は上記天然蛋白質中に存在する限
界酵素活性を商業的に有用な水準にまで高める方法を含
む。
本方法は天然蛋白質、典型的には酵素を、この蛋白質の
構造を、通常は可逆的に、部分変性する条件及び/又は
試薬に付することを含む。ついで、模型酵素の抑制剤を
上記部分変性状態にある天然蛋白質と接触させる。如何
なる理論にも束縛されるものではないが、上記蛋白質の
部分変性により、蛋白質は、本方法により模型となる酵
素の抑制剤を束縛し、模型酵素の活性全席に非常に似た
活性全席を形成するものと信ぜられる。上記めに1制剤
の束縛が、新しい配座が架橋されることが可能となる迄
、模型酵素の触媒機能を遂行できる少くとも一つの全席
を含む新しい配座を保存し、かつその形を定めるものと
信ぜられる。従って、上記抑制剤と上記部分変性蛋白質
との接触が行なわれた後、架橋工程を行なうと、上記蛋
白質の新し一配座を化学的に安定にする。かぐして、新
しい半合成酵素が模型蛋白質から調製される。
本明細書中に定義されているように、”部分変性″は、
蛋白質の不可逆の、甚だしい変性を生ずることなしに、
蛋白質の形又は配座をかき乱す(perturb )よ
うに蛋白質の配座を変化させることを意味する。パ配座
”は、当該技術において一般に受容されているように、
生体内で生物学的活性を有する蛋白質の二次及び三次構
造の組合せと定義される。蛋白質の部分変性は周知であ
シ、下記の文献類に詳細に論じられている:ワース出版
社(Worth Publishers N  Inc
、’ )、N、 Y、、A、 L、レーニンガー(Le
hnhnger )著、書物、生化学、sg頁:“蛋白
質化学の進歩” (Advances in Prot
einChemistry )、33巻、/乙7−/9
.2頁、中の°゛蛋白質の安定性”という表題の、P、
L、ゾリグアロフ(Pr1valov )の論文;”蛋
白質化学の進歩”、0部、21I−巻、2−27頁、中
の“1蛋白質変性′″という表題の、C,サンフォード
(5anford )の論頁A中の)°゛蛋白質の挙動
”(Mo t i o ns in Proteins
)と−う表題の、F、 RoN、ガード(Gurd )
等の論文;BBA 、627巻1.227−232頁、
中の0.ヤルデツキ−(Zardetzky )の論文
; TlB5. / 5;’ 72年72月1.27I
頁、中のR,ヒーーバー(Huber)の論文;及びM
o1ekulyarnaya Biologiya、 
1巻、1に乙、g37−、!i>63頁、中のり、S、
マルコピッチ(Markovich )等の論文。
本明細書中に用いられる゛′変性剤″″という語句は、
蛋白質の部分変性を生ずる行程の条件又は試薬を意味し
ている。例えば、蛋白質の部分変性は蛋白質を昇温、例
えば2部℃ないし乙θ℃の範囲内の温度の水溶液中に浸
漬することにより達成できる。大ていの蛋白質に対して
23℃ないし60℃は蛋白質の変化を生ずるように蛋白
質の構造をかき乱すことになろう。然しなから、当該技
術において周知の如く、好熱性細菌源からのいくつかの
蛋白質は水の沸点近辺に対して安定であるので、一般的
に上に開示した昇温より一層高い昇温を必要とすること
になろう。又、蛋白質の部分変性は蛋白質を無機塩、無
機又は有機酸又は水混和性溶剤を含有する水溶液中に浸
漬することによっても達成できる。
蛋白質構造を否安定にするのに役立つ適当な無機塩には
下記のもの例含まれる:NaF、(NH4)2s04、
(CH3)4NC11(CH3)4NBr1KCH3c
o01NH4c1、RbC1、Kct X NaC1−
、’ CsCl X LICI−、KBr、NaBr5
KNO3、MgCl2、NaNo 3、CaCl 2、
KSCN 、 Na5CN 1B a Cl 2、Na
l及びLi10適当な無機酸には下記のものが含まれる
:塩酸、硝酸、硫酸、リン酸及び同様な、プロトンを与
える強無機酸類。
適当な有機酸には酢酸、ギ酸、ゾロピオン酸及びクエン
酸が含まれる。
蛋白質上の疏水性基を溶解し、かぐしてその構造を不安
定にするものと信ぜられる適当な水混和性溶剤にはt−
ブタノール、アセトニトリル、ジオキサン、アセトン、
メタノール、エタノール及びツメチルスルホキシドが含
まれる。
本明細書中に用いられるパ抑制剤”という用語は、半合
成酵素の活性全席にとって鋳型(template)と
して役立つ、半合成蛋白質の天然基質に対して十分な構
造類似性をもつ化合物を意味する。抑制剤は概して、基
質と同様に、酵素により分解されない。酵素抑制剤と酵
素の天然基質との構造類似性の一例はグルコースオキシ
ダーゼの場合である。
グルコースはグルコースオキシダーゼノ天然基質であり
、一方、D−グルカールはグルコースオキシダーゼに対
する抑制剤である。グルコースとD゛ −グルカールは
構造的に非常によく似ている。
本明細書中に定義されているように°゛架橋という用語
は蛋白質上の反応性全席間の分子間又は分子内における
共有結合の生成を意味する。分子内架橋に対しては、工
程は通常、多官能試薬、例えばグルタルアルデヒドの使
用により達成される。
蛋白質の架橋を達成するのに適した架橋試薬のその他の
例は下記のものである:2−アミノーグ、乙−ノクロル
ー3−)リアジンジアゾニウム塩;N−ヒドロキシスク
シンアミド;p−ベンゾイルアジド及び下記の文献類に
開示されている架橋試薬類二F、ウォルド(wota)
、Methods Enzymol %//、HIR8
,C0H,W、版、アカデミツク・プレス、15;)乙
7、乙/ 7 ; H,ファンルド(Fasold )
等、及びKH,キーズ(Keyes )、カーク−オス
マー:エンサイクロペノア・オプ・ケミカルテクノロジ
ー、り、3ci ed、 、/り10.J、ウィリー・
アンド・ノンズ、Inc、 、/≠了−/7.2゜多く
の天然酵素類は本方法による模型作シ(model i
ng )に従うことができ、それらの半合成同族体、例
えば加水分解酵素、レドックス酵素及び転移酵素をつく
るであろう。例えば:第1群の加水分解酵素は蛋白質を
加水分解する蛋白質分解酵素、例エバ・ぞ・ぐイン、フ
ィシン、ペゾシン、トリジシン、キモトリジシン、プロ
メリン、ケラチナーゼ;炭化水素を加水分解するカルゴ
