JPS58101730A - Method and apparatus for producing fatty substance small cell - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、懸濁液中の破解すべき脂質構造（薄板）Ｋ音
響容器内で大体において一定の温度で超音波処理を施す
ことより成る均一で単層の所浦脂質小胞を製造するため
の方法％特に薄板状に配置され九脂質を脂質小胞に変え
るための方法に関する。本発明はまた前記方法を実施す
るだめの適当な装置を包含する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention discloses that the lipid structure (thin plate) to be disrupted in a suspension is prepared by ultrasonication at a more or less constant temperature in an acoustic vessel. A method for producing lipid vesicles, in particular a method for converting lipids arranged in lamellae into lipid vesicles. The invention also includes suitable apparatus for carrying out the method.

力旨質小胞は例えば医学的治療及び科学上の目的に対し
て必要になる。細胞間作用部位を有する医薬は細胞膜を
通過できなければならない。Hydroplasmic vesicles are required for example for medical treatment and scientific purposes. Drugs with intercellular sites of action must be able to cross cell membranes.

細胞間物質代謝をコントロールしかつ細胞内で形成され
る幾多の効果物質は、＃胞から出たシ外部から細胞内に
浸透することはできない、従ってこの物質群を治療上で
使用するには、非膜透過性物質を細胞中に移送するが、
同物質が細胞から再び出る仁とを不可能にすることので
きる運搬機作が必要になる。このような運搬機作は更に
、運搬すべき作用物質とは可及的に無関係であり、従っ
てすべての種類の効果物質を運搬することができるが、
他面においては細胞特異性であ）、つまシ特定細胞への
運搬のみを可能にすることが要求される。前記特性を有
する運搬系が脂質小胞であって、該小胞は櫨々の物質。A number of effective substances that control intercellular substance metabolism and are formed within cells cannot penetrate into cells from the outside after exiting the cells. Therefore, in order to use this group of substances therapeutically, transport non-membrane permeable substances into cells,
A transport mechanism is needed that makes it impossible for the substance to re-exit from the cell. Such a delivery mechanism is, moreover, as independent as possible from the active substance to be delivered and can therefore carry effect substances of all kinds;
On the other hand, it is required to be cell-specific (cell-specific) and to enable delivery only to specific cells. The transport system having the above characteristics is a lipid vesicle, and the vesicle is a solid substance.

例えば謬素、医薬、キレート形成物質、ホルモン、細胞
効果物質、抗原、抗体、インターフェロン誘導物質及び
遺伝子を封入することができる。脂質小胞においては、
溶剤及び溶剤中に溶けた物質が燐脂質の二重層膜によっ
て包囲されている。仁の脂質膜は４ｎｍの厚さを有し、
小胞は２５〜１２０ｎｍの直径を有する。小胞の大きさ
は、レーザー光散乱、超遠心分離、ゲルＦ遇によって又
は走査電子顕微−によって測゛定することができる。For example, substances, drugs, chelating substances, hormones, cell effect substances, antigens, antibodies, interferon inducers, and genes can be encapsulated. In lipid vesicles,
The solvent and the substances dissolved in the solvent are surrounded by a bilayer membrane of phospholipids. The lipid membrane of the kernel has a thickness of 4 nm,
Vesicles have a diameter of 25-120 nm. Vesicle size can be measured by laser light scattering, ultracentrifugation, gel fluorination, or by scanning electron microscopy.

脂質小胞の重要な用途は、ヘモグロビンの酸素親和性を
低下させるためにＹ、０．ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）
及びに、ゲルゾンデ（Ｇｅｒｓｏｎｄｅ）Ｋよって記載
された方法（米国特許第４１９２８６９号明細書）によ
り赤血球中にイノジットヘキサホスフェート（ＩＨＰ）
を輸入する場合である。すなわち１例えば保存血液の貯
蔵の際に赤血球中のヘモグロビンの酸素親和性は不断に
増大することは知られている。同様に％定の疾病の際に
もヘモグロビンの酸素親和性の増大が観察される。An important use of lipid vesicles is to reduce the oxygen affinity of hemoglobin with Y, 0. Nicolau
and inodite hexaphosphate (IHP) in red blood cells by the method described by Gersonde K. (U.S. Pat. No. 4,192,869).
This is the case when importing. For example, it is known that during storage of preserved blood, the oxygen affinity of hemoglobin in red blood cells increases constantly. Similarly, an increase in the oxygen affinity of hemoglobin is observed in certain diseases.

