JPH1189581A - Alcohol dehydrogenase, gene for alcohol dehydrogenase, new recombinant dna and production of alcohol dehydrogenase - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject enzyme useful for determination of alcohols and aldehydes, and, e.g. production of aldehydes as intermediates for synthesizing medicines and the like, and efficiently producible by genetic engineering, consisting of an alcohol dehydrogenase having a specific amino acid sequence. SOLUTION: This alcohol dehydrogenase is a new alcohol dehydrogenase consisting of a protein having an amino acid sequence expressed by the formula or a protein having an amino acid sequence expressed by the formula wherein one or plural amino acids is (are) deleted, substituted or added, and having alcohol dehydrogenase activity, is extremely useful for determination of alcohols and aldehydes and for e.g. production of aldehydes useful as intermediates for synthesizing medicines and the like. This alcohol dehydrogenase is obtained by extracting a chromosomal DNA from Pseudomonas putida-12 strain (FERM P-16,426), subjecting the DNA to the PCR technique using a partial gene of an alcohol dehydrogenase as a primer, integrating the resulting gene into a vector DNA, followed by expressing the gene in host cells.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、アルコール脱水素
酵素、アルコール脱水素酵素遺伝子、新規な組み換え体
ＤＮＡ及びアルコール脱水素酵素の製造法に関する。[0001] The present invention relates to an alcohol dehydrogenase, an alcohol dehydrogenase gene, a novel recombinant DNA, and a method for producing an alcohol dehydrogenase.

【０００２】[0002]

【従来の技術】アルコール脱水素酵素は、動植物界に広
く分布し、動物組織では肝臓等に、また微生物では酵母
等にその存在が知られおり、該酵素は、上記肝臓、酵母
等より精製等して製造されている（「酵素ハンドブッ
ク」、赤堀四郎監修、朝倉書店、１９８２年１２月１
日）。上記アルコール脱水素酵素は、例えば、アルコー
ルやアルデヒドの定量、医薬品等の合成中間体として有
用なアルデヒドの製造等に極めて有用な酵素である。し
かしながら、従来のアルコール脱水素酵素の製造法によ
るときには、その生産量が低い等の欠点があった。2. Description of the Related Art Alcohol dehydrogenase is widely distributed in the animal and plant kingdoms, and its existence is known in animal tissues such as liver, and in microorganisms such as yeast. (“Enzyme Handbook”, supervised by Shiro Akahori, Asakura Shoten, December 1, 1982)
Day). The alcohol dehydrogenase is an enzyme that is extremely useful for, for example, quantification of alcohol or aldehyde, production of aldehyde useful as a synthetic intermediate for pharmaceuticals and the like. However, the conventional method for producing an alcohol dehydrogenase has disadvantages such as a low production amount.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、シュードモ
ナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のアルコール
脱水素酵素を遺伝子工学的手法により生産することを目
的として、その生産のための遺伝子源となるアルコール
脱水素酵素遺伝子、更に、該遺伝子を含む組み換え体Ｄ
ＮＡ及び該組み換え体ＤＮＡを用いるアルコール脱水素
酵素の製造法を提供することである。The object of the present invention is to produce alcohol dehydrogenase derived from Pseudomonas putida by a genetic engineering technique. Enzyme gene, and a recombinant D containing the gene
An object of the present invention is to provide a method for producing alcohol dehydrogenase using NA and the recombinant DNA.

【０００４】[0004]

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記目的に鑑み鋭意研究を行ない、シュードモナス・プ
チダ由来のアルコール脱水素酵素遺伝子を単離及び構造
決定することに成功し、更にまた、アルコール脱水素酵
素をコードする遺伝子をベクターＤＮＡに挿入した組み
換え体ＤＮＡを得、この組み換え体をエッシェリシア(E
scherichia)属に属する菌株に含ませたアルコール脱水
素酵素生産能を有する菌株を培地に培養すると、効率よ
くアルコール脱水素酵素が生産されること等を見出し、
本発明を完成した。Means for Solving the Problems Accordingly, the present inventors have
In view of the above objects, the present inventors have conducted intensive studies, succeeded in isolating and determining the structure of an alcohol dehydrogenase gene derived from Pseudomonas putida, and further obtained a recombinant obtained by inserting a gene encoding an alcohol dehydrogenase into a vector DNA. DNA was obtained and this recombinant was transformed into Escherichia (E.
scherichia) found that when a strain having an alcohol dehydrogenase-producing ability contained in a strain belonging to the genus genus is cultured in a medium, alcohol dehydrogenase is efficiently produced, and the like.
The present invention has been completed.

【０００５】即ち、本願の第１の発明は、以下の(a)ま
たは(b)のアルコール脱水素酵素である。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質
本願の第２の発明は、以下の(a)または(b)のタンパク質
をコードするアルコール脱水素酵素遺伝子である。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質 本願の第３の発明は、上記のアルコール脱水素酵素遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規な
組み換え体ＤＮＡである。本願の第４の発明は、上記組
み換え体ＤＮＡを含む形質転換体または形質導入体であ
る。更に、本願の第５の発明は、上記の形質転換体また
は形質導入体を培地に培養し、培養物からアルコール脱
水素酵素を採取することを特徴とするアルコール脱水素
酵素の製造法である。That is, the first invention of the present application is the following alcohol dehydrogenase (a) or (b). (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence (a) in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an alcohol dehydrogenase activity A second aspect of the present invention is an alcohol dehydrogenase gene encoding the following protein (a) or (b). (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence (a) in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an alcohol dehydrogenase activity Protein The third invention of the present application is a novel recombinant DNA comprising the above alcohol dehydrogenase gene inserted into a vector DNA. A fourth invention of the present application is a transformant or a transductant containing the recombinant DNA. Further, the fifth invention of the present application is a method for producing an alcohol dehydrogenase, which comprises culturing the above-mentioned transformant or transductant in a medium and collecting an alcohol dehydrogenase from the culture.