ヒドラーセ、例エバセルラーゼ、アミラーゼ、マルター
ゼ、ペクチナーゼ、キチナーゼ:エステルを加水分解ス
ルエステラーゼ、例えばりi?−ゼ、コリンエステラー
ゼ、レシチナーゼ、アルカリ及びホスファターゼ:核酸
を加水分解するヌクレアーゼ、例えばリボヌクレアーゼ
、デオキシリボヌクレアーゼ;及びアミンを加水分解す
るアミダーゼ、例えばアルギナーゼ、アスi9ラギナー
ゼ、グルタミナーゼ、ヒスチダーゼ及びウレアーゼを含
む。第2群は酸化又は還元反応を接触するレドックス酵
素である。
これらはグルコースオキシダーゼ、キサンチンオキシダ
ーゼ、カタラーゼ、ベルオキシダーゼ、リポキシダーゼ
及びチトクローム還元酵素を含む。
第3群には基を一つの分子から他の一つの分子に転移す
る転移酵素がある。これらの例はグルタミンピルビント
ランスアーミナーゼ、グルタミン−オキサル酢酸トラン
スメチラーゼ、トランスメチラーゼ、ホスフォピルビン
トランスホスフォリラーゼである。
通常のゾラクチスにおいては、模型又は第1の蛋白質、
典型的には酵素が選ばれる。ついで、上記第1の蛋白質
をまねて模型となる第2の蛋白質が選ばれ、半合成酵素
をつくる。本発明を実施することにより、第2の蛋白質
を、所望の、異なった、半合成蛋白質に注文仕立てする
ことができる。
このことは、使用したい酵素が供給が欠乏し、非常に高
価か又は精製が困難である広範囲の臨床及び産業の状況
において多大の利益を与える。
かぐして、大量に及び/又は低価格で入手できる天然蛋
白質又は酵素を本発明方法によシ改質して、所望の天然
酵素の触媒活性を示す、前者はど入手可能ではない、及
び/又は一層高価の半合成酵素に変えることができる。
このような酵素変成生成物にとって多くの用途がある、
例えば多くの産業及び研究用途、とりわけ醗酵、医薬品
及び医学研究用途並びに食料加工需要における用途があ
る。
本発明の通常のゾラクチスにおいては、天然蛋白質を精
製し、適当な緩衝液に溶解する。ついで、溶液を変性剤
と混合し、その中に溶解している蛋白質を部分変性する
。典型的には、蛋白質の部分変性は、無機塩を加えて溶
液のイオン強度を変えるか、溶液の−を無機又は有機の
、プロトン供与酸で変えるか、又は水混和性有機溶剤を
導入して溶液を改質することにより行なわれる。変性剤
と蛋白質との接触時間は75分ないし数日であり得る。
又、溶液温度は、上記の文献類、例えばプリグアロフの
論文、中に開示されているように、蛋白質を部分変性す
ることになる一行程条件改変として上昇させることがで
きる。被処理蛋白質が多数のジスルフィド橋を含有して
いるいくつかの場合には、例えばウシ血清アルブミン又
はウレアーゼの場合には、蛋白質をメルカプト−エタノ
ールにさらして蛋白質内のノスルフィド結合を破壊する
ことによシ部分変性を達成することができる。
蛋白質の部分変性は蛋白質構造の弛緩を生じ、その結果
、蛋白質は、後で部分変性蛋白質含有溶液と混合される
抑制剤を受容し、かつ束縛することができるものと信ぜ
られる。
蛋白質を部分変成した後、模型酵素の抑制剤を混合し、
抑制剤一部分変性酵素の錯体の個体群をつくるのに十分
な時間の間及び温度に部分変性酵素と接触させておく。
例えば、天然トリプシンを、天然酵素キモ) IJプシ
ンの活性を模型にする半合成酵素に転化させる場合には
、天然酵素トリプシンをキモトリプシンの抑制剤、例え
ばインドール又は安息香酸と接触させる。この接触は水
溶液中で、又は抑制剤の可溶化を助けるのに十分な添加
量の有機溶剤を含有する水溶液中で起き得る。
抑制剤と部分変性酵素との接触の後、新しい形の半合成
酵素は蛋白質゛構造の広範囲の架橋により安定になる。
典型的にはこのような架橋はグルタルアルデヒド架橋剤
を用いてなされる。何故ならば、このものは比較的安価
であり、入手容易であるからである。然しながら、上記
架橋剤のいずれも上首尾で用することができる。
蛋白質を架橋して新しい構造にして半合成酵素を作った
後、抑制剤と過剰架橋剤を新生成牛合成酵素から任意の
適当な方法により除去する。液体クロマトグラフィー及
び徹底的透析が適当な方法である。典型的には、新生成
牛合成酵素をグルカラムクロマトグラフィーによりn製
し、溶離剤からの最も活性な蛋白質画分を集めると最も
活性な半合成酵素が得られる。
開示の便宜上、ここに記載の特許及び文献類のすべては
その一部が示されているにすぎない。
下記の実施例は本発明方法を例示するものである。
以下余白 実施例/ A部 酵素の精製 ウシの膵臓からの、二回結晶化、無塩、かつ凍結乾燥し
た精製トリプシンをコスッカ(Kos tka )及び
カー4ンター(Carpenter)の手順(V、:I
スツカ及びF、H,カーにンター、ザ・ツヤ−ナル・オ
ノ・ごメイーオーロ :、!功ピし−+S、−−ト リ
 −、 237、乙、 /7タタ(/9乙4’)、) 
 により試験したところ、天然キモトリノシン汚染物は
検出されない。トリノシン基質の特異性についての最初
の分析はウォルシー(Walsh)及びウィルコックス
(Wilcox)の教示による電位差計−スタット法(
K、A、ウォルシー及びP。
E、ウィルコックス、酵素学の方法(Methods 
in5Hzymo l ogy )、G、E、 ノe−
ルマン(Pe r 1mann )及びり、ロランド(
Lorand)による編集、アカデミツク・プレス、3
7−7/C7970))によりなされる。トリプシンを
PI−13,0の0.00/MHCI中で調製する。
吸光1f、’t−,2どOnmにおいて定量し、/チ溶
液に対する吸光度/’A、3を用いて〜/mlの濃度を
つくる。
tつの当初の電位可変器−スタット分析を行なって天然
トリプシンの各基質についてのU/In9活性を定量す
る。使用基質は下記のものであった:/、  7セチル
チロシンエチルエステル(ATEE)<o、ciM) 2、ペンソイルアルギニンエチルエステル(BAEE)
 (0,0fM) 3、 アセチルトリプトファンエチルエステル(ATr
EE) (0,0/ M ) 久 アセチルフェニルアラニンエチルエステル(APE
E)<0゜0fM) B部 酵素の変性 A部の十分な精製トリプシンを23;℃、pH3の0.
