JPH1192375A - Antibacterial agent capable of enhancing antibacterial activity of new quinolone-based antibacterial drug - Google Patents
Antibacterial agent capable of enhancing antibacterial activity of new quinolone-based antibacterial drugInfo
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- JPH1192375A JPH1192375A JP9278113A JP27811397A JPH1192375A JP H1192375 A JPH1192375 A JP H1192375A JP 9278113 A JP9278113 A JP 9278113A JP 27811397 A JP27811397 A JP 27811397A JP H1192375 A JPH1192375 A JP H1192375A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、ニュ−キノロン系
抗菌剤及びラクトフェリン加水分解物又はラクトフェリ
ン由来抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤
に関するものであり、更に詳しくは、本発明は、ニュ−
キノロン系抗菌剤と哺乳動物の主として乳汁に存在する
生理活性蛋白質であるラクトフェリン類の加水分解物又
はラクトフェリン類の加水分解物由来の抗菌性ペプチド
とを併用することにより、従来のニュ−キノロン系抗菌
剤と比較してその有効成分の使用量を顕著に低減するこ
とを可能とすると共に、少用量で強い抗菌活性が得ら
れ、副作用が少なく、耐性菌の出現頻度を低下させるこ
とが可能な新規抗菌剤に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a new quinolone antibacterial agent and an antibacterial agent containing a lactoferrin hydrolyzate or a lactoferrin-derived antimicrobial peptide as an active ingredient. −
A conventional quinolone antibacterial agent is used in combination with a quinolone antibacterial agent and an antibacterial peptide derived from a lactoferrin hydrolyzate or a lactoferrin hydrolyzate which is a physiologically active protein mainly present in milk of mammals. A new drug that can significantly reduce the amount of active ingredient used compared to a drug, and can provide strong antimicrobial activity in a small dose, have few side effects, and reduce the frequency of resistant bacteria Related to antibacterial agents.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ニューキノロン系抗菌剤は、ナリジクス
酸をプロトタイプとして開発された合成抗菌剤であるキ
ノロン系抗菌剤の欠点を補うために開発されたものであ
り、フッ素原子とピペラジニル基を有するキノリン誘導
体である。ニュ−キノロン系抗菌剤は、体内動態の改
善、抗菌力の増大及び抗菌スペクトルの拡大が図られ、
耐性菌の出現率も低い抗菌薬として臨床的に広く使用さ
れている。ニューキノロン系抗菌剤は、β―ラクタム系
抗菌剤に比べ抗菌力が強く（植手鉄男著、「抗生物質選
択と臨床の実際」、改訂８版、第１１５ペ−ジ、医薬ジ
ャーナル、１９９２年）、その効果は、細菌のＤＮＡ合
成阻害によるものであり、セフェム系抗菌剤耐性菌に交
差耐性が無く、ペニシリン結合蛋白の変化による耐性菌
に使用されている（吉川昌之介著、「医科細菌学」、第
１１８ペ−ジ、南江堂、１９８９年）。2. Description of the Related Art New quinolone antibacterial agents have been developed to compensate for the disadvantages of quinolone antibacterial agents, which are synthetic antibacterial agents developed using nalidixic acid as a prototype, and are quinoline derivatives having a fluorine atom and a piperazinyl group. It is. New quinolone antibacterial agents are intended to improve pharmacokinetics, increase antibacterial activity and broaden the antibacterial spectrum,
It is widely used clinically as an antibacterial drug with a low incidence of resistant bacteria. New quinolone antibacterial agents have stronger antibacterial activity than β-lactam antibacterial agents (Tetsuo Ute, “Selection of antibiotics and clinical practice”, 8th revised edition, page 115, Pharmaceutical Journal, 1992) The effect is due to the inhibition of bacterial DNA synthesis, which has no cross-resistance to cephem antimicrobial-resistant bacteria and has been used for resistant bacteria due to changes in penicillin-binding protein (Shinosuke Yoshikawa, "Medical Bacteriology"). 118, Nankodo, 1989).
【０００３】しかしながら、ニュ−キノロン系抗菌剤を
菌体から排出するタンパク質が、バシルス・サチリス、
スタフィロコッカス・アウレウス等のグラム陽性菌に存
在することが報告されており［マイクロバイオロジカル
・レビュ−ズ(Microbiological Reviews) 、第６０巻、
第５７５〜６０８ペ−ジ、１９９６年］、将来ニュ−キ
ノロン系抗菌剤に対する耐性が問題となる可能性も指摘
されている。[0003] However, proteins that excrete a new quinolone antibacterial agent from cells are Bacillus subtilis,
It has been reported to be present in Gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus [Microbiological Reviews, Vol.
575-608, 1996], and it has been pointed out that there is a possibility that resistance to a new quinolone antibacterial agent may become a problem in the future.
【０００４】また、ラクトフェリンは、生体内では、
涙、唾液、末梢血、乳汁等に含まれている天然の鉄結合
蛋白質であり、大腸菌、カンジダ菌、クロストリジウム
菌等の有害微生物に対して抗菌作用を示すことが知られ
ている［ジャ−ナル・オブ・ペディアトリクス（Journa
l of Pediatrics ）、第９４巻、第１ペ−ジ、１９７９
年］。ラクトフェリンは、ブドウ球菌及び腸球菌に対し
て、０．５〜３０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗菌作用を有する
ことが知られている［ジャ−ナル・オブ・デイリ−・サ
イエンス（Journal of Dairy Science）、第６７巻、第
６０６ペ−ジ、１９８４年］。[0004] In addition, lactoferrin, in vivo,
It is a natural iron-binding protein contained in tears, saliva, peripheral blood, milk, etc., and is known to have an antibacterial action against harmful microorganisms such as Escherichia coli, Candida and Clostridium [Journal] Of Pediatrics (Journa
l of Pediatrics), Vol. 94, No. 1, Page 1979
Year]. Lactoferrin is known to have antibacterial activity against staphylococci and enterococci at a concentration of 0.5 to 30 mg / ml [Journal of Dairy Science, 67, 606, 1984].
【０００５】更に、ラクトフェリンとニューキノロン系
抗菌剤の併用効果が検討されているが、併用効果を示す
とする報告［ダイアグノスティック・マイクロバイオロ
ジー・アンド・インフェクシャス・ディジーズ（Diagno
stics Microbiology and Infectious Disease)、第２０
巻、第６９ペ−ジ、１９９４年］と、併用効果を示さな
いとする報告［ケモセラピ−（Chemotherapy）、第３９
巻、第８２９〜８３５ペ−ジ、１９９１年］とがある。[0005] Furthermore, the combined effect of lactoferrin and a new quinolone antibacterial agent has been studied. A report indicating that the combined effect is shown [Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases (Diagno).
stics Microbiology and Infectious Disease), twentieth
Vol. 69, 1994] and a report showing no combined effect [Chemotherapy, 39].
829-835, 1991].
【０００６】一方、抗菌性蛋白質であるラクトフェリン
の加水分解物、又はラクトフェリンに由来するペプチド
が、抗菌活性及び抗真菌活性を有することが知られてお
り（特開平５−３２００６８号公報、及び特開平５−９
２９９４号公報）、抗生物質と、ラクトフェリン類の加
水分解物又はラクトフェリン関連抗菌性ペプチドとを含
む抗菌剤（特開平５−３１０５９４号公報）、アゾ−ル
系抗真菌剤とラクトフェリン類の加水分解物又はラクト
フェリン関連抗菌性ペプチドとを含む抗真菌剤（特開平
９−１６５３４２号公報）について開示されている。On the other hand, it is known that a hydrolyzate of lactoferrin, which is an antibacterial protein, or a peptide derived from lactoferrin has an antibacterial activity and an antifungal activity (see JP-A-5-320068 and JP-A-5-328068). 5-9
No. 2994), an antibacterial agent containing an antibiotic and a lactoferrin hydrolyzate or a lactoferrin-related antimicrobial peptide (Japanese Patent Laid-Open No. 5-310594), an azole antifungal agent and a lactoferrin hydrolyzate Or an antifungal agent containing a lactoferrin-related antimicrobial peptide (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-165342).
