JPH1192400A - 動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体及びワクチン並びにそれらの製造法 - Google Patents
動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体及びワクチン並びにそれらの製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ムチン型糖蛋白質に対するＩｇＧモノクローナ
ル抗体を用いる癌患者の受動免疫方法、ムチン型糖蛋白
質又は担体高分子に結合させた合成多糖類で能動免疫す
るワクチンの製造方法の提供 【解決手段】（ａ）Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを
有する精製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製
された核構造又は担体分子にリンクした化学合成炭水化
物成分であって、ムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を
誘導可能なものから成り、薬理的有効量の抗原、及び
（ｂ）製薬的に受容できる担体、希釈剤又は賦形剤：を
含むワクチンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応
を誘導することから成る、ムチン型糖蛋白質の核構造を
発現する癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法。
ル抗体を用いる癌患者の受動免疫方法、ムチン型糖蛋白
質又は担体高分子に結合させた合成多糖類で能動免疫す
るワクチンの製造方法の提供 【解決手段】（ａ）Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを
有する精製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製
された核構造又は担体分子にリンクした化学合成炭水化
物成分であって、ムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を
誘導可能なものから成り、薬理的有効量の抗原、及び
（ｂ）製薬的に受容できる担体、希釈剤又は賦形剤：を
含むワクチンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応
を誘導することから成る、ムチン型糖蛋白質の核構造を
発現する癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はヒト癌関連抗原に特
異的なモノクローナル抗体の製造方法並びにそれにより
製造されるハイブリドーマ及びモノクローナル抗体に関
する。より詳細には本発明は化学構造が明らかにされた
精製抗原を免疫原として用いるヒト癌関連抗原に対する
モノクローナル抗体の新規な製造方法に関し、該方法に
おいては目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を化学構造の明らかにされたムチン型糖蛋白
質を用いて選択する。本方法は、従来のヒト癌関連抗原
に対するモノクローナル抗体の製造法に比較して、多く
の余分なステップを省くことができる。さらに本発明
は、新規な方法で製造されたハイブリドーマおよびその
ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体にも
関する。上記本発明に係わるハイブリドーマは従来法に
より製造されたハイブリドーマと同様に質的に優れ、又
上記ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗
体も従来法により産生される抗体と同様に質的に優れ、
むしろ望ましくない交叉反応性を示さない点でより優れ
ていることが認められた。
異的なモノクローナル抗体の製造方法並びにそれにより
製造されるハイブリドーマ及びモノクローナル抗体に関
する。より詳細には本発明は化学構造が明らかにされた
精製抗原を免疫原として用いるヒト癌関連抗原に対する
モノクローナル抗体の新規な製造方法に関し、該方法に
おいては目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞を化学構造の明らかにされたムチン型糖蛋白
質を用いて選択する。本方法は、従来のヒト癌関連抗原
に対するモノクローナル抗体の製造法に比較して、多く
の余分なステップを省くことができる。さらに本発明
は、新規な方法で製造されたハイブリドーマおよびその
ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体にも
関する。上記本発明に係わるハイブリドーマは従来法に
より製造されたハイブリドーマと同様に質的に優れ、又
上記ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗
体も従来法により産生される抗体と同様に質的に優れ、
むしろ望ましくない交叉反応性を示さない点でより優れ
ていることが認められた。
【０００２】本発明はさらに、ムチン型糖蛋白質に対す
るＩｇＧモノクローナル抗体で癌患者を受動免疫する方
法及びムチン型糖蛋白質又は担体高分子に結合させた合
成多糖類で能動免疫することに基づくワクチンの製造方
法にも関する。
るＩｇＧモノクローナル抗体で癌患者を受動免疫する方
法及びムチン型糖蛋白質又は担体高分子に結合させた合
成多糖類で能動免疫することに基づくワクチンの製造方
法にも関する。
【０００３】
【従来の技術】ヒト癌細胞での免疫による多数のモノク
ローナル抗体が、ヒト癌細胞ラインに対する正の反応性
及び正常組織や正常細胞ラインに対する負の反応性によ
り選択された。これらの抗体の多くは、ムチン型糖蛋白
質に対するものと同定され、多数のＯ−結合性オリゴ糖
類を有しジスルフィド結合のある非常に異質の高分子量
ポリペプチドとして特徴づけられる。Ｏ結合性オリゴ糖
類の大部分は二糖からなる核構造（Ｇａｌβ１→３Ｇａ
ｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有し、これにシ
アル酸、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンのような
糖残基が結合して、ヒトでは非常に複雑な構造を形成す
る。これらのムチン型糖蛋白質は主に上皮細胞に存在
し、ゴプレット細胞から分泌されて粘液分泌物を形成す
る。
ローナル抗体が、ヒト癌細胞ラインに対する正の反応性
及び正常組織や正常細胞ラインに対する負の反応性によ
り選択された。これらの抗体の多くは、ムチン型糖蛋白
質に対するものと同定され、多数のＯ−結合性オリゴ糖
類を有しジスルフィド結合のある非常に異質の高分子量
ポリペプチドとして特徴づけられる。Ｏ結合性オリゴ糖
類の大部分は二糖からなる核構造（Ｇａｌβ１→３Ｇａ
ｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を有し、これにシ
アル酸、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミンのような
糖残基が結合して、ヒトでは非常に複雑な構造を形成す
る。これらのムチン型糖蛋白質は主に上皮細胞に存在
し、ゴプレット細胞から分泌されて粘液分泌物を形成す
る。
【０００４】腫瘍形質転換に関連して多くの糖鎖の合成
がブロックされる [Hakomori S.,Murakami W.T.,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,59,254-261(1968);Hakomori S.,Canc
er Res.,45,2405-2414(1985)]。多くのヒト癌では、ム
チン型糖蛋白質の炭水化物鎖の合成もまた強くブロック
され、その結果末梢構造の無い、即ち核構造の修飾は無
く、短い炭化水素鎖を有するムチン型糖蛋白質が、多く
形成される。これらの不完全なオリゴ糖鎖を有する糖蛋
白質のうちＴ，Ｔｎ，およびシアリル−Ｔｎが同定され
ている。これらは正常組織に潜在形態で存在する全ての
ムチン型糖蛋白質の、一般的な核構造である [Springer
G.,Science,224,1198-1206,(1984);Hirohashi S.et a
1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039-7043,(1985)]。
がブロックされる [Hakomori S.,Murakami W.T.,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,59,254-261(1968);Hakomori S.,Canc
er Res.,45,2405-2414(1985)]。多くのヒト癌では、ム
チン型糖蛋白質の炭水化物鎖の合成もまた強くブロック
され、その結果末梢構造の無い、即ち核構造の修飾は無
く、短い炭化水素鎖を有するムチン型糖蛋白質が、多く
形成される。これらの不完全なオリゴ糖鎖を有する糖蛋
白質のうちＴ，Ｔｎ，およびシアリル−Ｔｎが同定され
ている。これらは正常組織に潜在形態で存在する全ての
ムチン型糖蛋白質の、一般的な核構造である [Springer
G.,Science,224,1198-1206,(1984);Hirohashi S.et a
1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039-7043,(1985)]。
【０００５】ヒト癌関違抗原に対するモノクローナル抗
体を製造する現行の方法では、免疫原として癌組織ホモ
ジネート又は癌細胞ラインを使用し、産生する抗体の特
異性を多数の癌細胞及び組織切片を用いて分析すること
によりハイブリドーマを選択する。
体を製造する現行の方法では、免疫原として癌組織ホモ
ジネート又は癌細胞ラインを使用し、産生する抗体の特
異性を多数の癌細胞及び組織切片を用いて分析すること
によりハイブリドーマを選択する。
【０００６】例えば、糖蛋白質のセリン又はトレオニン
に結合するα−ＧａｌＮａｃ残基と血液型Ａとの交叉反
応抗原性については、Uhlenbruckにより報告されてお
り、血液型Ａ赤血球を優先的に凝集させる種々のＧａｌ
Ｎａｃレクチン（Helix pomatia,Soja hispeda及びSaro
thamnus sclparius）によって検出されるＴｎ抗原に関
連がある。エピトープは、トランスメンブレン糖蛋白質
及びムチン型糖蛋白質中に存在するＯ−結合炭化水素鎖
の最深部にあるα−ＧａｌＮＡｃ残基に相当する。従っ
て、この抗原は正常細胞又は分泌物中では隠れており、
脱シアル化の後スミス分解すると現出する [Dahr.W.,et
al.,Vox Sang.,27,29-42 (1974)］。Ｔｎ抗原について
はSpringerらも報告しており、トムセン−フリーデレイ
ヒ（Thomsen-Friedenreich）抗原（Ｔ抗原）の前駆体に
関連し、Ｔｎ及びＴ抗原は乳癌［Springer C.F.,et al.
J.Natl.Cancer lnst.,54,335 (1975)］及び種々の他の
癌 [Springer G.F.,et al,Cancer 556,561-569 (198
5)］で発現する。しかし、この抗原が種々のタイプのヒ
ト癌で広く発生すること及び正常組織では分布が限定さ
れていることは、このエピトープに特異的なモノクロー
ナル抗原が最近になって確立されるまでは良く理解され
ていなかった［Hirohashi S.et al.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,82,7039-7043,(1985)］。マウスにヒト肺偏平上
皮細胞癌Ｌｕ６５を免疫した後、腫瘍に対し特異的に反
応し正常組織とは反応しないことにより選択し、ＩｇＭ
抗体ＮＣＣ−ＬＵ−３５及びＮＣＣ−ＬＵ−８１が最初
に確立された。これらの抗体はＡ抗原と交又反応性を有
し、Ｔｎ抗原に対するものと同定された[Hirohashi S.,
Murakami W.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039-7043,
(1985)］。ＮＣＣ−ＬＵ−３５については血液型Ａ抗原
との大きな交叉反応性が示され、ＮＣＣ−ＬＵ−８１に
ついては交叉反応性がより少ないことが示されたにもか
かわらず、これらの抗体により、特に血液型Ｏ及びＢに
個体の腫瘍中でＴｎ抗原を確認できる。これらの抗Ｔｎ
抗体の反応性が非Ａ型腫瘍組織に高度に制限されること
が見出されたため [Hirohasi S.,et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,82,7039-7043,(1985)］、血液型Ａと交叉反
応しないＩｇＧクラスの抗Ｔｎ抗体の獲得が強く望まれ
ている。なぜならＩｇＧ抗体のみが腫瘍細胞で抗体依存
性の細胞障害効果を発揮できるからである［Young,W.
W.,Jr.and Hakomori.S.,Science,211,487-489(1981); H
oughton,A.N.,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,1242-
1246 (1985); Herberman,R.B.,et al,In:R.A.Reisfeld
and S.Sell(eds.),MonoclonalAntibodies and Cancer T
herapy,pp.193-203,AlanR,Liss,lnc.,New York,(1985);
and Herlyn,D.M.,et aI,Cancer Res.,40,717-721 (198
0)］。ＩｇＧ抗体は、毒素、他の抗腫瘍剤及び治療の為
の放射性又は磁性マーカーとの結合物の調製並びに腫瘍
のイメージ化に対し、ＩｇＭよりも適当である。
に結合するα−ＧａｌＮａｃ残基と血液型Ａとの交叉反
応抗原性については、Uhlenbruckにより報告されてお
り、血液型Ａ赤血球を優先的に凝集させる種々のＧａｌ
Ｎａｃレクチン（Helix pomatia,Soja hispeda及びSaro
thamnus sclparius）によって検出されるＴｎ抗原に関
連がある。エピトープは、トランスメンブレン糖蛋白質
及びムチン型糖蛋白質中に存在するＯ−結合炭化水素鎖
の最深部にあるα−ＧａｌＮＡｃ残基に相当する。従っ
て、この抗原は正常細胞又は分泌物中では隠れており、
脱シアル化の後スミス分解すると現出する [Dahr.W.,et
al.,Vox Sang.,27,29-42 (1974)］。Ｔｎ抗原について
はSpringerらも報告しており、トムセン−フリーデレイ
ヒ（Thomsen-Friedenreich）抗原（Ｔ抗原）の前駆体に
関連し、Ｔｎ及びＴ抗原は乳癌［Springer C.F.,et al.
J.Natl.Cancer lnst.,54,335 (1975)］及び種々の他の
癌 [Springer G.F.,et al,Cancer 556,561-569 (198
5)］で発現する。しかし、この抗原が種々のタイプのヒ
ト癌で広く発生すること及び正常組織では分布が限定さ
れていることは、このエピトープに特異的なモノクロー
ナル抗原が最近になって確立されるまでは良く理解され
ていなかった［Hirohashi S.et al.Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,82,7039-7043,(1985)］。マウスにヒト肺偏平上
皮細胞癌Ｌｕ６５を免疫した後、腫瘍に対し特異的に反
応し正常組織とは反応しないことにより選択し、ＩｇＭ
抗体ＮＣＣ−ＬＵ−３５及びＮＣＣ−ＬＵ−８１が最初
に確立された。これらの抗体はＡ抗原と交又反応性を有
し、Ｔｎ抗原に対するものと同定された[Hirohashi S.,
Murakami W.T.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7039-7043,
(1985)］。ＮＣＣ−ＬＵ−３５については血液型Ａ抗原
との大きな交叉反応性が示され、ＮＣＣ−ＬＵ−８１に
ついては交叉反応性がより少ないことが示されたにもか
かわらず、これらの抗体により、特に血液型Ｏ及びＢに
個体の腫瘍中でＴｎ抗原を確認できる。これらの抗Ｔｎ
抗体の反応性が非Ａ型腫瘍組織に高度に制限されること
が見出されたため [Hirohasi S.,et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,82,7039-7043,(1985)］、血液型Ａと交叉反
応しないＩｇＧクラスの抗Ｔｎ抗体の獲得が強く望まれ
ている。なぜならＩｇＧ抗体のみが腫瘍細胞で抗体依存
性の細胞障害効果を発揮できるからである［Young,W.
W.,Jr.and Hakomori.S.,Science,211,487-489(1981); H
oughton,A.N.,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,1242-
1246 (1985); Herberman,R.B.,et al,In:R.A.Reisfeld
and S.Sell(eds.),MonoclonalAntibodies and Cancer T
herapy,pp.193-203,AlanR,Liss,lnc.,New York,(1985);
and Herlyn,D.M.,et aI,Cancer Res.,40,717-721 (198
0)］。ＩｇＧ抗体は、毒素、他の抗腫瘍剤及び治療の為
の放射性又は磁性マーカーとの結合物の調製並びに腫瘍
のイメージ化に対し、ＩｇＭよりも適当である。
【０００７】さらに、Ｂ７２．３ [Nuti,M.,et al,J.ln
st.Cancer,29,539-545,(1982); Thor,A.,et al.,Cancer
Res.,46,850-857 (1986)] 及びＭＳＬ１０２ [Kurasaw
a,A.et al,ln: Tumor marler and their significance
in the management of breast cancer.(Eds,Dao,T.,Bro
die,A.,and Ip,C.) pp47-70, Alan R.Liss lnc.,N.Y.,
(1986)］の２個のモノクローナル抗体が、ヒト転移性乳
癌及び腸癌細胞ラインでの免疫により確立された。これ
らは種々のヒト癌に対して高度の特異性を示し、正常組
織に対する反応性は限定されている。
st.Cancer,29,539-545,(1982); Thor,A.,et al.,Cancer
Res.,46,850-857 (1986)] 及びＭＳＬ１０２ [Kurasaw
a,A.et al,ln: Tumor marler and their significance
in the management of breast cancer.(Eds,Dao,T.,Bro
die,A.,and Ip,C.) pp47-70, Alan R.Liss lnc.,N.Y.,
(1986)］の２個のモノクローナル抗体が、ヒト転移性乳
癌及び腸癌細胞ラインでの免疫により確立された。これ
らは種々のヒト癌に対して高度の特異性を示し、正常組
織に対する反応性は限定されている。
【０００８】しかし、これらの現行の方法は多数のステ
ップを必要とし、従って非常に扱いにくく、時間もかか
る。
ップを必要とし、従って非常に扱いにくく、時間もかか
る。
【０００９】従って、ヒト癌関連抗原に対するモノクロ
ーナル抗体を製造する為のより効率的な方法が望まれて
おり、同様に、正常な炭水化物配列及び構造を有する糖
蛋白質と好ましくない交叉反応を示さないモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマの単離も望まれてい
る。
ーナル抗体を製造する為のより効率的な方法が望まれて
おり、同様に、正常な炭水化物配列及び構造を有する糖
蛋白質と好ましくない交叉反応を示さないモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマの単離も望まれてい
る。
【００１０】さらに、腫瘍増殖を抑制するための能動免
疫が、腫瘍免疫学において長い歴史を有している。実験
的腫瘍で幾つかの成果が得られたが、多くの試みは失敗
している。この原因の一つとして、使用した腫瘍抗原が
化学的にあまり明確でなく、そのため宿主に免疫反応を
起こして腫瘍増殖を抑制する能力が曖昧であったことが
挙げられる。最近、モノクローナル抗体によって確認さ
れた幾つかの腫瘍関連炭水化物抗原が、化学的によく特
徴付けられてきた。このような抗原を、腫瘍増殖を抑制
する為の免疫原として用いることが、今では可能であ
る。
疫が、腫瘍免疫学において長い歴史を有している。実験
的腫瘍で幾つかの成果が得られたが、多くの試みは失敗
している。この原因の一つとして、使用した腫瘍抗原が
化学的にあまり明確でなく、そのため宿主に免疫反応を
起こして腫瘍増殖を抑制する能力が曖昧であったことが
挙げられる。最近、モノクローナル抗体によって確認さ
れた幾つかの腫瘍関連炭水化物抗原が、化学的によく特
徴付けられてきた。このような抗原を、腫瘍増殖を抑制
する為の免疫原として用いることが、今では可能であ
る。
【００１１】化学的に決められた癌関連糖蛋白質自体
は、腫瘍に対する生体内免疫反応を起こす目的で、癌患
者の能動免疫に単独で使用できる。Ｔ及びＴｎ抗原を有
するルイス肺癌から単離された糖蛋白質、ＴＣＡが、癌
患者の免疫に用いられ、その結果、癌患者の３３／７１
に部分的又は完全な退行が見られた [Adachi.M.,et a
l.,Anticancer Research,4,1-4 (1984); Adachi,M,mer
al,Anticancer Research，発行予定］。
は、腫瘍に対する生体内免疫反応を起こす目的で、癌患
者の能動免疫に単独で使用できる。Ｔ及びＴｎ抗原を有
するルイス肺癌から単離された糖蛋白質、ＴＣＡが、癌
患者の免疫に用いられ、その結果、癌患者の３３／７１
に部分的又は完全な退行が見られた [Adachi.M.,et a
l.,Anticancer Research,4,1-4 (1984); Adachi,M,mer
al,Anticancer Research，発行予定］。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に対するモノクローナル抗
体の確立及び新規な製造方法を提供することにある。本
方法は、従来法に必要な幾つかの余分なステップを回避
し、しかも従来法によるものと同程度の優れた品質を有
するハイブリドーマを与えるものである。
癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に対するモノクローナル抗
体の確立及び新規な製造方法を提供することにある。本
方法は、従来法に必要な幾つかの余分なステップを回避
し、しかも従来法によるものと同程度の優れた品質を有
するハイブリドーマを与えるものである。
【００１３】本発明の目的は、特別な癌関連抗原に対す
るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを提供
することにもある。
るモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを提供
することにもある。