このような＃１素親和性の増大により、ヘモグロビンに
結合されて血液中を循環する酸素のうちの少量しか実際
には組織に供給されないという結果になる。ヘモグロビ
ンのこのような高ｈｍ索親和性は、ヘモグロビンに特定
の効果物質の結合することによって低下されうる。最も
強力なこの種の効果物質がイノジットへキサホスフェ〜
）（ＩＨＰ）なのである、ＩＨＰの細胞内輸入は、完全
細胞をＩＨＰの負荷された脂質小胞と一緒に保温すると
、細胞及び該小胞の脂質膜の融合によってＩＨＰが細胞
内に移動されてそこでＩＨＰの効果、つまりヘモグロビ
ンの酸素親和性の変化（ヘモグロビンの酸素分離曲線の
１右方移動〃として測定できる）が達成されることによ
って実施される。このＩＨＰ負荷赤血球を循環に戻すと
赤血球中に貯えられた著しく多量の酸素量が末梢で供給
される。変性赤血球のこの特性は細胞の生存期間中保存
されている。This increase in #1 element affinity results in that only a small amount of the oxygen that circulates in the blood bound to hemoglobin is actually delivered to the tissues. Such high hm cord affinity of hemoglobin can be reduced by binding of specific effect substances to hemoglobin. The most powerful effect substance of this kind is Inojit Hexaphosphe~
) (IHP), and intracellular import of IHP occurs when intact cells are incubated together with IHP-loaded lipid vesicles, and IHP is transferred into the cells by fusion of the lipid membranes of the cells and the vesicles. The effect of IHP is then achieved by achieving a change in the hemoglobin's oxygen affinity (which can be measured as a one-point rightward shift in the hemoglobin's oxygen separation curve). When the IHP-loaded red blood cells are returned to the circulation, a significantly greater amount of oxygen stored in the red blood cells is delivered peripherally. This property of degenerated red blood cells is conserved throughout the life of the cell.

イノジットへキサホスフェートを赤血球中に輸入するた
めには、２０〜５０ｎｍの直径を有する単層のＩ）ＩＰ
負負荷脂質小戻必要になる。脂質懸濁液を超音波場で破
解することによって脂質小胞を製造することは公知であ
る。脂質小胞の治療適用に関する進歩は従来は・１めて
徐々にしか行なわれていない、それというのも赤血球と
の融合にとって適当な脂質小胞を十分な量で製造するこ
とは著しい困−を伴っているからでおる。つま）この目
的に叶った脂質小胞は多量に製造されうるばか）でなく
、均一な大きさで再生産でき、ひいては治療適用上横置
可能でなければならないからである。脂質小胞の適当な
爾 両分を分離するために分離法をｌｉ稜に適用することは
、捕々の問題５例えば無菌状態の維持及び約１日という
半生存時間しか有しない小胞の４生物学的有効性を著し
く減するコスト高で時間のかかる分離法の適用の問題を
生せしめる。多値の脂質小胞を短時間で製造することを
許す唯一の方法は超音波破解である。また科学的研究又
は治！Ｉｌ法の効果及び再現性、つまシ赤血球中へのＩ
ＨＰの移動は該小胞の脂質膜の種類及び４成に依存し、
著しくは脂質小胞の大きさに依存している。脂質懸濁液
の破解の際に十分な均質性、ひいては十分な品質及び十
分な量の脂質小胞が形成されたかどうかの管理は、製造
された脂質小胞を用いて赤血球中への所望のＩＨＰ移動
試験を実施することによって行なわれる。In order to import Inosit hexaphosphate into red blood cells, a monolayer of I) IP with a diameter of 20-50 nm is required.
Negative loading requires a small return of lipids. It is known to produce lipid vesicles by disrupting lipid suspensions in an ultrasound field. Advances in the therapeutic application of lipid vesicles have hitherto only been made gradually, as it is extremely difficult to produce sufficient quantities of lipid vesicles suitable for fusion with red blood cells. It's because I'm with you. This is because lipid vesicles suitable for this purpose cannot be manufactured in large quantities, but must be able to be reproduced to a uniform size and, therefore, be horizontal for therapeutic applications. The application of isolation methods to the Li ridge to separate the appropriate fractions of lipid vesicles presents considerable problems, such as maintaining sterility and the problem of vesicles having a half-lifetime of only about 1 day. This gives rise to the problem of applying costly and time-consuming separation methods that significantly reduce biological efficacy. The only method that allows the production of multivalued lipid vesicles in a short time is sonication. Also scientific research or cure! Effect and reproducibility of the Il method, I
The movement of HP depends on the type and composition of the lipid membrane of the vesicle,
It is significantly dependent on the size of the lipid vesicles. Controlling whether sufficient homogeneity and therefore sufficient quality and sufficient quantity of lipid vesicles are formed during the disruption of a lipid suspension is important in ensuring that the produced lipid vesicles are used to deliver the desired amount into red blood cells. This is done by performing an IHP transfer test.

同試験により細胞間ＩＭＦが検出され、完全細胞のヘモ
グロビンの酸素分離曲線が測定され又はＩ　ＨＰ負荷赤
血球の所望の生物学的又は治療的効果が動物実験で証明
される。従って試験結果、すなわち治療効果は高価な実
験後に初めて判断され、超音波処理の効果、つまり赤血
球との融合にとって有能な小胞の製造は後になって初め
て＆ｉ鐵されうる。The test detects intercellular IMF, determines the oxygen separation curve of whole-cell hemoglobin, or proves the desired biological or therapeutic effect of I HP-loaded red blood cells in animal experiments. Test results, ie therapeutic efficacy, can therefore only be judged after expensive experiments, and the effects of sonication, ie the production of vesicles competent for fusion with red blood cells, can only be determined later.

特に、例えば治療法にとって必要な大きな容積の一定の
特性を有する脂質小胞を公知の超音波法で製造すること
は困難であることが判った。In particular, it has proven difficult to produce lipid vesicles with certain properties of large volume, which are necessary for example for therapeutic methods, with known ultrasound methods.

従来は、超音波場で脂質懸濁液を破解する際に見かけは
完全に同一の条件を保っても、所謂単層の、従って融合
性を有する脂質小胞を同一収率で得ることはうまくいか
なかった。Conventionally, it has been difficult to obtain so-called monolayered, and therefore confluent, lipid vesicles with the same yield even if the apparently completely identical conditions are maintained when disrupting a lipid suspension in an ultrasonic field. I did not go.