00/ M HCI / 00 mlに溶解すると、−
2f(1)nmで0.7gの吸光度を与える。トリシア
ンf:30分間放置すると部分変性する。
0部 抑制剤の添加 B部の変性酵素溶液4tOmlに精製、乾燥インドール
粉末30rn9f添加し、混合物を7時間ゆっく9振と
うする。7時間後、トリプシンーキモトリグシン抑制剤
の錯体を分析して抑制)従って抑制剤の酵素への束縛を
確実にする。
0部 架橋 0部の溶液にとチのグルタルアルデヒド架橋剤700μ
lを加える。生成溶液f:PI−13,0−3℃で7時
間、振とりする。、7時間後、溶液の−をo、oiMの
Na OHの添加により夕に上げる。
E部 精製 り部の溶液jmlを、0.00 / M HCI 1C
aC12θ、00fMを溶離剤として用いて、セファデ
ックス(Sep、hadex)商標G−10グル濾過カ
ラム上でクロマトグラフィ分析に付す。インドール及び
過剰のグルタルアルデヒドの分離を、/2×/2部チの
カラム及び乙Qml/hrの溶離剤流速を用いて、約7
時間で行なう。蛋白質のピークが一23’4’nmで検
出され、かつ集められ、下記のように分析される。
E部 結果 キモトリプシンのための基質についての下記の活性増加
が、本発明により調製された半恰成キモトリノシンの、
E部からの試料から記録されている。
基質 ATEE(U/In/り  BAEE(U/ml)当初
の活性   左2/       !;!;、3最終活
性 分析手順/  と37     30.2/変化チ  
 +/乙0   −≠2 この結果は、半合成キモトリプシンがキモトリプシン基
質(ATEE)に関して活性増加を、かっトリプシン基
質(BAEE)に関して活性減少を示すことを示してい
る。
この実施例は又、本発明方法を用いる時、基質に関して
活性が実質上、増加することを示している。この実施例
は更に、本発明により処理して半合成キモトリプシンを
つくる時、イブチノルーペグチド加水分解酵素の一つの
種、即ち) IJ fシンの活性が、他の一つのベプチ
ノルーペプチド加水分解酵素、即ちキモトリプシンの基
質に関して、増加することを示している0 実施例2 A部 酵素の精製 シグマ・ケミカル・Co、からのタイプ[1−Aである
、無塩、ノロテア゛−ゼの無い、ウシの膵臓のIJ g
ヌクレアーゼとしての純粋形状のり?ヌクレアーゼ酵i
を購入した。
B部 酵素の変性 A部からの精製リボヌクレアーゼ乙omeを脱イオン蒸
留水1oorttlに溶解すると一21!i″Onmで
0.37の吸光度を示す。この溶液に0..2Mのメル
カゾトエタノール変性剤300μlを加える。溶液の−
を7に上げ、0.0fMのNaOHを滴加してjt℃で
ゆっくりかきまぜながら上記の−に保つ。
0部 抑制剤の添加 B部からの溶液700m1に乾燥粉末インドール抑制剤
a o myを加える。溶液t−jj℃でかきまぜ、0
.0 / M NaOHを/−7,3時間、滴加して−
7に保つと、ついにはすべてのインドールが溶解する。
D部 架橋 2I℃の0部の溶液を0. / MのNaOHを滴加し
ながらそのPHをZ4Ljに上げ、3時間ゆっくりかき
まぜる。ついで、溶液を冷水浴中で0−SCに冷却する
。溶液が通常は約30分でt℃に達すると、g係のグル
タルアルデヒド架橋剤りOOμlを加え、溶液を77時
間ゆっくシ振とうする02部 精製 り部の溶液3 mlを0.00 / M HCI溶離剤
ヲ用イテセファデックス商標G−/3のカラム上でクロ
マトグラフィー分析に付す。インドールと過剰グルタル
アルデヒドの分離を/2×/2部チのカラムを用いて行
なう。蛋白質画分を、20乙nmにおける制御により集
める。
F部 結果 エステラーゼのための基質についての下記の活性増加が
、本発明により調製された半合成エステラーゼの、E部
からの試料から記録されている。
基質 BAEE(U/my) 当初の活性   0.00 最終活性 分析手順70.3 分析手順20.グ 変化%     N/A この結果は、半合成エステラーゼが、天然IJ &ヌク
レアーゼ中に活性が検出されなかったエステラーゼ基質
に関して酵素活性を示すことを示している。このことは
、酵素の7つの属であるヌクレアーゼが酵素の他の一つ
の属であるエステラーゼに変ることを示している。
実施例3 A部 酵素の精製 ウシの膵臓からの、二回結晶化、無塩かつ凍結乾燥した
精製トリプシンをコスッカ及びカー(ンターの手+11
in (V、コスッカ及びF、H,カーベンター、ザ・
ツヤ−ナル・オシ・バイオロゾカル・ケミストリー、2
39、乙、/7り9(/9乙グ))により試験したとこ
ろ、天然キモトリジシン汚染物は検出されない。トリグ
シン基質の特異性についての最初の分析はウォルシー及
びウィルコックスの教示(K、A、ウオルシュ及びP、
E、ウィルコックス、酵素学の方法、G、E、−”−ル
マン及びり、ロランドによる編集、アカデミツク・プレ
ス、3/−1I−/(7970))、によりなされる。
トリプシンを…3.0の0.00 / M HCI中で
調製する。吸光度を、2どOnmで定量し、/係溶液に
ついての吸光度11A3f:用いてmy/mlの濃度を
つくる。
グつの当初の電位可変器−一スタット分析を行ない、天
然トリプシンの各基質についてのU/my活性を定量し
た。使用した基質は下記のものであった: /、  アセチルチロシンエチルエステル(ATEE)
(0,0IM) 、2.  ヘアソイルアルギニンエチルエステル(BA
EEX O,0/ M > 3、アセチルトリプトファンエチルエステル(ATrE
E)(0,0/ M ) ≠ アセチルフェニルアラニンエチルエステル(APE
EX O,0/ M ) B部 酵素の変性 A部の十分な精製トリプシンをPI−131,2,t℃
の0.00IM HCI / 00 mlに溶解すると
1.2 f Onmにおける吸光度/、≠を与える。こ
のトリプシンを30分間放置すると部分変性する。
0部 抑制剤の添加 B部の変性酵素溶液pQmlに(0,001M HCI
中の)/係のインドール溶液2 mlを加え、溶液をコ
時間ゆっくり振とうする。2時間後、トリノトンンーキ
モ) IJグシン抑制剤の錯体を分析して抑制、従って
抑制剤の酵素への束縛を確実にする。
D部 架橋 0部の溶液にg俤のグルタルアルデヒド架橋剤300μ
lを加える。生成溶液をO−S℃、PH3で77時間振