【００１４】本発明の目的はさらに、モノクローナル抗
体が正常の炭水化物構造を持つ糖蛋白質と望ましくない
交叉反応を示さないという点で、従来法による抗体と少
なくとも質的に同等かむしろより優れたモノクローナル
抗体を提供することにある。
体が正常の炭水化物構造を持つ糖蛋白質と望ましくない
交叉反応を示さないという点で、従来法による抗体と少
なくとも質的に同等かむしろより優れたモノクローナル
抗体を提供することにある。
【００１５】さらなる本発明の目的は、ワクチンの開発
方法、即ち、癌細胞により発現される抗原に特異的な抗
体又は他の免疫反応を誘導できる糖蛋白質又は合成オリ
ゴ糖付加ポリマー複合体を、動物又はヒトに投与するこ
とにより癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供するこ
とにある。
方法、即ち、癌細胞により発現される抗原に特異的な抗
体又は他の免疫反応を誘導できる糖蛋白質又は合成オリ
ゴ糖付加ポリマー複合体を、動物又はヒトに投与するこ
とにより癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供するこ
とにある。
【００１６】本発明の他の目的は、ムチン型糖蛋白質の
核構造に関連する炭水化物に対する抗体であり、癌細胞
により発現される抗原に特異的であるものを使用する、
癌の治療方法を提供することにある。
核構造に関連する炭水化物に対する抗体であり、癌細胞
により発現される抗原に特異的であるものを使用する、
癌の治療方法を提供することにある。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、（１）ムチン
型糖蛋白質の核構造で宿主を免疫する；（２）免疫され
た宿主から得た脾細胞をミエローマ細胞と融合させハイ
ブリドーマ細胞を形成する；（３）ハイブリドーマ細胞
を選択培地で培養する；（４）ステップ（３）で生き残
ったハイブリドーマ細胞からムチン型糖蛋白質の核構造
と結合する抗体を分泌するものを選択する；（５）ステ
ップ（４）で選択したハイブリドーマ細胞をクローニン
グする；（６）クローニングしたハイブリドーマ細胞を
培養する；及び（７）抗体を回収する；の各ステップを
含む、ヒト癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に結合するモノ
クローナル抗体の製造方法に係わるものである。
型糖蛋白質の核構造で宿主を免疫する；（２）免疫され
た宿主から得た脾細胞をミエローマ細胞と融合させハイ
ブリドーマ細胞を形成する；（３）ハイブリドーマ細胞
を選択培地で培養する；（４）ステップ（３）で生き残
ったハイブリドーマ細胞からムチン型糖蛋白質の核構造
と結合する抗体を分泌するものを選択する；（５）ステ
ップ（４）で選択したハイブリドーマ細胞をクローニン
グする；（６）クローニングしたハイブリドーマ細胞を
培養する；及び（７）抗体を回収する；の各ステップを
含む、ヒト癌関連ムチン型糖蛋白質抗原に結合するモノ
クローナル抗体の製造方法に係わるものである。
【００１８】本発明は、以下の確認された性質を持つモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る： （１）ＩｇＧ2aイソタイプ （２）Ｔｎ抗原と反応する （３）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に
特異性を有し、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）又はグルコース（Ｇｌ
ｃ）には特異性を有しない （４）α−Ｎ−アセチルガラクトサミン（α−ＧａｌＮ
Ａｃ）に対しエピトープ特異性を有し、β−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミンに対してはエピトープ特異性を有さな
い、及び （５）血液型Ａとは交叉反応しない。
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る： （１）ＩｇＧ2aイソタイプ （２）Ｔｎ抗原と反応する （３）Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）に
特異性を有し、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）又はグルコース（Ｇｌ
ｃ）には特異性を有しない （４）α−Ｎ−アセチルガラクトサミン（α−ＧａｌＮ
Ａｃ）に対しエピトープ特異性を有し、β−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミンに対してはエピトープ特異性を有さな
い、及び （５）血液型Ａとは交叉反応しない。
【００１９】本発明は、以下の確認された性質を持つモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る： （１）ＩｇＭイソタイプ （２）シアリルＴｎ抗原と反応し、Ｔ又はＴｎ抗原とは
反応しない、及び （３）ＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒに対しエピトープ特異性を有し、ＮｅｕＡｃ
α２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対し
エピトープ特異性を有さない。
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る： （１）ＩｇＭイソタイプ （２）シアリルＴｎ抗原と反応し、Ｔ又はＴｎ抗原とは
反応しない、及び （３）ＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒに対しエピトープ特異性を有し、ＮｅｕＡｃ
α２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対し
エピトープ特異性を有さない。
【００２０】本発明は、以下の確認された性質を持つモ
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る： （１）ＩｇＧ1イソタイプ （２）シアリルＴｎ抗原と反応しＴ又はＴｎ抗原とは反
応しない （３）ＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒに対しエピトープ特異性を有し、ＮｅｕＡｃ
α２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対し
エピトープ特異性を有さない、及び （４）Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）2フラグメントに容易に分
解できる。
ノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマをも提供す
る： （１）ＩｇＧ1イソタイプ （２）シアリルＴｎ抗原と反応しＴ又はＴｎ抗原とは反
応しない （３）ＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒに対しエピトープ特異性を有し、ＮｅｕＡｃ
α２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対し
エピトープ特異性を有さない、及び （４）Ｆａｂ又は（Ｆａｂ）2フラグメントに容易に分
解できる。
【００２１】もう一つの態様では、本発明は上記の確認
されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体を提供する。本抗体は、ムチン型糖蛋白質の核構
造、即ち、Ｔｎ及びシアリルＴｎ構造を発現する癌を有
する患者の受動免疫のために特に有用である。
されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体を提供する。本抗体は、ムチン型糖蛋白質の核構
造、即ち、Ｔｎ及びシアリルＴｎ構造を発現する癌を有
する患者の受動免疫のために特に有用である。
【００２２】もう一つの態様に於いて本発明は、ワクチ
ンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応を誘導する
ことによる、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細
胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供する。上記ワクチン
は、 （ａ）Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを有する精製ム
チン型糖蛋白質、精製されたムチン型糖蛋白質の核構
造、又はムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能
な、担体分子にリンクされた化学合成炭水化物成分を含
む薬理的有効量の抗原 （ｂ）製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤、 を含有する。
ンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応を誘導する
ことによる、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細
胞の増殖及び複製を防ぐ方法を提供する。上記ワクチン
は、 （ａ）Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを有する精製ム
チン型糖蛋白質、精製されたムチン型糖蛋白質の核構
造、又はムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能
な、担体分子にリンクされた化学合成炭水化物成分を含
む薬理的有効量の抗原 （ｂ）製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤、 を含有する。
【００２３】本発明は、化学的に同定された糖蛋白質、
即ち、Ｔｎ及びシアリルＴｎを有するウシ又はヒツジの
下顎ムチン（ＢＳＭ，ＯＳＭ）を免疫原として使用し、
腫瘍をチャレンジ後、シンジェニック（syngenic）マウ
スのＴＡ３ＨＡマウス腫瘍の増殖を防ぎ、腫瘍をチャレ
ンジしたマウスの生存を増大することを開示する。Ｔｎ
及びシアリルＴｎ決定基は多種類のヒト癌で高度に発現
するため［HirohashiS.,et al.,(1985) Proc Natl Acad
Sci USA,82,7039-7043; Takahashi HK,et aI(1988) Ca
ncer Res,48,4361-4367; Kjeldsen T.et al.,Cancer Re
s,48,2214-2220,(1988); Kurosaka A.,J Biol.Chem.,26
3,8724-8726］、ＢＳＭ，ＯＳＭ又はこれら決定基を有
する任意の他のムチン型糖蛋白質による能動免疫はヒト
癌の増殖を防ぐワクチンを提供するうえで有用であると
期待される。
即ち、Ｔｎ及びシアリルＴｎを有するウシ又はヒツジの
下顎ムチン（ＢＳＭ，ＯＳＭ）を免疫原として使用し、
腫瘍をチャレンジ後、シンジェニック（syngenic）マウ
スのＴＡ３ＨＡマウス腫瘍の増殖を防ぎ、腫瘍をチャレ
ンジしたマウスの生存を増大することを開示する。Ｔｎ
及びシアリルＴｎ決定基は多種類のヒト癌で高度に発現
するため［HirohashiS.,et al.,(1985) Proc Natl Acad
Sci USA,82,7039-7043; Takahashi HK,et aI(1988) Ca
ncer Res,48,4361-4367; Kjeldsen T.et al.,Cancer Re
s,48,2214-2220,(1988); Kurosaka A.,J Biol.Chem.,26
3,8724-8726］、ＢＳＭ，ＯＳＭ又はこれら決定基を有
する任意の他のムチン型糖蛋白質による能動免疫はヒト
癌の増殖を防ぐワクチンを提供するうえで有用であると
期待される。
【００２４】本発明はさらに、（ａ）ムチン型糖蛋白質
の精製された核構造に対して作られた抗癌抗体の薬理的
有効量、及び（ｂ）製薬上受容できる担体、希釈剤又は
賦形剤を含有する薬剤を対象に投与することから成る、
癌細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌の治療
法をも提供する。
の精製された核構造に対して作られた抗癌抗体の薬理的
有効量、及び（ｂ）製薬上受容できる担体、希釈剤又は
賦形剤を含有する薬剤を対象に投与することから成る、
癌細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌の治療
法をも提供する。
【００２５】
【発明の実施の形態】本明細書に於いて下記の用語は以
下の意味を有する。
下の意味を有する。
【００２６】ムチン型グリコプロテイン……セリン又は
トレオニン残基に高度にＯ−リンクしたグリコシレーシ
ョンを高度に有する高分子量蛋白質（Ｍｒ＞１０6）。
ムチン型糖蛋白質はＳ−Ｓ結合によりさらに重合し、こ
れは上皮分泌物の主成分である。 ムチン型糖蛋白質の
核構造……ムチン糖蛋白質の蛋白質部分に直接結合し
た、末梢の置換の無い塩基性炭水化物構造。最も高頻度
で主要なこのような構造はＴ抗原に等しい（下記参
照）。以下の核構造Ｔ、Ｔｎ、及びシアリルＴｎは全て
種によらず（種々の動物及びヒト）全ての型のムチン糖
蛋白質に共通する。
トレオニン残基に高度にＯ−リンクしたグリコシレーシ
ョンを高度に有する高分子量蛋白質（Ｍｒ＞１０6）。
ムチン型糖蛋白質はＳ−Ｓ結合によりさらに重合し、こ
れは上皮分泌物の主成分である。 ムチン型糖蛋白質の
核構造……ムチン糖蛋白質の蛋白質部分に直接結合し
た、末梢の置換の無い塩基性炭水化物構造。最も高頻度
で主要なこのような構造はＴ抗原に等しい（下記参
照）。以下の核構造Ｔ、Ｔｎ、及びシアリルＴｎは全て
種によらず（種々の動物及びヒト）全ての型のムチン糖
蛋白質に共通する。
【００２７】Ｔ抗原……Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃの
如き構造をとるＧａｌ及びＧａｌＮＡｃ各１モルずつか
ら成る二糖。還元末端ＧａｌＮＡｃはポリペプチド鎖の
セリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基にα−結合
している。
如き構造をとるＧａｌ及びＧａｌＮＡｃ各１モルずつか
ら成る二糖。還元末端ＧａｌＮＡｃはポリペプチド鎖の
セリン又はトレオニン残基のヒドロキシル基にα−結合
している。
【００２８】Ｔｎ抗原……その最も内部にあるα−Ｇａ
ｌＮＡｃ残基が、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオニ
ン残基のヒドロキシル基に直接結合している抗原。α−
ＧａｌＮＡｃは血液型Ａ抗原の一部であるため、多くの
抗Ｔｎ抗体はＡ抗原と交叉反応する。
ｌＮＡｃ残基が、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオニ
ン残基のヒドロキシル基に直接結合している抗原。α−
ＧａｌＮＡｃは血液型Ａ抗原の一部であるため、多くの
抗Ｔｎ抗体はＡ抗原と交叉反応する。
【００２９】シアリルＴｎ抗原……Ｔｎ抗原のα−Ｇａ
ｌＮＡｃ残基の６位のヒドロキシル基がシアル酸で置換
されている、即ち、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオ
ニン残基のヒドロキシル基にＮｅｕＡｃα２→６Ｇａｌ
ＮＡｃがα結合している抗原。
ｌＮＡｃ残基の６位のヒドロキシル基がシアル酸で置換
されている、即ち、ポリペプチド鎖のセリン又はトレオ
ニン残基のヒドロキシル基にＮｅｕＡｃα２→６Ｇａｌ
ＮＡｃがα結合している抗原。
【００３０】Ｔ抗原、Ｔｎ抗原及びシアリルＴｎ抗原の
構造を下記表１に示す。
構造を下記表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】本発明は、ヒト癌関連ムチン型糖蛋白質抗
原に対するモノクローナル抗体を製造する新規な方法を
提供する。この新規な方法において重要な２つの点は、
（ｌ）本方法で用いられる免疫原は、構造が化学的に明
らかにされた精製又は合成抗原である点、及び（２）ハ
イブリドーマの選択は化学構造が明らかにされた同じ免
疫原を使用して行われることである。
原に対するモノクローナル抗体を製造する新規な方法を
提供する。この新規な方法において重要な２つの点は、
（ｌ）本方法で用いられる免疫原は、構造が化学的に明
らかにされた精製又は合成抗原である点、及び（２）ハ
イブリドーマの選択は化学構造が明らかにされた同じ免
疫原を使用して行われることである。
【００３３】免疫原の調製 本発明に従えば、抗体を得るために使用する免疫原は、
上記に明らかにしたムチン型糖蛋白質の核構造である。
即ち、どの様なムチン型糖蛋白質の核構造も、その糖蛋
白質が免疫原性を発揮するに十分な大きさの分子量を有
し且つ全重量の５０％以上がグリコシル化されているム
チンと同程度まで、グリコシル化されている限り使用可
能である。
上記に明らかにしたムチン型糖蛋白質の核構造である。
即ち、どの様なムチン型糖蛋白質の核構造も、その糖蛋
白質が免疫原性を発揮するに十分な大きさの分子量を有
し且つ全重量の５０％以上がグリコシル化されているム
チンと同程度まで、グリコシル化されている限り使用可
能である。
【００３４】本発明の免疫原として有用なムチン型糖蛋
白質の核構造の例には、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、シアリルＴ
ｎ抗原、及びこれらの抗原を含む動物性ムチンが含まれ
る。Ｇａｌβ１→３［ＧｌｃＮＡｃβ１→４］ＧａｌＮ
Ａｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌβ
１→３［Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４］Ｇａｌ
ＮＡｃの様な他の核構造も使用できる。特に好ましい免
疫原はＴ抗原、Ｔｎ抗原、およびシアリルＴｎ抗原、並
びにこれら抗原を含む動物性ムチンである。
白質の核構造の例には、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、シアリルＴ
ｎ抗原、及びこれらの抗原を含む動物性ムチンが含まれ
る。Ｇａｌβ１→３［ＧｌｃＮＡｃβ１→４］ＧａｌＮ
Ａｃ、ＧｌｃＮＡｃβ１→４ＧａｌＮＡｃ及びＧａｌβ
１→３［Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→４］Ｇａｌ
ＮＡｃの様な他の核構造も使用できる。特に好ましい免
疫原はＴ抗原、Ｔｎ抗原、およびシアリルＴｎ抗原、並
びにこれら抗原を含む動物性ムチンである。
【００３５】免疫原は、ムチン型糖蛋白質を酵素的又は
化学的に修飾して核構造を露出させ、又は核構造をその
中に有するムチンを単離することにより得られる。これ
らのムチンは幾つかの動物種に存在する。
化学的に修飾して核構造を露出させ、又は核構造をその
中に有するムチンを単離することにより得られる。これ
らのムチンは幾つかの動物種に存在する。
【００３６】種々のムチン型糖蛋白質の核構造を露出さ
せるために使用可能な酵素的修飾のタイプの例には、末
端に位置するα２→３シアリル残基のインフルエンザウ
イルスシアリダーゼによる除去、又はクロストリジウム
ペルフリンゲンズ（Clostridium perfringense）シアリ
ダーゼによる全シアル酸残基の総除去が含まれる。酵素
的修飾にはさらに、β−ガラクトシダーゼ（好ましくは
Charonia lampasからのもの）、α−フコシダーゼ及び
Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼを用いた処理が含まれ得
る。ムチン糖蛋白質の酵素的加水分解はヒロハシ（Hiro
hashi）らにより記載されている［Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,82,7039-7043(1985)］。
せるために使用可能な酵素的修飾のタイプの例には、末
端に位置するα２→３シアリル残基のインフルエンザウ
イルスシアリダーゼによる除去、又はクロストリジウム
ペルフリンゲンズ（Clostridium perfringense）シアリ
ダーゼによる全シアル酸残基の総除去が含まれる。酵素
的修飾にはさらに、β−ガラクトシダーゼ（好ましくは
Charonia lampasからのもの）、α−フコシダーゼ及び
Ｎ−アセチルヘキサミニダーゼを用いた処理が含まれ得
る。ムチン糖蛋白質の酵素的加水分解はヒロハシ（Hiro
hashi）らにより記載されている［Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,82,7039-7043(1985)］。
【００３７】ムチン型糖蛋白質の核構造を露出させるた
めに使用可能な化学的反応の例には、過ヨウ素酸塩酸化
及びこれに続く硼化水素ナトリウムを用いた還元及び弱
酸処理が含まれる。この方法はスミス分解［Spiro,G.,M
ethods EnzymoI.,28,3-43 (1972)］と呼ばれる。この化
学的処理により、シアル酸以外の炭水化物残基の非還元
末端が除去され、シアル酸は上記の様にシアリダーゼ処
理により除去できる。
めに使用可能な化学的反応の例には、過ヨウ素酸塩酸化
及びこれに続く硼化水素ナトリウムを用いた還元及び弱
酸処理が含まれる。この方法はスミス分解［Spiro,G.,M
ethods EnzymoI.,28,3-43 (1972)］と呼ばれる。この化
学的処理により、シアル酸以外の炭水化物残基の非還元
末端が除去され、シアル酸は上記の様にシアリダーゼ処
理により除去できる。
【００３８】動物から単離され、免疫原として使用でき
るムチンの例には、９０％の炭水化物鎖がシアリルＴｎ
抗原から成るヒツジ下顎腺ムチン（ＯＳＭ）及び５０％
の炭水化物鎖がシアリルＴｎ抗原から成り３０％の炭水
化物鎖がＴｎ抗原及び他の確認されていない残基から成
るウシ下顎ムチンが含まれる。動物種のムチン糖蛋白質
の構造が全て明らかにされている訳ではない。しかし、
ヒツジ胃ムチンにすでに見出されているトリヘキソサミ
ン核（ＧｌｃＮＡｃβ１→４［ＧｌｃＮＡｃβ１→３］
ＧａｌＮＡｃ） [HounselI,E.et al.,Biochem.Biophys.
Res.Commun.,92,1143-1159 (1979)］のような新規な構
造は幾つかのヒト癌ムチンの核構造に存在すると考えら
れ、この場合にはこれらも本発明で用いることができ
る。種々の動物種のムチン核構造の系統的な理解は不完
全であるが、ムチン核構造が知られると、当業者は本発
明にそれらが有用であるかを容易に決めることができる
であろう。
るムチンの例には、９０％の炭水化物鎖がシアリルＴｎ
抗原から成るヒツジ下顎腺ムチン（ＯＳＭ）及び５０％
の炭水化物鎖がシアリルＴｎ抗原から成り３０％の炭水
化物鎖がＴｎ抗原及び他の確認されていない残基から成
るウシ下顎ムチンが含まれる。動物種のムチン糖蛋白質
の構造が全て明らかにされている訳ではない。しかし、
ヒツジ胃ムチンにすでに見出されているトリヘキソサミ
ン核（ＧｌｃＮＡｃβ１→４［ＧｌｃＮＡｃβ１→３］
ＧａｌＮＡｃ） [HounselI,E.et al.,Biochem.Biophys.