【０００６】[0006]

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明アルコール脱水素酵素は、本発明者等が土壌より
分離したシュードモナス・プチダ7-12株より得られる。
シュードモナス・プチダ7-12株の菌学的性質は、以下に
示す通りである。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The present invention will be described below in detail.
The alcohol dehydrogenase of the present invention is obtained from Pseudomonas putida strain 7-12 isolated from the soil by the present inventors.
The bacteriological properties of Pseudomonas putida 7-12 strain are as follows.

【０００７】 シュードモナス・プチダ7-12株の菌学的性質 (a)形態的性質 1)形態 桿菌 2)運動性 あり(鞭毛；極多毛) 3)胞子 なし (b)生理学的性質 1)グラム染色性 陰性 2)酸素に対する態度 好気性 3)オキシダーゼ 陽性 4)カタラーゼ 陽性 5)O-Fテスト O 6)蛍光色素の生成 陽性 7)PHBの蓄積 陽性 8)アルギニンジヒドロラーゼ 陽性 9)41℃での生育 陰性 10)硝酸塩の還元 陰性 11)脱窒反応 陰性 12)ゼラチン液化 陰性 13)デンプン分解 陰性 14)資化性 (1)グルコース 陽性 (2)トレハロース 陰性 (3)2-ケトグルコネイト 陽性 (4)meso-イノシトール 陰性 (5)ゲラニオール 陰性 (6)L-バリン 陽性 (7)β-アラニン 陽性 (8)DL-アルギニン 陽性 15)キノン系 Q-9を含有する 16)菌体内ＤＮＡのGC含量 61モル％Mycological properties of Pseudomonas putida 7-12 strain (a) Morphological properties 1) Morphology Bacillus 2) Motile (flagellate; hypertrich) 3) No spores (b) Physiological properties 1) Gram stain Sex negative 2) attitude to oxygen aerobic 3) oxidase positive 4) catalase positive 5) OF test O 6) fluorescent dye formation positive 7) PHB accumulation positive 8) arginine dihydrolase positive 9) growth at 41 ℃ negative 10 ) Nitrate reduction negative 11) Denitrification negative 12) Gelatin liquefaction negative 13) Starch degradation negative 14) Utilization (1) glucose positive (2) trehalose negative (3) 2-ketogluconate positive (4) meso-inositol negative (5) Geraniol negative (6) L-valine positive (7) β-alanine positive (8) DL-arginine positive 15) Contains quinone Q-9 16) GC content of intracellular DNA 61 mol%

【０００８】以上の結果より本菌株7-12株は、シュード
モナス・プチダに属するものと決定し、工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６４２
６として寄託されている。Based on the above results, this strain 7-12 was determined to belong to Pseudomonas putida, and deposited with the National Institute of Bioscience and Human-Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
No. 6 has been deposited.

【０００９】本発明のアルコール脱水素酵素遺伝子は、
例えば、次のようにして得ることができる。先ず、シュ
ードモナス・プチダ7-12株を、例えば、Current Protoc
ols in Molecular Biology（WILEY Intersciense,198
9）記載の方法等により培養し、得られた菌株から染色
体ＤＮＡを抽出する。[0009] The alcohol dehydrogenase gene of the present invention comprises:
For example, it can be obtained as follows. First, 7-12 strains of Pseudomonas putida, for example, Current Protoc
ols in Molecular Biology (WILEY Intersciense, 198
9) Culture according to the method described above, etc., and extract chromosomal DNA from the obtained strain.

【００１０】次いで、精製アルコール脱水素酵素のアミ
ノ酸配列、シュードモナス・プチダに属する微生物のコ
ドン使用頻度を考慮して、合成ＤＮＡを作製し、上記で
得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖
反応（以下、PCR法と略称する。）を行ない、アルコー
ル脱水素酵素の一部をコードするＤＮＡを得る。Next, in consideration of the amino acid sequence of the purified alcohol dehydrogenase and the codon usage of microorganisms belonging to Pseudomonas putida, a synthetic DNA is prepared, and the chromosomal DNA obtained above is used as a template to perform polymerase chain reaction ( Hereinafter, abbreviated as PCR method) to obtain DNA encoding a part of alcohol dehydrogenase.

【００１１】上記で得られた染色体ＤＮＡを、例えば、
Sau3AI等の制限酵素で部分消化し、常法に従いベクター
ＤＮＡに組み込む。用いられるベクターＤＮＡとして
は、例えば、pUC19（宝酒造社製）、pBR322（宝酒造社
製）、pBluescript SK+（Stratagene社製）、pMAL-C2
（NEW England Labs社製）等のプラスミドＤＮＡ、λEN
BL3（Stratagene社製）、λDASH II（フナコシ社製）等
のバクテリオファージＤＮＡ等が挙げられる。得られた
組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば大腸菌K-12、好まし
くは大腸菌JM109（東洋紡社製）、XL1-Blue（フナコシ
社製）等を形質転換または形質導入して夫々の形質転換
体または形質導入体を得る。宿主細胞としては、例え
ば、大腸菌等の細菌、酵母、かび、放線菌、動物細胞等
が用いられる。The chromosomal DNA obtained above is, for example,
After partial digestion with a restriction enzyme such as Sau3AI, the DNA is integrated into a vector DNA according to a conventional method. Examples of the vector DNA used include pUC19 (Takara Shuzo), pBR322 (Takara Shuzo), pBluescript SK + (Stratagene), pMAL-C2
(NEW England Labs), plasmid DNA, λEN
Bacteriophage DNA such as BL3 (Stratagene), λDASH II (Funakoshi) and the like. Using the obtained recombinant DNA, for example, Escherichia coli K-12, preferably Escherichia coli JM109 (manufactured by Toyobo), XL1-Blue (manufactured by Funakoshi) and the like are transformed or transduced, and the respective transformants or transformants are transformed. Get the introductory body. As the host cell, for example, bacteria such as Escherichia coli, yeast, mold, actinomycetes, animal cells and the like are used.