【０００７】しかしながら、ニュ−キノロン系抗菌剤
と、ラクトフェリンの加水分解物又はラクトフェリンに
由来する抗菌ペプチドとを組み合わせることにより、抗
菌活性が増強されることについてはこれまで知られてお
らず、報告も皆無である。However, it has not been known or reported that the antibacterial activity is enhanced by combining a new quinolone antibacterial agent with a hydrolyzate of lactoferrin or an antibacterial peptide derived from lactoferrin. There is nothing.
【０００８】以上のように、少量の使用で殺菌的作用を
有する抗菌剤、即ち、副作用が少なく、かつ強い抗菌作
用を有する抗菌剤の開発が待望されていた。As described above, the development of an antibacterial agent having a bactericidal action with a small amount of use, that is, an antibacterial agent having few side effects and a strong antibacterial action has been desired.
【０００９】[0009]
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、前記従
来技術に鑑みて、新規な抗菌剤について鋭意研究を行っ
た結果、ニュ−キノロン系抗菌剤と、ラクトフェリンの
加水分解物又はラクトフェリン由来抗菌ペプチドを併用
することにより、ニュ−キノロン系抗菌剤が、従来の用
量よりも極めて少用量で、強い抗菌活性を発揮すること
を見い出し、本発明を完成した。In view of the above prior art, the present inventors have conducted intensive studies on a novel antibacterial agent, and as a result, have found that a new quinolone antibacterial agent and a hydrolyzate of lactoferrin or lactoferrin-derived lactoferrin. By using an antimicrobial peptide in combination, it has been found that a new quinolone antimicrobial agent exerts a strong antimicrobial activity in a much smaller dose than the conventional dose, and thus completed the present invention.
【００１０】本発明の目的は、少用量で有効であり、副
作用が少なく、耐性菌の出現頻度が少ない抗菌剤を提供
することである。[0010] An object of the present invention is to provide an antibacterial agent which is effective at a small dose, has few side effects, and has a low frequency of emergence of resistant bacteria.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明は、ニュ−キノロン系抗菌剤及びラクトフェリン類の
加水分解物又はラクトフェリン類の加水分解物由来の抗
菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌剤であり、
ニュ−キノロン系抗菌剤が、スパルフロキサシン、エン
ロフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、
エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシ
ン、トスフロキサシン、フレロキサシン、レボフロキサ
シン又はこれらの混合物であること、ラクトフェリン類
の加水分解物由来の抗菌性ペプチドが、牛乳若しくは人
乳由来のラクトフェリン類の加水分解物から単離された
ペプチド、このペプチドと同一のアミノ酸配列を含む化
学合成されたペプチド、それらの誘導体、又はこれらの
２種以上の混合物であること、ラクトフェリン類の加水
分解物由来の抗菌性ペプチドが、配列番号１乃至配列番
号８のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するこ
と、ニュ−キノロン系抗菌剤１部（重量。以下特に断り
のない限り同じ。）に対してラクトフェリン類の加水分
解物が、少なくとも１００部の割合で含有されているこ
と、及びニュ−キノロン系抗菌剤１部に対してラクトフ
ェリン類の加水分解物由来の抗菌性ペプチドが、少なく
とも１０部の割合で含有されていることを望ましい態様
としてもいる。Means for Solving the Problems The present invention for solving the above-mentioned problems comprises an antibacterial agent comprising a new quinolone antibacterial agent and a hydrolyzate of lactoferrin or an antimicrobial peptide derived from a hydrolyzate of lactoferrin as active ingredients. Agent
New quinolone antibacterial agents include sparfloxacin, enrofloxacin, norfloxacin, ofloxacin,
Enoxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin, tosfloxacin, fleroxacin, levofloxacin or a mixture thereof, an antimicrobial peptide derived from a hydrolyzate of lactoferrins is isolated from a hydrolyzate of lactoferrins derived from milk or human milk. Peptide, a chemically synthesized peptide containing the same amino acid sequence as this peptide, a derivative thereof, or a mixture of two or more thereof, and an antibacterial peptide derived from a hydrolyzate of lactoferrins having SEQ ID NO: No. 1 to SEQ ID NO: 8, and a hydrolyzate of a lactoferrin at least based on 1 part of a quinolone antibacterial agent (weight; hereinafter the same unless otherwise noted). 100 parts by weight, and new quinolo Antimicrobial peptides from hydrolysates of lactoferrin per 1 part system antimicrobial agents, some as desired embodiment that is contained in a proportion of at least 10 parts.
【００１２】次に本発明について詳細に説明する。Next, the present invention will be described in detail.
【００１３】[0013]
【発明の実施の形態】本発明に使用するニュ−キノロン
系抗菌剤は、従来から医薬品として用いられているニュ
−キノロン系抗菌剤のいずれでもよく、ノルフロキサシ
ン、オフロサキシン、エノキサシン、ロメフロキサシ
ン、スパルフロキサシン、レボフロキサシン等を例示す
ることができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The new quinolone antibacterial agent used in the present invention may be any of the new quinolone antibacterial agents conventionally used as pharmaceuticals, such as norfloxacin, ofloxacin, enoxacin, lomefloxacin, sparfloxa. Syn, levofloxacin and the like can be exemplified.
【００１４】本発明に用いられるラクトフェリン類の加
水分解物は、牛乳、人乳、その他哺乳動物の乳由来のラ
クトフェリン、このラクトフェリンから鉄を除去したア
ポラクトフェリン、アポラクトフェリンを銅等の金属で
飽和した金属飽和ラクトフェリン、これらの任意の割合
の混合物等（以下、これらをまとめてラクトフェリン類
と記載する）を、酸又は酵素で加水分解して得られ、た
とえば特開平５−３２００６８号に記載された方法によ
り次のとおり製造することができる。The hydrolyzate of lactoferrin used in the present invention is lactoferrin derived from milk of milk, human milk and other mammals, apolactoferrin obtained by removing iron from lactoferrin, and apolactoferrin saturated with a metal such as copper. It is obtained by hydrolyzing metal-saturated lactoferrin, a mixture thereof in any ratio, etc. (hereinafter collectively referred to as lactoferrins) with an acid or an enzyme, for example, a method described in JP-A-5-320068. Can be produced as follows.
【００１５】即ち、酸により加水分解を行う場合は、ラ
クトフェリン類を水に溶解し、これに無機酸又は有機酸
を添加し、所定温度で所定時間加熱して加水分解する。
酵素により加水分解を行う場合は、ラクトフェリン類の
水溶液を、使用する酵素の至適ｐＨに調整し、これにペ
プシン、ＰＤ酵素等の蛋白分解酵素を添加し、所定温度
に所定時間保持して加水分解し、のち常法により酵素を
失活させる。酸又は酵素による加水分解で得られた分解
物は、種々の分子量を有する抗菌性ペプチドの混合物で
ある。That is, when performing hydrolysis with an acid, lactoferrins are dissolved in water, an inorganic acid or an organic acid is added thereto, and the mixture is heated at a predetermined temperature for a predetermined time to perform hydrolysis.
In the case of performing hydrolysis with an enzyme, an aqueous solution of lactoferrin is adjusted to an optimum pH of the enzyme to be used, a protease such as pepsin, PD enzyme or the like is added thereto, and the mixture is maintained at a predetermined temperature for a predetermined time to carry out hydrolysis. Decompose and then inactivate the enzyme by conventional methods. The hydrolyzate obtained by acid or enzyme hydrolysis is a mixture of antimicrobial peptides having various molecular weights.
【００１６】前記のとおり、加水分解して得られた反応
液（ラクトフェリン類加水分解物の溶液）を、常法によ
り冷却し、必要に応じて常法により中和、脱塩し、更に
必要に応じて常法により分画し、得られた溶液をそのま
ま、濃縮した液状、又は濃縮後乾燥した粉末状の形態に
おいて、ニューキノロン系抗菌剤と混合する。As described above, the reaction solution obtained by hydrolysis (solution of lactoferrin hydrolyzate) is cooled by a conventional method, and if necessary, neutralized and desalted by a conventional method. The resulting solution is fractionated according to a conventional method, and the resulting solution is directly mixed with a new quinolone antibacterial agent in the form of a concentrated liquid or a powder dried after concentration.