Res.Commun.,92,1143-1159 (1979)］のような新規な構
造は幾つかのヒト癌ムチンの核構造に存在すると考えら
れ、この場合にはこれらも本発明で用いることができ
る。種々の動物種のムチン核構造の系統的な理解は不完
全であるが、ムチン核構造が知られると、当業者は本発
明にそれらが有用であるかを容易に決めることができる
であろう。
【００３９】さらに、種々の動物種での系統的な適用に
より、免疫原として共通の構造が見出されるだろう。こ
の様な構造を明らかにする方法には、硼化水素存在下で
のアルカリ加水分解（β−エリミネーション）、メチレ
ーション分析及び遊離した各オリゴ糖のマススペクトロ
メトリーが含まれる。これらの方法は最近刊行された本
に編纂されている [Hakomori,S.,and Kannagi,R.(198
6).In:Handbook of Experimental Immunology,Vol.I,Bl
ackwell Scientific Publications,Oxford.pp.9.1-9.3
9］。
より、免疫原として共通の構造が見出されるだろう。こ
の様な構造を明らかにする方法には、硼化水素存在下で
のアルカリ加水分解（β−エリミネーション）、メチレ
ーション分析及び遊離した各オリゴ糖のマススペクトロ
メトリーが含まれる。これらの方法は最近刊行された本
に編纂されている [Hakomori,S.,and Kannagi,R.(198
6).In:Handbook of Experimental Immunology,Vol.I,Bl
ackwell Scientific Publications,Oxford.pp.9.1-9.3
9］。
【００４０】免疫原は常法に従い単離し精製する。
【００４１】例えば、酵素的又は化学的に修飾して核構
造を生ずるムチン型糖蛋白質はセファロース４Ｂ又はセ
ファクリル２００Ｓによるゲル濾過により単離される。
造を生ずるムチン型糖蛋白質はセファロース４Ｂ又はセ
ファクリル２００Ｓによるゲル濾過により単離される。
【００４２】次いで、単離された糖蛋白質を上記方法で
酵素的又は化学的に修飾して核構造を露出させ、核構造
を免疫原としての使用のために以下の様にして精製す
る。修飾されたムチンはセファロース４Ｂ又はセファク
リル２００Ｓによるゲル濾過により分離できる。合成分
子濾過カラムの高圧クロマトグラフィ（fast liquid ch
romatography; Pharmacia製）もまた酵素的及び化学的
に修飾されたムチンの分離に有用である。しかし、修飾
されたムチンは免疫原としては精製する必要はない。少
量の非修飾ムチンの存在は本発明に従う免疫原としての
使用に有害ではないであろう。さらに、適当な注意の下
に、修飾は通常定量的に行われる。
酵素的又は化学的に修飾して核構造を露出させ、核構造
を免疫原としての使用のために以下の様にして精製す
る。修飾されたムチンはセファロース４Ｂ又はセファク
リル２００Ｓによるゲル濾過により分離できる。合成分
子濾過カラムの高圧クロマトグラフィ（fast liquid ch
romatography; Pharmacia製）もまた酵素的及び化学的
に修飾されたムチンの分離に有用である。しかし、修飾
されたムチンは免疫原としては精製する必要はない。少
量の非修飾ムチンの存在は本発明に従う免疫原としての
使用に有害ではないであろう。さらに、適当な注意の下
に、修飾は通常定量的に行われる。
【００４３】動物種に由来し、すでに核構造の形態にあ
る糖蛋白質を含むムチンは、常法により得られる。例え
ば上記のようにセファロース４Ｂ、セファクリル２００
によるゲル濾過又はＦＰＬＣにより得る。
る糖蛋白質を含むムチンは、常法により得られる。例え
ば上記のようにセファロース４Ｂ、セファクリル２００
によるゲル濾過又はＦＰＬＣにより得る。
【００４４】このようにして動物から得たムチンは、免
疫原としての使用のため、適常のゲル濾過又はＦＰＬＣ
の様な上記と同様の方法で更に精製することができる。
しかし、免疫原の純度は本質的ではない。
疫原としての使用のため、適常のゲル濾過又はＦＰＬＣ
の様な上記と同様の方法で更に精製することができる。
しかし、免疫原の純度は本質的ではない。
【００４５】上記のように、特に好ましい抗原はＴ抗
原、Ｔｎ抗原及びシアリルＴｎ抗原である。
原、Ｔｎ抗原及びシアリルＴｎ抗原である。
【００４６】Ｔ抗原は下記の核構造を有するオリゴ糖を
有する種々の糖蛋白質をシアリダーゼ処理することによ
り [Hirohashi et aI., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,70
39-7043 (1985)］調製できる。
有する種々の糖蛋白質をシアリダーゼ処理することによ
り [Hirohashi et aI., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,70
39-7043 (1985)］調製できる。
【００４７】
【化１】
【００４８】この様な糖蛋白質の典型例は、ウシ下顎腺
ムチン及びヒト赤血球グリコホリンである。ウシ下顎腺
ムチンはニシザワ（Nisizawa.K.）及びピグマン（Pigma
n.W.）の記載した方法により［Arch.0ral BioI.,1,161
(1959)］ウシ下顎腺から得ることができる。ヒツジ下顎
腺ムチンは既に記載のある同様の方法［Tettamanti,G.,
and Pigman,W.,Arch,Biochem.Biophys.,124,45-50(196
8)］により調製できる。
ムチン及びヒト赤血球グリコホリンである。ウシ下顎腺
ムチンはニシザワ（Nisizawa.K.）及びピグマン（Pigma
n.W.）の記載した方法により［Arch.0ral BioI.,1,161
(1959)］ウシ下顎腺から得ることができる。ヒツジ下顎
腺ムチンは既に記載のある同様の方法［Tettamanti,G.,
and Pigman,W.,Arch,Biochem.Biophys.,124,45-50(196
8)］により調製できる。
【００４９】ヒト赤血球糖蛋白質はヒト赤血球膜から、
Ｍａｒｃｈｅｓｉ，Ｖ．Ｔ．及びＡｎｄｒｅｗｓ，Ｅ．
Ｄ．が最初に記載した方法［Science,174,1247-1248 (1
971)］により得ることができる。
Ｍａｒｃｈｅｓｉ，Ｖ．Ｔ．及びＡｎｄｒｅｗｓ，Ｅ．
Ｄ．が最初に記載した方法［Science,174,1247-1248 (1
971)］により得ることができる。
【００５０】ウシ下顎腺ムチン及びヒト赤血球グリコホ
リンはピーナッツレクチンに対する強い反応性により特
徴付けられる。しかし、上記構造を有する他のタイプの
糖蛋白質も、Ｔ抗原を得るために用いることができる。
リンはピーナッツレクチンに対する強い反応性により特
徴付けられる。しかし、上記構造を有する他のタイプの
糖蛋白質も、Ｔ抗原を得るために用いることができる。
【００５１】糖蛋白質が上記構造を有するかどうかは、
ピーナッツレクチンカラムを用いたアフィニティークロ
マトグラフィー [Carter.W.G.,and Sharon,N.,Arch.Bio
chem.Biophys.,180,570-582 (1977)］又は抗Ｔ抗体（Ch
emBiomed,Edmonston,Alberta,Canadaから購入可能）を
用いた糖蛋白質のイムノブロッティングにより測定でき
る。
ピーナッツレクチンカラムを用いたアフィニティークロ
マトグラフィー [Carter.W.G.,and Sharon,N.,Arch.Bio
chem.Biophys.,180,570-582 (1977)］又は抗Ｔ抗体（Ch
emBiomed,Edmonston,Alberta,Canadaから購入可能）を
用いた糖蛋白質のイムノブロッティングにより測定でき
る。
【００５２】ヒツジ下顎腺ムチンはシアリダーゼ処理な
しにＴ抗原の核を含む。したがって、これを修飾なしに
Ｔ抗原免疫原として用いるこどができる。ヒツジ下顎腺
ムチンはヒツジ下顎腺から、先に記載した方法 [Teetam
anti and Pigman上記参照］で直接抽出及び精製するほ
かは、さらに精製をすることなく得られる。
しにＴ抗原の核を含む。したがって、これを修飾なしに
Ｔ抗原免疫原として用いるこどができる。ヒツジ下顎腺
ムチンはヒツジ下顎腺から、先に記載した方法 [Teetam
anti and Pigman上記参照］で直接抽出及び精製するほ
かは、さらに精製をすることなく得られる。
【００５３】Ｔｎ抗原は、種々のタイプの糖蛋白質か
ら、エキソグリコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで
順次処理して得られる。しかし、β−ガラクトシダーゼ
はα−ＧａｌＮＡｃに結合したβ１→３ガラクトシル構
造を切断可能でなければならない。
ら、エキソグリコシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで
順次処理して得られる。しかし、β−ガラクトシダーゼ
はα−ＧａｌＮＡｃに結合したβ１→３ガラクトシル構
造を切断可能でなければならない。
【００５４】適当なエキソグリコシダーゼ及びβ−ガラ
クトシダーゼの例には、クロストリジウム ペルフリン
ゲンズ（Clostridium perfringens）（Sigma Chemical
Co.,St.Louis,MO製）由来のシアリダーゼ及びカロニア
ランパス（Caronia lampas）（Seikagaku Kogyo,Tokyo,
日本製）のβ−ガラクトシダーゼが含まれる [Hirohash
i et al.,上記参照］。
クトシダーゼの例には、クロストリジウム ペルフリン
ゲンズ（Clostridium perfringens）（Sigma Chemical
Co.,St.Louis,MO製）由来のシアリダーゼ及びカロニア
ランパス（Caronia lampas）（Seikagaku Kogyo,Tokyo,
日本製）のβ−ガラクトシダーゼが含まれる [Hirohash
i et al.,上記参照］。
【００５５】エキソグリコシダーゼ及びβ−ガラクトシ
ダーゼによる順次処理は以下のように行う。０．０２％
の適当なデタージェントを含む適当な緩衝液によるムチ
ンの安定な溶液を酵素と混合し、３７℃で数時間〜１８
時間インキュベートする。０．０２〜０．０５％のトリ
トンＸ−１００又はＮＰ４０を含む５０ｍＭの酢酸緩衝
液ｐＨ４．５〜５．０がしばしば用いられる。
ダーゼによる順次処理は以下のように行う。０．０２％
の適当なデタージェントを含む適当な緩衝液によるムチ
ンの安定な溶液を酵素と混合し、３７℃で数時間〜１８
時間インキュベートする。０．０２〜０．０５％のトリ
トンＸ−１００又はＮＰ４０を含む５０ｍＭの酢酸緩衝
液ｐＨ４．５〜５．０がしばしば用いられる。
【００５６】次に、この様に処理した糖蛋白質を免疫原
として用いるために、上記の適当なカラムでゲル濾過す
ることにより精製する。修飾されないムチンの存在はイ
ンビボでの修飾ムチンの免疫反応に影響しないため、免
疫原の精製は必須ではない。
として用いるために、上記の適当なカラムでゲル濾過す
ることにより精製する。修飾されないムチンの存在はイ
ンビボでの修飾ムチンの免疫反応に影響しないため、免
疫原の精製は必須ではない。
【００５７】更に、ヒツジ下顎腺ムチンのような幾つか
の動物ムチンは天然型に多量のＴｎ抗原を含む。従っ
て、天然ヒツジ下顎ムチンはＴｎ免疫反応を引き起こす
優秀な免疫原である。
の動物ムチンは天然型に多量のＴｎ抗原を含む。従っ
て、天然ヒツジ下顎ムチンはＴｎ免疫反応を引き起こす
優秀な免疫原である。
【００５８】ヒツジ下顎線ムチンは上記のようにして得
られる。
られる。
【００５９】他の効果的なＴｎ免疫原はヒト偏平上皮細
胞癌細胞ラインＬＵ−６５から分泌される天然Ｔｎ糖蛋
白質である。この細胞は懸濁液として培養され、既使用
（spent）培地は凍結乾燥して体積を初めの１／５０ま
で減小させる。次いで濃縮既使用培地を０．０１％ナト
リウムアジドを含むリン酸緩衝生理食塩液に４℃で十分
に透析する。次に、透析した物質をセファロース４Ｂに
かけ、ゲル濾過する。ポイドポリュームをプールし、さ
らに濃縮し、セファクリル２００で再度クロマトグラフ
を行う（第１図参照）。ボイドボリュームの糖蛋白質分
画を免疫原として用いる。ヒト偏平上皮肺癌細胞ライン
ＱＧ５６及びヒトヘパトーマ細胞ラインＨＵＨ−７（第
５図参照）のように抗Ｔｎ抗体に高反応性を示す細胞ラ
インの既使用培地も又、Ｔｎ抗原の調製に使用できる。
胞癌細胞ラインＬＵ−６５から分泌される天然Ｔｎ糖蛋
白質である。この細胞は懸濁液として培養され、既使用
（spent）培地は凍結乾燥して体積を初めの１／５０ま
で減小させる。次いで濃縮既使用培地を０．０１％ナト
リウムアジドを含むリン酸緩衝生理食塩液に４℃で十分
に透析する。次に、透析した物質をセファロース４Ｂに
かけ、ゲル濾過する。ポイドポリュームをプールし、さ
らに濃縮し、セファクリル２００で再度クロマトグラフ
を行う（第１図参照）。ボイドボリュームの糖蛋白質分
画を免疫原として用いる。ヒト偏平上皮肺癌細胞ライン
ＱＧ５６及びヒトヘパトーマ細胞ラインＨＵＨ−７（第
５図参照）のように抗Ｔｎ抗体に高反応性を示す細胞ラ
インの既使用培地も又、Ｔｎ抗原の調製に使用できる。
【００６０】シアリルＴｎ抗原の分布は、どちらかとい
えば限られている。しかし、本発明に有用なシアリルＴ
ｎ抗原の一つの供給源は、偏平上皮肺癌細胞ラインＱＧ
５６及びＬＵ−６５の培養上清である [Hirohashi S.,e
t al.,Proc.NatI.Acad.Sci.USA,82,7039-7043 (198
5)］。
えば限られている。しかし、本発明に有用なシアリルＴ
ｎ抗原の一つの供給源は、偏平上皮肺癌細胞ラインＱＧ
５６及びＬＵ−６５の培養上清である [Hirohashi S.,e
t al.,Proc.NatI.Acad.Sci.USA,82,7039-7043 (198
5)］。
【００６１】第二の供給源はまた、高密度のシアリルＴ
ｎを含むヒツジ下顎腺ムチンである。
ｎを含むヒツジ下顎腺ムチンである。
【００６２】培養上清から本発明の免疫原として有用な
形でシアリルＴｎを得るために、上記の種々の細胞ライ
ンを既知の方法に従い培養する。培養上清は、Ｔｎ抗原
についての上記記載と同様の方法で処理しシアリルＴｎ
抗原を得る。ただし、シアリル結合は不安定なので、全
ての工程は限られた時間内及び低温（４℃）で行わなけ
ればならない。培養上清からムチンを調製する典型例は
下記の実施例１に記す。
形でシアリルＴｎを得るために、上記の種々の細胞ライ
ンを既知の方法に従い培養する。培養上清は、Ｔｎ抗原
についての上記記載と同様の方法で処理しシアリルＴｎ
抗原を得る。ただし、シアリル結合は不安定なので、全
ての工程は限られた時間内及び低温（４℃）で行わなけ
ればならない。培養上清からムチンを調製する典型例は
下記の実施例１に記す。
【００６３】ヒツジ下顎腺ムチンはヒツジ下顎腺から
得、Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ及びＰｉｇｍａｎらの方法
（上記参照）により精製する。
得、Ｔｅｔｔａｍａｎｔｉ及びＰｉｇｍａｎらの方法
（上記参照）により精製する。
【００６４】炭水化物エピトープＴ、Ｔｎ及びシアリル
Ｔｎは、第１２図及び第１３図にお湯帯に示した様に化
学的に合成でき、またＴａｍの記載の様に [Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,85,5409-5413 (1988)］ｔ−ブトキシカル
ボニル−β−アラニンユニットに基く高度に分岐した合
成担体分子又はポリリジン、ヒト血清アルブミンの様な
合成又は天然の担体に共有結合することができる。炭水
化物エピトープＴｎの化学合成の詳細な記載は実施例４
に明らかにする。シアリルＴｎの合成はシアリル残基を
酵素的に又は化学的に付加することにより容易に行うこ
とができる。
Ｔｎは、第１２図及び第１３図にお湯帯に示した様に化
学的に合成でき、またＴａｍの記載の様に [Proc.Natl.
Acad.Sci.USA,85,5409-5413 (1988)］ｔ−ブトキシカル
ボニル−β−アラニンユニットに基く高度に分岐した合
成担体分子又はポリリジン、ヒト血清アルブミンの様な
合成又は天然の担体に共有結合することができる。炭水
化物エピトープＴｎの化学合成の詳細な記載は実施例４
に明らかにする。シアリルＴｎの合成はシアリル残基を
酵素的に又は化学的に付加することにより容易に行うこ
とができる。
【００６５】免疫の方法 上記記載のように調製した免疫原を免疫のため以下のよ
うに処理する。
うに処理する。
【００６６】糖蛋白質抗原（例えば４．０ｍｇ）を蒸留
水（例えば４ｍ１）に溶解し、適当な量の酸処理サルモ
ネラミネソタ（Salmonella minnesota）（例えば１６ｍ
ｇ）と完全に混合し、凍結乾燥する。乾燥した混合物を
適当な容量（例えば４．０ｍｌ）の適当なキャリアー
（例えば１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７．０）に懸濁し、そのうち約１００μｌ（即
ちムチン１００μｇ及びバクテリア４００μｇ）を静脈
内投与した。
水（例えば４ｍ１）に溶解し、適当な量の酸処理サルモ
ネラミネソタ（Salmonella minnesota）（例えば１６ｍ
ｇ）と完全に混合し、凍結乾燥する。乾燥した混合物を
適当な容量（例えば４．０ｍｌ）の適当なキャリアー
（例えば１４０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７．０）に懸濁し、そのうち約１００μｌ（即
ちムチン１００μｇ及びバクテリア４００μｇ）を静脈
内投与した。
【００６７】免疫スケジュールはムチン抗原の型によら
ず、ほぼ同様である。免疫はバクテリアへの吸着の代わ
りに完全フロイントアジュバントと共に行うこともで
き、ムチン及びサルモネラミネソタ（Salmonella minne
sota）の量比は変化できる。既に記載されているように
［Yang,W.W.,et al.,J.Exp.Med.,150,1008-1019 (197
9)］、サルモネラミネソタを酢酸処理した時、最も良い
結果が得られている。
ず、ほぼ同様である。免疫はバクテリアへの吸着の代わ
りに完全フロイントアジュバントと共に行うこともで
き、ムチン及びサルモネラミネソタ（Salmonella minne
sota）の量比は変化できる。既に記載されているように
［Yang,W.W.,et al.,J.Exp.Med.,150,1008-1019 (197
9)］、サルモネラミネソタを酢酸処理した時、最も良い
結果が得られている。
【００６８】免疫に使用する宿主としては、任意の系統
のマウスやラット、又はその脾細胞がハイブリドーマの
調製に適当な、即ち、安定なハイブリドーマを確立する
ためのＨＡＴ感受性ミエローマ細胞ラインとの細胞融合
に感受性を有する、他の種類の動物が可能である。
のマウスやラット、又はその脾細胞がハイブリドーマの
調製に適当な、即ち、安定なハイブリドーマを確立する
ためのＨＡＴ感受性ミエローマ細胞ラインとの細胞融合
に感受性を有する、他の種類の動物が可能である。
【００６９】免疫スケジュールは宿主動物のムチン免疫
に対する感受性に依存するが上記方法はマウスに適当で
ある。他の条件も又適用できる。適当な免疫スケジュー
ルは当業者が決定できる。
に対する感受性に依存するが上記方法はマウスに適当で
ある。他の条件も又適用できる。適当な免疫スケジュー
ルは当業者が決定できる。
【００７０】例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウスに適当な免疫
スケジュールとしては、調製した免疫原を尾静脈から週
１回、５週間静脈内投与し、次いで１か月放置した後、
調製免疫原でプーストする。宿主に投与する免疫原製剤
の量はムチンの分子量、炭水化物エピトープの露出度、
及びムチン型糖蛋白質に関連するエピトープの特殊性と
密度に依存する。マウスに投与する糖蛋白質の範囲は、
生理食塩水１００μｌに懸濁したサルモネラミネソタ３
０〜５０μｇをコートされた３〜５μｇであり、体重１
００〜１５０ｇの各マウス個体に静脈内投与する。
スケジュールとしては、調製した免疫原を尾静脈から週
１回、５週間静脈内投与し、次いで１か月放置した後、
調製免疫原でプーストする。宿主に投与する免疫原製剤
の量はムチンの分子量、炭水化物エピトープの露出度、
及びムチン型糖蛋白質に関連するエピトープの特殊性と
密度に依存する。マウスに投与する糖蛋白質の範囲は、
生理食塩水１００μｌに懸濁したサルモネラミネソタ３
０〜５０μｇをコートされた３〜５μｇであり、体重１
００〜１５０ｇの各マウス個体に静脈内投与する。
【００７１】完全フロイントアジュバントを用いる時
は、５００μｌの生理食塩水中の約２０μｇの糖蛋白質
を５００μｌの完全フロイントアジュバントと共に乳化
し、約２００μｌを複数の部位に皮下投与する（約５０
μｌ／サイト）。サルモネラミネソタをコートされ、又
は完全フロイントアジュバントと混合した、同様の量の
抗原が、ラット、ハムスター又はモルモットの様な他の
宿主に使用され、数倍量の抗原が、ウサギの様な他の宿
主に使用される。動物の体重に比例して抗原量を増加さ
せる必要は無い。
は、５００μｌの生理食塩水中の約２０μｇの糖蛋白質