本発明の基砿には、効果物質を有効に細胞内に移動する
脂質小胞を製造するための冒頭記載の方法を、方法の効
率が高められかつその都度所望される目的にとって極め
て有効な脂質小胞が筒状率で再生産可能に得られるよう
に再開発するという味題がるる。The basis of the invention is that the method described at the outset for the production of lipid vesicles which efficiently transfers effect substances into cells can be carried out using lipids which increase the efficiency of the method and which are highly effective for the desired purpose in each case. The challenge is to redevelop the vesicles so that they can be reproducibly obtained in a cylindrical manner.

本発明の本質は、所望の目的にとって極めて有効な小胞
大きさ又は小胞大きさ分布ならびにこの小胞大きさ又は
小胞大きさ分布を得るのに峻適な超音波周波数及び強度
を確定しかつこのように確定された最適な超音波周波数
及び強度を、その他の点では同一の処理条件で、超音波
処理の間に反応媒体中の超音波場の周波数及び強度の実
際値を連続的に測定し、この実際値に依存して超音波発
生装置に給電する発電機の出力及び周波数を制御するこ
とによって一定に保つことである。The essence of the invention is to determine a vesicle size or vesicle size distribution that is highly effective for the desired purpose, as well as an ultrasonic frequency and intensity that is steep to obtain this vesicle size or vesicle size distribution. and the optimum ultrasonic frequency and intensity thus determined are determined by continuously changing the actual values of the frequency and intensity of the ultrasonic field in the reaction medium during the ultrasonic treatment under otherwise identical processing conditions. The purpose is to measure and keep constant by controlling the output and frequency of the generator feeding the ultrasound generator depending on this actual value.

超音波発生装置に給電する発電機の制御は。Control of the generator that supplies power to the ultrasonic generator.

目標櫃−実際値を含む自動制御閉ループを用いて行なう
。This is done using an automatic control closed loop that includes target and actual values.

超音波場の強直及び周波数を測定するためＫは反応液中
に浸入している圧電気音響ピックアップを使用する。圧
電気音響ピックアップは反応容器の底部に、前記ピック
アップの最高感度の方向が超音波発生装置に向いている
ように配置されており、他方超音波発生装置は媒体の上
部三方の−に浸入しているのが有利である。To measure the tonicity and frequency of the ultrasonic field, K uses a piezoelectric acoustic pickup immersed in the reaction liquid. A piezoelectric acoustic pickup is placed at the bottom of the reaction vessel such that the direction of maximum sensitivity of said pickup faces the ultrasonic generator, while the ultrasonic generator penetrates the top three sides of the medium. It is advantageous to have one.

本発明の基嫌には、該小側を治療用に使用す小胞の有効
性にとって決定的に重要でありかつ超音波場で製造され
た小胞の大きさ及び均質性は、脂質に作用する超音波場
の恒常性及び強度に依存するという認識がある。従来は
音源に投入された音場エネルギーを測定して一定に保つ
のがふつうであるけれど４．本発明は、反応媒体内で有
効音場エネルギーを＃１定して目標に合せて変え、しか
も有効音場エネルギーが反応媒体そのものにおいてその
最適値で一定に保たれるようＫすることを提案するので
ある。反応媒体自体の有効音場エネルギーを測定し、こ
の実際値を投入される音場エネルギーの調節のために使
用することによって、小胞の形成位置における有効音場
強度及び音場周波数に影響を与えるすべての作用、例え
ば反応の進行と共に変化する棟々の音場エネルギーの吸
収、超音波処理の間の気泡発売時に反応媒体内で変化す
る幾何学的諸関係ならびに音源から放射される音波が重
畳し、場合によっては移相された重畳の際には音場エネ
ルギーの消聾を生じる音波の周波数帯の反射が補償され
る。The basis of the present invention is that the size and homogeneity of the vesicles produced in the ultrasound field are critical to the effectiveness of the vesicles used therapeutically and that the size and homogeneity of the vesicles produced in the ultrasound field are There is a recognition that it depends on the homeostasis and strength of the ultrasound field. Conventionally, it is common practice to measure the sound field energy input to the sound source and keep it constant.4. The present invention proposes to keep the effective sound field energy #1 constant in the reaction medium and vary it according to the target, while K such that the effective sound field energy is kept constant at its optimum value in the reaction medium itself. It is. By measuring the effective sound field energy of the reaction medium itself and using this actual value for adjusting the input sound field energy, the effective sound field strength and sound field frequency at the location of vesicle formation are influenced. All the effects, such as the absorption of sound field energy by the wings that change as the reaction progresses, the geometric relations that change within the reaction medium during the release of bubbles during sonication, and the superposition of the sound waves emitted from the sound source. , the reflections of the frequency range of the sound waves, which in the case of phase-shifted superimposition would result in a deafening of the sound field energy, are compensated.