【００１７】また、本発明に使用するラクトフェリン類
の加水分解物由来の抗菌性ペプチドは、前記ラクトフェ
リン類の加水分解物から単離されたペプチド、このペプ
チドと同一のアミノ酸配列を含む化学的に合成されたペ
プチド、それらの誘導体、配列番号１乃至配列番号８の
いずれかに記載のアミノ酸配列を有するペプチド、又は
これらの２種以上の混合物（以下、これらをまとめてラ
クトフェリン由来抗菌性ペプチドと記載する。）であ
る。The antimicrobial peptide derived from the hydrolyzate of lactoferrin used in the present invention is a peptide isolated from the hydrolyzate of lactoferrin, chemically synthesized containing the same amino acid sequence as this peptide. Peptide, a derivative thereof, a peptide having the amino acid sequence of any of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 8, or a mixture of two or more of these (hereinafter, collectively referred to as a lactoferrin-derived antimicrobial peptide) ).
【００１８】ラクトフェリン加水分解物を配合した本発
明の抗菌剤は、ニュ−キノロン系抗菌剤１部に対して少
なくとも１００部、望ましくは２００〜８００，０００
部の割合でラクトフェリン加水分解物が配合される。The antibacterial agent of the present invention containing a lactoferrin hydrolyzate is used in an amount of at least 100 parts, preferably 200 to 800,000, relative to 1 part of the new quinolone antibacterial agent.
Parts of the lactoferrin hydrolyzate are blended.
【００１９】また、ラクトフェリン由来抗菌性ペプチド
を配合した本発明の抗菌剤は、ニュ−キノロン系抗菌剤
１部に対して少なくとも１０部、望ましくは５０〜２
０，０００部の割合でラクトフェリン由来抗菌性ペプチ
ドが配合される。The antibacterial agent of the present invention containing the lactoferrin-derived antibacterial peptide is used in an amount of at least 10 parts, preferably 50 to 2 parts per part of the quinolone antibacterial agent.
The lactoferrin-derived antimicrobial peptide is blended at a ratio of 0000 parts.
【００２０】ラクトフェリン類の加水分解物、ラクトフ
ェリン由来抗菌性ペプチド、又はこれらの任意の混合物
のいずれかと、ニューキノロン系抗菌剤のいずれかとの
組み合わせは、使用目的によって適宜選択することがで
きる。また、それらの混合割合は、各々の成分の種類、
使用目的等によって適宜選択することができる。それら
の成分を液状又は粉末状で混合することができ、適宜公
知の希釈剤、賦形剤を添加してもよい。The combination of any of the lactoferrin hydrolyzate, the lactoferrin-derived antimicrobial peptide, or any mixture thereof, and any of the quinolone antibacterial agents can be appropriately selected depending on the purpose of use. Also, their mixing ratio depends on the type of each component,
It can be appropriately selected depending on the purpose of use and the like. These components can be mixed in liquid or powder form, and a known diluent or excipient may be added as appropriate.
【００２１】本発明の抗菌剤は、公知の方法により経口
剤、注射剤、膣剤、点眼液、トローチ剤、軟膏、ローシ
ョン剤等に加工することが可能であり、これに含有され
ている公知の抗菌剤の投与方法と同様に、そのままヒト
又は動物に投与することができる。The antibacterial agent of the present invention can be processed into an oral agent, an injection, a vaginal agent, an ophthalmic solution, a troche, an ointment, a lotion and the like by a known method. Can be directly administered to humans or animals in the same manner as in the method of administering an antibacterial agent.
【００２２】抗菌剤中の有効成分の含量は、ニュ−キノ
ロン系抗菌剤が、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌ、望まし
くは１０ｎｇ／ｍｌ以上、ラクトフェリン加水分解物
が、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、望ましくは２０００
μｇ／ｍｌ以上、ラクトフェリン由来抗菌性ペプチド
が、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、望ましくは１００μｇ
／ｍｌ以上、である。また、投与量は、症状等により異
なるが、通常体重１ｋｇ当たり１日少なくとも０．００
１ｍｇ、望ましくは０．０１〜２００ｍｇ、である。The content of the active ingredient in the antibacterial agent is at least 0.1 ng / ml, preferably at least 10 ng / ml for the new quinolone-based antibacterial agent, and at least 100 μg / ml for the lactoferrin hydrolyzate, preferably at least 2,000.
μg / ml or more, the lactoferrin-derived antimicrobial peptide is at least 10 μg / ml, preferably 100 μg
/ Ml or more. The dose varies depending on the symptoms and the like, but is usually at least 0.001 per kg of body weight per day.
1 mg, desirably 0.01 to 200 mg.
【００２３】ラクトフェリン加水分解物又はラクトフェ
リン由来抗菌性ペプチドは、食品の一成分であり、また
食品としても利用されるもので、全く毒性を示さず、副
作用が問題とされる従来の抗菌剤の使用量を低減するこ
とにより、安全な抗菌剤を提供することができる。The lactoferrin hydrolyzate or the lactoferrin-derived antimicrobial peptide is a component of foods and is also used as foods. It shows no toxicity and uses conventional antimicrobial agents which have side effects. By reducing the amount, a safe antibacterial agent can be provided.
【００２４】次に試験例を示してこの発明を詳細に説明
する。 試験例１ １）試料の調製 ラクトフェリン加水分解物 参考例１記載と同一の方法により調製したラクトフェリ
ン加水分解物粉末を蒸留水に溶解し、滅菌フィルタ−
（アドバンテック社製）で除菌した水溶液を調製した。 ニュ−キノロン系抗菌剤 ニュ−キノロン系抗菌剤として、ノルフロキサシン（シ
グマ社製) 、オフロキサシン（シグマ社製) 、エノキサ
シン（シグマ社製) 、ロメフロキサシン（シグマ社製)
を使用した。また、スパルフロキサシンは、スパラ錠
（「スパラ」は登録商標。大日本製薬社製) から、レボ
フロキサシンは、クラビット細粒（「クラビット」は登
録商標。第一製薬社製) から、それぞれ常法により精製
して使用した。各ニュ−キノロン系抗菌剤を力価１００
％（重量。以下、特に断りのない限り同じ。）換算で１
０ｍｇを０．１規定水酸化ナトリウム１ｍｌに溶解し、
蒸留水で１０ｍｌに調整した。Next, the present invention will be described in detail with reference to test examples. Test Example 1 1) Preparation of sample Lactoferrin hydrolyzate The lactoferrin hydrolyzate powder prepared by the same method as described in Reference Example 1 was dissolved in distilled water and sterilized by filtration.
An aqueous solution that had been disinfected by (Advantech) was prepared. New-quinolone antibacterial agents As the new-quinolone antibacterial agents, norfloxacin (manufactured by Sigma), ofloxacin (manufactured by Sigma), enoxacin (manufactured by Sigma), lomefloxacin (manufactured by Sigma)
It was used. Sparfloxacin is always available from Spara Tablets (“Spara” is a registered trademark, manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and levofloxacin is from Cravit Fine Granules (“Cravit” is a registered trademark, manufactured by Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.). It was used after purification by the method. Each new quinolone antibacterial agent has a titer of 100
% (Weight; hereinafter the same unless otherwise noted)
0 mg is dissolved in 1 ml of 0.1 N sodium hydroxide,
The volume was adjusted to 10 ml with distilled water.
【００２５】２）試験方法 凍結保存した供試菌（エシェリヒア・コリＯ−１１１
は、東京大学医科学研究所から、スタフィロコッカス・
アウレウスＪＣＭ２１５１は、理化学研究所から、それ
ぞれ入手した。）懸濁液から１白金耳を採取し、トリプ
チケ−ス・ソイ寒天培地（ＢＢＬ社製）に塗沫し、３７
℃で１６時間培養し、トリプチケ−ス・ソイ寒天培地の
表面に育成したコロニ−を白金耳でかき取り、試験培地
であるミュ−ラ−・ヒントン・ブロス（ディフコ社製）
に懸濁し、３７℃で数時間培養し、３×１０8 ／ｍｌの
菌濃度に増殖した対数期の菌液を前培養菌液とした。2) Test method The test bacteria (Escherichia coli O-111) cryopreserved
From Staphylococcus
Aureus JCM2151 was obtained from RIKEN. ) One platinum loop was collected from the suspension and spread on a trypticase soy agar medium (manufactured by BBL).