を５００μｌの完全フロイントアジュバントと共に乳化
し、約２００μｌを複数の部位に皮下投与する（約５０
μｌ／サイト）。サルモネラミネソタをコートされ、又
は完全フロイントアジュバントと混合した、同様の量の
抗原が、ラット、ハムスター又はモルモットの様な他の
宿主に使用され、数倍量の抗原が、ウサギの様な他の宿
主に使用される。動物の体重に比例して抗原量を増加さ
せる必要は無い。
【００７２】免疫は、十分な抗体が全血清から検出され
るまで繰り返す。宿主の脾細胞を取出し、脾細胞をＨＡ
Ｔ感受性ミエローマ細胞とよく確立された技術により融
合する [Kohler,G.AND Milstein,C.,Nature,256,495-49
7 (1975) and Young,W.W.etal（上記参照）］。ＨＡＴ
感受性ミエローマ細胞としては、例えばＮＳ−１、ＳＰ
−１又はＳＰ−２が可能であるが、任意の種類のＨＡＴ
感受性ミエローマ細胞を用いることができる。場合によ
り、宿主血清中に抗体が検出されなくても、宿主脾細胞
とミエローマ細胞との融合の後ハイブリドーマを確立で
きる。従って、細胞融合の前に抗体を検出することは必
須ではない。融合は、通常ヤングらの記載のように（上
記）、ポリエチレングリコール中で行われる。
るまで繰り返す。宿主の脾細胞を取出し、脾細胞をＨＡ
Ｔ感受性ミエローマ細胞とよく確立された技術により融
合する [Kohler,G.AND Milstein,C.,Nature,256,495-49
7 (1975) and Young,W.W.etal（上記参照）］。ＨＡＴ
感受性ミエローマ細胞としては、例えばＮＳ−１、ＳＰ
−１又はＳＰ−２が可能であるが、任意の種類のＨＡＴ
感受性ミエローマ細胞を用いることができる。場合によ
り、宿主血清中に抗体が検出されなくても、宿主脾細胞
とミエローマ細胞との融合の後ハイブリドーマを確立で
きる。従って、細胞融合の前に抗体を検出することは必
須ではない。融合は、通常ヤングらの記載のように（上
記）、ポリエチレングリコール中で行われる。
【００７３】本発明で使用する好ましいミエローマ細胞
ラインはＳＰ−２である。
ラインはＳＰ−２である。
【００７４】融合細胞は９６ウェルプレートで、ミニク
ローンが形成されるまで培養する。多くの増殖する生存
融合細胞を得るためには、最終ブースター投与の４８〜
７２時間後に脾細胞を用い、よく分化したミエローマ細
泡と融合させることが重要である。インキュベーター中
の湿度及びＣＯ2濃度は、融合細胞の培養初期の段階に
注意深く制御しなくてはならない。
ローンが形成されるまで培養する。多くの増殖する生存
融合細胞を得るためには、最終ブースター投与の４８〜
７２時間後に脾細胞を用い、よく分化したミエローマ細
泡と融合させることが重要である。インキュベーター中
の湿度及びＣＯ2濃度は、融合細胞の培養初期の段階に
注意深く制御しなくてはならない。
【００７５】支持細胞（feeder celI）は、本発明の方
法に従って融合細胞を増殖させるためには必須ではな
い。当業者は適当な培養条件を容易に決定できる。
法に従って融合細胞を増殖させるためには必須ではな
い。当業者は適当な培養条件を容易に決定できる。
【００７６】適当な培養時間の後、免疫に使用した糖蛋
白質の核構造と反応する抗体を分泌するハイブリドーマ
を、限界希釈法によりクローニング及びサブクローニン
グする。即ち、新たな培養体当り１個以下の細胞しか期
待されない点まで希釈した後、ウェルにプレーティング
する。
白質の核構造と反応する抗体を分泌するハイブリドーマ
を、限界希釈法によりクローニング及びサブクローニン
グする。即ち、新たな培養体当り１個以下の細胞しか期
待されない点まで希釈した後、ウェルにプレーティング
する。
【００７７】一般に、９６ウェルプレートの各ウェル
を、糖蛋白質のＰＢＳ溶液と共にインキュベートするこ
とにより、免疫原として使用した核構造を含むムチン糖
蛋白質でコートする。即ち、５〜１０μｇ／５０μｌ／
ウェルを加え、一晩インキュベートする。糖蛋白質溶液
を除去し、洗浄し、さらにウシ血清アルブミン（１０μ
ｇ／５０μｌ／ウェル）と共にインキュベートし、抗体
のスクリーニングに使用する前にプレートをブロックす
る。この方法はヒロハシらにより記載されている（上記
参照）。
を、糖蛋白質のＰＢＳ溶液と共にインキュベートするこ
とにより、免疫原として使用した核構造を含むムチン糖
蛋白質でコートする。即ち、５〜１０μｇ／５０μｌ／
ウェルを加え、一晩インキュベートする。糖蛋白質溶液
を除去し、洗浄し、さらにウシ血清アルブミン（１０μ
ｇ／５０μｌ／ウェル）と共にインキュベートし、抗体
のスクリーニングに使用する前にプレートをブロックす
る。この方法はヒロハシらにより記載されている（上記
参照）。
【００７８】特別の抗原と反応する抗体を分泌するハイ
ブリドーマを、以下のようにしてスクリーニングした。
抗原でコートしたウェルに結合した抗体は、最初にヤン
グらが記載したように（上記参照）、通常、二次抗体
（抗マウスＩｇＭ及びＩｇＧヤギ又はウサギ抗体）の後
125Ｉラベル化プロテインＡにより検出する。本方法は
市販のＥＬＩＳＡアッセイより感受性が良いが、ＥＬＩ
ＳＡも使用可能である。ＥＬＩＳＡ法は市販の自動リー
ダー及びＥＬＩＳＡキットの使用により便利に行われ
る。
ブリドーマを、以下のようにしてスクリーニングした。
抗原でコートしたウェルに結合した抗体は、最初にヤン
グらが記載したように（上記参照）、通常、二次抗体
（抗マウスＩｇＭ及びＩｇＧヤギ又はウサギ抗体）の後
125Ｉラベル化プロテインＡにより検出する。本方法は
市販のＥＬＩＳＡアッセイより感受性が良いが、ＥＬＩ
ＳＡも使用可能である。ＥＬＩＳＡ法は市販の自動リー
ダー及びＥＬＩＳＡキットの使用により便利に行われ
る。
【００７９】このようにして、本発明の方法に従い単離
されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体は、ハイブリドーマ細胞培養体の大バッチを増殖さ
せ上清から抗体を精製することにより、又はハイブリド
ーマラインをマウスに投与し腹腔液の生成を刺激するこ
とにより、多量に製造できる。両方法は技術的によく知
られている。本発明に従ってモノクローナル抗体を多量
に製造する方法はヤングらにより記載されている（上記
参照）。
されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体は、ハイブリドーマ細胞培養体の大バッチを増殖さ
せ上清から抗体を精製することにより、又はハイブリド
ーマラインをマウスに投与し腹腔液の生成を刺激するこ
とにより、多量に製造できる。両方法は技術的によく知
られている。本発明に従ってモノクローナル抗体を多量
に製造する方法はヤングらにより記載されている（上記
参照）。
【００８０】本発明に従い単離されたハイブリドーマは
懸濁培養の大バッチで増殖させ、又は、より簡便には、
細胞がパックされ高密度に成育し、その中で抗体が培地
中に拡散することができるファイバーグラスコンテナー
中で、増殖させることができる。モノクローナル抗体
は、例えばプロテインＡを用いるアフィニティー単離、
逆相アルキル化シリカゲルによる高圧液体クロマトグラ
フィー又は合成ポリスチレンゲル濾過カラムの様な知ら
れた方法により精製できる。
懸濁培養の大バッチで増殖させ、又は、より簡便には、
細胞がパックされ高密度に成育し、その中で抗体が培地
中に拡散することができるファイバーグラスコンテナー
中で、増殖させることができる。モノクローナル抗体
は、例えばプロテインＡを用いるアフィニティー単離、
逆相アルキル化シリカゲルによる高圧液体クロマトグラ
フィー又は合成ポリスチレンゲル濾過カラムの様な知ら
れた方法により精製できる。
【００８１】上記方法に従えば、モノクローナル抗体を
分泌するハイブリドーマは、常法により製造された抗体
と比べて、少なくとも質的に同等の優れた抗体を製造で
き、むしろ、本発明のモノクローナル抗体は、完全なグ
リコシル化構造を持つ正常糖配列を有する正常糖蛋白質
と好ましくない交叉反応をしない点で、公知のヒト癌関
連抗原に特異的なモノクローナル抗体よりも優れてい
る。本発明の方法に従って分離された３種の好ましいモ
ノクローナル抗体は、ＢＭ−８、ＢＭ−３及びＢＭ−４
である。これらモノクローナル抗体を分泌する、ハイブ
リドーマＢＭ−８、ＢＭ−３及びＢＭ−４と名付けられ
たハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション、ロックビル、メリーランドに寄託され
ており、各々のＡＴＣＣ寄託番号は、ＨＢ−９８７３、
ＨＢ−９６５３及びＨＢ−９６５４である。本発明に従
うモノクローナル抗体ＢＭ−８はハイブリドーマＢＭ−
８により分泌され、以下の確認された性質を有する。
分泌するハイブリドーマは、常法により製造された抗体
と比べて、少なくとも質的に同等の優れた抗体を製造で
き、むしろ、本発明のモノクローナル抗体は、完全なグ
リコシル化構造を持つ正常糖配列を有する正常糖蛋白質
と好ましくない交叉反応をしない点で、公知のヒト癌関
連抗原に特異的なモノクローナル抗体よりも優れてい
る。本発明の方法に従って分離された３種の好ましいモ
ノクローナル抗体は、ＢＭ−８、ＢＭ−３及びＢＭ−４
である。これらモノクローナル抗体を分泌する、ハイブ
リドーマＢＭ−８、ＢＭ−３及びＢＭ−４と名付けられ
たハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション、ロックビル、メリーランドに寄託され
ており、各々のＡＴＣＣ寄託番号は、ＨＢ−９８７３、
ＨＢ−９６５３及びＨＢ−９６５４である。本発明に従
うモノクローナル抗体ＢＭ−８はハイブリドーマＢＭ−
８により分泌され、以下の確認された性質を有する。
【００８２】（１）ＩｇＧ2aイソタイプであり、（２〉
Ｔｎ抗原と反応し、（３）ＧａｌＮＡｃに特異的であ
り、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ又はＧｌｃには特異的でな
く、（４）α−ＧａｌＮＡｃにエピトープ特異性を有
し、β−ＧａｌＮＡｃにはエピトープ特異性を有さず、
且つ（５）血液型Ａとは交叉反応しない。
Ｔｎ抗原と反応し、（３）ＧａｌＮＡｃに特異的であ
り、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ又はＧｌｃには特異的でな
く、（４）α−ＧａｌＮＡｃにエピトープ特異性を有
し、β−ＧａｌＮＡｃにはエピトープ特異性を有さず、
且つ（５）血液型Ａとは交叉反応しない。
【００８３】更に、モノクローナル抗体ＢＭ−８は、第
３図に示し、下記の実施例１に記載したように、種々の
細胞ラインと結合する。モノクローナル抗体ＢＭ−８
は、正常ヒト線維芽細胞ＢＲＡＳＣＨ及びＷＩ−３８又
は腫瘍細胞ラインＨＥＬ−２９９及びＩＭＲ−９０とは
反応しない。
３図に示し、下記の実施例１に記載したように、種々の
細胞ラインと結合する。モノクローナル抗体ＢＭ−８
は、正常ヒト線維芽細胞ＢＲＡＳＣＨ及びＷＩ−３８又
は腫瘍細胞ラインＨＥＬ−２９９及びＩＭＲ−９０とは
反応しない。
【００８４】モノクローナル抗体ＢＭ−８は、第４図に
示し、下記実施例１に記載したように、種々の腫瘍細胞
に対するサイトトキシック細胞の活性化を示す。特に、
ヒト赤白血病細胞ラインＫ５６２及びヒト偏平上皮細胞
肺癌ＬＵ−６５は、モノクローナル抗体ＢＭ−８により
誘導される抗体依存性細胞障害（antibody-dependentcy
totoxicity）に顕著な感受性を示し、ヒト線維芽細胞Ｂ
ＲＡＳＣＨ及びＷＩ−３８並びにヒト赤白血病細胞ライ
ンＨＥＬ２９９はＢＭ−８依存性細胞障害に感受性を持
たない。
示し、下記実施例１に記載したように、種々の腫瘍細胞
に対するサイトトキシック細胞の活性化を示す。特に、
ヒト赤白血病細胞ラインＫ５６２及びヒト偏平上皮細胞
肺癌ＬＵ−６５は、モノクローナル抗体ＢＭ−８により
誘導される抗体依存性細胞障害（antibody-dependentcy
totoxicity）に顕著な感受性を示し、ヒト線維芽細胞Ｂ
ＲＡＳＣＨ及びＷＩ−３８並びにヒト赤白血病細胞ライ
ンＨＥＬ２９９はＢＭ−８依存性細胞障害に感受性を持
たない。
【００８５】Ｔｎ抗原に対するＩｇＭモノクローナル抗
体を分泌する２個のハイブリドーマＮＣＣ−ＬＵ−３５
及び−８１は、既に確立されている。これらの抗体は肺
偏平上皮細胞癌ＬＵ−６５により免疫した後、得られる
[Hirohashi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7029-
7043 (1985)］。抗体Ｂ−Ｍ−８の細胞増殖の阻害及び
細胞障害の性質は、本抗体を明確にＮＣＣ−ＬＵ−３５
及び−８１由来の抗体と区別する。
体を分泌する２個のハイブリドーマＮＣＣ−ＬＵ−３５
及び−８１は、既に確立されている。これらの抗体は肺
偏平上皮細胞癌ＬＵ−６５により免疫した後、得られる
[Hirohashi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,7029-
7043 (1985)］。抗体Ｂ−Ｍ−８の細胞増殖の阻害及び
細胞障害の性質は、本抗体を明確にＮＣＣ−ＬＵ−３５
及び−８１由来の抗体と区別する。
【００８６】本発明のモノクローナル抗体ＢＭ−３はハ
イブリドーマＢＭ−３から分泌され、以下の確認された
性質を有する： （１）ＩｇＭイソタイプであり、（２）シアリルＴｎ抗
原と反応し、Ｔ抗原とは反応せず、及び（３）Ｎｅｕ
Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに
対しエピトープ特異性を有し、ＮｅｕＡｃα２→６Ｇａ
ｌＮＡｃβ１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにはエピトープ特異
性を有さない。
イブリドーマＢＭ−３から分泌され、以下の確認された
性質を有する： （１）ＩｇＭイソタイプであり、（２）シアリルＴｎ抗
原と反応し、Ｔ抗原とは反応せず、及び（３）Ｎｅｕ
Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに
対しエピトープ特異性を有し、ＮｅｕＡｃα２→６Ｇａ
ｌＮＡｃβ１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにはエピトープ特異
性を有さない。
【００８７】本発明のモノクローナル抗体ＢＭ−４はハ
イブリドーマＢＭ−４から分泌され、以下の確認された
性質を有する： （１）ＩｇＧ1イソタイプであり、（２）シアリルＴｎ
抗原と反応し、Ｔ抗原又はＴｎ抗原とは反応せず、
（３）ＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒに対しエピトープ特異性を有し、ＮｅｕＡｃ
α２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにはエ
ピトープ特異性を有さず、及び（４）容易にＦａｂ又は
（Ｆａｂ）2フラグメントに分解される。
イブリドーマＢＭ−４から分泌され、以下の確認された
性質を有する： （１）ＩｇＧ1イソタイプであり、（２）シアリルＴｎ
抗原と反応し、Ｔ抗原又はＴｎ抗原とは反応せず、
（３）ＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅ
ｒ／Ｔｈｒに対しエピトープ特異性を有し、ＮｅｕＡｃ
α２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにはエ
ピトープ特異性を有さず、及び（４）容易にＦａｂ又は
（Ｆａｂ）2フラグメントに分解される。
【００８８】抗体イソタイプの確認 本発明に方法に従い単離されたモノクローナル抗体のイ
ソタイプは、Cappel Laboratriesのような種々の業者か
ら購入できるイソタイプ特異的抗マウス抗体に対する抗
体を用いた、固相ラジオイムノアッセイの様な通常の方
法により確認できる。
ソタイプは、Cappel Laboratriesのような種々の業者か
ら購入できるイソタイプ特異的抗マウス抗体に対する抗
体を用いた、固相ラジオイムノアッセイの様な通常の方
法により確認できる。
【００８９】抗体の特異性の確認 本発明に従い単離された抗体の特異性は、天然の及び酵
素的又は化学的に処理したムチン型糖蛋白質に対する
（１）競合結合アッセイ、（２）阻害アッセイ、（３〉
結合アッセイを含む多くの方法で確認できる。
素的又は化学的に処理したムチン型糖蛋白質に対する
（１）競合結合アッセイ、（２）阻害アッセイ、（３〉
結合アッセイを含む多くの方法で確認できる。
【００９０】競合結合アッセイ 本アッセイは固相ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）競合
アッセイである。本アッセイは、本発明の方法に従い分
離されたモノクローナル抗体の使用及び本発明の方法に
従い分離されたモノクローナル抗体が有すると推定され
るのと同じ抗原特異性を有すると知られている他のモノ
クローナル抗体１種以上の使用を含む。さらに２種のモ
ノクローナル抗体は、異なるイソタイプを有し、又は共
に存在した時に二次抗体に別々に認識され得るような異
なる種由来のものでなければならない。
アッセイである。本アッセイは、本発明の方法に従い分
離されたモノクローナル抗体の使用及び本発明の方法に
従い分離されたモノクローナル抗体が有すると推定され
るのと同じ抗原特異性を有すると知られている他のモノ
クローナル抗体１種以上の使用を含む。さらに２種のモ
ノクローナル抗体は、異なるイソタイプを有し、又は共
に存在した時に二次抗体に別々に認識され得るような異
なる種由来のものでなければならない。
【００９１】このアッセイにおいて、既知の特異性を有
する各モノクローナル抗体について、２つのインキュベ
ーションを行う。即ち、１つのインキュベーションは、
２つのモノクローナル抗体のうちｌつを一定量で用い、
チャレンジするモノクローナル抗体を順次増加して用い
て行う。他のインキュベーションでは、２つのモノクロ
ーナル抗体の役割を入れ替える。即ち、最初のインキュ
ベーションで一定量用いた抗体を、二回目のインキュベ
ーションでは順次増加して用い、最初のインキュベーシ
ョンで順次増加して用いた抗体を、二回目のインキュベ
ーションでは一定量用いる。
する各モノクローナル抗体について、２つのインキュベ
ーションを行う。即ち、１つのインキュベーションは、
２つのモノクローナル抗体のうちｌつを一定量で用い、
チャレンジするモノクローナル抗体を順次増加して用い
て行う。他のインキュベーションでは、２つのモノクロ
ーナル抗体の役割を入れ替える。即ち、最初のインキュ
ベーションで一定量用いた抗体を、二回目のインキュベ
ーションでは順次増加して用い、最初のインキュベーシ
ョンで順次増加して用いた抗体を、二回目のインキュベ
ーションでは一定量用いる。
【００９２】各インキュベーションでは、２つの抗体は
最初に混合され、次いで抗体の混合物を調べたい抗原と
共にインキュベートする。簡単に述べると、順次希釈し
た（約１２希釈で十分である）１つの抗体（約１．５μ
ｇ〜６０ｎｇ）を、１００μｌの適当な緩衝液中、例え
ばＰＢＳ中の約１．５μｇの他の抗体に加える。次に、
２種のモノクローナル抗体の役割を入れ替えた反応を行
う。各混合物の量を同じ緩衝液、例えばＰＢＳで２００
μｌに調整し、そのうち約１００μｌの２種の抗体の混
合液を、予め調べたい抗原でコートし（約５μｇ／ウェ
ル）、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックしたアッセイプ
レート中で、一晩４℃でインキュベートする。インキュ
ベーションの後、プレートを適当な回数、例えば３回、
適当な緩衝液、例えばＰＢＳで洗浄し、チャレンジ後抗
原に結合したままのモノクローナル抗体の量を、種又は
サブクラス特異的抗体（例えばマウスＩｇＭに対しては
抗マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ3に対しては抗マウスＩ
ｇＧ3）と反応させた後、適当にラベルしたプローブと
反応させて測定する。
最初に混合され、次いで抗体の混合物を調べたい抗原と
共にインキュベートする。簡単に述べると、順次希釈し
た（約１２希釈で十分である）１つの抗体（約１．５μ
ｇ〜６０ｎｇ）を、１００μｌの適当な緩衝液中、例え
ばＰＢＳ中の約１．５μｇの他の抗体に加える。次に、
２種のモノクローナル抗体の役割を入れ替えた反応を行
う。各混合物の量を同じ緩衝液、例えばＰＢＳで２００
μｌに調整し、そのうち約１００μｌの２種の抗体の混
合液を、予め調べたい抗原でコートし（約５μｇ／ウェ
ル）、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックしたアッセイプ
レート中で、一晩４℃でインキュベートする。インキュ
ベーションの後、プレートを適当な回数、例えば３回、
適当な緩衝液、例えばＰＢＳで洗浄し、チャレンジ後抗
原に結合したままのモノクローナル抗体の量を、種又は
サブクラス特異的抗体（例えばマウスＩｇＭに対しては
抗マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ3に対しては抗マウスＩ
ｇＧ3）と反応させた後、適当にラベルしたプローブと
反応させて測定する。