とうする。77時間後、0.0 / M NaOHを加
えて溶液の−をjに上げる。
E部 精製 り部の溶液jmlを0.00 / M HCI XCa
Cl 20.007Mを溶離剤として用いてセファデッ
クス商標G−10rル濾過カラム上でクロマトグラフィ
に付す。
/、2X/インチのカラム及び溶離剤の流速乙Oml/
hr、を用いて、インドールと過剰のグルタルアルデヒ
ドの分離を約7時間で行なう。蛋白質のピークが、2j
4’nmで検出され、集められ、下記のように分析され
る。
結果 キモ) IJプシンのための基質についての下記の活性
増加が、本発明にょシ調製された半合成キモトリプシン
の、E部から6試料から記録されている。
基質 ATEE(U/mJ) BAEE(U/i/)当初の活
性    3.2    32.0最終活性 分析手順/   /、2.I3;    lI−よ7j
変化係     十≠0/    −/4’この結果は
半合成キモトリプシンがキモトリプシン基質(ATEE
)に関して活性増加を、トリジシン基質(BAEE)に
皇して活性減少を示すことを示している。
この実施例は又、本発明方法を用いる時、基質に関して
活性が実質上、増加することを示している。この実施例
は更に、本発明によシ処理する時、ペノチノルーペグチ
ド加水分解酵素の一つの種、即ちトリジシンの活性が、
他の一つのベグチノルーヘノチド加水分解酵素、即ちキ
モトリプシンの基質に関して、増加することを示してい
る。
実施例≠ A部 シグマ・ケミカル・Co、から、/−3%のグロブリン
を含有する結晶性、凍結乾燥蛋白質としての精製形状の
ウシ血清アルブミン4(BSA)を購入した、ロットA
≠37g。
B部 酵素の変性 A部からの精製BSA / 00 m9を脱イオン蒸留
水100’mlに溶解すると1.2了θr1mで0.6
gの吸光度を示す。溶液の−を、0.0jMHC1を滴
加して、2j℃でゆっくりかきまぜながら2時間、PH
3に保つ。
0部 抑制剤の添加 B部からの溶液/ 00 mlに乾燥粉末イ:/ドール
抑制剤1ltOrn9を加える。溶液を2j℃でかきま
ぜ、0.0 / M HCIを/−/、j時間滴下して
P)I3に保ンと、ついにはインドールのすべてが溶解
する。
D部 架橋 、2j℃の0部の溶液を、0./ M NaOHを滴加
17ながらその−を7に上け、3時間、ゆっくりかきま
ぜる。ついで、溶液を冷水浴内でO−S℃に冷却する。
溶液が通常は約30分でt℃に達した時、J’[のグル
タルアルデヒド架橋剤4t00 till t 加え、
溶液を17時間ゆっくり振とつする。
E部 精製 ロマトグラフィーに付す。インドールと過剰グルタルア
ルデヒドの分離を、/、2X/インチのカラムを用いて
行なう。蛋白質画分を、20乙nmで制御して集める。
F部 結果 エステラーゼのだめの基質についての下記の活性増加が
、本発明により調製された半合成エステラーゼの、E部
からの試料から記録されている。
基  質 BAEE(u1m&) 当初の活性    0.00 最終活性 分析子Jlliii/    0.0乙分析手順、2 
  0.022 変化チ      N/A この結果は、半合成エステラーゼが、天然BSA中に活
性が検出されないエステラーゼ基質に関して酵素活性を
示すことを示している。このことは非酵素蛋白質の7つ
の属であるアルブミンが蛋白質の他の1つの属である、
酵素的に活性のあるエステラーゼに転化することを示し
ている。
実施例S A部 ウシの膵臓からの、二回結晶化、無塩、かつ凍結乾燥し
た精製トリプシンを、コスツカ及びカーペンタ−の手順
(v1コスツカ及びF、H,カー波ンター、ザ・ジャー
ナル・オブ・ノクイオロソカル・ケミスト リー、λ3
り、乙、/799(/り乙≠))により試験したところ
、天然キモトリプシン汚染物は検出されない。トリノノ
ン基質の特異性についての当初の分析は、ウォ゛ルシュ
及びウィルコックスの教示(K、A、ウオルシュ及びP
、E、ウィルコックス、酵素学の方法、G、E、 /?
−ルマン及びり、ロランドによる編集、アカデミツク・
プレス、37−≠/(/970))による電位差計PH
スタット法によりなされる。トリプシンをpH3,0の
0.OO/MHCI中で調製する。吸光度を210nm
で定量し、7%溶液についての吸光度/4t、3を用い
て〜/mlの濃度をつくる。
tつの当初の電位可変器PHスタット分析を行なって、
天然トリプシンの各基質についてのU/mg活性を定量
する。使用基質は下記のものであった:乙 アセチルチ
ロシンエチルエステル (ATEE)( 0.0 / M ) ユ ペンソイルアルギニンエチルエステル(BAEE)
( 0.0 / M ) 3、  アセチルトリットファンエチルエステル(AT
rEE)(0.0/M) ≠ アセチルフェニルアラニンエチルエステル(APE
EX o.0 / M ) B部 酵素の変性 A部の十分な精製トリプシンをPHJ、2!;℃の0、
00/ M HCI / 0 0 mlに溶解すると、
2fOnmで0、 5;’ fの吸光度を与える。この
トリプシンを30分間、放置すると部分変性する。
0部 抑制剤の添加 B部の変性酵素溶液41 Q rnlに( 0.0)0
 / M HCI中の)/%のインドール2mlを加え
、溶液を7時間ゆっくり振とうする。
D部 架橋 0部の溶液にトチのグルタルアルデヒド架橋剤700μ
jを加える。生成溶液をO−SC、P)(3で20時間
、振とうする。20時間後、0.0/ M NaOHを
加えて溶液の−を5に上ける。
E部 精製 り部の溶液3 mlを、、 0.00 / M HCI
、C aC 1 20、007Mを溶離剤として用いて
セファデックス商標G−10のグルp過カラム上でクロ
マトグラフィーに付す。インドール及び過剰グルタルア
ルデヒドの分離を、/2×/2/チのカラム及び10m
l/hr.の溶離剤流速を用いて約7時間で行なう。
蛋白質のピークを.2 J” 41 nmで検出し、集
め、下記のように分析する。
F部 結果 キモトリプシンのための基質についての下記の活性増加
が、本発明により調製された半合成キモトリゾシンの、
E部からの試料から記録されている。
基質 当初の活性    3.コ    32.O最終活性 分析手順/    l1lt!;    婦τ変化係 
    +、2乙≠   −gこの結果は、半合成キモ