At 16 ° C. for 16 hours, scraping the colonies grown on the surface of Trypticase soy agar with a platinum loop and using a test medium, Muller Hinton Broth (manufactured by Difco).
, And cultured at 37 ° C. for several hours, and a logarithmic phase bacterial solution grown to a bacterial concentration of 3 × 10 8 / ml was used as a precultured bacterial solution.
【００２６】前記試験培地を用いて表１及び表２に示す
濃度でラクトフェリン加水分解物水溶液の２段階希釈系
列を作製し、それぞれに、ニュ−キノロン系抗菌剤を最
終濃度１ｍｌあたり０μｇ、０．００１μｇ、０．０１
μｇ、０．１μｇ、及び1 μｇの割合で試験培地で希釈
して添加した。各濃度のラクトフェリン加水分解物とニ
ュ−キノロン系抗菌剤を含む試験培地に、前記供試菌の
前培養菌液を最終菌濃度が１×１０6 ／ｍｌの割合で添
加し、３７℃で１６時間培養した。Using the test medium, a two-stage dilution series of a lactoferrin hydrolyzate aqueous solution was prepared at the concentrations shown in Tables 1 and 2, and a new quinolone antibacterial agent was added in an amount of 0 μg / ml and 0.1 μg / ml in each final concentration. 001 μg, 0.01
After dilution with the test medium at a ratio of μg, 0.1 μg, and 1 μg, they were added. To a test medium containing each concentration of lactoferrin hydrolyzate and a new quinolone antibacterial agent, a precultured bacterial solution of the test bacterium was added at a final bacterial concentration of 1 × 10 6 / ml. Cultured for hours.
【００２７】培養後、培地の濁りの有無より各濃度のラ
クトフェリン加水分解物を共存させた場合のニュ−キノ
ロン系抗菌剤の最少発育阻止濃度（以下、ＭＩＣ値と記
載する。）を測定した。After the cultivation, the minimum growth inhibitory concentration (hereinafter, referred to as MIC value) of the new quinolone antibacterial agent in the presence of lactoferrin hydrolyzate of each concentration was measured based on the presence or absence of turbidity of the medium.
【００２８】３）試験結果 この試験の結果は、表１及び表２に示すとおりである。
表１及び表２から明らかなとおり、ラクトフェリン加水
分解物を併用することにより、供試した全てのニュ−キ
ノロン系抗菌剤は、単用の場合に比較してより低濃度で
供試菌の発育を阻止し、ラクトフェリン加水分解物がニ
ュ−キノロン系抗菌剤の抗菌効果を増強することが認め
られた。3) Test results The results of this test are as shown in Tables 1 and 2.
As is clear from Tables 1 and 2, the combined use of the lactoferrin hydrolyzate enables all the tested quinolone antibacterial agents to grow at a lower concentration than the single use. Lactoferrin hydrolyzate was found to enhance the antibacterial effect of the new quinolone antibacterial agent.
【００２９】尚、前記ラクトフェリン加水分解物以外の
分解物、及びラクトフェリン由来抗菌性ペプチドについ
ても同様の試験を行なったが、この場合もニュ−キノロ
ン系抗菌剤の抗菌効果を増強させることが認められた。The same test was carried out on degraded products other than the lactoferrin hydrolyzate and on lactoferrin-derived antimicrobial peptides. In this case, too, it was found that the antibacterial effect of the new quinolone antibacterial agent was enhanced. Was.
【００３０】[0030]
【表１】 [Table 1]
【００３１】[0031]
【表２】 [Table 2]
【００３２】試験例２ １）試料の調製 抗菌性ペプチド 参考例２記載の方法により調製した抗菌性ペプチド粉末
を蒸留水に溶解し、滅菌フィルタ−（アドバンテック社
製）で除菌した水溶液を調製した。 ニュ−キノロン系抗菌剤 スパルフロキサシン、オフロキサシン、及びノルフロキ
サシンをそれぞれ試験例１の試料の調製に記載した方法
により調製した。Test Example 2 1) Preparation of Sample Antimicrobial Peptide The antimicrobial peptide powder prepared by the method described in Reference Example 2 was dissolved in distilled water, and an aqueous solution was prepared using a sterilizing filter (manufactured by Advantech). . New quinolone antibacterial agents Sparfloxacin, ofloxacin, and norfloxacin were each prepared by the method described in Preparation of Sample in Test Example 1.
【００３３】２）試験方法 スタフィロコッカス・アウレウス３０株（ウシ***炎由
来の野外株。日本獣医畜産大学獣医畜産学部獣医衛生学
教室から入手した。）をそれぞれ、パ−ルコアマンニッ
ト食塩培地（栄研化学社製）により３７℃で４８時間培
養し、のちトリプトソ−ヤブイヨン（日水製薬社製）１
０ｍｌにｌコロニ−を接種し、３７℃で１８時間培養
し、感受性測定用ブイヨン「ニッスイ」（日水製薬社
製）で２×１０6 ／ｍｌの割合に希釈した。2) Test method 30 strains of Staphylococcus aureus (an outdoor strain derived from bovine mastitis; obtained from the Department of Veterinary Hygiene at the Department of Veterinary and Hygienic Science, Faculty of Veterinary and Animal Science, Veterinary and Veterinary Sciences, Nippon Veterinary and Animal Husbandry University) were each used in a Parkoamannit salt medium ( The cells were cultured at 37 ° C. for 48 hours using Eiken Chemical Co., Ltd.
0 ml was inoculated with 1 colony, cultured at 37 ° C. for 18 hours, and diluted with a broth for sensitivity measurement “Nissui” (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) at a rate of 2 × 10 6 / ml.
【００３４】ＰＹＧブロス（１％バクトペプトン、１％
グルコ−ス、０．０５％イ−スト・エクストラクトから
なる。）を用いて、ニュ−キノロン系抗菌剤の濃度が１
ｍｌ当たり０．８μｇからから０．００３１２μｇまで
２段階希釈した希釈液を調製して試験培地とした。PYG broth (1% bactopeptone, 1%
Glucose, consisting of 0.05% yeast extract. ), The concentration of the new quinolone antibacterial agent is 1
A diluent was prepared in two steps from 0.8 μg to 0.00312 μg per ml to prepare a test medium.
【００３５】前記供試菌液５ｍｌに、抗菌ペプチドの水
溶液を最終濃度が１ｍｌ当たり１２．５μｇの割合に調
整した液２．５ｍｌに、前記各濃度のニュ−キノロン系
抗菌剤を含む試験培地を２．５ｍｌ添加し、３７℃で１
８〜２０時間培養し、培地の濁りの有無より最終濃度１
２．５μｇ／ｍｌの濃度の抗菌ペプチドを共存させた場
合の各菌株に対するニュ−キノロン系抗菌剤のＭＩＣ値
を測定した。A test medium containing a quinolone antibacterial agent of each concentration was added to 2.5 ml of a solution prepared by adjusting the final concentration of an aqueous solution of an antibacterial peptide to 12.5 μg per ml in 5 ml of the test bacterial solution. Add 2.5 ml and add 1
After culturing for 8 to 20 hours, the final concentration is 1
The MIC value of the new quinolone antibacterial agent with respect to each strain when an antibacterial peptide at a concentration of 2.5 μg / ml was present was measured.
【００３６】３）試験結果 この試験の結果は、図１、図２及び図３に示すとおりで
ある。各図の横軸は、ニュ−キノロン系抗菌剤のＭＩＣ
値（μｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は、横軸の該当するＭＩ
Ｃ値以下のＭＩＣ値を示す菌株数を累積し、全菌株（３
０株）の百分率3) Test Results The results of this test are as shown in FIGS. 1, 2 and 3. The horizontal axis in each figure is the MIC of the new quinolone antibacterial agent.
(Μg / ml), and the vertical axis represents the corresponding MI on the horizontal axis.