従って本発明方法により先づ公知の試験法によってその
都度の目的にとって最適な小胞直径又は最も有効な小胞
直径の最適分布曲線を確定し１次に他の一連の実験で、
所望の分布曲線の得られる最適音場条件１例えば周波数
及び音圧ｆ：確定し、次いでこのように確定された最適
超音波場強度及び周波数を反応媒体内で反応時間中一定
に抹つ場合には、その都度の目的にとって億めて有効な
１１１質小鉋の極めて高い収率が得られる。Therefore, according to the method of the invention, the optimal vesicle diameter or the most effective distribution curve of vesicle diameters for the particular purpose is first determined by known test methods, and then in a series of other experiments.
Optimum sound field conditions 1 for obtaining the desired distribution curve, e.g. frequency and sound pressure f: are determined, and then the optimal ultrasonic field strength and frequency thus determined are kept constant in the reaction medium during the reaction time. This results in extremely high yields of 111 quality small planes that are extremely effective for the respective purpose.

本発明による方法は、脂質小胞の製造のみならず、また
例えば膜酵素の機能及び構造の研究の場合には天然の生
物学的膜を処理して小胞に変成するためにも同一効果を
もって適用することができる。つまりこのためにも膜酵
素を特定の大きさの小胞に再現可能に変えることが必要
だからであり、これは公知方法によって十分圧安全には
なし得ない。The method according to the invention has the same effect not only for producing lipid vesicles, but also for treating natural biological membranes to convert them into vesicles, for example in the case of studying the function and structure of membrane enzymes. Can be applied. This also requires a reproducible conversion of membrane enzymes into vesicles of a specific size, which cannot be accomplished sufficiently pressure-safely by known methods.

次に本発明による方法の詳細ならびに利点を。Next, details and advantages of the method according to the invention will be described.

図面及び実施例により詳述する。This will be explained in detail with reference to drawings and examples.

適当な分散剤中の脂質懸濁液の形の反応媒体１は、二重
壁ガラス反応容器３０円筒状内管中に存在する。反応容
器３の底部は反応室３に通じＬ入口を有し、同人口には
音響ピックアップ５が差込まれている。音響ピックアッ
プ５は前記入口を包囲する壁７を有するエポキシ樹脂層
６によって付着されて密閉されている。超音波発生装置
８は上方から反応媒体１中に浸漬されている。超音波発
生器８０反応容器３から上部に突出している部分９は電
流接続のための結合部９を備えている。The reaction medium 1 in the form of a lipid suspension in a suitable dispersant is present in a double-walled glass reaction vessel 30 cylindrical inner tube. The bottom of the reaction vessel 3 communicates with the reaction chamber 3 and has an L inlet, into which an acoustic pickup 5 is inserted. The acoustic pickup 5 is adhered and sealed by an epoxy resin layer 6 with a wall 7 surrounding said inlet. The ultrasonic generator 8 is immersed into the reaction medium 1 from above. The part 9 of the ultrasonic generator 80 projecting upward from the reaction vessel 3 is provided with a connection 9 for electrical current connection.

反応容器の二重壁によって、冷却体の貫流されている中
空室ｌＯが形成されている。接続管１１及び１２は冷却
水の送入及び排出のために用いられる。接続管１３は反
応媒体１の上部の反応室に通じていて、アルノンの様な
不活性ガス゛の供給のために周込られている０反応室１
は上方で蓋１４によって閉鎖されている。蓋１４と超音
波発生装置及び容器壁との間に残存している隙間から低
超過圧下に存在する不活気ガスが逃出しう′る。The double wall of the reaction vessel forms a cavity lO through which the cooling body flows. Connecting pipes 11 and 12 are used for supplying and discharging cooling water. The connecting pipe 13 leads to the reaction chamber above the reaction medium 1, which is enclosed for the supply of an inert gas such as arunone.
is closed at the top by a lid 14. Inert gases present under low overpressure can escape through the gaps remaining between the lid 14, the ultrasound generator and the container wall.

音響ピックアップ５は１反応媒体ｌと接触しているその
上端部に実際の音圧及び音場強度の検出器としてピエゾ
板１８を有しており、同ピエゾ板は図示の場合には保持
管に半径方向に装置されていて、この保持管に例えばエ
ポキシ樹脂で付着されかつ密閉されている。ピエゾ板１
８から送出される電気信号は１反応媒体中の有効廿場周
波数及び有効音場強度の尺度である。この電気信号は画
ｔＩＩａ閉ループの実際値であって、伝送−２０を介し
て調節増幅器２１に送られる。The acoustic pickup 5 has a piezo plate 18 as a detector for the actual sound pressure and sound field intensity at its upper end in contact with the reaction medium 1, and in the case shown, the piezo plate 18 is attached to the holding tube. It is arranged radially and is attached to this holding tube, for example with epoxy resin, and hermetically sealed. Piezo board 1
The electrical signal emitted from 8 is a measure of the effective field frequency and field strength in the reaction medium. This electrical signal is the actual value of the closed-loop image tIIa and is sent to the conditioning amplifier 21 via transmission -20.

場合によってはオシ關グラフ２２で有効周波数及び音場
強度を視覚的に追跡し、必要ならば高周波発電機２３の
周波数及び出力の再調整を手動で実施しうる。Optionally, the effective frequency and sound field strength can be tracked visually on the oscillator graph 22 and, if necessary, readjustment of the frequency and power of the high frequency generator 23 can be carried out manually.