【００１２】この形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの
方法（Method in Enzymology,68,326-331,1979）に行な
うことができる。また、形質導入は、例えば、B.Hohnの
方法（Method in Enzymology,68,299-309,1979）により
行なうことができる。This transformation can be performed, for example, by the method of DMMorrison (Method in Enzymology, 68, 326-331, 1979). Transduction can be performed, for example, by the method of B. Hohn (Method in Enzymology, 68, 299-309, 1979).

【００１３】上記形質転換体または形質導入体より純化
された新規な組み換え体ＤＮＡを得るには、例えば、ピ
ー・グーリー(P.Guerry)等の方法〔ジェイ．バクテリオ
ロジー（J.Bacteriology）、第１１６巻、第１０６４〜
１０６６頁(1973年)〕、デー・ビー・クレウェル(Clewe
ll)の方法〔ジェイ．バクテリオロジー（J.Bacteriolog
y）、第１１０巻、第６６７〜６７６頁(1972年)〕等に
より得ることができる。To obtain a novel recombinant DNA purified from the above transformant or transductant, for example, a method such as P. Guerry [J. J. Bacteriology, Vol. 116, No. 1064-
1066 (1973)], Clewe
ll) [J. Bacteriology (J. Bacteriolog
y), Vol. 110, pp. 667-676 (1972)] and the like.

【００１４】更に、上記アルコール脱水素酵素遺伝子を
含有するＤＮＡを用いて、後述の実施例項目(6)に示す
３７０ＤＮＡシークエンス・システム（パーキンエルマ
ー社製）を用いてアルコール脱水素酵素遺伝子の全塩基
配列の解析を行ない（配列番号１参照）、次いで、前記
塩基配列を有する遺伝子によって翻訳されるポリペプチ
ドのアミノ酸の一次配列を確定する。（配列番号２参
照）Further, using the DNA containing the above-mentioned alcohol dehydrogenase gene, all bases of the alcohol dehydrogenase gene were obtained by using a 370 DNA sequencing system (manufactured by PerkinElmer) described in Example Item (6) below. The sequence is analyzed (see SEQ ID NO: 1), and then the primary sequence of the amino acid of the polypeptide translated by the gene having the nucleotide sequence is determined. (See SEQ ID NO: 2)

【００１５】なお、配列番号２に示されるアミノ酸配列
において、１もしくは複数、好ましくは、数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつ、アルコ
ール脱水素酵素活性をもたらすアミノ酸配列をコードす
るアルコール脱水素酵素遺伝子は、全て本発明に含まれ
る。In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or more, preferably several amino acids are deleted, substituted or added, and the amino acid sequence conferring alcohol dehydrogenase activity is encoded. All the alcohol dehydrogenase genes described above are included in the present invention.

【００１６】そして、配列番号２に示されるアミノ酸配
列において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換も
しくは付加されており、かつ、アルコール脱水素酵素活
性をもたらすアミノ酸配列をコードするアルコール脱水
素酵素遺伝子を得るには、如何なる方法でもよく、例え
ば、遺伝子に点変異または欠失変異を生じさせるための
周知技術である部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に
開裂し、次いで、選択されたヌクレオチドを除去または
付加し、遺伝子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変
異誘導法等が挙げられる。In addition, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or more amino acids are deleted, substituted or added, and the alcohol dehydrogenase gene encodes an amino acid sequence that provides alcohol dehydrogenase activity. Can be obtained by any method, for example, a site-directed mutagenesis method, which is a well-known technique for generating a point mutation or a deletion mutation in a gene; selectively cleaving the gene, and then removing the selected nucleotides. Methods of removing or adding and linking genes; oligonucleotide mutagenesis, and the like.

【００１７】上記のようにして得られたアルコール脱水
素酵素生産能を有する形質転換体または形質導入体、例
えば、エッシェリシア属に属する菌株を用いてアルコー
ル脱水素酵素を生産するには、下記のようにして行なう
ことができる。上記微生物を培養するには、通常の固体
培養法で培養してもよいが、なるべく液体培養法を採用
して培養するのが好ましい。Production of alcohol dehydrogenase using the transformant or transductant having the ability to produce alcohol dehydrogenase obtained as described above, for example, a strain belonging to the genus Escherichia, is performed as follows. It can be done. In order to culture the above microorganism, it may be cultured by a usual solid culture method, but it is preferable to employ a liquid culture method as much as possible.