The number of strains showing an MIC value equal to or lower than the C value is accumulated, and all the strains (3
0 shares)
【００３７】[0037]
【外１】 スパルフロキサシンの結果を示す図１、オフロキサシン
の結果を示す図２及びノルフロキサシンの結果を示す図
３から明らかなとおり、ニュ−キノロン系抗菌剤と抗菌
性ペプチドとを併用することにより、ニュ−キノロン系
抗菌剤単用に比較して、低濃度のニュ−キノロン系抗菌
剤で発育が阻止される菌株数が増加した。この結果か
ら、抗菌ペプチドがニュ−キノロン系抗菌剤の抗菌効果
を増強することが確認された。[Outside 1] As is clear from FIG. 1 showing the results of sparfloxacin, FIG. 2 showing the results of ofloxacin, and FIG. 3 showing the results of norfloxacin, the new quinolone antibacterial agent and the antimicrobial peptide were used in combination to produce a new antimicrobial agent. Compared with the quinolone-based antibacterial agent alone, the number of bacterial strains whose growth was inhibited by a low concentration of the quinolone-based antibacterial agent increased. From these results, it was confirmed that the antimicrobial peptide enhanced the antimicrobial effect of the new quinolone antibacterial agent.
【００３８】尚、前記の抗菌性ペプチド以外の抗菌性ペ
プチド、及びラクトフェリン加水分解物についても同様
の試験を行なったが、この場合もニュ−キノロン系抗菌
剤の抗菌効果を増強させることが認められた。Similar tests were carried out on antibacterial peptides other than the above-mentioned antibacterial peptides and on lactoferrin hydrolyzate. In this case, the antibacterial effect of the new quinolone antibacterial agent was found to be enhanced. Was.
【００３９】次にラクトフェリン加水分解物及びラクト
フェリン由来抗菌性ペプチドの製造について参考例とし
て記載する。Next, production of lactoferrin hydrolyzate and lactoferrin-derived antimicrobial peptide will be described as Reference Examples.
【００４０】参考例１ ウシ・ラクトフェリン（シグマ社製）２００ｇを精製水
３．６ｌに溶解し、０．１規定塩酸でｐＨを２．５に調
整し、市販のブタペプシン（シグマ社製）４ｇを添加
し、３７℃で６時間加水分解した。次いで０．１規定水
酸化ナトリウムでｐＨを７．０に調整し、８０℃で１０
分間加熱して酵素を失活させ、室温に冷却し、１５，０
００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、透明な上清を得た。
この上清を凍結乾燥し、ラクトフェリン加水分解物約１
５８ｇを得た。Reference Example 1 200 g of bovine lactoferrin (manufactured by Sigma) was dissolved in 3.6 l of purified water, the pH was adjusted to 2.5 with 0.1 N hydrochloric acid, and 4 g of commercially available butapepsin (manufactured by Sigma) was dissolved. And hydrolyzed at 37 ° C. for 6 hours. Then, the pH was adjusted to 7.0 with 0.1 N sodium hydroxide, and 10
Heat for 5 minutes to inactivate the enzyme, cool to room temperature,
Centrifugation was performed at 00 rpm for 10 minutes to obtain a clear supernatant.
The supernatant was freeze-dried, and about 1 lactoferrin hydrolyzate was obtained.
58 g were obtained.
【００４１】参考例２ ２５ｍｌのカルボキシメチルトヨパール（商標。東ソー
社製。６５０Ｍ）を１００ｍＭ第一リン酸ナトリウム−
第二リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で十分洗浄
し、平衡化したスラリーに、前記緩衝液に溶解した参考
例１で製造したラクトフェリン加水分解物１０ｇを添加
し、ビ−カ−中でマグネティックスターラーで攪拌しな
がら十分に吸着させた。ラクトフェリン加水分解物を吸
着したカチオン交換体を、カラム（長さ５ｃｍ、直径３
ｃｍ）に充填し、前記緩衝液を用いて洗浄液の２８０ｎ
ｍにおける吸光度が０．０３以下になるまで５ｍｌ／分
の流速で洗浄した。同様に、洗浄液の２８０ｎｍにおけ
る吸光度が０．０３以下になるまで５ｍｌ／分の流速で
１００ｍＭ塩化ナトリウム、１００ｍＭ第一リン酸ナト
リウム−第二リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を
カラムに通夜し、非特異的にゲルに吸着したペプチドを
洗浄した。２Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．８）をカラ
ムに通夜し、配列番号１のラクトフェリン由来抗菌性ペ
プチドを含む溶液１０ｍｌを得た。得られた溶液を、水
で平衡化した脱塩用ＰＤ１０カラム（ファルマシア製）
に５回に分けて注入し、ラクトフェリン由来抗菌性ペプ
チド溶液を取得し、この溶液を凍結乾燥し、ラクトフェ
リン由来抗菌性ペプチド粉末約１００ｍｇを得た。Reference Example 2 25 ml of carboxymethyl toyopearl (trademark, manufactured by Tosoh Corporation, 650M) was added to 100 mM sodium monophosphate-
10 g of the lactoferrin hydrolyzate prepared in Reference Example 1 dissolved in the above buffer solution was added to the slurry which had been sufficiently washed with a dibasic sodium phosphate buffer solution (pH 7.8) and equilibrated, and was added to a beaker. The mixture was sufficiently adsorbed while stirring with a magnetic stirrer. The cation exchanger to which the lactoferrin hydrolyzate was adsorbed was applied to a column (length 5 cm, diameter 3
cm) and 280 n of the washing solution using the buffer solution.
Washing was performed at a flow rate of 5 ml / min until the absorbance at m became 0.03 or less. Similarly, 100 mM sodium chloride, 100 mM sodium monophosphate-dibasic sodium phosphate buffer (pH 7.8) is passed through the column at a flow rate of 5 ml / min until the absorbance at 280 nm of the washing solution becomes 0.03 or less. The peptides that were non-specifically adsorbed on the gel were washed. 2M ammonium acetate (pH 7.8) was passed through the column overnight to obtain 10 ml of a solution containing the lactoferrin-derived antibacterial peptide of SEQ ID NO: 1. The obtained solution was equilibrated with water, and a PD10 column for desalination (Pharmacia) was used.
The solution was injected five times to obtain a lactoferrin-derived antimicrobial peptide solution, and the solution was freeze-dried to obtain about 100 mg of lactoferrin-derived antimicrobial peptide powder.
【００４２】前記ペプチドについてペプチドシーケンサ
ーを用いて常法によりアミノ酸配列を分析し、配列番号
１に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。The amino acid sequence of the peptide was analyzed by a conventional method using a peptide sequencer, and it was confirmed that the peptide had the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
【００４３】参考例３ ペプチド自動合成装置（ファルマシアＬＫＢバイオテク
ノロジ−社製。ＬＫＢＢｉｏｌｙｎｘ４１７０）を用
い、シェパ−ド等による固相ペプチド合成法［ジャ−ナ
ル・オブ・ケミカル・ソサイエティ−・パ−キンＩ（Jo
urnal of Chemical Society PerkinＩ）、第５３８ペ−
ジ、１９８１年］に基づいてペプチドを次のとおり合成
した。REFERENCE EXAMPLE 3 A solid-phase peptide synthesis method using a shepard or the like [Journal of Chemical Parkin I, using an automatic peptide synthesizer (Pharmacia LKB Biotechnology Co., Ltd., LKB Biolynx 4170). (Jo
urnal of Chemical Society Perkin I), p. 538
, 1981].