超音波の強度の目標値は、目標値調整装置２４を介して
調整増幅器２１に対して設定されており、超音波周波数
の目標値は目標値Ｗｓ整装置２５を介して設定されてい
る。反応媒体中の超音波場の周波数及び強度の設定目標
値からの偏差のある時には伝送線２６を介して高周波発
電機２３が調整され、その周波数及び／又は出力は反応
媒体１内で測定された有効値が設定目標値と合致するま
で変化される。高周波発電機２３から伝送線２８を介し
て超音波発生装置８に必要電圧が供給される。A target value for the ultrasound intensity is set for the adjustment amplifier 21 via a target value adjustment device 24, and a target value for the ultrasound frequency is set for the adjustment amplifier 21 via a target value Ws adjustment device 25. In the event of a deviation of the frequency and intensity of the ultrasonic field in the reaction medium from the set target value, a high-frequency generator 23 is regulated via a transmission line 26, the frequency and/or the power of which was measured in the reaction medium 1. The effective value is changed until it matches the set target value. The necessary voltage is supplied from the high frequency generator 23 to the ultrasonic generator 8 via the transmission line 28 .

第２図に図示した装置は脂質小胞をより多量に製造する
ために過当である０反応容器は上方の開いた円筒状長方
形で、耐食性０ｒ−Ｎｉ鋼より成る槽３０でめる６反応
容器中の液体３１の冷却は、１Ｎ１３０内に存在する液
体中に入れられている冷却巻管装置３２に行なわれる。The apparatus illustrated in FIG. 2 is suitable for producing larger quantities of lipid vesicles.The six reaction vessels are cylindrical and rectangular with an open top and are housed in a vessel 30 made of corrosion-resistant 0R-Ni steel. Cooling of the liquid 31 inside takes place in a cooling tube arrangement 32 which is contained in the liquid present in the 1N 130.

槽３ｏの底部下の外側には８個の電気音響変換器３３が
配置されていて、その発振装置３４は憎３ｏの底部に連
結されている。このようにして音響エネルギーは槽３０
の液体３１に伝達される。この液体３１中に上方から音
響ピックアップ３５が浸入している０反応媒体そのもの
は閉鎖無菌−袋３６中に存在しており、同衾は液体３１
内で冷却巻管装置３２によって槽底部上にわずかに保持
されている。音響ピックアップ３５は、そのヘッド、つ
まりピエゾ板３７が無菌袋３６に向かって押され、それ
Ｋよって反応媒体中の超廿波場を読取るところまで下げ
られみ。Eight electroacoustic transducers 33 are arranged outside under the bottom of the tank 3o, and their oscillators 34 are connected to the bottom of the tank 3o. In this way, the acoustic energy is transferred to the tank 30.
is transmitted to the liquid 31 of. The reaction medium itself, into which the acoustic pickup 35 penetrates from above, is present in a closed, sterile bag 36;
It is held slightly above the tank bottom by a cooling tube arrangement 32 within the tank. The acoustic pickup 35 is lowered to the point where its head, ie the piezo plate 37, is pushed towards the sterile bag 36 and thereby reads the ultrasonic field in the reaction medium.

ピエゾ板３７から送出される信号は伝送ＩＩＭ３８を介
して調節槽−４３９を制御し、同増幅器に制御操作のた
めの実際値を供給する。超音波の周波数及び強度の目標
値は、目標値設定装置４０及び４１によって設定される
。設定目標値から実嘩値がずれると、伝送縁４２を介し
て制御可能な発電慎４３が制御され、伝送［４４を介し
て電磁変換器３“３に送出された同発電機の出力及び／
又は周波数が目標値と実際値とが合致するまで変えられ
る。ピエゾ板３７によって測定された超音波場の周波数
及びｉ＋＝はオシログラフ４５で視覚的に観察され得る
ので、場合によってはまた手動投入制御も可能である。The signal emitted by the piezo plate 37 controls the regulating tank 439 via the transmission IIM 38 and supplies the same amplifier with actual values for control operations. Target values for the frequency and intensity of the ultrasound waves are set by target value setting devices 40 and 41. If the actual value deviates from the set target value, the controllable generator generator 43 is controlled via the transmission link 42, and the output and/or output of the generator is sent via the transmission link 44 to the electromagnetic converter 3.
Or the frequency is varied until the target value and actual value match. Since the frequency of the ultrasound field and i+= measured by the piezo plate 37 can be visually observed on the oscilloscope 45, manual input control is also possible if appropriate.

前記装置を用いて例えば以下の反応を実施する。For example, the following reactions are carried out using the above apparatus.

例　　１ 治療目的のため、それも赤血球の酸素遊離特性の改善の
ために融合によってＩＨＰを赤血球中に移動するための
ＩＨＰ負荷脂質小胞を製造することが要求される。脂質
小胞の一般的製造方法は米国特許第４１９２８６９号明
細書に記載されており、その限）において同明細書が参
照される。該脂質小胞は、モリ比８；２ニアのホスファ
チジルコリン、ホスファチジルセリン及びコレステロー
ルより構成されている０次に仁れらの脂質をクロロホル
ム９５部とメタノール５部とより成る有機溶剤中で溶か
して同脂質の均質溶液及び混合物を得る０次に浴剤を摂
氏２０度で回転蒸発器で除去する。その際丸底フラスコ
中に残留する脂質膜を、生物学的活性物質（この場合Ｉ
ＨＰ）を含有する水性溶液を用いて取）、かきまぜると
、今度はこの懸濁液中に脂質の均一薄板が形成される。Example 1 For therapeutic purposes, it is required to produce IHP-loaded lipid vesicles to transfer IHP into red blood cells by fusion, also to improve the oxygen-releasing properties of red blood cells. A general method for producing lipid vesicles is described in US Pat. No. 4,192,869, to which reference is made herein. The lipid vesicles were prepared by dissolving zero-order lipids composed of phosphatidylcholine, phosphatidylserine, and cholesterol with a mole ratio of 8:2 in an organic solvent consisting of 95 parts of chloroform and 5 parts of methanol. The bath agent is then removed in a rotary evaporator at 20 degrees Celsius to obtain a homogeneous solution and mixture of lipids. The lipid film remaining in the round-bottomed flask is then removed from the biologically active substance (in this case I
When an aqueous solution containing HP) is taken and stirred, a homogeneous lamella of lipids is in turn formed in this suspension.