【００１８】また、上記微生物を培養する培地として
は、例えば、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
ステイープリカーあるいは大豆もしくは小麦麹の浸出液
等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリウム、リン
酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄、硫
酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜
添加したものが用いられる。The medium for culturing the microorganism may be, for example, potassium dihydrogen phosphate in one or more nitrogen sources such as yeast extract, peptone, meat extract, corn steep liquor or soybean or wheat koji leaching solution. One or more inorganic salts such as dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate are added, and if necessary, saccharide raw materials, vitamins and the like are appropriately added. Can be

【００１９】なお、培地の初発pHは、7〜9に調整するの
が適当である。また培養は、30〜42℃、好ましくは37℃
前後で6〜24時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静
置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該
培養物よりアルコール脱水素酵素を採取するには、通常
の酵素採取手段を用いることができる。The initial pH of the medium is suitably adjusted to 7-9. In addition, culture is performed at 30 to 42 ° C, preferably at 37 ° C.
It is preferable to carry out by aeration and stirring deep culture, shaking culture, stationary culture, etc. for 6 to 24 hours before and after. After completion of the cultivation, an ordinary enzyme collecting means can be used to collect alcohol dehydrogenase from the culture.

【００２０】培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の
操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体からアル
コール脱水素酵素を採取することが好ましい。この場
合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕
機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を
用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶
解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ
-100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方
法等により、菌体からアルコール脱水素酵素を採取する
のが好ましい。The cells are separated from the culture by, for example, filtration, centrifugation, etc., and washed. It is preferable to collect alcohol dehydrogenase from the cells. In this case, the cells can be used as they are, but a method of destroying the cells using various disrupting means such as an ultrasonic crusher, a French press, and a dynamill, a cell cell wall using a cell wall lysing enzyme such as lysozyme. To dissolve Triton X
It is preferable to collect alcohol dehydrogenase from the cells by a method of extracting the enzyme from the cells using a surfactant such as -100.

【００２１】このようにして得られた粗酵素液からアル
コール脱水素酵素を単離するには、通常の酵素精製に用
いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機
溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過ク
ロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等
を適宜組み合わせて行なうのが好ましい。In order to isolate the alcohol dehydrogenase from the thus obtained crude enzyme solution, a method used for ordinary enzyme purification can be used. For example, it is preferable to carry out an appropriate combination of ammonium sulfate salting out, organic solvent precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, adsorption chromatography, electrophoresis and the like.

【００２２】得られたアルコール脱水素酵素の理化学的
性質は、以下に示す通りである。次の理化学的性質(1)
〜(5)を有するアルコール脱水素酵素 (1)作用：アルコール＋ＮＡＤ⁺←→アルデヒド＋ＮＡＤ
Ｈ＋Ｈ⁺ (2)基質特異性：炭素数2-12のn-アルコールに特異的で
ある。 (3)至適pH：8〜9 (4)pH安定性：8〜10 (5)分子量：160(ゲル濾過法)The physicochemical properties of the obtained alcohol dehydrogenase are as follows. The following physicochemical properties (1)
Alcohol dehydrogenase having-(5) (1) Action: alcohol + NAD ⁺ ← → aldehyde + NAD
H + H ⁺ (2) Substrate specificity: Specific for n-alcohol having 2-12 carbon atoms. (3) Optimum pH: 8-9 (4) pH stability: 8-10 (5) Molecular weight: 160 (gel filtration method)

【００２３】（1）酵素活性測定法 （活性測定法） （試薬） Ａ 200ｍＭ りん酸緩衝液、pH7.5 Ｂ 10ｍＭ ＮＡＤ水溶液 Ｃ 200ｍＭ グリセルアルデヒド水溶液 Ｄ 酵素希釈液（10％グリセロールを含む50ｍＭ りん
酸緩衝液 pH7.5）(1) Enzyme activity measurement method (activity measurement method) (Reagent) A 200 mM phosphate buffer, pH 7.5 B 10 mM NAD aqueous solution C 200 mM glyceraldehyde aqueous solution D Enzyme diluent (50 mM phosphorus containing 10% glycerol Acid buffer pH7.5)

【００２４】（手順） １ 下記反応混液をキュベット（ｄ＝1.0ｃｍ）に調製
し、37℃で約5分間予備加温する。 0.5ｍｌ りん酸緩衝液（pH7.5） 0.4ｍｌ ＮＡＤ水溶液 0.4ｍｌ グリセルアルデヒド水溶液 0.6ｍｌ 水 ２ 酵素溶液0.1ｍｌを添加し、混和後水を対照に37℃
に制御された分光光度計で340ｎｍの吸光度変化を4〜5
分間記録し、その初期直線部分から1分間当りの吸光度
変化を求める（△ｔｅｓｔ）。盲検は、酵素溶液の代わ
りに酵素希釈液を0.1ｍｌ加え、上記と同様に操作を行
なって1分間当りの吸光度変化を求める（△ｂｌａｎ
ｋ）。(Procedure) 1 The following reaction mixture is prepared in a cuvette (d = 1.0 cm) and preliminarily heated at 37 ° C. for about 5 minutes. 0.5 ml Phosphate buffer (pH 7.5) 0.4 ml NAD aqueous solution 0.4 ml glyceraldehyde aqueous solution 0.6 ml water 2 Enzyme solution 0.1 ml is added and mixed.
The change in absorbance at 340 nm with a spectrophotometer controlled to
For one minute, the change in absorbance per minute is determined from the initial linear portion (部分 test). In the blind test, 0.1 ml of an enzyme diluent was added in place of the enzyme solution, and the same operation as above was performed to determine the change in absorbance per minute (Δblan
k).

【００２５】（計算式） Ａ＝6.22×1.0×0.1（ｍｌ） Ｂ＝△ＯＤ／ｍｉｎ（△ｔｅｓｔ−△ｂｌａｎｋ）×2.
0（ｍｌ）×希釈倍数(Calculation formula) A = 6.22 × 1.0 × 0.1 (ml) B = △ OD / min (△ test- △ blank) × 2.
0 (ml) x dilution factor

【００２６】[0026]

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。EXAMPLES The present invention will be described more specifically with reference to the following examples.