【００４４】アミン官能基を９−フルオレニルメトキシ
カルボニル基で保護したアミノ酸［以下Fmoc−アミノ酸
又はFmoc−固有のアミノ酸の名称（例えば、Fmoc−アス
パラギン）と記載することがある。］に、Ｎ，Ｎ−ジシ
クロヘキシルカルボジイミドを添加して所望のアミノ酸
の無水物を生成させ、このFmoc−アミノ酸無水物を合成
に用いた。ペプチド鎖を製造するためにＣ−末端のセリ
ン残基に相当するFmoc−セリン無水物を、そのカルボキ
シル基を介し、ジメチルアミノピリジンを触媒としてウ
ルトロシンＡ樹脂（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロ
ジ−社製）に固定する。次いでこの樹脂をピペリジンを
含むジメチルホルムアミドで洗浄し、Ｃ−末端アミノ酸
のアミン官能基の保護基を除去する。のちアミノ酸配列
のＣ−末端から２番目に相当するFmoc−アスパラギン酸
無水物を前記Ｃ−末端アミノ酸残基を介して樹脂に固定
されたセリンの脱保護アミン官能基にカップリングさせ
た。以下同様にして順次アミノ酸を固定した。全てのア
ミノ酸のカップリングが終了し、所望のアミノ酸配列の
ペプチド鎖が形成された後、９４％ＴＦＡ、５％フェノ
−ル、及び１％エタンジオ−ルからなる溶媒でアセトア
ミドメチル以外の保護基の除去及びペプチドの脱離を行
ない、自然酸化によりジスルフィド結合を形成し、高速
液体クロマトグラフイ−によりペプチドを精製し、この
溶液を濃縮し、乾燥し、ラクトフェリン由来抗菌性ペプ
チドと同一のペプチド粉末約１００ｍｇを化学的に合成
した。An amino acid whose amine function is protected with a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group [hereinafter sometimes referred to as Fmoc-amino acid or Fmoc-specific amino acid name (eg, Fmoc-asparagine). ], N, N-dicyclohexylcarbodiimide was added to form an anhydride of the desired amino acid, and this Fmoc-amino acid anhydride was used in the synthesis. To produce a peptide chain, Fmoc-serine anhydride corresponding to the C-terminal serine residue is immobilized via its carboxyl group on Ultrosin A resin (Pharmacia LKB Biotechnology) using dimethylaminopyridine as a catalyst. I do. The resin is then washed with dimethylformamide containing piperidine to remove the protecting group for the amine function of the C-terminal amino acid. The Fmoc-aspartic anhydride corresponding to the second from the C-terminus of the amino acid sequence was then coupled to the deprotected amine function of serine immobilized on the resin via the C-terminal amino acid residue. Amino acids were sequentially fixed in the same manner. After coupling of all amino acids is completed and a peptide chain having a desired amino acid sequence is formed, a protecting group other than acetamidomethyl is removed with a solvent consisting of 94% TFA, 5% phenol, and 1% ethanediol. After removal and removal of the peptide, a disulfide bond is formed by spontaneous oxidation, the peptide is purified by high performance liquid chromatography, and the solution is concentrated and dried. 100 mg was chemically synthesized.
【００４５】前記ペプチドについてペプチドシーケンサ
ーを用いて常法によりアミノ酸配列を分析し、配列番号
３に記載のアミノ酸配列を有することを確認した。The amino acid sequence of the peptide was analyzed by a conventional method using a peptide sequencer, and it was confirmed that the peptide had the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
【００４６】次に実施例を示して本発明を更に詳細に説
明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
【００４７】[0047]
実施例１ オフロキサシン（シグマ社製）０．０１ｍｇに対して、
参考例１と同一の方法により製造したラクトフェリン加
水分解物粉末を２０ｍｇの割合で均一混合し、ニュ−キ
ノロン系抗菌剤の抗菌性を増強させる抗菌剤を調製し
た。Example 1 For 0.01 mg of ofloxacin (manufactured by Sigma),
The lactoferrin hydrolyzate powder produced by the same method as in Reference Example 1 was uniformly mixed at a ratio of 20 mg to prepare an antibacterial agent for enhancing the antibacterial properties of the new quinolone antibacterial agent.
【００４８】実施例２ 注射用水（大塚製薬社製）１ｍｌに、ロメフロキサシン
（シグマ社製) ０．００１ｍｇ、参考例２と同一の方法
により製造した配列番号１のラクトフェリン由来の抗菌
性ペプチド０．０５ｍｇ、塩化ナトリウム（和光純薬社
製）１０ｍｇの割合で溶解し、ｐＨを７に調整し、濾過
滅菌し、常法により１ｍｌずつアンプルに充填し、注射
用のニュ−キノロン系抗菌剤の抗菌性を増強させる抗菌
剤２，０００個を得た。Example 2 0.001 mg of lomefloxacin (manufactured by Sigma) in 1 ml of water for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical), 0.05 mg of the lactoferrin-derived antibacterial peptide of SEQ ID NO: 1 manufactured by the same method as in Reference Example 2. , Dissolved in sodium chloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a rate of 10 mg, adjusted to pH 7, sterilized by filtration, filled into ampoules by 1 ml each by a conventional method, and the antibacterial activity of the quinolone antibacterial agent for injection 2,000 antimicrobial agents for enhancing the
【００４９】実施例３ ノルフロキサシン（シグマ社製) ０．５ｍｇに対して、
参考例３の方法で製造した配列番号３のラクトフェリン
由来抗菌性ペプチド粉末１００ｍｇの割合で均一混合
し、ニュ−キノロン系抗菌剤の抗菌性を増強させる抗菌
剤を調製した。Example 3 For 0.5 mg of norfloxacin (manufactured by Sigma),
An antibacterial agent for enhancing the antibacterial activity of the quinolone-based antibacterial agent was prepared by uniformly mixing 100 mg of the lactoferrin-derived antibacterial peptide powder of SEQ ID NO: 3 produced by the method of Reference Example 3.
【００５０】実施例４ 常法により、次の組成の***炎治療薬を製造した。Example 4 A remedy for mastitis having the following composition was produced by a conventional method.
【００５１】 １，２―ヒドロキシステアリン（和光純薬社製) １．０（％） グリセルモノステアレート（ナカライテスク社製) ０．５ ブチル化ヒドロキシアニソール（ナカライテスク社製) ０．０２ 落花生油（ナカライテスク社製) ９６．４８ 実施例３の抗菌製剤 ２．０1,2-hydroxystearin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) 1.0 (%) glyceryl monostearate (manufactured by Nakarai Tesque) 0.5 butylated hydroxyanisole (manufactured by Nakarai Tesque) 0.02 peanut oil (Nacalai Tesque) 96.48 Antibacterial preparation of Example 3 2.0
【００５２】[0052]
【発明の効果】以上詳細に説明したとおり、本発明は、
ニュ−キノロン系抗菌剤及びラクトフェリン加水分解物
又はラクトフェリン由来抗菌性ペプチドを有効成分とし
て含有する抗菌剤であり、本発明により奏せられる効果
は次のとおりである。 １）本発明の抗菌剤は、少用量で強い抗菌効果を有する
ので、ニュ−キノロン系抗菌剤の使用量を大幅に低減す
ることができる。 ２）本発明の抗菌剤は、広範囲の微生物に対して優れた
抗菌作用を有する。 ３）本発明の抗菌剤は、副作用が少なく、耐性菌の出現
頻度が低い。 ４）本発明の抗菌剤は、極めて安全である。As described in detail above, the present invention provides
An antibacterial agent containing a new quinolone antibacterial agent and a lactoferrin hydrolyzate or a lactoferrin-derived antibacterial peptide as active ingredients. The effects of the present invention are as follows. 1) Since the antibacterial agent of the present invention has a strong antibacterial effect even in a small dose, the amount of the new quinolone antibacterial agent can be significantly reduced. 2) The antibacterial agent of the present invention has an excellent antibacterial action against a wide range of microorganisms. 3) The antimicrobial agent of the present invention has few side effects and low frequency of resistant bacteria. 4) The antimicrobial agent of the present invention is extremely safe.