同懸濁液は約１７〜２００μｙ／ｌの濃度の脂質を含有
する。The suspension contains lipids at a concentration of approximately 17-200 μy/l.

また懸濁液はＩＨＰで飽和してお、９ｓｐＨ７，０〜８
．０で緩衝されている。The suspension was saturated with IHP and had a pH of 7.0 to 8.
．． Buffered with 0.

一連の先行実験で、赤血球との融合及び赤血球中へのＩ
ＨＰの輸入のためＫは、前記組成を有しかつ２５０〜５
００Ａの直径を有する小胞が適していることが確認され
た。効果は、その都度の製剤中のこの小胞の形成分量が
多ければ多い程それだけ大きい。その次には他の一連の
実験で、脂質が摂氏３７度のほぼ一定の温度で、３〜６
　Ｗ、に−の有効音場エネルギーを有す不狭帯域音場周
波数をもって音Ｉ＃曝射される場合には前記の所望の直
径分布の得られることが確められた。In a series of preliminary experiments, fusion with red blood cells and I
For the import of HP, K has the above composition and 250-5
Vesicles with a diameter of 00A were found to be suitable. The effect is greater the greater the amount of these vesicles formed in the respective formulation. This was followed by another series of experiments in which lipids were heated at a nearly constant temperature of 37 degrees Celsius, and
It has been confirmed that the desired diameter distribution described above can be obtained when the sound I# is emitted with a non-narrow band sound field frequency having an effective sound field energy of -W.

前記Ｂ’ＦＩ質懸濁液を不活性ガス導入下に反応容器３
中に注入する。反応容器を管１３１Ｃよってアルノンで
掃気する０次に目標値調整装置２４及び２５で最適音場
強度及び所望の音場周波数を設定する。前記調整装置は
、最適音場強度が全処理時間の間反応液に入って十分に
作用する。The B'FI suspension was introduced into the reaction vessel 3 while introducing an inert gas.
Inject inside. The optimum sound field strength and desired sound field frequency are set by the zero-order target value adjustment devices 24 and 25, which scavenge the reaction vessel with alnon through the pipe 131C. The adjustment device is fully functional so that the optimum sound field strength enters the reaction solution during the entire treatment time.

Ｍ幼音場強度として保たれるように配慮する。Care should be taken to maintain the M infant sound field strength.

処理は３０〜６０分持続する。全処理時間の間は反応容
器中に発生する熱は冷却水によって放出されて温度は一
定に保たれる。Treatment lasts 30-60 minutes. During the entire treatment time, the heat generated in the reaction vessel is dissipated by cooling water and the temperature is kept constant.

さてこのようにして得られた小胞懸濁液は赤血球と一緒
に摂氏３７度で１時間保温する。次に赤血球を等張緩漬
液ｐＨ７，４で洗浄し、変性完全細胞のヘモグロビンの
酸素分離曲線を測定する。ＩＨＰの輸入効果はヘモグロ
ビンの酸素分離曲線の亀右方移動ｌとして認められる。The vesicle suspension thus obtained is then incubated together with red blood cells at 37 degrees Celsius for 1 hour. Next, the red blood cells are washed with an isotonic soaking solution pH 7.4, and the hemoglobin oxygen separation curve of the denatured complete cells is measured. The import effect of IHP is recognized as a rightward shift of the hemoglobin oxygen separation curve.

ヘモグロビンにＩＨＰの結合することによって得られる
最高中飽和圧は摂氏３７度及びｐＨ７，４で９５ｗＨｆ
である。The maximum medium saturation pressure obtained by binding IHP to hemoglobin is 95 wHf at 37 degrees Celsius and pH 7.4.
It is.

制御超音波法の効果は就中、最大ＩＨＰ輸入効果が、有
効なＩＨＰ輸入のために従来用いられた非制御超音波法
の場合に使用されねばならなかった値のわずか１０％で
あるＲＢＯ（赤血球＝　ｆＬｏｔｅ−Ｂｌｕｔｚｅｌｌ
ｅｎ）　：小胞の容積比又は脂質濃度をもって達成され
る点にある。この結果。The effectiveness of the controlled ultrasound method is inter alia that the RBO ( Red blood cell = fLote-Blutzell
en): the point achieved with the vesicle volume ratio or lipid concentration. As a result.

脂質が高価で再使用され得ない故に著しい経済的利点が
生じる。また従来用いられた方法では。Significant economic advantages arise because lipids are expensive and cannot be reused. Also, with the conventionally used methods.

治療上の安全な配置に関する絶対的前提である）再現可
能な成績を得ることはできない。(an absolute prerequisite for safe therapeutic placement) cannot yield reproducible results.