トリプシンがキモトリプシン基質(ATEE )に関し
て活性増加を、かつトリプシン基質(BAEE)に関し
て活性減少を示すことを示している。
どの実施例は又、本発明方法を用いる時、基質に関して
活性が実質上、増加することを示している。この実施例
は更に、本発明により処理する時、4ゾチノル−被ゾチ
ド加水分解酵素の一つの種、即ちトリプシンの活性が、
他の一つのペプチノルーペフ0チド加水分解酵素、即ち
キモトリプシンの基質に関して、増加することを示して
いる。
実施例乙 A部 酵素の精製 ウシの膵臓からの、二回結晶化、無塩、かつ凍結乾燥し
た精製トリプシンをコスツカ及びカーペンタ−の手順(
V、コスツカ及びF、H,カーペンタ−、ザ・ツヤ−ナ
ル・オプ・バイオロジカル・ケミスト リー、23り、
乙、/7り9(/り乙4’))により試験したところ、
天然・キモトリプシン汚染物は検出されない。トリプシ
ン基質の特異性についての当初の分析を、ウオルシュ及
びウィルコックスの教示(K、A、ウオルシュ及びP、
E、ウィルコックス、酵素学の方法、G、E、 =−ル
マン及びり、ロランドによる編集、アカデミツク・ブレ
ス、3/−11,/(/り70))による電位差計−一
スタット法により行なう。トリプシンをpH3,0の0
.00/MHC1中で調製する。吸光度を2gOnmで
定量し、/ヂ溶液に対する/443の吸光度を用いてm
9/mlの濃度をつくる。
グつの当初の電位可変器−スタット分析を行なって、天
然トリプシンの各基質についてのU 1m9活性を定量
する。使用基質は下記のものであった。
/、 アセチルチロシンエチルエステル(ATEEX 
O,0/ M) ノ、ペンソイルアルギニンエチルエステル(BAEE)
(0,0/ M ) 3、  アセチル) IJ ニア’ )ファンエチルエ
ステル(ATrEE)(0,0/ M ) 久アセチルフェニルアラニンエチルエステル(APEE
)(0,0/ M ) B部 A部の十分な精製トリプシンをpH3,2/℃の0.0
0/ M HCI / 00 mlに溶解すると、2I
!i>Onmで/、3jの吸光度を与える。このトリプ
シンを30分間放置すると部分変性する。
C部 B部の変性酵素溶液/Qmlに水中/チの安息香酸3m
lを加え、溶液を7時間、ゆっくり振とうする。7時間
後、トリシトシン−キモトリプシンの錯体を分析して抑
制、従って抑制剤の酵素への束縛を確実にする。
D部 架橋 C部の溶液にgチのグルタルアルデヒド架橋剤100μ
gを加える。生成溶液をo−s℃、PH3で77時間振
とつする。77時間後、0.0 / M NaOHを添
加して溶液のPHを、夕に上げる。
E部 精製 り部の溶液3 mlを、0−00/ M HCl 1C
aCl 20.00 /Mを溶離剤として用いて、セフ
ァデックス商標G−10のグル濾過カラム上でクロマト
グラフィーに付す。安息香酸及び過剰グルタルアルデヒ
ドの分離を、/2×/2/チのカラム及び乙Qml/h
r。
の溶離剤流速を用いて約7時間で行なう。蛋白質のピー
クを2 !; 4Lnmで検出し、集め、下記のように
分析する。
F部 結果 キモトリノシンのだめの基質についての下記の活性増加
が、本発明により調製された半合成キモトリノシンの、
E部からの試料から記録されている。
基質 ATrEE(U/mAり 当初の活性    /3乙 最終活性 分析手順/   乙、3j 変化係     +3ざ2 この結果は、半合成キモトリジシンがキモトリグンン基
質(ATEE)に関して活性増加を、かつトリシアン基
質(BAEE)に関して活性減少を示すことを示してい
る。
この実施例は又、本発明方法を用いる時、基質に関して
活性が実質上、増加することを示している。この実施例
は更に、本発明により処理する時、ペノチノルーペノチ
ド加水分解酵素の一つの種、即ちトリプンンの活性が、
他の一つのペノチノルーヘソチド加水分解酵素、即ちキ
モトリジシンの基質に関して、増加することを示してい
る。
実施例7 A部 酵素の精製 シグマ・ケミカル・Co、からのタイツIt−Aである
、無塩、プロテアーゼの無い、ウシの膵臓のりボヌクレ
アーゼとしての精製形状のりボヌクレアーゼ酵素を購入
した。
B部 酵素の変性 A部からの精製リゾヌクレアーゼ乙O■を脱イオン蒸留
水100nllに溶解すると、?I Onmで0.11
t//の吸光度を示す。0.0jMHC1を滴加して、
溶液のPHを3に下げ、コタ℃でゆっくりかきまぜなが
ら2時間、その−に保つ。
0部 抑制剤の添加 B部からの溶液ioomt、に乾燥、粉末インドール抑
制剤lI−om9を加える。溶液をjJ−℃でかきまぜ
、0.0 / M HCIを/−/、j時間滴加して−
に保つと、ついにはインドールのすべてが溶解する。
D部 架橋 、2j℃の0部の溶液を、0./ M NaOHを滴加
しながら、その−を7に上げ、3時間ゆっくりかきまぜ
る。ついで、溶液を冷水浴中でO−S℃に冷却する。溶
液が通常は約30分で5℃に達した時、g%のグルタル
アルデヒド架橋剤弘OOμlを加え、溶液を30時間ゆ
っくり振とつする。
E部 精製 り部からの溶液を、約3!;00の分子量カット・オフ
をもつスペクトラポアー(Spectrapore)の
商標の管を用いて、PH7の0.0jMのトリス緩衝液
に対して20時間、O−S℃で透析する。
F部 結果 エステラーゼのだめの基質についての下記の活性増加が
、本発明によシ調製された半合成エステラーゼの、E部
からの試料から記録されている。
分析手順2に記載しである緩衝液は0.0jMHC1で
適当な−に調整されている。
基質 BAEE(U為) 当初の活性    0.00 最終活性 分析手順2P)′Iり、ogり PH1,/j pH7、,2り PH乙 、7り pH3;、グ/ 変化チ      N/A この結果は、半合成エステラーゼが、天然IJ yfヌ
クレアーゼ中に活性が検出されなかったエステラーゼ基
質に関して酵素活性を示すことを示している。このこと
は、酵素の一つの属であるヌクレアーゼが、酵素の他の
一つの属であるエステラーゼに転化することを示してい
る。
実施例ざ A部 酵素の精製 ウシの膵臓からの、二回結晶化、無塩、かつ凍結乾燥し
た精製トリプシンを、コスツカ及びカーインターの手順
(V・コスツカ及ヒF、H,カーベンター、ザ・ジャー
ナル・オブ・パイロノカル・ケミストリー、237、乙