【００５３】[0053]
配列番号：１ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、及びこのペプチドをフラグ
メントとして含むペプチド。下記配列において、３番の
Cys と２０番のCys がジスルフィド結合している。 配列： Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe 20 25SEQ ID NO: 1 Sequence length: 25 Sequence type: Amino acid Topology-: Linear Sequence type: Peptide Sequence characteristics: This peptide and peptides containing this peptide as a fragment. In the following sequence,
Cys and Cys at position 20 are disulfide bonded. Sequence: Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe 20 25
【００５４】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、及びこのペプチドをフラグ
メントとして含むペプチド。下記配列においてCys*は、
ジスルフィド結合の形成を防止するため、チオ−ル基を
化学的に修飾したシステインを示す。 配列： Phe Lys Cys* Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ile Thr Cys* Val Arg Arg Ala Phe 20 25 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 25 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence characteristics: This peptide and peptides containing this peptide as a fragment. Cys * in the following sequence
The cysteine in which the thiol group is chemically modified to prevent the formation of a disulfide bond is shown. Sequence: Phe Lys Cys * Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ile Thr Cys * Val Arg Arg Ala Phe 20 25
【００５５】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、及びこのペプチドをフラグ
メントとして含むペプチド。下記配列において、３番の
Cys と２０番のCys がジスルフィド結合している。 配列： Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro 1 5 10 15 Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser 20 25SEQ ID NO: 3 Sequence length: 25 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence characteristics: This peptide and peptides containing this peptide as a fragment. In the following sequence,
Cys and Cys at position 20 are disulfide bonded. Sequence: Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro 1 5 10 15 Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser 20 25
【００５６】配列番号：４ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、及びこのペプチドをフラグ
メントとして含むペプチド。下記配列においてCys*は、
ジスルフィド結合の形成を防止するため、チオ−ル基を
化学的に修飾したシステインを示す。 配列： Thr Lys Cys* Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro 1 5 10 15 Pro Val Ser Cys* Ile Lys Arg Asp Ser 20 25 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 25 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence characteristics: This peptide and peptides containing this peptide as a fragment. Cys * in the following sequence
The cysteine in which the thiol group is chemically modified to prevent the formation of a disulfide bond is shown. Sequence: Thr Lys Cys * Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro 1 5 10 15 Pro Val Ser Cys * Ile Lys Arg Asp Ser 20 25
【００５７】配列番号：５ 配列の長さ：４７ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド及びこのペプチドをフラグメ
ントとして含むペプチド。下記配列において、配列の長
さ３６であって９番、２６番、及び３５番にCys を有す
るペプチドの、９番のCys と２６番のCys とがジスルフ
ィド結合し、上記配列の長さ３６のペプチドの３５番の
Cys が、配列の長さ１１であって１０番にCysを有する
ペプチドの１０番のCys とがジスルフィド結合してい
る。 配列： Val Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met 1 5 10 15 Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro 20 25 30 Ile Gln Cys Ile 35 Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala 1 5 10 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 47 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence characteristics: This peptide and peptides containing this peptide as a fragment. In the following sequence, Cys at position 9 and Cys at position 26 of a peptide having a sequence length of 36 and having Cys at positions 9, 26, and 35 are disulfide-bonded, and No. 35 of the peptide
Cys is a disulfide bond with Cys at position 10 of the peptide having a sequence length of 11 and having Cys at position 10. Sequence: Val Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met 1 5 10 15 Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro 20 25 30 Ile Gln Cys Ile 35 Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala 1 5 10
【００５８】配列番号：６ 配列の長さ：４７ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、及びこのペプチドをフラグ
メントとして含むペプチド。下記配列において、１０番
の Cysと４６番のCys とがジスルフィド結合し、２０番
のCys と３７番のCys とがジスルフィド結合している。 配列： Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro Glu 1 5 10 15 Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly 20 25 30 Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln Cys Ile 35 40 45SEQ ID NO: 6 Sequence length: 47 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence characteristics: This peptide and peptides containing this peptide as a fragment. In the following sequence, Cys at position 10 and Cys at position 46 are disulfide bonded, and Cys at position 20 and Cys at position 37 are disulfide bonded. Sequence: Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser Gln Pro Glu 1 5 10 15 Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly 20 25 30 Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln Cys Ile 35 40 45
【００５９】配列番号：７ 配列の長さ：３６ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、及びこのペプチドをフラグ
メントとして含むペプチド。下記配列において、９番の
Cys と２６番のCys とがジスルフィド結合している。 配列： Val Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met 1 5 10 15 Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro 20 25 30 Ile Gln Cys Ile 35 SEQ ID NO: 7 Sequence length: 36 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence characteristics: This peptide and peptides containing this peptide as a fragment. In the following sequence,
Cys and Cys at position 26 have a disulfide bond. Sequence: Val Ser Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met 1 5 10 15 Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro 20 25 30 Ile Gln Cys Ile 35
【００６０】配列番号：８ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：このペプチド、及びこのペプチドをフラグ
メントとして含むプチド。 配列： Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala 1 5 10SEQ ID NO: 8 Sequence length: 11 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: peptide Sequence characteristics: This peptide and peptides containing this peptide as a fragment. Sequence: Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala 1 5 10
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────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成９年１１月２５日[Submission date] November 25, 1997
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００２８[Correction target item name] 0028
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００２８】３）試験結果 この試験の結果は、表１（エシェリヒア・コリＯ−１１
１の結果）及び表２（スタフィロコッカス・アウレウス
ＪＣＭ２１５１の結果）に示すとおりである。表１及び
表２から明らかなとおり、ラクトフェリン加水分解物を
併用することにより、供試した全てのニューキノロン系
抗菌剤は、単用の場合に比較してより低濃度で供試菌の
発育を阻止し、ラクトフェリン加水分解物がニューキノ
ロン系抗菌剤の抗菌効果を増強することが認められた。3) Test results The results of this test are shown in Table 1 (Escherichia coli O-11).
1) and Table 2 (Staphylococcus aureus)
JCM2151) . As is clear from Tables 1 and 2, all of the tested new quinolone antibacterial agents inhibit the growth of the test bacterium at a lower concentration than the single use, by using lactoferrin hydrolyzate in combination. However, it was confirmed that the lactoferrin hydrolyzate enhanced the antibacterial effect of the new quinolone antibacterial agent.
【手続補正２】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００３２[Correction target item name] 0032
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００３２】試験例２ １）試料の調製 抗菌性ペプチド 参考例２記載の方法により調製した抗菌性ペプチド粉末
を蒸留水に溶解し、滅菌フィルター（アドバンテック社
製）で除菌した水溶液を調製した。 ニューキノロン系抗菌剤 スパルフロキサシン、エンロフロキサシン、及びノルフ
ロキサシンをそれぞれ試験例１の試料の調製に記載した
方法により調製した。Test Example 2 1) Preparation of Sample Antimicrobial peptide The antimicrobial peptide powder prepared by the method described in Reference Example 2 was dissolved in distilled water, and an aqueous solution was prepared by sterilizing with a sterilizing filter (manufactured by Advantech). New quinolone antibacterial agents Sparfloxacin, enrofloxacin , and norfloxacin were each prepared by the method described in Preparation of Sample in Test Example 1.
【手続補正３】[Procedure amendment 3]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００３３[Correction target item name] 0033
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００３３】２）試験方法 スタフィロコッカス・アウレウス３０株（ウシ***炎由
来の野外株。日本獣医畜産大学獣医畜産学部獣医衛生学
教室から入手した。）をそれぞれ、パールコアマンニッ
ト食塩培地（栄研化学社製）により３７℃で４８時間培
養し、のちトリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製）１
０ｍｌにコロニーを接種し、３７℃で１８時間培養し、
感受性測定用ブイヨン「ニッスイ」（日水製薬社製）で
１×１０６／ｍｌの割合に希釈した。2) Test Method Staphylococcus aureus 30 strain (an outdoor strain derived from bovine mastitis, obtained from the Department of Veterinary and Hygiene Science, School of Veterinary and Animal Science, Nippon Veterinary and Animal Science University) was used in a Pearl Coremannit salt medium (Eiken). (Chemical Co., Ltd.) for 48 hours at 37 ° C., and then tryptosoy broth (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) 1
0 ml of the colony was inoculated and cultured at 37 ° C. for 18 hours.
With broth "Nissui" (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) for sensitivity measurement
It was diluted at a rate of 1 × 10 6 / ml.