【００２７】[0027]

【実施例】【Example】

(1)シュードモナス・プチダ7-12株の染色体の調製 シュードモナス・プチダ7-12株を1%のグルコースを添加
したＬＢ培地〔Current Protocols in Molecular Biolo
gy（WILEY Intersciense,1989）〕100mlに接種して、30
℃で20時間振とう培養し、培養物を得た。この培養物を
6,000r.p.m.で10分間遠心分離することにより集菌して
菌体を得た。この菌体よりCurrent Protocols in Molec
ular Biology（WILEY Intersciense,1989）記載の方法
に従い、染色体ＤＮＡ1.2 mgを得た。(1) Preparation of chromosome of Pseudomonas putida 7-12 strain Pseudomonas putida 7-12 strain was added to an LB medium (Current Protocols in Molecular Biolo
gy (WILEY Intersciense, 1989)]
After shaking culture at 20 ° C for 20 hours, a culture was obtained. This culture
The cells were collected by centrifugation at 6,000 rpm for 10 minutes to obtain bacterial cells. Current Protocols in Molec
According to the method described in ular Biology (WILEY Intersciense, 1989), 1.2 mg of chromosomal DNA was obtained.

【００２８】(2)プライマーの合成 シュードモナス・プチダ7-12株由来の精製アルコール脱
水素酵素150μgをプロテインシークエンサー（パーキン
エルマー473A）に供し、N末端アミノ酸配列を決定し
た。また、シュードモナス・プチダ7-12株由来の精製ア
ルコール脱水素酵素150μgをトリプシン消化し、ＨＰＬ
Ｃで分取したペプチド5をプロテインシークエンサーに
供し、内部アミノ酸配列を決定した。更に、シュードモ
ナス・プチダ7-12株に属する微生物のコドン使用頻度を
検討した。これらの情報により配列番号３及び４に記載
したプライマーをＤＮＡ合成機（パーキンエルマー 39
2）で合成した。(2) Synthesis of Primers 150 μg of purified alcohol dehydrogenase derived from Pseudomonas putida 7-12 strain was applied to a protein sequencer (Perkin Elmer 473A) to determine the N-terminal amino acid sequence. Further, 150 μg of purified alcohol dehydrogenase derived from Pseudomonas putida 7-12 strain was digested with trypsin, and HPL
Peptide 5 fractionated in C was subjected to a protein sequencer to determine the internal amino acid sequence. Furthermore, the codon usage of microorganisms belonging to Pseudomonas putida 7-12 strain was examined. Based on this information, the primers described in SEQ ID NOs: 3 and 4 were used to prepare
Synthesized in 2).

【００２９】(3)PCR 反応液を下記の組成で調製し、変性を94℃, 1分間、ア
ニールを62℃,2分間、伸長反応を74℃,2分間で30サイク
ルの反応条件でPCRを行なった。 （反応液組成） 染色体ＤＮＡ 1μg プライマー 50pmoles *10×Ex Taq緩衝液 10μl dNTP 溶液 各0.2mM 塩化マグネシウム 1mM *Ex Taqポリメラーゼ 2.5ユニット 水 最終容量100μlになるよう加える。 *宝酒造社製 PCR終了後、反応液をアガロースゲル電気泳動に供した
ところ、約1kbに目的の断片と思われるバンドが確認さ
れたので、そのバンドを切り出し、GENECLEAN II（フナ
コシ社製）にて精製した。(3) PCR A PCR reaction solution was prepared with the following composition, and PCR was performed under the following reaction conditions: denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 62 ° C for 2 minutes, and extension reaction at 74 ° C for 2 minutes for 30 cycles. Done. (Reaction solution composition) Chromosomal DNA 1 μg Primer 50 pmoles * 10 x Ex Taq buffer 10 μl dNTP solution 0.2 mM each Magnesium chloride 1 mM * Ex Taq polymerase 2.5 units Water Add to a final volume of 100 μl. * After completion of Takara Shuzo PCR, the reaction mixture was subjected to agarose gel electrophoresis. As a result, a band thought to be the desired fragment was confirmed at about 1 kb. The band was cut out and subjected to GENECLEAN II (Funakoshi). Purified.