、/79り(/L?乙ll)により試験したところ、天
然キモトリプシン汚染物は検出されない。トリプシン基
質の特異性についての当初の分析を、ウオルシュ及びウ
ィルコックスの教示(K。
A、ウオルシュ及びP、 E、ウィルコックス、酵素学
の方法、G、E、・ぐ−ルマン及びり、ロランドによる
編集、アカデミツク・プレス、3/ −!/ (/り7
0乃による電位差計PH−スタット法により行なう。ト
リプシンをPH3,0の0.001MHCl中で調製す
る。吸光度を210 nmで定量し、7%溶液について
の/4t、3の吸光度を用いてmy/mlの濃度をつく
る。
≠つの当初の電位可変器…スタット分析を行なって天然
トリプシンの各基質についての01m9活性を定量する
。使用基質は下記のものであった:/、  アセチルチ
ロシンエチルエステル(ATEE)(0,07M) λ、 ベンゾイルアルギニンエチルエステル(BAEE
) (0,0/ M ) 3、 アセチルトリプトファンエチルエステル(ATr
 EE) C0,07M) ≠ アセチルフェニルアラニンエチルエステル(APE
E) (0,0/ M ) B部 酵素の変性 A部の十分な精製トリプシンをPI−13,2/℃の0
.00/ M HCI / 00m1に溶解すると、2
10 nmで/、j乙の吸光度を与える。このトリプシ
ンを30分間放置すると部分変性する。
0部 抑制剤の添加 B部の変性酵素溶液≠Q mlに純酢酸フェニル2m1
3を加え、溶液を稀HCIでpi−I3に再調整する。
ついで、溶液を≠θ℃に加熱して、すべての酢酸フェニ
ル抑制剤を溶液中に溶解し、2時間かきまぜる。
■ 架橋 0部の溶液にg%のグルタルアルデヒド架橋剤乙OOμ
tを加える。生成溶液を0−j’c、PH3で、20時
時間表うする。
E部 精製 り部の溶液3 mlを、0.00 / M HCl 1
CaCl 20.00 /Mを溶離剤として用いてセフ
ァデックスの商標のG−10の涙過カラム上でクロマト
グラフィーに付ス。酢酸フェニルと過剰グルタルアルデ
ヒドの分離を、/2×/2/チのカラム及び乙Q me
/h r 。
の溶離剤流速を用いて約7時間で行なう。蛋白t」のピ
ークを、234’ nmで検出し、集め、下記のように
分析する。
F部 結果 キモ) IJデシンのだめの基質についての下記の活性
増加が、本発明に調整された半合成キモトリプシンの、
E部からの試料から記録されている。
基質 当初の活性   3.2    j≠ 最終活性 分析手順/  乙、23    3.2.乙変化チ  
    +/りj      −,22この結果は、半
合成キモトリプシンがキモトリプシン基質(ATEE)
に関して活性増加を、かつトリプシン基質(BAEE)
に関して活性減少を示すことを示している。
この実施例は又、本発明方法を用いる時、基質に関して
活性が実質上、増加することを示している。この実施例
は更に、本発明により処理する時、ベデチノルー被デチ
ド加水分解酵素の一つの種、即ちトリプシンの活性が、
他の一つのペプチジル−ペプチド加水分解酵素、即ちキ
モトリプシンの基質に関して、増加することを示してい
る。
実施例り N部 酵素の精製 バチルス・ズブチリスから単離した、シグマ・ケミカル
・CO・からのタイプII−Aである、≠回結晶化の材
料である精製酵素としての細菌アルファーアミラーゼを
購入した。
精製細菌アルファーアミラーゼ/gを脱イオン蒸留水1
00m1に溶解し、O−S℃で、2/時間、PH7の/
 mM IJン酸塩緩衝液に対して透析する。
ついで、調製物を使用迄、凍結する。
B部 酵素の変性 A部からの凍結/チアルファーアミラーゼ10m1を室
温にもたらし、0.20μmの孔径のフィルターを通し
て濾過する。濃度を定量したところ、貯蔵後、0.67
チである。ついで、このアルファーアミラーゼ溶液乙。
jmlを0.0 / M NaOHで滴定してPHを7
0,7とし、70分間ゆっくりかきまぜる。
抑制剤の添加 B部の溶液をセロビオース抑制剤0.0/7gと混合し
、2/℃で≠j分間わきまぜる。
D部 架橋 、2/℃の6部からの溶液をグルタルアルデヒド架橋剤
10μtと混合し、75分間かきまぜる。ダルタルアル
デヒド添加の際、−は2りに低下し、溶液は無色から黄
色になった。−を0.07MHClを滴加してりに調整
し、更に/5分間かきまぜる。
ついで、PHを0.0/MHClでゆっくり7に調整し
、更に7時間かきまぜる。
E部 精製 り部からの溶液jmlをセフ了デツクス商標Gー10ケ
8ル濾過カラム/.λ夕X 17 7 cm上で、流速
/mVmin−の0,θ/ M, PI(7のトリス緩
衝液を用いて、クロマトグラフィーに付す。蛋白質のピ
ークを20乙1mで検出し、集める。
F部 結果 配糖体加水分解酵素のための基質についての下記の活性
増加が、本発明により調製した半合成配糖体加水分解酵
素の、E部からの試料から記録されている。使用配糖体
加水分解酵素のための基質は下記のものである: ρーニトロフェニルーβ−D−がラクトピラノシド(ρ
NβGA)及び ρー二トロフェニルーαーDー配糖体(ρNαGL)基
質 ρNβGA(U/ml)ρNαGL(U/m/l’)当
初の活性    o.oo     o.o。
最終活性 分析手順3  /.f×10−3/.、!;×10−’
分析手順≠  3×10= この結果は、半合成配糖体加水分解酵素が、自身、配糖
体加水分解酵素の一つの種である、天然細菌アルファー
アミラーゼ中に活性が検出されなかった配糖体加水分解
酵素基質に関して酵素活性を示すことを示している。こ
のことは一つの配糖体加水分解酵素が他の一つの配糖体
加水分解酵素に転化することを示している。
実施例10 A部 酵素の精製 バチルス・ズブチリスから単離された、シグマ・ケミカ
ル・Co.からのタイプII−Aである、≠回結晶化材
料の精製酵素としての細菌アルレフ了−アミラーゼを購
入した。
精製細菌アルファーアミラーゼ/v10011を脱イオ
ン蒸留水/j;mlに溶解し、0−夕℃で2/時間、p
H7の/ mM リン酸塩緩衝液に対して透析する。
B部 酵素の変性 A部からの/チアルファーアミラーゼ溶液10mlを室
温にもたらし、、2o.oooの重力で.20分間、遠
心分離″゛する。濃度を定量し友ところ0,乙tSであ
る。ついで、アルファーアミラーゼ溶液/Qmlを0.