【手続補正４】[Procedure amendment 4]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００３５[Correction target item name] 0035
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００３５】前記供試菌液５ｍｌに、抗菌ペプチドの水
溶液を最終濃度が１ｍｌ当たり１２．５μｇの割合に調
整した液、又は蒸留水を各２．５ｍｌ添加し、前記各濃
度のニューキノロン系抗菌剤を含む試験培地を２．５ｍ
ｌ添加し、３７℃で１８〜２０時間培養し、培地の濁り
の有無より最終濃度１２．５μｇ／ｍｌの濃度の抗菌ペ
プチドを共存させた場合の各菌株に対するニューキノロ
ン系抗菌剤のＭＩＣ値、及びニューキノロン系抗菌剤単
独のＭＩＣ値を測定した。To 5 ml of the test bacterial solution , 2.5 ml of a solution prepared by adjusting the final concentration of an aqueous solution of the antimicrobial peptide to 12.5 μg per ml or distilled water was added, and the quinolone antibacterial agent of each concentration was added. 2.5m test medium containing
The MIC value of the new quinolone antibacterial agent for each strain in the case of adding and culturing at 37 ° C. for 18 to 20 hours and coexisting an antimicrobial peptide at a final concentration of 12.5 μg / ml based on the presence or absence of turbidity of the medium , and New quinolone antibacterial agent
The MIC value of Germany was measured.
【手続補正５】[Procedure amendment 5]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００３７[Correction target item name] 0037
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００３７】[0037]
【外１】スパルフロキサシンの結果を示す図１、エンロ
フロキサシンの結果を示す図２及びノルフロキサシンの
結果を示す図３から明らかなとおり、ニューキノロン系
抗菌剤と抗菌性ペプチドとを併用することにより、ニュ
ーキノロン系抗菌剤単用に比較して、低濃度のニューキ
ノロン系抗菌剤で発育が阻止される菌株数が増加した。
この結果から、抗菌ペプチドがニューキノロン系抗菌剤
の抗菌効果を増強することが確認された。 ─────────────────────────────────────────────────────
Figure 1 shows the results of sparfloxacin , Enro
As is clear from FIG. 2 showing the results of floxacin and FIG. 3 showing the results of norfloxacin, the combined use of a new quinolone antibacterial agent and an antimicrobial peptide resulted in a lower concentration of new quinolone compared to the single use of the new quinolone antibacterial agent. The number of strains whose growth was inhibited by antimicrobial agents increased.
From these results, it was confirmed that the antimicrobial peptide enhanced the antimicrobial effect of the new quinolone antibacterial agent. ────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成９年１１月２６日[Submission date] November 26, 1997
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】図面の簡単な説明の欄[Correction target item name] A column for brief description of the drawing
【補正方法】追加[Correction method] Added
【補正内容】[Correction contents]
【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]
【図１】図１は、スパルフロキサシンにおける累積百分
率とＭＩＣ値との関係を示す。FIG. 1 shows the relationship between the cumulative percentage of sparfloxacin and the MIC value.
【図２】図２は、エンロフロキサシンにおける累積百分
率とＭＩＣ値との関係を示す。FIG. 2 shows the relationship between cumulative percentage and MIC value for enrofloxacin.
【図３】図３は、ノルフロキサシンにおける累積百分率
とＭＩＣ値との関係を示す。FIG. 3 shows the relationship between the cumulative percentage of norfloxacin and the MIC value.
Claims (6)
リン類の加水分解物又はラクトフェリン類の加水分解物
由来の抗菌性ペプチドを有効成分として含有する抗菌
剤。1. An antibacterial agent comprising, as active ingredients, a new quinolone antibacterial agent and a hydrolyzate of lactoferrin or an antimicrobial peptide derived from a hydrolyzate of lactoferrin.
キサシン、エンロフロキサシン、ノルフロキサシン、オ
フロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロ
メフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、
レボフロキサシン又はこれらの混合物である請求項１に
記載のニュ−キノロン系抗菌剤の抗菌性を増強させる抗
菌剤。2. The method of claim 1, wherein the new quinolone antibacterial agent is sparfloxacin, enrofloxacin, norfloxacin, ofloxacin, enoxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin, tosfloxacin, fleroxacin,
The antibacterial agent for enhancing the antibacterial activity of the new quinolone antibacterial agent according to claim 1, which is levofloxacin or a mixture thereof.
菌性ペプチドが、牛乳若しくは人乳由来のラクトフェリ
ン類の加水分解物から単離されたペプチド、このペプチ
ドと同一のアミノ酸配列を含む化学合成されたペプチ
ド、それらの誘導体、又はこれらの２種以上の混合物で
ある請求項１又は請求項２に記載のニュ−キノロン系抗
菌剤の抗菌性を増強させる抗菌剤。3. An antimicrobial peptide derived from a hydrolyzate of lactoferrins is a peptide isolated from a hydrolyzate of lactoferrins derived from cow's milk or human milk, and chemically synthesized containing the same amino acid sequence as this peptide. The antibacterial agent for enhancing the antibacterial activity of the new quinolone antibacterial agent according to claim 1 or 2, which is a peptide, a derivative thereof, or a mixture of two or more thereof.
菌性ペプチドが、配列番号１乃至配列番号８のいずれか
に記載されたアミノ酸配列を有する請求項１乃至請求項
３のニュ−キノロン系抗菌剤の抗菌性を増強させる抗菌
剤。4. The antibacterial peptide according to claim 1, wherein the antibacterial peptide derived from a lactoferrin hydrolyzate has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 8. An antibacterial agent that enhances the antibacterial properties of
対してラクトフェリン類の加水分解物が、少なくとも１
００部（重量）の割合で含有されている請求項１又は請
求項２に記載のニュ−キノロン系抗菌剤の抗菌性を増強
させる抗菌剤。5. A lactoferrin hydrolyzate is used in an amount of at least 1 part per 1 part (by weight) of a new quinolone antibacterial agent.
The antibacterial agent which enhances the antibacterial activity of the new quinolone antibacterial agent according to claim 1 or 2 which is contained in a ratio of 00 parts (weight).
対してラクトフェリン類の加水分解物由来の抗菌性ペプ
チドが、少なくとも１０部（重量）の割合で含有されて
いる請求項１乃至請求項４に記載のニュ−キノロン系抗
菌剤の抗菌性を増強させる抗菌剤。6. An antimicrobial peptide derived from a hydrolyzate of lactoferrin at a ratio of at least 10 parts (by weight) to 1 part (by weight) of the new quinolone antibacterial agent. An antibacterial agent which enhances the antibacterial properties of the new quinolone antibacterial agent according to item 4.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9278113A JPH1192375A (en) | 1997-09-25 | 1997-09-25 | Antibacterial agent capable of enhancing antibacterial activity of new quinolone-based antibacterial drug |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9278113A JPH1192375A (en) | 1997-09-25 | 1997-09-25 | Antibacterial agent capable of enhancing antibacterial activity of new quinolone-based antibacterial drug |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1192375A true JPH1192375A (en) | 1999-04-06 |
Family
ID=17592813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9278113A Pending JPH1192375A (en) | 1997-09-25 | 1997-09-25 | Antibacterial agent capable of enhancing antibacterial activity of new quinolone-based antibacterial drug |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1192375A (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR100295742B1 (en) * | 1999-04-16 | 2001-07-03 | 이동규 | Complex antibiotic composition for animal bacterial infections |
| WO2001034641A3 (en) * | 1999-11-11 | 2002-02-14 | Am Pharma Bv | Antimicrobial activity of the first cationic cluster of human lactoferrin |
| JP2003506416A (en) * | 1999-08-06 | 2003-02-18 | バイエル アクチェンゲゼルシャフト | Moxifloxacin / sodium chloride preparation |
| US7060677B1 (en) | 1999-11-11 | 2006-06-13 | Am-Pharma B.V. | Antimicrobial activity of the first cationic cluster of human lactoferrin |
| WO2012015037A1 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | 森永乳業株式会社 | Antimicrobial activity enhancing agent |
| JP2012240970A (en) * | 2011-05-20 | 2012-12-10 | Keio Gijuku | Novel metalloprotein and process for producing the same |
| WO2013018169A1 (en) | 2011-07-29 | 2013-02-07 | 森永乳業株式会社 | Antimicrobial activity enhancing agent |
-
1997
- 1997-09-25 JP JP9278113A patent/JPH1192375A/en active Pending
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