【００３０】(4)形質転換株大腸菌JM109（pPADH1）の作
製 先ず、上記ＤＮＡ断片をT4ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造社製）を用い、付属のマニュアルに従いリン酸
化を行なった。また、別にpUC19（宝酒造社製）を制限
酵素HincＩＩ（宝酒造社製）を用いて消化し、常法に従
い脱リン酸化したＤＮＡ断片を作製した。この上記2種
類のＤＮＡ断片を用いてligation反応を行ないpPADH1を
作製した。次いで、D.M.Morrisonの方法（Method in En
zymology,68,326-331,1979）に従い、プラスミドpPADH1
を用いて大腸菌JM109（東洋紡社製）を形質転換し、形
質転換株、大腸菌(E.coli)JM109（pPADH1）を得た。こ
の形質転換株を75μg/mlのアンピシリンを含むTY培地
（1％バクトトリプトン、0.5％バクトイースト・エクス
トラクト、0.5 ％NaCl、pH7.0）10mlにて一晩培養し、
常法に従いプラスミドＤＮＡ0.2 mgを調製した。このプ
ラスミドＤＮＡを370ＤＮＡシークエンシス・システム
（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列の決定及び
解析を行なったところ、決定した塩基配列より予想され
るアミノ酸配列に前述のアミノ酸配列(Val Thr Leu Arg
Pro Ile Glu Asp Ile Asn)が確認された。このことよ
り、上記のPCRで増幅したＤＮＡ断片にはアルコール脱
水素酵素遺伝子の一部の配列が存在していることが確認
された。(4) Preparation of Transformant Escherichia coli JM109 (pPADH1) First, the above DNA fragment was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase (manufactured by Takara Shuzo) according to the attached manual. Separately, pUC19 (manufactured by Takara Shuzo) was digested with a restriction enzyme HincII (manufactured by Takara Shuzo) to prepare a dephosphorylated DNA fragment according to a conventional method. Using these two types of DNA fragments, a ligation reaction was performed to prepare pPADH1. Then, the method of DMMorrison (Method in En
zymology, 68, 326-331, 1979), plasmid pPADH1
Was used to transform Escherichia coli JM109 (manufactured by Toyobo) to obtain a transformed strain, Escherichia coli (E. coli) JM109 (pPADH1). This transformant was cultured overnight in 10 ml of a TY medium (1% bactotryptone, 0.5% bactoeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0) containing 75 μg / ml ampicillin,
According to a conventional method, 0.2 mg of plasmid DNA was prepared. The nucleotide sequence of this plasmid DNA was determined and analyzed using a 370 DNA sequencing system (manufactured by PerkinElmer). The amino acid sequence predicted from the determined nucleotide sequence was replaced with the amino acid sequence (Val Thr Leu Arg
Pro Ile Glu Asp Ile Asn) was confirmed. This confirmed that a partial sequence of the alcohol dehydrogenase gene was present in the DNA fragment amplified by the above PCR.

【００３１】(5)シュードモナス・プチダのゲノミック
ライブラリーの作製 先ず、上記のＤＮＡ配列解析よりプライマーを設計し、
ＤＮＡ合成機（パーキンエルマー 392）で合成した。こ
れと上記のpPADHとDIG・ＰＣＲラベリング・キット（ベ
ーリンガーインゲルハイム社製）用いてプローブを作製
した。このプローブを用いてサザンブロッティングを行
なったところ約8kbのEcoRI断片とハイブリダイズした。
これをプローブとしアルコール脱水素酵素遺伝子の全領
域を取得するためゲノミックライブラリーを作製するこ
ととした。先ず、前述の染色体ＤＮＡを用いてMolecula
r Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press 198
9）記載の方法に従い、制限酵素EcoRIによる分解物を得
た。分解物をアガロース電気泳動にかけ、約7〜9kbの部
分をゲルから切り出し、定法に従ってＤＮＡ断片を調製
した。一方、pUC19を制限酵素EcoRIで消化しＤＮＡ断片
を得た。これら２つのＤＮＡ断片を用いてライゲーショ
ン反応を行ない、D.M.Morrisonの方法（Method in Enzy
mology,68,326-331,1979）に従い、大腸菌JM109（東洋
紡社製）を形質転換し、ゲノミックライブラリーを作製
した。(5) Preparation of Pseudomonas putida Genomic Library First, primers were designed from the above DNA sequence analysis,
It was synthesized using a DNA synthesizer (Perkin Elmer 392). A probe was prepared using this and the above-mentioned pPADH and DIG PCR labeling kit (Boehringer Ingelheim). When Southern blotting was performed using this probe, it hybridized with an EcoRI fragment of about 8 kb.
Using this as a probe, a genomic library was prepared to obtain the entire region of the alcohol dehydrogenase gene. First, using the chromosomal DNA described above, Molecula
r Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press 198
9) According to the method described, a digestion product with the restriction enzyme EcoRI was obtained. The digest was subjected to agarose electrophoresis, a portion of about 7 to 9 kb was cut out from the gel, and a DNA fragment was prepared according to a standard method. On the other hand, pUC19 was digested with a restriction enzyme EcoRI to obtain a DNA fragment. A ligation reaction was performed using these two DNA fragments, and the method of DMMorrison (Method in Enzyme) was used.
E. coli JM109 (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed to prepare a genomic library according to Mology, 68, 326-331, 1979).

【００３２】(6)アルコール脱水素酵素遺伝子のスクリ
ーニング及び形質転換株大腸菌JM109（pPADH101）の作
製 上記のプローブとライブラリーを用い常法に従ってコロ
ニーハイブリダイゼーションを行なったところ、いくつ
かの陽性クローンを得ることが出来た。これらを2mlのT
Y培地で37℃で18時間培養し、常法に従ってプラスミド
を調製した。一方、解析して得られたアルコール脱水素
酵素部分ＤＮＡ配列よりプライマーを設計し（配列番号
５及び６）、ＤＮＡ合成機（パーキンエルマー 392）で
合成した。この合成プライマーと前述のプラスミドを用
いてPCR反応を行ない、アガロース電気泳動により増幅
されたＤＮＡ断片を解析したところ、一つの形質転換株
JM109（pPADH101）について得られるべき長さのＤＮＡ
断片が増幅され、そのＤＮＡ配列を370ＤＮＡシークエ
ンシス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩
基配列の決定及び解析を行なったところ前述の部分ＤＮ
Ａ配列が確認された。これより、上記のプラスミドは、
目的のアルコール脱水素酵素遺伝子を含むことが判明し
た。該形質転換株、即ち、大腸菌JM109（pPADH101）
は、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１６４２５として寄託されている。(6) Screening of Alcohol Dehydrogenase Gene and Preparation of Transformant Escherichia coli JM109 (pPADH101) Colony hybridization was carried out according to a conventional method using the above-mentioned probe and library, and several positive clones were obtained. I was able to do it. Take these 2ml T
The cells were cultured in Y medium at 37 ° C. for 18 hours, and plasmids were prepared according to a conventional method. On the other hand, primers were designed based on the alcohol dehydrogenase partial DNA sequence obtained by the analysis (SEQ ID NOS: 5 and 6), and synthesized using a DNA synthesizer (Perkin Elmer 392). A PCR reaction was carried out using this synthetic primer and the above-mentioned plasmid, and the amplified DNA fragment was analyzed by agarose gel electrophoresis.
Length of DNA to be obtained for JM109 (pPADH101)
The fragment was amplified, and its DNA sequence was subjected to nucleotide sequence determination and analysis using a 370 DNA sequencing system (manufactured by PerkinElmer).
The A sequence was confirmed. Thus, the above plasmid is
It was found to contain the desired alcohol dehydrogenase gene. The transformed strain, that is, Escherichia coli JM109 (pPADH101)
FERM P
No. 16425.