例　　２ 治療目的のための脂質小胞の場合には絶対的な無菌状態
の要求がある。完成した小胞懸濁液の殺菌は最大の困難
に遭遇するので１次の方法を適用する。先づ例１に相当
する出発成分を殺菌し、無菌予防処置の下にポリエチレ
ン又は肉厚約０．５■の軟質ＰＶＯフィルムより成る同
様に殺菌した袋に入れる。この袋を無菌的に密閉し１次
に第２図による超音波容器中で超音波作用に曝露するが
、この際容器壁と袋との間の空間には水が満しである。Example 2 In the case of lipid vesicles for therapeutic purposes there is a requirement for absolute sterility. Sterilization of the finished vesicle suspension encounters the greatest difficulties and therefore the first order method is applied. The starting components corresponding to Example 1 are first sterilized and placed under sterile precautions into likewise sterile bags made of polyethylene or flexible PVO film with a wall thickness of about 0.5 .mu.m. The bag is aseptically sealed and first exposed to ultrasonic action in an ultrasound container according to FIG. 2, the space between the container wall and the bag being filled with water.

この場合には音場強度の測定は袋の外側で行なわれる。In this case, the measurement of the sound field strength is carried out outside the bag.

発振装置に供給される出力を約１．６５倍高めると、そ
のほかは例１で記載した条件と同一の条件下で同結果が
侍られる。所定の実験装置で測定によシ実験的に得られ
た前記倍率は袋を入れることｋよって生じる出力損失を
表わす。The same result is obtained by increasing the power supplied to the oscillator by a factor of about 1.65 under otherwise identical conditions to those described in Example 1. Said multiplier, obtained experimentally by measurements in a given experimental apparatus, represents the power loss caused by bagging.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図は少鎗の脂質小胞懸濁液の製造に適した本発明の
特徴を有する装置の略示図面であり。 第２図は、臨床用の脂質小胞懸濁液を無菌袋でリットル
量で製造するのに適した装置の略示断面図である。 １・・・反応媒体、３・・・反応容器、８・・・超音波
発生装置、１０・・・冷却水、１３・・・接続管、１４
・・・蓋、１８・・・ピエゾ板、２１・・・調節増幅器
、２３・・・高周波発電機、３０・・・檜、３２・・・
冷却巻管装置、３３・・・電気音響変換器、３４・・・
発振装置。FIG. 1 is a schematic drawing of an apparatus having features of the invention suitable for the production of small scale lipid vesicle suspensions. FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of an apparatus suitable for producing clinical lipid vesicle suspensions in liter quantities in sterile bags. DESCRIPTION OF SYMBOLS 1... Reaction medium, 3... Reaction container, 8... Ultrasonic generator, 10... Cooling water, 13... Connecting pipe, 14
... Lid, 18... Piezo plate, 21... Adjustment amplifier, 23... High frequency generator, 30... Cypress, 32...
Cooling tube device, 33... Electroacoustic transducer, 34...
Oscillation device.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、　破壊すべき脂質懸濁液又は脂質粒子に処理容器内
の分散液中で大体において一定の温度で超音波処理を施
すことより成る。生物学的懸 膜又は脂質懸濁液から脂質小胞を製造するための方法に
おいて、所望の目的にとって有効な小胞大きさ又は小胞
大きさ分布ならびにこの小胞大きさ又は小胞大きさ分布
を得るのに最適な分散液中の超音波周波数及び強度を確
定し、このように確定した最適超音波周波数及び強度を
その他の点では同一の処理条件で。 超音波処理の間反も媒体中の超音波場の周波数及び強度
の実際値を連続的に測定しかつこの実際値に依存して超
音波発生装置に給電する発電機の出力及び周波数を制御
することによって一定に保つことを特徴とする脂質小胞
ｔ−製造するための方法。 ２　超音波発生装置に給電する発電機の制御を。 目標値−実際値の比較を含む自動制御閉ループを用いて
行なう特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、超音波場の強度及び周波数を測定するために反応液
中に浸入している圧電気音響ピックアップを使用する特
許請求の範囲第１又は２項記載の方決。 ４、圧電気音響ピックアップは反応容器の底部に１前記
ピツクアツプの最高感度の方向が超音波発生装置に向い
ているように配置されておシ、他方超音波発生装置は媒
体の上部三分の−に浸入している特許請求の範囲第３項
記載の方法。 ５、反応媒体を不活性ガス雰囲下に処理する特許請求の
範囲渠耳〜４項のいづれかに記載の方法。 ６、　治療目的に一定され、イノジットへキサホスフェ
ートのような作用物質の負荷される。 赤血球と融合する能力のある脂質小胞を製造する特許請
求の範囲第１〜５項のいづれかに記載の方法。 γ　破壊すべき脂質懸濁液又は脂質粒子に処理谷ｌｉ内
の分散液中で大体において一定の温度で超音波処理を施
すことより成る生物学的膜又は脂質懸濁液から脂質小胞
を製造するための方法において１反応媒体を殺菌して無
菌袋に封入しかつ反応媒体を含有する無菌袋を。 超音波場忙曝嵩される液体内で処理することを特徴とす
る脂質小胞を製造するための方法。 ＆　治療目的に特定され、イノジットへキサホスフェー
トのような作用物質の負荷される、赤血球と融合する能
力のある脂質小胞を製造する特肝錆よの範囲＄７項記載
の方法。 ９、　反応液を収容する処理容器及び発電機によって給
電される５反応媒体中の超音波場をつくるための電気音
響変換器を有する生物学的膜又は脂質懸濁液から脂質小
胞を製造するための装置において、処理容器（３：３０
）内に音響ピックアップとして１反応液中の超音波の強
度及び周波数を制御するためにその出力信号が使用され
る音響−電気変換器（１８：３７）が配置されているこ
とを特徴とする脂質小胞を製造するための装置。 １０、発電機（２３：４３）を制御する、目標値−実際
値の比較を含む調節増幅器（２１：３９）を有する特許
請求の範囲第９項記載の装置。 １１、音響−電気変換器（１８：３７）が管の端部に配
置されたピエゾ板より成り、同ピエゾ板が音圧に対して
鰻も鋭敏な方向をもって超音波発生装置に向けられてい
る特許請求の範囲第８又９項記載の装置。 １２、超音波発生装置及び媒体を収容する処理容器（３
：３０）の幾何学的関係が、反射によって惹起される超
音波の発生が、音響陽射媒体で目標周波数からずれる周
波数及び／又は第一次超音波から変位された位相をもっ
て回避されるように選択されている特許請求の範囲第９
〜１１項のいづれかに記載の装置。 １３、処理容器（３：３０）が冷却液の貫流する二重壁
を有する特許請求の範囲第９〜１２項のいづれかに記載
の装置。 １４、処理容器（３）が外部雰囲気から密閉されており
かつ音響曝射される反応媒体の上方に不活性ガスをガス
室に供給するための送）管（１３）を有する特許請求の