【００９３】種又はサブクラス特異的抗体との反応に適
当な反応時間は、約２時間であり、適当な反応温度は室
温即ち２２〜２５℃である。
当な反応時間は、約２時間であり、適当な反応温度は室
温即ち２２〜２５℃である。
【００９４】反応の後、プレートを適当な回数、例えば
３回、適当な緩衝液、例えばＰＢＳで洗浄し、適当にラ
ベルしたプローブを加える。適当なプローブの１つの例
は、125Ｉラベル化プロテインＡである。例えば１．３
時間室温、即ち２２〜２５℃での適当なインキュベーシ
ョンの後、プレートを例えば５回、例えばＰＢＳのよう
な適当な緩衝液で再度洗浄し、使用したラベルの種類に
従いプローブの量を定量する。例えば、125Ｉラベル化
プローブはガンマーカウンターでカウントする。
３回、適当な緩衝液、例えばＰＢＳで洗浄し、適当にラ
ベルしたプローブを加える。適当なプローブの１つの例
は、125Ｉラベル化プロテインＡである。例えば１．３
時間室温、即ち２２〜２５℃での適当なインキュベーシ
ョンの後、プレートを例えば５回、例えばＰＢＳのよう
な適当な緩衝液で再度洗浄し、使用したラベルの種類に
従いプローブの量を定量する。例えば、125Ｉラベル化
プローブはガンマーカウンターでカウントする。
【００９５】本発明の方法に従って単離されたモノクロ
ーナル抗体の特定の抗原に対する結合が、既知の特異性
を有するモノクローナル抗体により競合的に阻害された
場合には、本発明の方法に従い単離されたモノクローナ
ル抗体はその特定の抗原に特異性を持つと考えられる。
ーナル抗体の特定の抗原に対する結合が、既知の特異性
を有するモノクローナル抗体により競合的に阻害された
場合には、本発明の方法に従い単離されたモノクローナ
ル抗体はその特定の抗原に特異性を持つと考えられる。
【００９６】本アッセイが、通常抗マウスＩｇＧ＋Ｉｇ
Ｍである二次抗体を、省いて行うことができることは、
当業者に明らかである。
Ｍである二次抗体を、省いて行うことができることは、
当業者に明らかである。
【００９７】阻害アッセイ 本発明の方法に従い分離された抗体は糖蛋白質の核構造
に対するものであるので、特異性は、そのモノクローナ
ル抗体が対すると仮定される抗原への結合能に対する、
種々の単糖及び二糖の阻害能をアッセイすることにより
確認できる。
に対するものであるので、特異性は、そのモノクローナ
ル抗体が対すると仮定される抗原への結合能に対する、
種々の単糖及び二糖の阻害能をアッセイすることにより
確認できる。
【００９８】アッセイはモノクローナル抗体を種々の単
糖又は二糖とインキュベートすることにより行われる。
モノクローナル抗体と糖との適当なモル比は約１：５か
ら約１：１００で、適当な緩衝液はＰＢＳである。イン
キュベーションはモノクローナル抗体が糖と反応するの
に十分な時間及び温度で、例えば、室温付近で１時間行
う。インキュベーションの後、モノクローナル抗体／糖
の混合物の部分を取出し、モノクローナル抗体が特異性
を有すると仮定される抗原と、上記と類似の方法でイン
キュベートする。即ち、予めＰＢＳの様な適当な緩衝液
中で、抗原でコートしＢＳＡでブロックしたウェルに、
混合物の部分を加える。抗原との適当なインキュベーシ
ョン条件は、４℃一晩である。
糖又は二糖とインキュベートすることにより行われる。
モノクローナル抗体と糖との適当なモル比は約１：５か
ら約１：１００で、適当な緩衝液はＰＢＳである。イン
キュベーションはモノクローナル抗体が糖と反応するの
に十分な時間及び温度で、例えば、室温付近で１時間行
う。インキュベーションの後、モノクローナル抗体／糖
の混合物の部分を取出し、モノクローナル抗体が特異性
を有すると仮定される抗原と、上記と類似の方法でイン
キュベートする。即ち、予めＰＢＳの様な適当な緩衝液
中で、抗原でコートしＢＳＡでブロックしたウェルに、
混合物の部分を加える。抗原との適当なインキュベーシ
ョン条件は、４℃一晩である。
【００９９】次いで、抗原に対するモノクローナル抗体
の結合に対する種々の糖の阻害効果を、上記固相ＲＩＡ
により確認した。
の結合に対する種々の糖の阻害効果を、上記固相ＲＩＡ
により確認した。
【０１００】当業者は、阻害実験に使用する適当な糖を
容易に決めることができる。
容易に決めることができる。
【０１０１】例えば、Ｔｎ抗原に特異性を有すると仮定
されるモノクローナル抗体については、ＧａｌＮＡｃ、
ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ及びＧｌｃの単糖が使用できる。
もしもモノクローナル抗体が実際Ｔｎ抗原に特異的なら
ば、モノクローナル抗体の抗原に対する結合はＧａｌＮ
Ａｃに阻害され、他の３つの糖には阻害されない。更
に、Ｔｎ抗原に特異的なモノクローナル抗体について
は、抗体が特異性を有するＧａｌＮＡｃの実際のエピト
ープは、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ、
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ、並びにα
−誘導体の混合物及びβ−ｐ−ニトロフェニル誘導体の
混合物を用いた阻害アッセイを行うことにより確認でき
る。
されるモノクローナル抗体については、ＧａｌＮＡｃ、
ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ及びＧｌｃの単糖が使用できる。
もしもモノクローナル抗体が実際Ｔｎ抗原に特異的なら
ば、モノクローナル抗体の抗原に対する結合はＧａｌＮ
Ａｃに阻害され、他の３つの糖には阻害されない。更
に、Ｔｎ抗原に特異的なモノクローナル抗体について
は、抗体が特異性を有するＧａｌＮＡｃの実際のエピト
ープは、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ、
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ、並びにα
−誘導体の混合物及びβ−ｐ−ニトロフェニル誘導体の
混合物を用いた阻害アッセイを行うことにより確認でき
る。
【０１０２】もしも、モノクローナル抗体がＴｎ抗原に
特異的ならば、モノクローナル抗体のＴｎ抗原に対する
結合は、α−ｐ−ニトロフェニル誘導体に阻害され、β
−ｐ−ニトロフェニル誘導体には阻害されない。さら
に、完全ではないある程度の阻害が、α−ｐ−ニトロフ
ェニル誘導体及びβ−ｐ−ニトロフェニル誘導体混合物
で見られる。
特異的ならば、モノクローナル抗体のＴｎ抗原に対する
結合は、α−ｐ−ニトロフェニル誘導体に阻害され、β
−ｐ−ニトロフェニル誘導体には阻害されない。さら
に、完全ではないある程度の阻害が、α−ｐ−ニトロフ
ェニル誘導体及びβ−ｐ−ニトロフェニル誘導体混合物
で見られる。
【０１０３】さらなる例として、もしもモノクローナル
抗体がシアリルＴｎ抗原に特異性を有するならば、Ｇａ
ｌＮＡｃ及びＮｅｕＡｃ、Ｌ−フコース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−グルコース及びＤ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ンの様な単糖を用いて阻害アッセイを行うことができ
る。
抗体がシアリルＴｎ抗原に特異性を有するならば、Ｇａ
ｌＮＡｃ及びＮｅｕＡｃ、Ｌ−フコース、Ｄ−ガラクト
ース、Ｄ−グルコース及びＤ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ンの様な単糖を用いて阻害アッセイを行うことができ
る。
【０１０４】抗体がシアリルＴｎ抗原に特異的であれ
ば、抗体の抗原に対する結合はＧａｌＮＡｃ及びＮｅｕ
Ａｃにより阻害されるが他の単糖には阻害されない。
ば、抗体の抗原に対する結合はＧａｌＮＡｃ及びＮｅｕ
Ａｃにより阻害されるが他の単糖には阻害されない。
【０１０５】同様に、二糖ＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮ
Ａｃα１→Ｏ−セリンはシアリルＴｎ抗原に特異的なモ
ノクローナル抗体の反応を阻害するが、ラクトースは阻
害活性を持たない。しかし、Ｔｎ抗原に対するモノクロ
ーナル抗体はＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｏ
構造と交叉反応可能であり、従って、この構造のＯ−プ
ロピル誘導体には軽度に阻害される。
Ａｃα１→Ｏ−セリンはシアリルＴｎ抗原に特異的なモ
ノクローナル抗体の反応を阻害するが、ラクトースは阻
害活性を持たない。しかし、Ｔｎ抗原に対するモノクロ
ーナル抗体はＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→Ｏ
構造と交叉反応可能であり、従って、この構造のＯ−プ
ロピル誘導体には軽度に阻害される。
【０１０６】処理又は非処理のムチン型糖蛋白質に対す
る結合 本アッセイは、種々のムチンに対するある種の酵素的及
び／又は化学的処理が抗原構造を露出又は消失させると
いうという事実に基く。本アッセイは以下の様に行う。
ムチン型糖蛋白質で９６ウェルのプラスティックプレー
トを、一晩１０μｇ／５０μｌＰＢＳ／ウェルでインキ
ュベートすることによりコートする。プラスティック表
面に吸収させる糖蛋白質は、各々シアリダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、並びにα−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニダーゼにより処理されたもの又はその未処理のもので
ある。次いで、この様な処理又は未処理の固相糖蛋白質
に対する抗体の結合を比較する。抗体ＢＭ−３により確
認されるシアリルＴｎ活性は、プラスティック表面に吸
収されたヒツジ下顎腺ムチンの様なシアリルＴｎ抗原を
シアリダーゼで処理すると、ＢＭ−８により確認される
Ｔｎ活性に変換できる。Ｔ又はＴｎ活性を持たないヒト
赤血球グリコホリンＡは、プラスティック表面に吸収さ
せ、シアリダーゼで処理するか（Ｔ抗原に変換する）、
又はシアリダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで順次処理
すると（Ｔｎ抗原に変換する）、Ｔ又はＴｎ抗原に変換
できる。このような方法はヒロハシらにより記載されて
いる（上記参照）。
る結合 本アッセイは、種々のムチンに対するある種の酵素的及
び／又は化学的処理が抗原構造を露出又は消失させると
いうという事実に基く。本アッセイは以下の様に行う。
ムチン型糖蛋白質で９６ウェルのプラスティックプレー
トを、一晩１０μｇ／５０μｌＰＢＳ／ウェルでインキ
ュベートすることによりコートする。プラスティック表
面に吸収させる糖蛋白質は、各々シアリダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、並びにα−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ニダーゼにより処理されたもの又はその未処理のもので
ある。次いで、この様な処理又は未処理の固相糖蛋白質
に対する抗体の結合を比較する。抗体ＢＭ−３により確
認されるシアリルＴｎ活性は、プラスティック表面に吸
収されたヒツジ下顎腺ムチンの様なシアリルＴｎ抗原を
シアリダーゼで処理すると、ＢＭ−８により確認される
Ｔｎ活性に変換できる。Ｔ又はＴｎ活性を持たないヒト
赤血球グリコホリンＡは、プラスティック表面に吸収さ
せ、シアリダーゼで処理するか（Ｔ抗原に変換する）、
又はシアリダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼで順次処理
すると（Ｔｎ抗原に変換する）、Ｔ又はＴｎ抗原に変換
できる。このような方法はヒロハシらにより記載されて
いる（上記参照）。
【０１０７】当業者は本アッセイに使用される適当なム
チン型糖蛋白質並びに酵素的及び化学的処理を容易に決
めることができる。
チン型糖蛋白質並びに酵素的及び化学的処理を容易に決
めることができる。
【０１０８】例えば、モノクローナル抗体がシアリルＴ
ｎ抗原に特異的であるならば、種々の酵素的分解の前及
び後にＯＳＭに対する抗体の反応性を比較することがで
きる。具体的に言うと、天然ＯＳＭの約９０％の炭水化
物鎖はシアリルＴｎ抗原である。しかし、この抗原はシ
アリダーゼを用いた酵素的処理により分解される。この
ように、シアリルＴｎ抗原に特異的なモノクローナル抗
体は、天然ＯＳＭと反応するがシアリダーゼ処理ＯＳＭ
とは反応しない。
ｎ抗原に特異的であるならば、種々の酵素的分解の前及
び後にＯＳＭに対する抗体の反応性を比較することがで
きる。具体的に言うと、天然ＯＳＭの約９０％の炭水化
物鎖はシアリルＴｎ抗原である。しかし、この抗原はシ
アリダーゼを用いた酵素的処理により分解される。この
ように、シアリルＴｎ抗原に特異的なモノクローナル抗
体は、天然ＯＳＭと反応するがシアリダーゼ処理ＯＳＭ
とは反応しない。
【０１０９】加えて、本発明者らは、グリコホリンＡが
その天然型ではＴ、Ｔｎ又はシアリルＴｎ抗原を含まな
いことを発見した。しかし、脱シアル化したグリコホリ
ンＡはＴ抗原を露出するが、Ｔｎ抗原を露出しない。従
って、Ｔ抗原と結合するモノクローナル抗体はシアル化
グリコホリンＡとは反応するが天然グリコホリンＡとは
反応しない。さらに、グリコホリン抗体及びそのシアリ
ル化誘導体はシアリルＴｎ抗原に対するモノクローナル
抗体の検出に使用できる。グリコホリンＡのシアリルＴ
ｎ抗原を露出させる変換は困難である。天然グリコホリ
ンＡを、シアリル２→３Ｇａｌを分解するがシアリル２
→６ＧａｌＮＡｃは分解しないインフルエンザウイルス
のシアリダーゼ又は二ューキャッスル病ウイルスのシア
リダーゼで処理するならば、核構造はＧａｌβ１→３
［ＮｅｕＡｃα１→６］ＧａｌＮＡｃを含むであろう。
この構造は、β−ガラクトシダーゼによるＧａｌ残基の
脱離により、さらにシアリルＴｎ抗原に変換できる。し
かし、ＮｅｕＡｃα２→６結合構造が隣接した場所に存
在するときβ−ガラクトシダーゼは能率的に脱離しない
ため、これは実際は非常に難しい。
その天然型ではＴ、Ｔｎ又はシアリルＴｎ抗原を含まな
いことを発見した。しかし、脱シアル化したグリコホリ
ンＡはＴ抗原を露出するが、Ｔｎ抗原を露出しない。従
って、Ｔ抗原と結合するモノクローナル抗体はシアル化
グリコホリンＡとは反応するが天然グリコホリンＡとは
反応しない。さらに、グリコホリン抗体及びそのシアリ
ル化誘導体はシアリルＴｎ抗原に対するモノクローナル
抗体の検出に使用できる。グリコホリンＡのシアリルＴ
ｎ抗原を露出させる変換は困難である。天然グリコホリ
ンＡを、シアリル２→３Ｇａｌを分解するがシアリル２
→６ＧａｌＮＡｃは分解しないインフルエンザウイルス
のシアリダーゼ又は二ューキャッスル病ウイルスのシア
リダーゼで処理するならば、核構造はＧａｌβ１→３
［ＮｅｕＡｃα１→６］ＧａｌＮＡｃを含むであろう。
この構造は、β−ガラクトシダーゼによるＧａｌ残基の
脱離により、さらにシアリルＴｎ抗原に変換できる。し
かし、ＮｅｕＡｃα２→６結合構造が隣接した場所に存
在するときβ−ガラクトシダーゼは能率的に脱離しない
ため、これは実際は非常に難しい。
【０１１０】本発明まで、Ｔ、Ｔｎ又はシアリルＴｎ抗
原に対するモノクローナル抗体は意図して作られてはい
なかった。むしろ、それらは常法により選択された、即
ち、腫瘍細胞又は組織に対する優先的反応に基く多くの
ハイブリドーマのなかに含まれる。
原に対するモノクローナル抗体は意図して作られてはい
なかった。むしろ、それらは常法により選択された、即
ち、腫瘍細胞又は組織に対する優先的反応に基く多くの
ハイブリドーマのなかに含まれる。
【０１１１】本発明に従えば、このようなモノクローナ
ル抗体が意図的に作成できる。
ル抗体が意図的に作成できる。
【０１１２】癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法、並びに
癌の治療方法 本発明は、癌紬胞の増殖及び複製を防ぐ方法並びに癌の
治療方法をも提供する。
癌の治療方法 本発明は、癌紬胞の増殖及び複製を防ぐ方法並びに癌の
治療方法をも提供する。
【０１１３】より詳しくは、本発明は、（ａ〉精製ムチ
ン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、又はム
チン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能な、担体分
子に結合している化学合成された炭水化物抗原決定基を
含む抗原の薬理的有効量、及び（ｂ）製薬的に受容でき
る担体、希釈剤又は賦形剤を含有するワクチンを対象に
投与することにより抗癌細胞免疫反応を誘導することか
らなる、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細胞の
増殖および複製を防ぐ方法を提供する。
ン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、又はム
チン型糖蛋白質に対する免疫反応を誘導可能な、担体分
子に結合している化学合成された炭水化物抗原決定基を
含む抗原の薬理的有効量、及び（ｂ）製薬的に受容でき
る担体、希釈剤又は賦形剤を含有するワクチンを対象に
投与することにより抗癌細胞免疫反応を誘導することか
らなる、ムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌細胞の
増殖および複製を防ぐ方法を提供する。
【０１１４】抗原は、抗癌細胞免疫反応を誘導できるも
のであり、Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを有する精
製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、
並びに上記のように担体分子に結合した化学合成炭水化
物の抗原決定基が含まれる。抗癌細胞免疫反応は、ムチ
ン型糖蛋白質又は化学合成された炭水化物の抗原決定基
に対する抗体の産生であり、又サイトトキシックキラー
Ｔ細胞、アノマラスキラー細胞（ＡＫ細胞）及び抗体依
存性細胞障害細胞等の誘導の様な種々の他のタイプの免
疫応答の誘導であり得る。
のであり、Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを有する精
製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製核構造、
並びに上記のように担体分子に結合した化学合成炭水化
物の抗原決定基が含まれる。抗癌細胞免疫反応は、ムチ
ン型糖蛋白質又は化学合成された炭水化物の抗原決定基
に対する抗体の産生であり、又サイトトキシックキラー
Ｔ細胞、アノマラスキラー細胞（ＡＫ細胞）及び抗体依
存性細胞障害細胞等の誘導の様な種々の他のタイプの免
疫応答の誘導であり得る。
【０１１５】好ましい抗原は、天然の供給源から精製し
たものであるか、化学合成したものかによらず、Ｔ抗
原、Ｔｎ抗原及びシアリルＴｎ抗原であり、Ｔｎ抗原と
シアリルＴｎ抗原が特に好ましい。
たものであるか、化学合成したものかによらず、Ｔ抗
原、Ｔｎ抗原及びシアリルＴｎ抗原であり、Ｔｎ抗原と
シアリルＴｎ抗原が特に好ましい。
【０１１６】Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを有する
精製ムチン型糖蛋白質を含む抗原としては、ウシ又はヒ
ツジ下顎ムチンが好ましい。
精製ムチン型糖蛋白質を含む抗原としては、ウシ又はヒ
ツジ下顎ムチンが好ましい。
【０１１７】抗原がハイブリドーマの調製に適当な脾細
胞でその抗体を誘導可能な抗癌細胞抗体の例は、上記Ｂ
Ｍ−８、ＢＹ−３及びＢＭ−４である。
胞でその抗体を誘導可能な抗癌細胞抗体の例は、上記Ｂ
Ｍ−８、ＢＹ−３及びＢＭ−４である。
【０１１８】当業者は、投与量並びに適当な製薬的に受
容できる担体：希釈剤及び賦形剤を容易に決めることが
できる。上記のように、本発明は、（ａ）ムチン型糖蛋
白質の精製された核構造に対して産生される、薬理的有
効量の抗癌抗体、及び（ｂ）製薬的に受容できる担体、
希釈剤又は賦形剤を含有する薬剤を対象に投与すること
から成る、癌細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現す
る癌の治療法をも供袷する。
容できる担体：希釈剤及び賦形剤を容易に決めることが
できる。上記のように、本発明は、（ａ）ムチン型糖蛋
白質の精製された核構造に対して産生される、薬理的有
効量の抗癌抗体、及び（ｂ）製薬的に受容できる担体、
希釈剤又は賦形剤を含有する薬剤を対象に投与すること
から成る、癌細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現す
る癌の治療法をも供袷する。
【０１１９】抗原は、上記の様なムチン型糖蛋白質の精
製された核構造であればよく、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原および
シアリルＴｎ抗原が含まれ、特にＴｎ抗原及びシアリル
Ｔｎ抗原が好ましい。
製された核構造であればよく、Ｔ抗原、Ｔｎ抗原および
シアリルＴｎ抗原が含まれ、特にＴｎ抗原及びシアリル
Ｔｎ抗原が好ましい。
【０１２０】抗癌抗体は上記のように製造され単離され
る。
る。
【０１２１】好ましい抗癌抗体にはＢＭ−８、ＢＭ−３
及びＢＭ−４が含まれる。