【００３３】(7)活性の確認 大腸菌JM109（pPADH101）菌体を、75μg/mlのアンピシ
リンを含むTY培地（１％バクトトリプトン、0.5 ％バク
トイースト・エクストラクト、0.5 ％NaCl、pH7.0）10m
lにて37℃で14時間振とう培養した後、この培養液を氷
上で冷却下、超音波破砕器(Ulutrasonicgenerator、Niss
ei社製)を用いて2分間処理した。これをエッペンドルフ
チューブに入れ、微量遠心機を用い、12,000r.p.m.で10
分間遠心分離し、上清画分及び沈殿画分に分離し、上清
を別のエッペンドルフチューブに移しかえ、前述した酵
素活性測定法によりアルコール脱水素酵素活性を測定し
たところ、0.38U/mlであった。(7) Confirmation of Activity E. coli JM109 (pPADH101) cells were cultured in TY medium containing 75 μg / ml ampicillin (1% bactotryptone, 0.5% bactoeast extract, 0.5% NaCl, pH 7.0). 10m
After culturing with shaking at 37 ° C. for 14 hours at 37 ° C., the culture solution was cooled on ice, and an ultrasonic crusher (Ulutrasonicgenerator, Niss
(manufactured by ei) for 2 minutes. Put this in an Eppendorf tube and use a microcentrifuge at 12,000 rpm for 10 minutes.
Centrifuged for 1 minute, separated into a supernatant fraction and a precipitate fraction, transferred the supernatant to another Eppendorf tube, and measured the alcohol dehydrogenase activity by the enzyme activity measurement method described above, 0.38 U / ml there were.

【００３４】(8)アルコール脱水素酵素遺伝子の解析 大腸菌JM109（pPADH101）のアルコール脱水素酵素活性
が確認されたので、pPADH101の挿入断片がアルコール脱
水素酵素遺伝子を含むことが明らかとなった。そこで、
このプラスミドＤＮＡについて370ＤＮＡ シークエン
ス・システム（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配
列の決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号１
に、また、該ＤＮＡ配列から翻訳されるポリペプチドの
アミノ酸配列を配列番号２に夫々示した。アルコール脱
水素酵素遺伝子は、999bpのコーディング領域を有し、3
33個のアミノ酸をコードしていた。(8) Analysis of alcohol dehydrogenase gene Since the alcohol dehydrogenase activity of Escherichia coli JM109 (pPADH101) was confirmed, it was revealed that the inserted fragment of pPADH101 contains the alcohol dehydrogenase gene. Therefore,
The nucleotide sequence of this plasmid DNA was determined using a 370 DNA sequence system (Perkin Elmer). SEQ ID NO: 1
And the amino acid sequence of the polypeptide translated from the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 2, respectively. The alcohol dehydrogenase gene has a 999 bp coding region and 3
It coded for 33 amino acids.

【００３５】[0035]

【発明の効果】本発明によれば、新規なアルコール脱水
素酵素を効率よく生産することができる。According to the present invention, a novel alcohol dehydrogenase can be efficiently produced.

【００３６】[0036]

【配列表】[Sequence list]