範囲第９〜１３項のいづれかに記載の装置。Claims: 1. It consists of subjecting the lipid suspension or lipid particles to be disrupted to an ultrasonic treatment in the dispersion in a treatment container at an approximately constant temperature. A vesicle size or vesicle size distribution effective for the desired purpose and this vesicle size or vesicle size distribution in a method for producing lipid vesicles from biological suspended membranes or lipid suspensions. Determine the optimal ultrasonic frequency and intensity in the dispersion to obtain the optimal ultrasonic frequency and intensity thus determined under otherwise identical processing conditions. During the ultrasound treatment, the actual values of the frequency and intensity of the ultrasound field in the medium are continuously measured and depending on this actual value the output and frequency of the generator feeding the ultrasound generator are controlled. A method for the production of lipid vesicles, characterized in that the lipid vesicles are kept constant by: 2. Control of the generator that supplies power to the ultrasonic generator. 2. The method according to claim 1, wherein the method is carried out using an automatic control closed loop including a setpoint value-actual value comparison. 3. The method according to claim 1 or 2, which uses a piezoelectric acoustic pickup immersed in the reaction liquid to measure the intensity and frequency of the ultrasonic field. 4. A piezoelectric acoustic pickup is placed at the bottom of the reaction vessel such that the direction of maximum sensitivity of the pickup faces the ultrasonic generator, while the ultrasonic generator is located at the top third of the medium. A method according to claim 3 in which the method of claim 3 is incorporated. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the reaction medium is treated under an inert gas atmosphere. 6. Fixed for therapeutic purposes and loaded with active substances such as Inosit hexaphosphate. 6. A method according to any one of claims 1 to 5 for producing lipid vesicles capable of fusing with red blood cells. γ Production of lipid vesicles from biological membranes or lipid suspensions by subjecting the lipid suspension or lipid particles to be disrupted to ultrasonic treatment in a dispersion in a treatment valley at a more or less constant temperature. In a method for: sterilizing a reaction medium and enclosing it in a sterile bag, the sterile bag containing the reaction medium; A method for producing lipid vesicles, characterized in that the process is carried out in a liquid that is exposed to an ultrasonic field. & A method according to item $7 for producing lipid vesicles capable of fusing with red blood cells, specific for therapeutic purposes and loaded with an agent such as Inosit hexaphosphate. 9. Producing lipid vesicles from biological membranes or lipid suspensions with a processing vessel containing the reaction liquid and an electroacoustic transducer to create an ultrasonic field in the reaction medium powered by a generator. In the equipment for
) in which an acoustic-to-electrical transducer (18:37) is placed, the output signal of which is used as an acoustic pick-up to control the intensity and frequency of the ultrasound in the reaction solution. Equipment for producing vesicles. 10. Device according to claim 9, comprising a control amplifier (21:39) with a setpoint-actual value comparison for controlling the generator (23:43). 11. The acoustic-electrical transducer (18:37) consists of a piezo plate placed at the end of the tube, and the piezo plate is oriented toward the ultrasonic generator in a direction that is sensitive to sound pressure. The device according to claim 8 or 9. 12. Processing container (3) containing an ultrasonic generator and medium
:30) such that the generation of ultrasound waves caused by reflection is avoided in the acoustic radiation medium with a frequency deviated from the target frequency and/or a phase displaced from the primary ultrasound wave. Selected Claim No. 9
The device according to any one of items 11 to 11. 13. The apparatus according to any one of claims 9 to 12, wherein the processing container (3:30) has a double wall through which a cooling liquid flows. 14. The processing vessel (3) is sealed from the external atmosphere and has a feed pipe (13) for supplying an inert gas to the gas chamber above the reaction medium to be exposed to sound. The device according to any one of items 9 to 13.