 0 / M NaOHで滴定し、PHio.tにし、
10分間ゆっくりかきまぜる。
6部 抑制剤の添加 B部の溶液をセロビオース抑制剤o、osigと混合し
、25℃で≠夕分間かきまぜる。
D部 架橋 2!℃の、6部からの溶液をグルタルアルデヒド架橋剤
と乙μtと混合する。その後すぐに、PH10,0のN
a C03−Na HCO5の0.1M溶液を、−が7
5分間、10に保たれるまで添加する。炭酸塩溶液的9
.7 mliを添加した。
E部 精製 り部からの溶液/ mlを、セファデックス商標α−1
0グル沖過カラム/、23x4t7cm上で、流速0、
34’ mVminの0.0 / M、 PH7ノ)リ
ス緩衝液を用いてクロマトグラフィーに付す。蛋白質の
ピークを、251A nmで検出し、集める。
F部 配糖体加水分解酵素のだめの基質に関する下記の活性増
加が、本発明により調製した半合成配糖体加水分解酵素
の、E部からの試料から記録されている。使用配糖体加
水分解酵素のだめの基質は下記のものである: ρ−ニトロフェニルーβ−り一配糖体(ρNβGL)及
び ρ−ニトロフェニル、−α−り一配糖体(ρNctGL
)基質 ρNβGL(U/ff19)  ρNαGL(財ζ)当
初の活性   o、oo     o、o。
最終活性 分析手順!;  3./×/θ−’   /、lI−×
10−’この結果、半合成配糖体加水分解酵素が、自身
、配糖体加水分解酵素の一つの種である、天然細菌アル
ファーアミラーゼ中に活性が検、出されなかった配糖体
加水分解酵素基質に関して酵素活性を示すことを示して
いる。このことは一つの配糖体加水分解酵素が他の一つ
の配糖体加水分解酵素に転化することを示している。
実施例// A部 酵素の精製 バチルス・ズブチリスから単離した、シグマ・ケミカル
・Co、からのタイプII−Aである、≠団結晶化材料
の精製酵素としての細菌アルファーアミラーゼを購入し
た。
精製細菌アルファーアミラーゼ/!/100gを脱イオ
ン蒸留水/j;mlに溶解し、O−S℃で、2部時間P
)(7の/’mM’Jン酸塩緩衝液に対して透析する。
B部 酵素の変性 A部からの/チアル)了−アミラーゼ101nlヲ室温
にもたらし、20分間、20.000の重力で遠心分離
する。濃度を定量したところ、0. j 7 %である
。ついで、アルファーアミラーゼ溶液10m1を0.0
 / N NaOHで滴定し−を10.乙にし、70分
間ゆっくりかきまぜる。
抑制剤の添加 B部の溶液をセロビオース抑制剤0.0夕/9と混合し
、2!℃で4tj分間かきまぜる。
D部 架橋 、25uの6部からの溶液をグルタルアルデヒド架橋剤
72μlと混合する。ての後すぐ、pH/ 0.0の、
/ M NaC0−NaHCO3溶液を、−が75分間
10ρに保たれるまで添加する。炭酸塩溶液’l/10
 mlが使用された。
E部 精製 り部からの溶液/ rulをセファデックス商標α−1
0ダル濾過カラム/、m?jX4’7tM上で、0.3
11−mVmi n、の流速の0007M、pH7のト
リス緩衝液を用いてクロマトグラフィーに付lす°。蛋
白質のピークを、2!; II nmで検出し、集める
F部 結果 配糖体加水分解酵素のだめの基質に関する下記の活性増
加が、本発明により調製した半合成配糖体加水分解酵素
の、E部からの試料から記録されている。使用配糖体加
水分解酵素のだめの基質は下記のものである: ρ−二トロフェニルーβ−D−配糖体(ρNβGL)基
質 ρNβGL(U/m9 ) 当初の活性    0.00 最終活性 分析手順j   2.I×70−’ この結果は、半合成配糖体加水分解酵素が、自身、配糖
体加水分解酵素の一つの種である、天然細菌アルファー
アミラーゼ中に活性が検出されなかった配糖体加水分解
酵素基質に関して酵素活性を示すことを示している。こ
のことは一つの配糖体加水分解酵素が他の一つの配糖体
加水分解酵素に転化することを示している。
分析手順 実施/−gで分析した試料は二つの方法の一つにより分
析できる。分析法/は反応する基質からのプロトン放出
を測定する。分析法2は基質の加水分解により誘起され
る電子構造の変化によるス被りトルの変化を測定する。
上記実施例/−gのすべての場合において、いずれの方
法も、模型となることが所望されている活性に関して正
の活性変化測定を生じ、二つの、関係が無い測定法によ
り、以前には活性が全く存在しなかった場合に活性が生
ずることを確認した。
試薬:pj−17,73;のO,/MKCI、0.03
; M CaCl2.0、0 / M トリスの緩衝液 基質:  アルファーN−ベンゾイル−し−アルギニン
エチルエステルHCI(BAEE) 34t3 m9を
緩衝液100m1に溶解する。
手順: サーゼントーウェルチ(Sargent−We
lch)PH−スタットモデルpHRf:用いて、滴定
ビニレットを0. / M NaOHで充たす。基質溶
液3; mlを急速にかきまぜながら、PH−スタット
ビーカーに入れる。滴定装置を調整して、−を7gに上
げる。固定基本線を設定する。酵素溶液、2 mlを加
える。
記録計は、分当りの消費基質のミクロモルの直接の尺度
としての、単位時間当りの消費塩基の容量を記録する。
分析法!の実施例 試薬:  pHf、 QのO,/MKC110、Oj 
M Ca Cl 2.0.3Mトリスの緩衝液 基質:  フルファーN−ベンソイル−し一アルギニン
エチルエステルHC1(BAEE)34t、3rn9を
緩衝液100m1に溶解する。
手順: ベックマンACTA分光計を用いて波長調整器
をスリット幅/、 、23 nmで2 !; 3; n
mにセットする。対照及び試料中のゼロ緩衝液を調整す
る。試料室を空にし、キュベラ)kアセトンで、つぎに
水で洗浄する。・、:l、 3 mlのBAEE基質溶
液及び/針基本線を加える。溶液酵素0.5mlを加え
、BAEEがアルファーN−ベンゾイル−し−アルギニ
ンに加水分解されるにつれての吸光度増加速度を記録す
る。少くとも5分間、吸光度対時間(デルタA/分)を
プロットする。I O+S’ M−” cm−’におけ
、るデルタ吸光係数基質−生成物については、一単位は
2j℃及びPHf、 0における分画シBAEE / 
ミクロモルの加水分解に等しい。
G、W、シュヴエルト及びT、タケナケ、ビオケミ力・
エービオフィノ力(Biochemica et Bi
ophisica)、ACTA、/乙、j70、/9!
;!参照。
分析手順3の実施例 実施例りにおいて分析した試料は下記の手順により分析
できる。
試薬:pHIA乙のクエン酸ナトリウム緩衝液。
0、.2Mの炭酸ナトリウム。
基質:  pop、乙の0. Oj Mクエン酸ナトリ
ウム緩衝液中ノρ−ニトロフェニル−α−D −配糖体
23 mM浴溶液 PHI/l−、乙の0. Oj Mクエン酸ナトリウム
緩衝液中のρ−二トロフェニル〜α−D−ガラクトピラ
ノシド2!rmM溶液。
手順:PI(4t、乙の0.0 !; mMクエン酸ナ
トリウム緩漬液中のどちらもの基質の26 mM浴溶液
700μl試料を同じ緩衝液3jOμgと共に30℃で
5分間、温室する。jつのこのような溶液を調製した。
これらの溶液のうちの3個にjOμlの酵素を、かつ残
りの2個の対照溶液にjOμlのクエン酸塩緩衝液を加
えた後、溶液を30℃で温室する。75分で、酵素含有
の一つの溶液と一つの対照が選ばれる。0.2M炭酸ナ
トリウム7θOμlを加えて反応を停止させる。吸光度
を≠、20nmで測定する。30分で、他の一つの酵素
溶液を分析し、かつ60分で、最後の酵素溶液及び残り
の対照を分析する。
酵素学の方法、2g巻、7.20−27頁、参照。
活性は/、g3×10  M  cm  の吸光係数を
用いて計算される。
J%Bio1. Chem、 、233、///3C/
93g’)参照。
α−アミラーゼ/チ溶液についての210nmにおける
吸光度、2よ2を用いて酵素の存在量を計算する。
実施例りにおいて分析した試料は下記の手順により分析
できる。
試薬: ガラクトース、0.1%溶液。
がラクトース、7.0チ溶液。
ρ−ニトロフェニルーβ−D−ガラクトピラノシド(ρ
NβGL)、/ 、! mM浴溶液ρ−ニトロフェノー
ル、O,SS溶液。
グルコシダーゼ、0.−jチ溶液。
マイクロ−バク(Micro−Pak)商標(ヴアリア
ン・アソシエーツ(Varian Asso−ciat
eg))カラム3QXlILcm。
吸光度検出器を、20乙−にセットする。
2!℃の水溶離削。
流速−2,000pSiにおい′″cQj; ml!/
 m i n 。
手順二 半合成配糖体加水分解酵素とρN/lGLの混
合物を温室′腰ついでカラムに加え゛た。
/g待時間、ガラクトースに対して設定された位置にお
けるピークが記録された。
標準ガラクトース溶液から、ピークの高さと濃度を決定
した。半合成酵素の活性を計算したところ、3×10 
 U/meであった。
実施例10及び//において分析した試料は下記の手順
により分析される。
試薬二 PHvoのクエン酸ナトリウム緩衝液0.0!