及びＢＭ−４が含まれる。
【０１２２】当業者は投与量並びに適当な薬理的に許容
できる担体、希釈剤及び賦形剤を容易に決めることがで
きる。
できる担体、希釈剤及び賦形剤を容易に決めることがで
きる。
【０１２３】
【実施例】以下に本発明を、特定の実施例を挙げて説明
する。しかし、本発明は実施例に制限されて解釈される
ものではない。実施例に於て、他に特に記述しない限
り、全てのパーセント、割合等は重量による。
する。しかし、本発明は実施例に制限されて解釈される
ものではない。実施例に於て、他に特に記述しない限
り、全てのパーセント、割合等は重量による。
【０１２４】モノクローナル抗体ＢＭ−８の精製 モノクローナル抗体ＢＭ−８は腹腔液からシリカゲル−
プロテインＡカラムのアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製した。抗体は３．０Ｍチオシアン酸ナトリ
ウムを用いて溶離した。Ｔｎ抗原に対する活性を持つ分
画（各１．０ｍｌ）は固相ラジオイムノアッセイにより
確認してプールし、ＰＢＳに対して透析し、蛋白質量を
Ａ280を読みとることにより定量した。培養上清はアミ
コン（Amicon）濃縮装置（Amicon，Boston，MA製）を用
いた限外濾過により１／１００容量まで濃縮した。濃縮
した上清を逆相Ｃ１８シリカゲル カラムで精製し、Ｉ
ｇＭ及びＩｇＧ分画を得た。
プロテインＡカラムのアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製した。抗体は３．０Ｍチオシアン酸ナトリ
ウムを用いて溶離した。Ｔｎ抗原に対する活性を持つ分
画（各１．０ｍｌ）は固相ラジオイムノアッセイにより
確認してプールし、ＰＢＳに対して透析し、蛋白質量を
Ａ280を読みとることにより定量した。培養上清はアミ
コン（Amicon）濃縮装置（Amicon，Boston，MA製）を用
いた限外濾過により１／１００容量まで濃縮した。濃縮
した上清を逆相Ｃ１８シリカゲル カラムで精製し、Ｉ
ｇＭ及びＩｇＧ分画を得た。
【０１２５】抗体依存性細胞障害作用（antibody-depen
dent cytotoxicity）の測定 抗体依存性細胞障害作用の測定には４時間51Ｃｒ遊離試
験を用いた。この方法は、例えばMischell及びShiigiに
より報告されている［Selected Methods in Cellular l
mmunology,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,(198
0)］。２人の健常人から得た末梢血リンパ球をフィコー
ル−ハイパック（Ficoll-Hypaque）により分離してエフ
ェクター細胞を得た。ターゲット細胞に対するエフェク
ター細胞の割合は１００：１、５０：１、２５：１及び
１２．５：１とした。
dent cytotoxicity）の測定 抗体依存性細胞障害作用の測定には４時間51Ｃｒ遊離試
験を用いた。この方法は、例えばMischell及びShiigiに
より報告されている［Selected Methods in Cellular l
mmunology,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,(198
0)］。２人の健常人から得た末梢血リンパ球をフィコー
ル−ハイパック（Ficoll-Hypaque）により分離してエフ
ェクター細胞を得た。ターゲット細胞に対するエフェク
ター細胞の割合は１００：１、５０：１、２５：１及び
１２．５：１とした。
【０１２６】ターゲット細胞は細胞ラインＫ５６２、Ｌ
Ｕ−６５、ＷＩ−３８、ＢＲＡＳＣＨ、ＭＫＮ−４５、
ＳＫＯＶ３、ＱＧ５６、ＨＥＬ２９９、ＨＵＨ７及びＢ
ＸＰＣ３であり、これらは全て上記文献に記載されてい
る。ターゲット細胞（１０6個）を１００μＣｉの51Ｃ
ｒと共にＰＢＳ中で３７℃で１時間インキュベートする
ことによりラベルした後、細胞を３回洗浄し、ＲＰＭＩ
培地に再懸濁した。１５μ１の培地中のラベルされたタ
ーゲット細胞（５×１０3個）を各ウェルに入れ、エフ
ェクター細胞を種々の個数（５×１０5、２．５×１
０5、１．２５×１０5及び６．２５×１０4個／ウェ
ル）加えた。混合物を４時間インキュベートした後、プ
レートを５００×ｇで遠心した。上清を分離し、１２５
μｌの試料中の放射活性をガンマーカウンターで測定し
た。グループ当り３回実験を行い、自発遊離量は抗体及
びリンパ球に触れないターゲット細胞から培地に遊離し
たｃｐｍとし、全遊離量は測定の終りに２．０％のトリ
トンＸ−１００を加えて溶解したターゲット細胞から遊
離したカウント数とした。細胞障害性％は下記式から算
出した。
Ｕ−６５、ＷＩ−３８、ＢＲＡＳＣＨ、ＭＫＮ−４５、
ＳＫＯＶ３、ＱＧ５６、ＨＥＬ２９９、ＨＵＨ７及びＢ
ＸＰＣ３であり、これらは全て上記文献に記載されてい
る。ターゲット細胞（１０6個）を１００μＣｉの51Ｃ
ｒと共にＰＢＳ中で３７℃で１時間インキュベートする
ことによりラベルした後、細胞を３回洗浄し、ＲＰＭＩ
培地に再懸濁した。１５μ１の培地中のラベルされたタ
ーゲット細胞（５×１０3個）を各ウェルに入れ、エフ
ェクター細胞を種々の個数（５×１０5、２．５×１
０5、１．２５×１０5及び６．２５×１０4個／ウェ
ル）加えた。混合物を４時間インキュベートした後、プ
レートを５００×ｇで遠心した。上清を分離し、１２５
μｌの試料中の放射活性をガンマーカウンターで測定し
た。グループ当り３回実験を行い、自発遊離量は抗体及
びリンパ球に触れないターゲット細胞から培地に遊離し
たｃｐｍとし、全遊離量は測定の終りに２．０％のトリ
トンＸ−１００を加えて溶解したターゲット細胞から遊
離したカウント数とした。細胞障害性％は下記式から算
出した。
【０１２７】
【数１】
【０１２８】ＢＭ−８により誘導された種々のターゲッ
ト細胞ラインに対する抗体依存性細胞障害作用を第４図
に示す。ヒト赤白血病細胞ラインＫ５６２及びヒト偏平
上皮細胞肺癌ＬＵ−６５はＢＭ−８抗体により誘導され
た抗体依存性細胞障害に注目すべき感受性を示した。対
照的にヒト線維芽細胞ＢＲＡＳＣＨ、ＷＩ−３８、及び
ヒト赤白血病細胞ＨＥＬ２９９はＢＭ−８依存性細胞障
害に感受性を示さなかった。ヒト偏平上皮細胞肺癌ＱＧ
５６及びヒト胃癌細胞ラインＭＫＮ−４５はＢＭ−８抗
体に対し最も強い結合活性を示したにもかかわらず、Ｂ
Ｍ−８抗体依存性紬胞障害には低い感受性を有した。
ト細胞ラインに対する抗体依存性細胞障害作用を第４図
に示す。ヒト赤白血病細胞ラインＫ５６２及びヒト偏平
上皮細胞肺癌ＬＵ−６５はＢＭ−８抗体により誘導され
た抗体依存性細胞障害に注目すべき感受性を示した。対
照的にヒト線維芽細胞ＢＲＡＳＣＨ、ＷＩ−３８、及び
ヒト赤白血病細胞ＨＥＬ２９９はＢＭ−８依存性細胞障
害に感受性を示さなかった。ヒト偏平上皮細胞肺癌ＱＧ
５６及びヒト胃癌細胞ラインＭＫＮ−４５はＢＭ−８抗
体に対し最も強い結合活性を示したにもかかわらず、Ｂ
Ｍ−８抗体依存性紬胞障害には低い感受性を有した。
【０１２９】これらの結果から、ＢＭ−８抗体は幾つか
の腫瘍細胞に対するサイトトキシック細胞の明確な活性
化を示した。しかし、各腫瘍細胞の抗体依存性細胞障害
に対する感受性は大きく異なり、抗原発現との定量的相
関性は無かった。
の腫瘍細胞に対するサイトトキシック細胞の明確な活性
化を示した。しかし、各腫瘍細胞の抗体依存性細胞障害
に対する感受性は大きく異なり、抗原発現との定量的相
関性は無かった。
【０１３０】種々の組織切片の免疫組織学 モノクローナル抗体ＢＭ−８の免疫組織学的染色能を以
下のように測定した。凍結及びパラフィン包埋組織は共
に外科手術により得た。組織はＯＣＴ化合物（免疫組織
学では広く使用されている特許された化合物、Tissue−
TekII Division,Miles Laboratories,Naperville,Illin
ois製）中に包埋し、ドライアイス−アセトン中で凍結
し、使用までレブコ（Revco）冷凍庫で−８０℃で保存
した。凍結切片（４〜５μｍ厚）は低温層を用いて調製
し、対物ガラス上で室温で３０分乾燥し、アセトン中で
４℃で１０分固定し、４℃のＰＢＳで洗浄した。組織切
片（５〜７μｍ厚）は、常法に従いホルマリン固定しパ
ラフィン包埋した標本から調製した。切片はキシレン中
で４℃で５分間脱パラフィンし、段階的エタノールで脱
水し、４℃のＰＢＳで洗浄した。次いで凍結切片及びパ
ラフィン包埋切片を両者共、０．０３％の過酸化水素水
を含む１００％メタノールで室温で３０分間処理するこ
とにより、内因性ペロキシデースをブロックした。ＰＢ
Ｓで３回洗浄後、切片をブロックし、即ち正常ウマ血清
と共に室温で３０分インキュベートして内因性ペロキシ
デースを不活性化した。次いで切片をＰＢＳで３回洗浄
し、一次抗体溶液（ＢＭ−８培養上清；抗体濃度＝５０
μｇ／ｍ１）と共にモイストチャンバー中で４℃で一晩
インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、切片を１：
１００希釈のビオチン化二次抗体（ビオチン化ウマ抗マ
ウスＩｇＧ、VectorLab,Inc.,BurIingame,CA製）と共に
室温で１時間モイスト チャンバー中でインキュベート
した。ＰＢＳで３回洗浄後、切片を予め作成したアビジ
ン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（Vector Lab,I
nc.,Burlingame,CA製）の容量比１：１００の希釈溶液
と共に室温で１時間モイスト チャンバー中でインキュ
ベートした。ＰＢＳ及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．６）で３回リンスの後、切片を０．０５
％ ３−３’ジアミノベンジジン（Sigma Chemical C
o.,St.Louis,M0製）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ７．６）及び０．０３％過酸化水素水中で
１０分インキュベートした後、へマトキシリンで対比染
色した。次いで切片を段階的エタノール、キシレンで脱
水し、封入した。
下のように測定した。凍結及びパラフィン包埋組織は共
に外科手術により得た。組織はＯＣＴ化合物（免疫組織
学では広く使用されている特許された化合物、Tissue−
TekII Division,Miles Laboratories,Naperville,Illin
ois製）中に包埋し、ドライアイス−アセトン中で凍結
し、使用までレブコ（Revco）冷凍庫で−８０℃で保存
した。凍結切片（４〜５μｍ厚）は低温層を用いて調製
し、対物ガラス上で室温で３０分乾燥し、アセトン中で
４℃で１０分固定し、４℃のＰＢＳで洗浄した。組織切
片（５〜７μｍ厚）は、常法に従いホルマリン固定しパ
ラフィン包埋した標本から調製した。切片はキシレン中
で４℃で５分間脱パラフィンし、段階的エタノールで脱
水し、４℃のＰＢＳで洗浄した。次いで凍結切片及びパ
ラフィン包埋切片を両者共、０．０３％の過酸化水素水
を含む１００％メタノールで室温で３０分間処理するこ
とにより、内因性ペロキシデースをブロックした。ＰＢ
Ｓで３回洗浄後、切片をブロックし、即ち正常ウマ血清
と共に室温で３０分インキュベートして内因性ペロキシ
デースを不活性化した。次いで切片をＰＢＳで３回洗浄
し、一次抗体溶液（ＢＭ−８培養上清；抗体濃度＝５０
μｇ／ｍ１）と共にモイストチャンバー中で４℃で一晩
インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、切片を１：
１００希釈のビオチン化二次抗体（ビオチン化ウマ抗マ
ウスＩｇＧ、VectorLab,Inc.,BurIingame,CA製）と共に
室温で１時間モイスト チャンバー中でインキュベート
した。ＰＢＳで３回洗浄後、切片を予め作成したアビジ
ン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体（Vector Lab,I
nc.,Burlingame,CA製）の容量比１：１００の希釈溶液
と共に室温で１時間モイスト チャンバー中でインキュ
ベートした。ＰＢＳ及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ７．６）で３回リンスの後、切片を０．０５
％ ３−３’ジアミノベンジジン（Sigma Chemical C
o.,St.Louis,M0製）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ７．６）及び０．０３％過酸化水素水中で
１０分インキュベートした後、へマトキシリンで対比染
色した。次いで切片を段階的エタノール、キシレンで脱
水し、封入した。
【０１３１】モノクローナル抗体ＢＭ−８による種々の
癌及び正常組織の染色陽性の発生を表２に要約する。
癌及び正常組織の染色陽性の発生を表２に要約する。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】表２に示した結果から、ＢＭ−８抗体によ
り測定したＴｎ抗原は胃、結腸、肺、及び乳癌で染色陽
性の高い発生を示した。正常結腸及び正常***における
染色陽性の低い発生も、染色強度が低いながら示され
た。
り測定したＴｎ抗原は胃、結腸、肺、及び乳癌で染色陽
性の高い発生を示した。正常結腸及び正常***における
染色陽性の低い発生も、染色強度が低いながら示され
た。
【０１３４】実施例２ シアリルＴｎ抗原に対するモノクローナル抗体の製造及
び特徴付け シアリルＴｎ抗原の供給源としてヒツジ下顎腺ムチン
（ＯＳＭ）を用いた。ＯＳＭの約９０％の炭水化物鎖は
シアリルＴｎ抗原から成る。
び特徴付け シアリルＴｎ抗原の供給源としてヒツジ下顎腺ムチン
（ＯＳＭ）を用いた。ＯＳＭの約９０％の炭水化物鎖は
シアリルＴｎ抗原から成る。
【０１３５】ＯＳＭはヒツジ下顎腺から常法により単離
した［Tettamanti,G.,and Pigman,W.Arch.Biochem.Biop
hys.,124,45-50 (1968)］。簡単には、下顎腺の水性抽
出物を酸性ｐＨ（例えば３．５）で沈殿させた。これを
ムチン クロットと呼ぶ。ムチン クロットを遠心し、
水に溶解し、ｐＨを中性に合わせ、酢酸ナトリウム中で
分別エタノール沈殿を行った。
した［Tettamanti,G.,and Pigman,W.Arch.Biochem.Biop
hys.,124,45-50 (1968)］。簡単には、下顎腺の水性抽
出物を酸性ｐＨ（例えば３．５）で沈殿させた。これを
ムチン クロットと呼ぶ。ムチン クロットを遠心し、
水に溶解し、ｐＨを中性に合わせ、酢酸ナトリウム中で
分別エタノール沈殿を行った。
【０１３６】このように単離したＯＳＭを免疫原の組成
として用いた。
として用いた。
【０１３７】免疫及びモノクローナル坑体の確立 Ｂａｌｂ／ｂマウスを実施例１の記載に従い免疫した。
【０１３８】実施例１に記載の常法により脾臓の細胞を
取出し、脾細胞をマウス ミエローマＳＰ−２細胞と融
合した。
取出し、脾細胞をマウス ミエローマＳＰ−２細胞と融
合した。
【０１３９】選択培地で増殖したハイブリドーマを実施
例１の記載と類似の方法で、上記ＯＳＭ、脱シアル化Ｏ
ＳＭ、ウシ下顎ムチン（ＢＳＭ）（ＢＳＭの約５０％の
炭水化物鎖はシアリルＴｎ抗原から成る）、及びグリコ
ホリンＡに対するモノクローナル抗体の反応性によりス
クリーニングした。ウシ下顎腺ムチン（ＢＳＭ）及びグ
リコホリンＡはシグマ ケミカル カンパニー［Sigma
Chemical Campany,St.Louis,Missouri］から購入した。
ＯＳＭは、常法に従い０．１ユニット／ｍｌのクロスト
リジウム ペルフリンゲンズ（Clostridium Perfringen
s）タイプＸ由来のノイラミニダーゼ（Sigma製）で処理
し脱シアル化した［Magnani.J.L.et al.,J.Biol.Chem.,
257,14365(1982); Fukushi et al.,J.Biol.Chem.259,10
511(1984)］。
例１の記載と類似の方法で、上記ＯＳＭ、脱シアル化Ｏ
ＳＭ、ウシ下顎ムチン（ＢＳＭ）（ＢＳＭの約５０％の
炭水化物鎖はシアリルＴｎ抗原から成る）、及びグリコ
ホリンＡに対するモノクローナル抗体の反応性によりス
クリーニングした。ウシ下顎腺ムチン（ＢＳＭ）及びグ
リコホリンＡはシグマ ケミカル カンパニー［Sigma
Chemical Campany,St.Louis,Missouri］から購入した。
ＯＳＭは、常法に従い０．１ユニット／ｍｌのクロスト
リジウム ペルフリンゲンズ（Clostridium Perfringen
s）タイプＸ由来のノイラミニダーゼ（Sigma製）で処理
し脱シアル化した［Magnani.J.L.et al.,J.Biol.Chem.,
257,14365(1982); Fukushi et al.,J.Biol.Chem.259,10
511(1984)］。
【０１４０】ＯＳＭに反応陽性のモノクローナル抗体を
分泌する約２２個のハイブリドーマが見出だされた。
分泌する約２２個のハイブリドーマが見出だされた。
【０１４１】これらハイブリドーマをスケール アップ
し、モノクローナル抗体のＯＳＭ、脱シアル化ＯＳＭ、
ＢＳＭ、及びグリコホリンＡに対する反応性を再検査し
た。
し、モノクローナル抗体のＯＳＭ、脱シアル化ＯＳＭ、
ＢＳＭ、及びグリコホリンＡに対する反応性を再検査し
た。
【０１４２】ＯＳＭに対し強い反応性を示し、ＢＳＭに
対しては弱い反応性を示し、グリコホリンＡ又はシアリ
ダーゼ処理ＯＳＭに対しては反応しないモノクローナル
抗体を分泌する２個のハイブリドーマを再クローニング
し、続く実験に用いた。
対しては弱い反応性を示し、グリコホリンＡ又はシアリ
ダーゼ処理ＯＳＭに対しては反応しないモノクローナル
抗体を分泌する２個のハイブリドーマを再クローニング
し、続く実験に用いた。
【０１４３】ハイブリドーマ及びこれから産生されるモ
ノクローナル抗体をＢＭ−３及びＢＭ−４と呼ぶ。
ノクローナル抗体をＢＭ−３及びＢＭ−４と呼ぶ。
【０１４４】抗体イソタイプの確認 抗体イソタイプは実施例１に従い固相ラジオイムノアッ
セイにより決定した。結果は抗体ＢＭ−３はＩｇＭイソ
タイプであり、抗体ＢＭ−４はＩｇＧ1イソタイプであ
ることを示した。
セイにより決定した。結果は抗体ＢＭ−３はＩｇＭイソ
タイプであり、抗体ＢＭ−４はＩｇＧ1イソタイプであ
ることを示した。
【０１４５】抗体の特異性の確認 ＢＭ−３及びＢＭ−４の特異性をｉ）シアリダーゼ処理
ＯＳＭと比較した天然ＯＳＭに対する反応性、及びii）
種々の単糖及び二糖による抗体結合の阻害により測定し
た。各方法を以下に示す。
ＯＳＭと比較した天然ＯＳＭに対する反応性、及びii）
種々の単糖及び二糖による抗体結合の阻害により測定し
た。各方法を以下に示す。
【０１４６】天然及びシアリダーゼ処理ＯＳＭに対する
反応性 ＯＳＭの表現する抗原の性質を調べるため、天然ＯＳＭ
及びシアリダーゼ処理ＯＳＭを抗Ｔｎ（モノクローナル
抗体ＣＡ３２３９由来の腹腔液中に存在）及び抗Ｔ（モ
ノクローナル抗体ＨＨ８の培養上清中に存在）と反応さ
せた［Clausen,H.et al.In:Glycoconjugates,Proceedin
gs of the IXth International Symposium,Lille,Franc
e,p,F49(1987)］。
反応性 ＯＳＭの表現する抗原の性質を調べるため、天然ＯＳＭ
及びシアリダーゼ処理ＯＳＭを抗Ｔｎ（モノクローナル
抗体ＣＡ３２３９由来の腹腔液中に存在）及び抗Ｔ（モ
ノクローナル抗体ＨＨ８の培養上清中に存在）と反応さ
せた［Clausen,H.et al.In:Glycoconjugates,Proceedin
gs of the IXth International Symposium,Lille,Franc
e,p,F49(1987)］。
【０１４７】測定は固相ラジオイムノアッセイを用いて
行った。室温で１８時間インキュベートすることにより
ＯＳＭ及びシアリダーゼ処理ＯＳＭで９６ウェル プレ
ートをコートし、１％ＢＳＡで２時間ブロックした後、
ＢＳＡで３回洗浄した。一次抗体（抗Ｔｎ又は抗Ｔ Ｈ
Ｈ８抗体）を加え室温で２時間反応させた後、ＰＢＳで
洗浄した。固相ＯＳＭ又はシアリダーゼ処理ＯＳＭに結
合した抗体を二次抗体及び125Ｉラベル化プロテインＡ
で定量した。本方法は多くの刊行物に記載されている
［Hirohashi,et al.（上記参照）,Fukushi et al,JBC.2
569,4681(1984);JBC.259,10511(1984);Young et al.,J.
Exp.Med.,150,1008(1979)］。
行った。室温で１８時間インキュベートすることにより
ＯＳＭ及びシアリダーゼ処理ＯＳＭで９６ウェル プレ
ートをコートし、１％ＢＳＡで２時間ブロックした後、
ＢＳＡで３回洗浄した。一次抗体（抗Ｔｎ又は抗Ｔ Ｈ
Ｈ８抗体）を加え室温で２時間反応させた後、ＰＢＳで
洗浄した。固相ＯＳＭ又はシアリダーゼ処理ＯＳＭに結
合した抗体を二次抗体及び125Ｉラベル化プロテインＡ
で定量した。本方法は多くの刊行物に記載されている
［Hirohashi,et al.（上記参照）,Fukushi et al,JBC.2
569,4681(1984);JBC.259,10511(1984);Young et al.,J.
Exp.Med.,150,1008(1979)］。
【０１４８】結果から天然ＯＳＭはＣＡ３２３９由来の
抗Ｔｎに弱い反応性を示したが、シアリダーゼ処理の後
反応性は大きく増大した。さらに、ＨＨ８由来の抗Ｔに
対しては、シアリダーゼ処理の前及び後で反応性は見ら
れなかった。
抗Ｔｎに弱い反応性を示したが、シアリダーゼ処理の後
反応性は大きく増大した。さらに、ＨＨ８由来の抗Ｔに
対しては、シアリダーゼ処理の前及び後で反応性は見ら
れなかった。
【０１４９】これらの反応性は、ＯＳＭはＴ又はＴｎ抗
原を発現しないがシアリルＴｎ抗原を強く発現すること
を示唆する。
原を発現しないがシアリルＴｎ抗原を強く発現すること
を示唆する。
【０１５０】モノクローナル抗体ＢＭ−３及びＢＭ−４
は天然ＯＳＭとの反応及びシアリダーゼ処理ＯＳＭとの
反応により特徴づけられる。天然ＯＳＭはシアリル２→
６Ｇａ１ＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを主な炭水化
物グループとして含み、ＢＭ−３及びＢＭ−４はこれと
反応する。このことからＢＭ−３及びＢＭ−４は共にシ
アリルＴｎ抗原を認識することが示唆される。さらにＢ
Ｍ−３及びＢＭ−４の反応性は、ＯＳＭのシアリダーゼ
処理により完全に消失した。この処理でシアリルＴｎグ
ループは全てＴｎ残基に変換されており、このことから
ＢＭ−３及びＢＭ−４はＴ抗原とは反応しないことが示
唆される。ＯＳＭのシアリダーゼ処理はプラスティック
表面に吸着した固相上で行った。本方法はヒロハシ（Hi
rohasi）らにより既に報告されている（上記参照）。
は天然ＯＳＭとの反応及びシアリダーゼ処理ＯＳＭとの
反応により特徴づけられる。天然ＯＳＭはシアリル２→
６Ｇａ１ＮＡｃα１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを主な炭水化
物グループとして含み、ＢＭ−３及びＢＭ−４はこれと
反応する。このことからＢＭ−３及びＢＭ−４は共にシ
アリルＴｎ抗原を認識することが示唆される。さらにＢ
Ｍ−３及びＢＭ−４の反応性は、ＯＳＭのシアリダーゼ
処理により完全に消失した。この処理でシアリルＴｎグ
ループは全てＴｎ残基に変換されており、このことから
ＢＭ−３及びＢＭ−４はＴ抗原とは反応しないことが示
唆される。ＯＳＭのシアリダーゼ処理はプラスティック
表面に吸着した固相上で行った。本方法はヒロハシ（Hi
rohasi）らにより既に報告されている（上記参照）。
【０１５１】ＢＭ−３についての結果を第５図に示す。
パネルＡは種々の濃度のＢＭ−３上清におけるＢＭ−３
のＯＳＭに対する反応性を示し、パネルＢは種々の濃度
のＯＳＭに対するＢＭ−３の反応性を示す。黒丸は天然
ＯＳＭに対する反応性を示し、白丸はノイラミニダーゼ
（又はシアリダーゼ）で処理されたＯＳＭに対する反応
性を示す。
パネルＡは種々の濃度のＢＭ−３上清におけるＢＭ−３
のＯＳＭに対する反応性を示し、パネルＢは種々の濃度
のＯＳＭに対するＢＭ−３の反応性を示す。黒丸は天然
ＯＳＭに対する反応性を示し、白丸はノイラミニダーゼ
（又はシアリダーゼ）で処理されたＯＳＭに対する反応
性を示す。
【０１５２】結果は、モノクローナル抗体ＢＭ−３は天
然ＯＳＭに対する反応性を有し、この反応性はシアリダ
ーゼ処理の後大きく減少することを示す。
然ＯＳＭに対する反応性を有し、この反応性はシアリダ
ーゼ処理の後大きく減少することを示す。
【０１５３】この様にモノクローナル抗体ＢＭ−３はシ
アリル−Ｔｎ抗原に特異的である。モノクローナル抗体
ＢＭ−４についても同様のことが見出された。
アリル−Ｔｎ抗原に特異的である。モノクローナル抗体
ＢＭ−４についても同様のことが見出された。
【０１５４】ＢＭ−３抗体の反応性の単糖及び二糖によ
る阻害 単糖溶液を、９６ウェル プレートの一連のウェル中で
初めの濃度５００ｍＭから２倍希釈した。各々の単糖溶
液をＢＭ−３又はＢＭ−４抗体に加え（１０〜５０ｎｇ
／ウェル）、溶液を室温で１時間インキュベートした。
９６ウェルプレートの一連のプラスティック ウェル
は、上記方法でＯＳＭでプレコートし（室温で一晩、生
理食塩水溶解のＯＳＭのインキュベーション）、ＢＳＡ
でプレウォッシュした。単糖又は多糖と抗体との反応混
合液をＯＳＭでコートしたプレート上に移し、２時間イ
ンキュベートした後、ＢＳＡで洗浄し、上記方法により
二次抗体及び125ＩラベルしたプロテインＡで抗体の結
合を検出した。阻害の程度は、単糖又は二糖と混合しな
い抗体と比較し、コントロールの反応性に対する％で表
した。
る阻害 単糖溶液を、９６ウェル プレートの一連のウェル中で
初めの濃度５００ｍＭから２倍希釈した。各々の単糖溶
液をＢＭ−３又はＢＭ−４抗体に加え（１０〜５０ｎｇ
／ウェル）、溶液を室温で１時間インキュベートした。
９６ウェルプレートの一連のプラスティック ウェル
は、上記方法でＯＳＭでプレコートし（室温で一晩、生
理食塩水溶解のＯＳＭのインキュベーション）、ＢＳＡ
でプレウォッシュした。単糖又は多糖と抗体との反応混
合液をＯＳＭでコートしたプレート上に移し、２時間イ
ンキュベートした後、ＢＳＡで洗浄し、上記方法により
二次抗体及び125ＩラベルしたプロテインＡで抗体の結
合を検出した。阻害の程度は、単糖又は二糖と混合しな
い抗体と比較し、コントロールの反応性に対する％で表
した。
【０１５５】ＢＭ−３についての結果を第６図に示す。
パネルＡは単糖のフコース（白丸）、ガラクトース（白
四角）、グルコース（黒三角）、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン（白三角）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（黒四
角）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（黒丸）によるＢＭ−
３の阻害を示し、パネルＢは二糖ＮｅｕＡｃα２→６Ｇ
ａｌＮＡｃα１→セリン（黒四角）及びラクトース（黒
丸）によるＢＭ−３の阻害を示す。
パネルＡは単糖のフコース（白丸）、ガラクトース（白
四角）、グルコース（黒三角）、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン（白三角）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（黒四
角）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（黒丸）によるＢＭ−
３の阻害を示し、パネルＢは二糖ＮｅｕＡｃα２→６Ｇ
ａｌＮＡｃα１→セリン（黒四角）及びラクトース（黒
丸）によるＢＭ−３の阻害を示す。
【０１５６】結果は単糖のＧａｌＮＡｃ及びＮｅｕＡｃ
のみがＢＭ−３のＯＳＭ及びＢＳＭに対する結合を阻害
することができ、一方他の単糖Ｌ−フコース、Ｄ−ガラ
クトース、Ｄ−グルコース及びＤ−Ｎ−アセチルグルコ
サミンは反応を阻害できなかった。ＮｅｕＡｃの阻害活
性はＧａｌＮａｃよりも強かった。二糖ＮｅｕＡｃα２
→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−セリンも又ＢＭ−３の反応
を阻害したが、そのアノメリック アイソマー、Ｎｅｕ
Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→０−プロピル、及びラ
クトースは阻害活性を有さなかった。
のみがＢＭ−３のＯＳＭ及びＢＳＭに対する結合を阻害
することができ、一方他の単糖Ｌ−フコース、Ｄ−ガラ
クトース、Ｄ−グルコース及びＤ−Ｎ−アセチルグルコ
サミンは反応を阻害できなかった。ＮｅｕＡｃの阻害活
性はＧａｌＮａｃよりも強かった。二糖ＮｅｕＡｃα２
→６ＧａｌＮＡｃα１→Ｏ−セリンも又ＢＭ−３の反応
を阻害したが、そのアノメリック アイソマー、Ｎｅｕ
Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃβ１→０−プロピル、及びラ
クトースは阻害活性を有さなかった。
【０１５７】これらの結果はＢＭ−３抗体により認識さ
れるハプテン構造はＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃα
１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、即ち正確にシアリルＴｎ構造
であることを示唆する。
れるハプテン構造はＮｅｕＡｃα２→６ＧａｌＮＡｃα
１→Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、即ち正確にシアリルＴｎ構造
であることを示唆する。
【０１５８】同様の結果がＢＭ−４について得られた。
【０１５９】種々の組織切片の免疫組織学 モノクローナル抗体ＢＭ−３及びＢＭ−４の免疫組織学
的染色能を既に記載された方法に従って（Fukushi et a
l.,J.Exp.Med.,159,506(1984)］調べた。簡単には、抗
原検出のため標本をホルマリンで固定し、パラフィンに
包埋した。モノクローナル抗体を脱パラフィンした組織
切片に加え４℃で一晩インキュベートした。結合したモ
ノクローナル抗体の検出はビオチニル抗マウスＩｇＧ＋
ＩｇＭ及びビオチニル−ペルオキシダーゼ複合体を用い
て行った（vactastain ABC kit;Vector Laboratories I
nc.製）。酵素活性は０．０２％のデアミノベンジジン
テトラヒドロクロリド及び０．００５％の過酸化水素水
を含む０．０５Ｍトリスにより測定した。この方法は種
々の過酸化水素水について行われる。これらの方法は種
々のモノグラフ、例えばK.Watanab及びP.K.Nakane著“I
mmunoenzymatic Method”(Interdisciplinary Publicat
ions,Toshima,Tokyo,(1985)）に詳しく述べられてい
る。
的染色能を既に記載された方法に従って（Fukushi et a
l.,J.Exp.Med.,159,506(1984)］調べた。簡単には、抗
原検出のため標本をホルマリンで固定し、パラフィンに
包埋した。モノクローナル抗体を脱パラフィンした組織
切片に加え４℃で一晩インキュベートした。結合したモ
ノクローナル抗体の検出はビオチニル抗マウスＩｇＧ＋
ＩｇＭ及びビオチニル−ペルオキシダーゼ複合体を用い
て行った（vactastain ABC kit;Vector Laboratories I
nc.製）。酵素活性は０．０２％のデアミノベンジジン
テトラヒドロクロリド及び０．００５％の過酸化水素水
を含む０．０５Ｍトリスにより測定した。この方法は種
々の過酸化水素水について行われる。これらの方法は種
々のモノグラフ、例えばK.Watanab及びP.K.Nakane著“I
mmunoenzymatic Method”(Interdisciplinary Publicat
ions,Toshima,Tokyo,(1985)）に詳しく述べられてい
る。
【０１６０】ペルオキシダーゼ染色した典型的な免疫組
織学像を第７図及び第８図に示す。
織学像を第７図及び第８図に示す。
【０１６１】第７図はＢＭ−３抗体を用いた、ホルマリ
ン固定、パラフィン包埋の悪性腫瘍のイムノペルオキシ
ダーゼ染色を示す。第７図は、ＢＭ−３モノクローナル
抗体は肺腺癌と反応するが、正常肺とは反応せずこれら
は染色されない（パネルＡ）ことを示す。さらにＢＭ−
３モノクローナル抗体は適度に分化した結腸腺癌と反応
するが、周囲の正常細胞及びストロマとは反応せず、こ
れらは染色されない（パネルＢ）。ＢＭ−３モノクロー
ナル抗体は粘性胃カルシノーマ癌細胞（パネルＣ）及び
細葉肺腺癌とも不均一に反応するが、正常肺組織とは反
応せずこれらは染色されない（パネルＤ）。
ン固定、パラフィン包埋の悪性腫瘍のイムノペルオキシ
ダーゼ染色を示す。第７図は、ＢＭ−３モノクローナル
抗体は肺腺癌と反応するが、正常肺とは反応せずこれら
は染色されない（パネルＡ）ことを示す。さらにＢＭ−
３モノクローナル抗体は適度に分化した結腸腺癌と反応
するが、周囲の正常細胞及びストロマとは反応せず、こ
れらは染色されない（パネルＢ）。ＢＭ−３モノクロー
ナル抗体は粘性胃カルシノーマ癌細胞（パネルＣ）及び
細葉肺腺癌とも不均一に反応するが、正常肺組織とは反
応せずこれらは染色されない（パネルＤ）。
【０１６２】第８図はＢＭ−４モノクローナル抗体を用
いたホルマリン固定、パラフィン包埋悪性腫瘍のイムノ
ペルオキシダーゼ染色を示す。第８図は、ＢＭ−４モノ
クローナル抗体は肺腺癌（パネルＡ）、粘性胃癌（パネ
ルＢ）、及び適度に分化した結腸腺癌と反応するが、正
常結腸細胞又はストロマとは反応しない（パネルＣ）こ
とを示す。
いたホルマリン固定、パラフィン包埋悪性腫瘍のイムノ
ペルオキシダーゼ染色を示す。第８図は、ＢＭ−４モノ
クローナル抗体は肺腺癌（パネルＡ）、粘性胃癌（パネ
ルＢ）、及び適度に分化した結腸腺癌と反応するが、正
常結腸細胞又はストロマとは反応しない（パネルＣ）こ
とを示す。
【０１６３】種々の癌及び正常組織のモノクローナル抗
体ＢＭ−３及びＢＭ−４による染色陽性の発生を他の抗
シアリルＴｎ抗体（Ｂ７２．３、ＮＣＣ−ＬＵ−３５、
及びＮＣＣ−ＬＵ−８１）と比較し、下記表３に示す。
正常組織のＢＭ−３及びＢＭ−４による染色陽性の発生
は非常に限られているため、正常組織の陽性の図は省略
した。
体ＢＭ−３及びＢＭ−４による染色陽性の発生を他の抗
シアリルＴｎ抗体（Ｂ７２．３、ＮＣＣ−ＬＵ−３５、
及びＮＣＣ−ＬＵ−８１）と比較し、下記表３に示す。
正常組織のＢＭ−３及びＢＭ−４による染色陽性の発生
は非常に限られているため、正常組織の陽性の図は省略
した。
【０１６４】
【表３】
【０１６５】モノクローナル抗体ＢＭ−３及びＢＭ−４
は共にシアリルＴｎに対するものであるが染色陽性の発
生はモノクローナル抗体ＢＭ−４を用いた方がずっと高
かった。ＢＭ−８と比較して、両抗体はずっと低い正常
組織の染色陽性の発生を示した。
は共にシアリルＴｎに対するものであるが染色陽性の発
生はモノクローナル抗体ＢＭ−４を用いた方がずっと高
かった。ＢＭ−８と比較して、両抗体はずっと低い正常
組織の染色陽性の発生を示した。
【０１６６】実施例３ Ｔｎエピトープを含むムチン糖蛋白質を用いた免疫によ
るマウスにおける先天性腫瘍増殖の阻害 Ｔｎ抗原を含むウシ下顎ムチン（ＢＳＭ）はヒルらの方
法に従い精製した［Hill H.D.,et al.,J.Biol.Chem.25
2,3791-3798(1977)］。ウシ下顎腺を０．０１ＭＮａＣ
ｌ中でホモジナイズした。上清をｐＨ４．７に合わせ、
沈殿を除いた。上清をスルホプロピル−セファデックス
Ｃ−２５カラムにかけ、モノクローナル抗体により検出
したＴｎ及びシアリルＴｎ抗原を含む分画を１つにし
た。
るマウスにおける先天性腫瘍増殖の阻害 Ｔｎ抗原を含むウシ下顎ムチン（ＢＳＭ）はヒルらの方
法に従い精製した［Hill H.D.,et al.,J.Biol.Chem.25
2,3791-3798(1977)］。ウシ下顎腺を０．０１ＭＮａＣ
ｌ中でホモジナイズした。上清をｐＨ４．７に合わせ、
沈殿を除いた。上清をスルホプロピル−セファデックス
Ｃ−２５カラムにかけ、モノクローナル抗体により検出
したＴｎ及びシアリルＴｎ抗原を含む分画を１つにし
た。
【０１６７】ムチンを、アセチルトリメチルアンモニウ
ム ブロマイドの添加及び遠心により沈殿させた。沈殿
を４．５Ｍ ＣａＣｌ2に再溶解し、無水エタノールに
溶解して６０％濃度にした。沈殿を捨て、上清を７５％
エタノールにした。２７，０００ｇで３０分間遠心する
ことによりムチンを集めた。沈殿を１Ｍ ＮａＣｌに懸
濁し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８に透析し
た。ムチンはヒドロキシルアパタイト カラムにかけ、
Ｔｎ及びシアリルＴｎ活性を含む分画を集めた。ムチン
をノイラミニダーゼ（クロストリジウム ペリフリンゲ
ンズ（Clostridium perfringens）由来）で処理し（Ｎ
−ＢＳＭ）、セファロースＣＬ−４Ｂカラムにかけた。
Ｔｎ活性を含む分画をプールし、透析し、凍結乾燥し
た。雌性ＣＡＦ１マウスをＰＢＳ、フロイント アジュ
バント（ＦＡ）、又は完全ＦＡアジュバントに乳化した
Ｎ−ＢＳＭ（２０μｇ）で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）によ
り免疫した。１週間後、マウスをＰＢＳ、不完全ＦＡ、
又は不完全ＰＡに乳化したＮ−ＢＳＭ（４０μｇ）で
ｉ．ｐ．より再免疫した。二回目の免疫の１０日後、マ
ウスに先天性乳腫瘍ＴＡ３ＨＡ細胞（１０4細胞、皮下
投与）をチャレンジし、腫瘍サイズ、マウスの生存、及
び抗体の産生をマウスでモニターした。結果を第９図及
び第１１図に示す。第９図に於いて、実線はＦＡのみで
免疫したグループを表し、破線はＮ−ＢＳＭで免疫した
マウスを表わす。第９図は、コントロールＦＡグループ
のマウスは腫瘍チャレンジの１４日後には全て死亡した
が、一方ＢＳＭで免疫したグループではチャレンジの１
９日後に３／７のマウスが生存していたことを示す。
ム ブロマイドの添加及び遠心により沈殿させた。沈殿
を４．５Ｍ ＣａＣｌ2に再溶解し、無水エタノールに
溶解して６０％濃度にした。沈殿を捨て、上清を７５％
エタノールにした。２７，０００ｇで３０分間遠心する
ことによりムチンを集めた。沈殿を１Ｍ ＮａＣｌに懸
濁し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８に透析し
た。ムチンはヒドロキシルアパタイト カラムにかけ、
Ｔｎ及びシアリルＴｎ活性を含む分画を集めた。ムチン
をノイラミニダーゼ（クロストリジウム ペリフリンゲ
ンズ（Clostridium perfringens）由来）で処理し（Ｎ
−ＢＳＭ）、セファロースＣＬ−４Ｂカラムにかけた。
Ｔｎ活性を含む分画をプールし、透析し、凍結乾燥し
た。雌性ＣＡＦ１マウスをＰＢＳ、フロイント アジュ
バント（ＦＡ）、又は完全ＦＡアジュバントに乳化した
Ｎ−ＢＳＭ（２０μｇ）で腹腔内投与（ｉ．ｐ．）によ
り免疫した。１週間後、マウスをＰＢＳ、不完全ＦＡ、
又は不完全ＰＡに乳化したＮ−ＢＳＭ（４０μｇ）で
ｉ．ｐ．より再免疫した。二回目の免疫の１０日後、マ
ウスに先天性乳腫瘍ＴＡ３ＨＡ細胞（１０4細胞、皮下
投与）をチャレンジし、腫瘍サイズ、マウスの生存、及
び抗体の産生をマウスでモニターした。結果を第９図及
び第１１図に示す。第９図に於いて、実線はＦＡのみで
免疫したグループを表し、破線はＮ−ＢＳＭで免疫した
マウスを表わす。第９図は、コントロールＦＡグループ
のマウスは腫瘍チャレンジの１４日後には全て死亡した
が、一方ＢＳＭで免疫したグループではチャレンジの１
９日後に３／７のマウスが生存していたことを示す。
【０１６８】第１０図に示したように、ＢＳＭ免疫グル
ープは血清中に高力価のＴｎ及びシアリルＴｎ特異的抗
体を有したが、一方Ｔエピトープ（ノイラミニダーゼ処
理グリコホリンＡ）に対する抗体は検出されなかった。
第１０図において、白四角はＮ−ＢＳＭ（Ｔｎ）に対す
る抗体の力価を表し、白三角はヒツジ下顎腺ムチン（Ｏ
ＳＭ）に対する抗体の力価を表し、黒四角はノイラミニ
グーゼ処理グリコホリンＡ（Ｔ）に対する抗体の力価を
表す。ＰＢＳ又はＦＡで免疫した動物に於いてはＴｎ抗
原に対する抗体は検出されなかった。第１１図は腫瘍サ
イズに対するＮ−ＢＳＭ免疫の効果を示す。白四角はＦ
Ａで免疫したマウスを、＋印はフロイント アジュバン
ト中のＮ−ＢＳＭで免疫したマウスを示す。腫瘍はＰＢ
Ｓ及びＢＳＭ免疫のマウス共に増殖するが、腫瘍増殖の
速度は、ＰＢＳ免疫グループと比較してＢＳＭ免疫グル
ープでは遅かった。
ープは血清中に高力価のＴｎ及びシアリルＴｎ特異的抗
体を有したが、一方Ｔエピトープ（ノイラミニダーゼ処
理グリコホリンＡ）に対する抗体は検出されなかった。
第１０図において、白四角はＮ−ＢＳＭ（Ｔｎ）に対す
る抗体の力価を表し、白三角はヒツジ下顎腺ムチン（Ｏ
ＳＭ）に対する抗体の力価を表し、黒四角はノイラミニ
グーゼ処理グリコホリンＡ（Ｔ）に対する抗体の力価を
表す。ＰＢＳ又はＦＡで免疫した動物に於いてはＴｎ抗
原に対する抗体は検出されなかった。第１１図は腫瘍サ
イズに対するＮ−ＢＳＭ免疫の効果を示す。白四角はＦ
Ａで免疫したマウスを、＋印はフロイント アジュバン
ト中のＮ−ＢＳＭで免疫したマウスを示す。腫瘍はＰＢ
Ｓ及びＢＳＭ免疫のマウス共に増殖するが、腫瘍増殖の
速度は、ＰＢＳ免疫グループと比較してＢＳＭ免疫グル
ープでは遅かった。
【０１６９】実施例４ キャリアー蛋白質に結合したＴｎ及びシアリルＴｎ抗原
の化学合成 多価抗原システムの製造方法の基本的考え方を第１２図
スキームＩに要約する。多くの抗原を樹状アームとして
担う核マトリックスとして、リジルリジンを用いること
が、第１２図スキームＩの提案の必須部分となってい
る。３個のアミノ酸グループを反応末端として使用可能
なリジルリジンに連続して結合させることにより、３n
個のＴｎ抗原残基が生成する。続いて、これらの残基を
化学的又は酵素的シアル化によりシアリルＴｎ（Ｎｅｕ
Ａｃα２→６Ｇａ１ＮＡｃα１→Ｒ）に変換する。化学
的シアル化に含まれる多くのステップを避けるため、Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃ（シチジン−モノホスホ−シアル酸）
及び２→６シアリルトランスフェラーゼを用いた酵素的
シアル化が好ましい。これらの結合物はキャリアー蛋白
質に結合後、免疫抗原として用いることができる。ｔ−
プトキシカルボニル（Ｂｏｃ）β−Ａｌａ−Ｏ−ＣＨ2
−Ｐａｎレジン及びリジン核を用いた多価抗原ペプチド
システム（ＭＡＰ）の合成は既に記載されている［Ta
m JP,Proc NatlAcad Sci USA.85,5409-5413,(1988)］。
の化学合成 多価抗原システムの製造方法の基本的考え方を第１２図
スキームＩに要約する。多くの抗原を樹状アームとして
担う核マトリックスとして、リジルリジンを用いること
が、第１２図スキームＩの提案の必須部分となってい
る。３個のアミノ酸グループを反応末端として使用可能
なリジルリジンに連続して結合させることにより、３n
個のＴｎ抗原残基が生成する。続いて、これらの残基を
化学的又は酵素的シアル化によりシアリルＴｎ（Ｎｅｕ
Ａｃα２→６Ｇａ１ＮＡｃα１→Ｒ）に変換する。化学
的シアル化に含まれる多くのステップを避けるため、Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃ（シチジン−モノホスホ−シアル酸）
及び２→６シアリルトランスフェラーゼを用いた酵素的
シアル化が好ましい。これらの結合物はキャリアー蛋白
質に結合後、免疫抗原として用いることができる。ｔ−
プトキシカルボニル（Ｂｏｃ）β−Ａｌａ−Ｏ−ＣＨ2
−Ｐａｎレジン及びリジン核を用いた多価抗原ペプチド
システム（ＭＡＰ）の合成は既に記載されている［Ta
m JP,Proc NatlAcad Sci USA.85,5409-5413,(1988)］。
【０１７０】三価の結合体の合成はＴｎ抗原のＮ−ヒド
ロキシサクシニミル誘導体をリジルリジンとカップルさ
せることにより行われる。全反応のシークエンスを第１
３図スキームIIに示す。抗原１は刊行物記載の方法で
［Paulsen H and Holek J-P Carbohydr.Res.,109,89-l0
7(1982);Grundler G. and Schmidt RR,Liebigs Ann.Che
m.,1826-1847(1984)］合成した。高度にチャージされた
結合物の発生を与えるアミノグループのカチオン性の性
質を除くため、セリンのアミノ グループはメタノール
溶解の無水酢酸を用いた選択的Ｎ−アセチル化により修
飾する必要がある。得られる化合物２を、縮合剤として
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で、そのＮ−
ヒドロキシサクシニミド誘導体に変換する。３と４（Ba
chem Bioscience Inc.,Philadelphia,PA）とのカップリ
ング反応は、３の４．５Ｍ過剰量を用いて行い、３価の
結合物５を得る。Ｈ2Ｏを用いたＰ２カラムクロマトグ
ラフィによる精製の後、さらに４又はキャリアー蛋白質
にカップルさせるため、結合物５をその活性エステル６
に変換する。
ロキシサクシニミル誘導体をリジルリジンとカップルさ
せることにより行われる。全反応のシークエンスを第１
３図スキームIIに示す。抗原１は刊行物記載の方法で
［Paulsen H and Holek J-P Carbohydr.Res.,109,89-l0
7(1982);Grundler G. and Schmidt RR,Liebigs Ann.Che
m.,1826-1847(1984)］合成した。高度にチャージされた
結合物の発生を与えるアミノグループのカチオン性の性
質を除くため、セリンのアミノ グループはメタノール
溶解の無水酢酸を用いた選択的Ｎ−アセチル化により修