;M。
0.2Mの炭酸ナトリウム。
基質: 脱イオン蒸留水に溶解したρ−ニトロフェニル
ーβ−D−1’ルコヒラノシド 23; mM浴溶液 脱イオン蒸留水に溶解したρ−ニトロフェニルーα−D
−1’ルコeう/シト 、2 !; mM浴溶液 手順:pH,5−のクエン酸ナトリウム緩衝液700μ
lのアリコートを5本の管に加える、その内、2本は対
照である。半合成酵素100μgを3本の上記管に加え
、一方、pH3−のクエン酸ナトリウム100μlf、
二つの対照に加える。これらの管を30℃の振とう器中
で70分間、温室する。この70分の期間の後、適当な
基質200μlをすべtの5本の管に加え、30℃の振
とう器中で温室のままにしておく。75分の温室の後、
7本の対照管及び7本の酵素含有管を取出す。対照管中
の溶液を直ちに10.2M炭酸ナトリ、ラム/、≠ml
と混合する。酵素含有管を2分間、遠心分離する。
2分の期間後、管中の液を標線管に注入し、沈殿を棄て
る。ついで、上記溶液 線管に入れ1.2M炭酸ナトリウム緩衝液700μlを
加えて反応を停止させる。
吸光度を≠20 nmで測定する。30分で、7本の酵
素含有管を取出し、約2分間、遠心分離する。ついで、
液を標線管に注入し、溶液500μlをピペットにより
他の一つの標線管に入れる。この管に、 1.2M炭酸ナトリウム溶液700μlを加えて反応を
停止させる。4’J−分で、最後の2本の管(7本は酵
素含有、他は対照を取出し、上記75分の管について述
べた手順を繰返す。
≠)θnmにおける、ρ−ニトロフェノールについての
吸光係数/、3g×IO’M’col−’を用いてU/
m9を計算する。
α−アミラーゼについての吸光度(A’%)も分析の際
の酵素存在量の割算において用いられる。
代理人の氏名  川原1)−穂 手続補正書 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 l事件の表示 特願昭57−36乙g3号 3補正をする者 事件との関係      特許出願人 fl所 4代 理 人 郵便番号    105 6 補正により増加する発明の数 7、補正の対象   明細書の発明の詳細な説明の欄8
補正の内容   別紙の通り 9 添附書類の目録 補正の内容 先に提出せる明細書を次の通り補正する。
(1)第70頁第6行「2は」を「又は」に訂正する。
(2)第2j頁第1行「E部」を「F部」に訂正する。
(3)第57頁下から第2行「実施」を「実施例」に訂
正する。
(4)第2j頁第g行(2ケ所)、第32頁第g行(,
2ケ所)、第39頁第≠行(2ケ所)、第4t3頁第g
行、及び第まO頁第≠行(,2ケ所)に記載のi U、
/ mt JをそれぞれrU’m9−1に訂正する。
以  上

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 (1)蛋白質を部分変性し;かつ 上記部分変性蛋白質をその場で、予め定めた半合成蛋白
    質のための抑制剤の存在下に架橋することを含む、 蛋白質の基質特異性を化学的に変えて予め定めた半合成
    蛋白質をつくる方法。 (2)上記蛋白質の水溶液をつくり、この水溶液を、上
    記蛋白質を部分変性するのに十分な温度にかつ時間の間
    、保持すること、により、上記蛋白質を特徴とする特許
    請求の範囲第(1)項の方法。 (3)上記時間が約75分ないし2≠時間であり、かつ
    上記温度が約2j℃ないし60℃である、特許請求の範
    囲第(2)項の方法。 (4)上記蛋白質を水と混合して水溶0.をつくり、か
    つこの生成溶液を変性剤と混合することにより、上記蛋
    白質を特徴とする特許請求の範囲第(1)項の方法。 (5)上記変性剤が無機酸である、特許請求の範囲第(
    4)項の方法。 (6)上記変性剤が有機酸である、特許請求の範囲第(
    4)項の方法。 (7)上記変性剤が水混和性有機溶剤である、特許請求
    の範囲第(4)項の方法。 (8)上記変性剤が無機塩である、特許請求の範囲第(
    4)項の方法。 (9)模型となる酵素蛋白質を選定し;上記酵素蛋白質
    に模するように改質される第コの蛋白質を選定し; 上記第2の蛋白質を、この第2の蛋白質を部分変性する
    のに十分な時間の間、かつ温度で変性剤と混合し;かつ 上記第2の蛋白質をその場で、上記酵素蛋白質のための
    抑制剤の存在下に架橋することを含む、半合成酵素の製
    法〇 αO上記第2の蛋白質の水溶液を作り、この水溶液を、
    上記蛋白質を部分変性するのに十分な温度で、かつ時間
    の間、保持することにより、上記第2の蛋白質を特徴と
    する特許請求の範囲第(9)項の方法。 (11)  上記時間が約75分ないし2Il一時間で
    1、かつ上記温度が23℃ないし60℃である、特許請
    求の範囲第四項の方法。 0埠 上記第2の蛋白質を水と混合して水溶液を作り、
    この生成溶液を変性剤と混合することにより、上記第2
    の蛋白質を特徴とする特許請求の範囲第(9)項の方法
    。 03  上記変性剤が無機酸である、特許請求の範囲第
    α鎧項の方法。 α◆ 上記変性剤が有機酸である、特許請求の範囲第0
    ■項の方法。 q→ 上記変性剤が水混和性有機溶剤である、特許請求
    の範囲第92項の方法。 0→ 上記変性剤が無機塩である、特許請求の範囲第0
    4項の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US7625192B2 (en) 2007-03-16 2009-12-01 Yamada Manufacturing Co., Ltd. Internal gear pump including a crescent

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