飾する必要がある。得られる化合物２を、縮合剤として
ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で、そのＮ−
ヒドロキシサクシニミド誘導体に変換する。３と４（Ba
chem Bioscience Inc.,Philadelphia,PA）とのカップリ
ング反応は、３の４．５Ｍ過剰量を用いて行い、３価の
結合物５を得る。Ｈ2Ｏを用いたＰ２カラムクロマトグ
ラフィによる精製の後、さらに４又はキャリアー蛋白質
にカップルさせるため、結合物５をその活性エステル６
に変換する。
【０１７１】本発明を詳細に且つその特定の態様を参照
に説明してきたが、本発明の精神及び範囲から離れるこ
となく種々の変更を成し得ることは当業者に明らかであ
る。
に説明してきたが、本発明の精神及び範囲から離れるこ
となく種々の変更を成し得ることは当業者に明らかであ
る。
【０１７２】寄託について ハイブリドーマ細胞ラインＢＭ−８、ＢＭ−３、及びＢ
Ｍ−４はアメリカンタイプ カルチャー コレクション
（American Type Culture Collection,Rockville,Maryl
and）に１９８８年１０月２１日、１９８８年３月２日
及び１９８８年３月２日に夫々寄託され、夫々寄託番号
ＨＢ−９８７３、ＨＢ−９６５３及びＨＢ−９６５４を
有する。
Ｍ−４はアメリカンタイプ カルチャー コレクション
（American Type Culture Collection,Rockville,Maryl
and）に１９８８年１０月２１日、１９８８年３月２日
及び１９８８年３月２日に夫々寄託され、夫々寄託番号
ＨＢ−９８７３、ＨＢ−９６５３及びＨＢ−９６５４を
有する。
【０１７３】寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的
承認に関するブタペスト条約に従って成された。
承認に関するブタペスト条約に従って成された。
【０１７４】本発明にアメリカ合衆国特許を付与するこ
とに対し、全ての接触の制限は変更なしに除かれる。
とに対し、全ての接触の制限は変更なしに除かれる。
【第１図】第１図Ａ及びＢは、ヒト偏平上皮細胞癌ＬＵ
−６５の培養上清中に存在する糖蛋白質のＴｎ活性を示
すゲル濾過パターンを表わす。 第１Ａ図：ＬＵ−６５細胞上清中の全糖蛋白質の、セフ
ァロースＣＬ−４Ｂによるゲル濾過パターン及び実施例
１に記載の方法でアッセイしたＴｎ活性。縦軸は抗Ｔｎ
抗体ＮＣＣ−ＬＵ−８１の結合を示し、横軸は分画Ｎ
ｏ．を示す。実線で示した分画（分画７−１５）を更に
セファクリルＳ２００で精製した（下記参照）。 第１Ｂ図：第１Ａ図の７−１５分画中のＴｎ活性の、セ
ファクリルＳ２００によるゲル濾過パターン。左の縦軸
は２８０ｎｍに於けるＵＶ吸収を示し、右の縦軸はＴｎ
抗体の結合活性を示す。横軸は分画Ｎｏ．及び溶出液の
全容積を示す。○はＴｎ抗体活性を表わし、●は２８０
ｎｍでの吸光度により示された蛋白質濃度を表わす。
−６５の培養上清中に存在する糖蛋白質のＴｎ活性を示
すゲル濾過パターンを表わす。 第１Ａ図：ＬＵ−６５細胞上清中の全糖蛋白質の、セフ
ァロースＣＬ−４Ｂによるゲル濾過パターン及び実施例
１に記載の方法でアッセイしたＴｎ活性。縦軸は抗Ｔｎ
抗体ＮＣＣ−ＬＵ−８１の結合を示し、横軸は分画Ｎ
ｏ．を示す。実線で示した分画（分画７−１５）を更に
セファクリルＳ２００で精製した（下記参照）。 第１Ｂ図：第１Ａ図の７−１５分画中のＴｎ活性の、セ
ファクリルＳ２００によるゲル濾過パターン。左の縦軸
は２８０ｎｍに於けるＵＶ吸収を示し、右の縦軸はＴｎ
抗体の結合活性を示す。横軸は分画Ｎｏ．及び溶出液の
全容積を示す。○はＴｎ抗体活性を表わし、●は２８０
ｎｍでの吸光度により示された蛋白質濃度を表わす。
【第２図】第２図Ａ、Ｂ、およびＣは、固相Ｔｎ抗原に
対するＢＭ−８抗体の結合の、単糖による又はグリコシ
ドによる阻害を測定するアッセイの結果を示すグラフで
ある。縦軸は抗体結合活性を示し、横軸はｍＭで表わし
た糖の濃度を示す。 第２Ａ図：抗体の結合の単糖による阻害。■はＢＭ−８
結合のＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃによる阻害を表し、●は
ＢＭ−８結合のＧａｌＮＡｃによる阻害を表し、□はＢ
Ｍ−８結合のＧａｌによる阻害を表す。 第２Ｂ図：固相Ｔｎ抗原へのＢＭ−８抗体の結合の、ｐ
−ニトロフェニル−α又はβ−ＧａｌＮＡｃによる阻
害。●はｐ−ニトロフェニル−α−ＧａｌＮＡｃによる
阻害を示し、△はｐ−ニトロフェニル−β−ＧａｌＮＡ
ｃによる阻害を示し、□はＧａｌＮＡｃ（α及びβの混
合物）を表し、■はＧｌｃＮＡｃを表す。 第２Ｃ図：固相Ｔｎ抗原へのＢＭ−８抗体の結合の、ｐ
−ニトロフェニル−α又はβ−ＧｌｃＮＡｃによる阻
害。○はｐ−ニトロフェニル−α−ＧａｌＮＡｃを表
し、▲はＧａｌＮＡｃ（α及びβの混合物）を表し、△
はｐ−ニトロフェニル−β−ＧａｌＮＡｃを表し、□は
ＧｌｃＮＡｃを表す。
対するＢＭ−８抗体の結合の、単糖による又はグリコシ
ドによる阻害を測定するアッセイの結果を示すグラフで
ある。縦軸は抗体結合活性を示し、横軸はｍＭで表わし
た糖の濃度を示す。 第２Ａ図：抗体の結合の単糖による阻害。■はＢＭ−８
結合のＧｌｃＮＡｃ又はＧｌｃによる阻害を表し、●は
ＢＭ−８結合のＧａｌＮＡｃによる阻害を表し、□はＢ
Ｍ−８結合のＧａｌによる阻害を表す。 第２Ｂ図：固相Ｔｎ抗原へのＢＭ−８抗体の結合の、ｐ
−ニトロフェニル−α又はβ−ＧａｌＮＡｃによる阻
害。●はｐ−ニトロフェニル−α−ＧａｌＮＡｃによる
阻害を示し、△はｐ−ニトロフェニル−β−ＧａｌＮＡ
ｃによる阻害を示し、□はＧａｌＮＡｃ（α及びβの混
合物）を表し、■はＧｌｃＮＡｃを表す。 第２Ｃ図：固相Ｔｎ抗原へのＢＭ−８抗体の結合の、ｐ
−ニトロフェニル−α又はβ−ＧｌｃＮＡｃによる阻
害。○はｐ−ニトロフェニル−α−ＧａｌＮＡｃを表
し、▲はＧａｌＮＡｃ（α及びβの混合物）を表し、△
はｐ−ニトロフェニル−β−ＧａｌＮＡｃを表し、□は
ＧｌｃＮＡｃを表す。
【第３図】第３図は、種々の細胞ラインに対するＢＭ−
８抗体の結合能を示す。各棒グラフは各細胞ラインを示
す。抗体の結合はＱＧ−５６（１００％）に対するパー
セントで表わされている。
８抗体の結合能を示す。各棒グラフは各細胞ラインを示
す。抗体の結合はＱＧ−５６（１００％）に対するパー
セントで表わされている。
【第４図】第４図はＢＭ−８抗体に引き起される、種々
の細胞ラインの抗体依存性細胞障害（antibody-depende
nt cytotoxicity）を示すグラフである。４個のパネル
は、エフェクターを標的細胞に対し種々の割合とした時
に生じる腫瘍細胞の溶解を示す。
の細胞ラインの抗体依存性細胞障害（antibody-depende
nt cytotoxicity）を示すグラフである。４個のパネル
は、エフェクターを標的細胞に対し種々の割合とした時
に生じる腫瘍細胞の溶解を示す。
【第５図】第５図Ａ及びＢは、モノクローナル抗体ＢＭ
−３の固相ＯＳＭに対する反応性を示す。 第５Ａ図：種々の濃度のＢＭ−３上清に於ける、ＯＳＭ
に対するＢＭ−３の反応性。 第５Ｂ図：種々の濃度のＯＳＭに対するＢＭ−３の反応
性。天然のＯＳＭに対する反応性は●で示し、ノイラミ
ニダーゼ処理ＯＳＭに対する反応性は○で示す。
−３の固相ＯＳＭに対する反応性を示す。 第５Ａ図：種々の濃度のＢＭ−３上清に於ける、ＯＳＭ
に対するＢＭ−３の反応性。 第５Ｂ図：種々の濃度のＯＳＭに対するＢＭ−３の反応
性。天然のＯＳＭに対する反応性は●で示し、ノイラミ
ニダーゼ処理ＯＳＭに対する反応性は○で示す。
【第６図】第６図の２つのグラフは、種々の糖を用いた
ときの、ＯＳＭに対するＢＭ−３の反応性を示す。 第６Ａ図：ＢＭ−３に対する単糖類：フコース（○）、
ガラクトース（□）、グルコース（▲）、Ｎ−アセチル
グルコサミン（△）、Ｎ−アセチルガラクトサミン
（■）及びＮ−アセチルノイラミン酸（●）の阻害作
用。 第６Ｂ図：ＢＭ−３に対する二糖 ＮｅｕＡｃα２→６
ＧａｌＮＡｃα１→セリン（■）及びラクトース（●）
の阻害作用。
ときの、ＯＳＭに対するＢＭ−３の反応性を示す。 第６Ａ図：ＢＭ−３に対する単糖類：フコース（○）、
ガラクトース（□）、グルコース（▲）、Ｎ−アセチル
グルコサミン（△）、Ｎ−アセチルガラクトサミン
（■）及びＮ−アセチルノイラミン酸（●）の阻害作
用。 第６Ｂ図：ＢＭ−３に対する二糖 ＮｅｕＡｃα２→６
ＧａｌＮＡｃα１→セリン（■）及びラクトース（●）
の阻害作用。
【第７図】第７図は、ＢＭ−３モノクローナル抗体を用
いた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍の
イムノペルオキシダーゼ染色を示す。 第７Ａ図：肺腺癌に対するＢＭ−３の反応性（×９
０）。一方正常肺は染色されない。 第７Ｂ図：適度に分化した結腸腺癌の染色。周囲の正常
細胞及びストロマ（stroma）は反応しない。 第７Ｃ図：ＢＭ−３による癌紬胞の不均一な染色を示す
粘性（mucinous）胃癌（×９０）。 第７Ｄ図：ＢＭ−３による細葉肺腺癌の染色。正常肺組
織は染色されない。
いた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍の
イムノペルオキシダーゼ染色を示す。 第７Ａ図：肺腺癌に対するＢＭ−３の反応性（×９
０）。一方正常肺は染色されない。 第７Ｂ図：適度に分化した結腸腺癌の染色。周囲の正常
細胞及びストロマ（stroma）は反応しない。 第７Ｃ図：ＢＭ−３による癌紬胞の不均一な染色を示す
粘性（mucinous）胃癌（×９０）。 第７Ｄ図：ＢＭ−３による細葉肺腺癌の染色。正常肺組
織は染色されない。
【第８図】第８図は、ＢＭ−４モノクローナル抗体を用
いた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍イ
ムノペルオキシダーゼ染色を示す。 第８Ａ図：肺腺癌に対するＢＭ−４の反応性（×４
０）。 第８Ｂ図：ＢＭ−４による粘性胃癌の染色（×９０）。 第８Ｃ図：適度に分化した結腸腺癌に対するＢＭ−４の
反応性（×９０）。正常結腸細胞及びストロマは反応し
ない。
いた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した悪性腫瘍イ
ムノペルオキシダーゼ染色を示す。 第８Ａ図：肺腺癌に対するＢＭ−４の反応性（×４
０）。 第８Ｂ図：ＢＭ−４による粘性胃癌の染色（×９０）。 第８Ｃ図：適度に分化した結腸腺癌に対するＢＭ−４の
反応性（×９０）。正常結腸細胞及びストロマは反応し
ない。
【第９図】第９図は、肝臓ＴＡ３ＨＡ細胞をチャレンジ
されたマウスの生存に対するノイラミニダーゼ処理ＢＳ
Ｍ（Ｎ−ＢＳＭ）の効果を示す。実線はフロイント ア
ジュバント（ＦＡ）のみで免疫されたマウスを表わし、
破線はＮ−ＢＳＭで免疫されたマウスを表わす。
されたマウスの生存に対するノイラミニダーゼ処理ＢＳ
Ｍ（Ｎ−ＢＳＭ）の効果を示す。実線はフロイント ア
ジュバント（ＦＡ）のみで免疫されたマウスを表わし、
破線はＮ−ＢＳＭで免疫されたマウスを表わす。
【第１０図】第１０図はマウス血清中の抗Ｔｎ、抗シア
リル−Ｔｎ又は抗Ｔ抗体の力価に対するＮ−ＢＳＭ免疫
の効果を示す。□はＮ−ＢＳＭ（Ｔｎ）に対する抗体の
力価を表わし、△はＯＳＭ（シアリル−Ｔｎ）に対する
抗体の力価を表わし、■はノイラミニダーゼ処理された
グリコホリンＡ（Ｔ）を表わす。
リル−Ｔｎ又は抗Ｔ抗体の力価に対するＮ−ＢＳＭ免疫
の効果を示す。□はＮ−ＢＳＭ（Ｔｎ）に対する抗体の
力価を表わし、△はＯＳＭ（シアリル−Ｔｎ）に対する
抗体の力価を表わし、■はノイラミニダーゼ処理された
グリコホリンＡ（Ｔ）を表わす。
【第１１図】第１１図は、腫瘍サイズに対するＮ−ＢＳ
Ｍ免疫の効果を示す。□はＦＡで免疫されたマウスを示
し、＋印はフロイント アジュバントと共にＮ−ＢＳＭ
で免疫されたマウスを示す。
Ｍ免疫の効果を示す。□はＦＡで免疫されたマウスを示
し、＋印はフロイント アジュバントと共にＮ−ＢＳＭ
で免疫されたマウスを示す。
【第１２図】第１２図は、実施例４に記載の炭水化物エ
ピトープＴｎの化学合成を図示したものである。シアリ
ル−Ｔｎの合成は、シアリル残基を酵素的又は化学的に
付加することによって容易に行うことができる。
ピトープＴｎの化学合成を図示したものである。シアリ
ル−Ｔｎの合成は、シアリル残基を酵素的又は化学的に
付加することによって容易に行うことができる。
【第１３図】第１３図は、実施例４に記載の炭水化物エ
ピトープＴｎの化学合成を図示したものである。シアリ
ル−Ｔｎの合成は、シアリル残基を酵素的又は化学的に
付加することによって容易に行うことができる。
ピトープＴｎの化学合成を図示したものである。シアリ
ル−Ｔｎの合成は、シアリル残基を酵素的又は化学的に
付加することによって容易に行うことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジェルドソン トマス ジェイ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 クローゼン ヘンリック アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 シンガイ アニル アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 トヨクニ タツシ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 タカハシ ヘリオ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内 (72)発明者 ハコモリ センイチロー アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル、エリオット アベニュー ウェス ト201 ザ バイオメンブレン インステ ィテュート内
Claims (13)
- 【請求項１】（ａ）Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを
有する精製ムチン型糖蛋白質、ムチン型糖蛋白質の精製
された核構造又は担体分子にリンクした化学合成炭水化
物成分であって、ムチン型糖蛋白質に対する免疫反応を
誘導可能なものから成り、薬理的有効量の抗原、及び
（ｂ）製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤：を
含むワクチンを対象に投与して癌細胞に対する免疫反応
を誘導することから成る、ムチン型糖蛋白質の核構造を
発現する癌細胞の増殖及び複製を防ぐ方法。 - 【請求項２】Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを有する
精製ムチン型糖蛋白質が、シンジェニックマウスに於い
てマウス腫瘍ＴＡ３ＨＡの増殖を阻害する能力のある、
請求項２記載の方法。 - 【請求項３】Ｔｎ又はシアリルＴｎエピトープを有する
精製ムチン型糖蛋白質がウシ下顎ムチン又はヒツジ下顎
ムチンである請求項２記載の方法。 - 【請求項４】ムチン型糖蛋白質の精製した核構造が、Ｔ
抗原、Ｔｎ抗原、シアリルＴｎ抗原、又は上記抗原を含
む動物ムチンを含有する請求項１記載の方法。 - 【請求項５】ムチン型糖蛋白質の精製した核構造が、Ｔ
ｎ抗原、又はシアリルＴｎ抗原を含有する請求項４記載
の方法。 - 【請求項６】化学的に合成された炭水化物成分がＴｎ又
はシアリルＴｎエピトープを含有する請求項１記載の方
法。 - 【請求項７】癌細胞に対する抗体が、ＡＴＣＣ寄託番号
ＨＢ−９８７３のハイブリドーマＢＭ−８が産生する抗
Ｔｎ抗体ＢＭ−８、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−９６５３の
ハイブリドーマＢＭ−３が産生する抗シアリルＴｎ抗体
ＢＭ−３、及びＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−９６５４のハイ
ブリドーマＢＭ−４が産生する抗シアリルＴｎ抗体ＢＭ
−４からなる群より選ばれるものものである請求項１記
載の方法。 - 【請求項８】対象がヒトである請求項１乃至７のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項９】（ａ）ムチン型糖蛋白質の精製された核構
造に対して作られた抗癌抗体の薬理的有効量、及び
（ｂ）製薬的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を含
有する薬剤を対象に投与することから成る、その中の癌
細胞がムチン型糖蛋白質の核構造を発現する癌の治療
法。 - 【請求項１０】ムチン型糖蛋白質の精製された核構造が
Ｔ抗原、Ｔｎ抗原、シアリルＴｎ抗原、又は上記抗原を
含む動物ムチンである、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】ムチン型糖蛋白質の精製された核構造が
Ｔｎ抗原又はシアリルＴｎ抗原を含有する請求項１０記
載の方法。 - 【請求項１２】癌細胞に対する抗体が、ＡＴＣＣ寄託番
号ＨＢ−９８７３のハイブリドーマＢＭ−８が産生する
抗Ｔｎ抗体ＢＭ−８、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−９６５３
のハイブリドーマＢＭ−３が産生する抗シアリルＴｎ抗
体ＢＭ−３及びＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−９６５４のハイ
ブリドーマＢＭ−４が産生する抗シアリルＴｎ抗体ＢＭ
−４からなる群より選ばれるものである請求項９記載の
方法。 - 【請求項１３】対象がヒトである請求項９乃至１２のい
ずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16778688A | 1988-03-11 | 1988-03-11 | |
| US167786 | 1988-03-11 | ||
| US31749289A | 1989-03-01 | 1989-03-01 | |
| US317492 | 1989-03-01 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1504002A Division JP2849683B2 (ja) | 1988-03-11 | 1989-03-10 | 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1192400A true JPH1192400A (ja) | 1999-04-06 |
| JP3066741B2 JP3066741B2 (ja) | 2000-07-17 |
Family
ID=26863475
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1504002A Expired - Lifetime JP2849683B2 (ja) | 1988-03-11 | 1989-03-10 | 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」 |
| JP10205777A Expired - Fee Related JP3066741B2 (ja) | 1988-03-11 | 1998-07-07 | 癌細胞の増殖及び複製を抑制するための組成物 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1504002A Expired - Lifetime JP2849683B2 (ja) | 1988-03-11 | 1989-03-10 | 「動物及びヒトのムチンを用い、並びに合成炭水化物−担体結合物を用いた免疫による、ヒト癌関連抗原に対するモノクローナル抗体」 |
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|---|---|
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| DE (1) | DE68922806T2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111630069A (zh) * | 2017-10-13 | 2020-09-04 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 针对Thomsen-nouvelle(Tn)抗原的人抗体 |
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| IE914075A1 (en) * | 1990-11-23 | 1992-06-03 | Gen Hospital Corp | Inhibition of cell adhesion protein-carbohydrate¹interactions |
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| US5527891A (en) * | 1994-03-09 | 1996-06-18 | Biomira, Inc. | Stereodirected process for synthesis of α-N-acetylgalactosaminides |
| US8021667B2 (en) | 1994-11-16 | 2011-09-20 | Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd | Compositions for immunotherapy and uses thereof |
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| KR102262720B1 (ko) | 2014-04-28 | 2021-06-08 | 이카가쿠 소우야쿠 가부시키가이샤 | 항muc1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도 |
| US11161911B2 (en) | 2017-10-23 | 2021-11-02 | Go Therapeutics, Inc. | Anti-glyco-MUC1 antibodies and their uses |
| PT110526B (pt) * | 2018-01-26 | 2021-02-04 | Univ Nova De Lisboa | Anticorpo, fragmento funcional ou sonda do mesmo contra antigénios tumorais |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4444744A (en) * | 1980-03-03 | 1984-04-24 | Goldenberg Milton David | Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens |
-
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- 1989-03-10 EP EP89903892A patent/EP0357767B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1989-03-10 CA CA000593376A patent/CA1340587C/en not_active Expired - Fee Related
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-
1998
- 1998-07-07 JP JP10205777A patent/JP3066741B2/ja not_active Expired - Fee Related
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|---|---|---|---|---|
| CN111630069A (zh) * | 2017-10-13 | 2020-09-04 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 针对Thomsen-nouvelle(Tn)抗原的人抗体 |
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| CN111630069B (zh) * | 2017-10-13 | 2024-05-31 | 勃林格殷格翰国际有限公司 | 针对Thomsen-nouvelle(Tn)抗原的人抗体 |
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