配列番号１ 配列の長さ：999 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス・プチダ 株名：7-12 配列： ATG AAA GCT GCT GTC GTT GCC AAA GGG CGT CGC GTG GAC GTG GTG GAG 48 AAG ACA CTG CGG CCG CTG GCG CAC GGT GAA GCG TTG CTG AAG ATG CAG 96 TGC TGT GGC GTT TGC CAT ACC GAC CTG CAT GTC AAG AAT GGC GAT TTC 144 GGC GAC AAG ACG GGT GTG ATT CTG GGC CAC GAA GGG ATT GGC GTG GTC 192 GTG GAA GTG GGG CCG GGT GTC ACG TCG CTC AAG CCG GGT GAC CGG GCC 240 AGT GTG GCG TGG TTC TTC CAG GGC TGC GGG CAC TGC GAA TAT TGC AAC 288 AGC GGC AAC GAA ACG CTG TGC CGT GAG GTG AAA AAC TCC GGC TAC ACG 336 GTC GAC GGT GGC ATG GCC GAA GCG TGC ATC GTG GTG GCC GAC TAT GCG 384 GTT AAA GTC CCG GAT GGG CTG GAT TCA GCG GCC GCC AGC AGC ATC ACC 432 TGC GCC GGC GTG ACC ACC TAC AAA TCA TCG AAT ATC CGC CCT GGG CAA 480 TGG CTG GCC ATC TAC GGC CTT GGC GGC CTG GGC AAC CTT GCC CTG CAG 528 TAC GCC AAA AAC TTC TTC AAC GCC GGG GTC ATT GCC ATC GAC GTC AAC 576 GAT GAT CAA CTG GCC TTC GCC CGT GAA ATG GGC GCC GAC CTG GTG GTC 624 AAC CCG CGC GAC GAA GAC GCC GCG AAA GTC ATC CAG GCC AAG ACC GGG 672 GGC GCC CAT GCT GCC GTG GTC ACG GCA GTG GCC AAG AGC GCG TTC AAC 720 TCT GCA GTG GAT GCA CTG CGC GCG GGC GGT CGC TTC GTG GCT GTG GGG 768 CTG CCG CCA GAG GCC ATG AGC CTG GAT ATT CCA CGC CTG GTA CTC GAC 816 GGT ATC GAG GTC GTC GGT TCG CTG GTC GGC ACC CGC CAG GAC CTG CAC 864 GAA GCC TTC GAG TTT GCC GCC CAA GGC AAG GTG GTG CCG AAG GTG ACC 912 CTG CGC CCG ATC GAA GAC ATC AAT GAC ATC TTC GAA GAG ATG CAA GCG 960 GGG AAG ATC AGA GGC CGC ATG GTG ATG CAC TTC GCC GAT 999 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 999 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: Genomic DNA Origin Organism name: Pseudomonas putida Strain name: 7-12 Sequence: ATG AAA GCT GCT GTC GTT GCC AAA GGG CGT CGC GTG GAC GTG GTG GAG 48 AAG ACA CTG CGG CCG CTG GCG CAC GGT GAA GCG TTG CTG AAG ATG CAG 96 TGC TGT GGC GTT TGC CAT ACC GAC CTG CAT GTC AAG AAT GGC GAT TTC 144 GGC GAC AAG ACG GGT GTG ATT CTG GGC CAC GAA GGG ATT GGC GTG GTC 192 GTG GAA GTG GGG CCG GGT GTC ACG TCG CTC AAG CCG GGT GAC CGG GCC 240 AGT GTG GCG TGG TTC TTC CAG GGC TGC GGG CAC TGC GAA TAT TGC AGC 288 GGC AAC GAA ACG CTG TGC CGT GAG GTG AAA AAC TCC GGC TAC ACG 336 GTC GAC GGT GGC ATG GCC GAA GCG TGC ATC GTG GTG GCC GAC TAT GCG 384 GTT AAA GTC CCG GAT GGG CTG GAT TCA GCG GCC GCC AGC AGC ATC ACC 432 TGC GCC GGC GTG ACC ACC TAC AAA TCA TCG AAT ATC CGC CCT GGG CAA 480 TGG CTG GCC ATC TAC GGC CTT GGC GGC CTG GGC AAC CTT GCC CTG CAG 528 TAC GCC AAA AAC TTC TTC AAC GCC GGG GTC ATT GCC ATC GAC GTC AAC 576 GAT GAT CAA CTG GCC TTC GCC CGT GAA ATG GGC GCC GAC CTG GTG GTC 624 AAC CCG CGC GAC GAA GAC GCC GCG AAA GTC ATC CAG GCC AAG ACC GGG 672 GGC GCC CAT GTC GCC GTC ACG GCA GTG GCC AAG AGC GCG TTC AAC 720 TCT GCA GTG GAT GCA CTG CGC GCG GGC GGT CGC TTC GTG GCT GTG GGG 768 CTG CCG CCA GAG GCC ATG AGC CTG GAT ATT CCA CGC CTG GTA CTC GAC 816 GGT ATC GAG GTC GTC GTC TCG CTG GTC GGC ACC CGC CAG GAC CTG CAC 864 GAA GCC TTC GAG TTT GCC GCC CAA GGC AAG GTG GTG CCG AAG GTG ACC 912 CTG CGC CCG ATC GAA GAC ATC AAT GAC ATC TTC GAA GAG ATG CAA GCG 960 GGG AAG ATC AGA CGC ATG GTG ATG CAC TTC GCC GAT 999

【００３７】配列番号２ 配列の長さ：333 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Lys Ala Ala Val Val Ala Lys Gly Arg Arg Val Asp Val Val 5 10 15 Glu Lys Thr Leu Arg Pro Leu Ala His Gly Glu Ala Leu Leu Lys 20 25 30 Met Gln Cys Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Val Lys Asn 35 40 45 Gly Asp Phe Gly Asp Lys Thr Gly Val Ile Leu Gly His Glu Gly 50 55 60 Ile Gly Val Val Val Glu Val Gly Pro Gly Val Thr Ser Leu Lys 65 70 75 Pro Gly Asp Arg Ala Ser Val Ala Trp Phe Phe Gln Gly Cys Gly 80 85 90 His Cys Glu Tyr Cys Asn Ser Gly Asn Glu Thr Leu Cys Arg Glu 95 100 105 Val Lys Asn Ser Gly Tyr Thr Val Asp Gly Gly Met Ala Glu Ala 110 115 120 Cys Ile Val Val Ala Asp Tyr Ala Val Lys Val Pro Asp Gly Leu 125 130 135 Asp Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ile Thr Cys Ala Gly Val Thr Thr 140 145 150 Tyr Lys Ser Ser Asn Ile Arg Pro Gly Gln Trp Leu Ala Ile Tyr 155 160 165 Gly Leu Gly Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu Gln Tyr Ala Lys Asn 170 175 180 Phe Phe Asn Ala Gly Val Ile Ala Ile Asp Val Asn Asp Asp Gln 185 190 195 Leu Ala Phe Ala Arg Glu Met Gly Ala Asp Leu Val Val Asn Pro 200 205 210 Arg Asp Glu Asp Ala Ala Lys Val Ile Gln Ala Lys Thr Gly Gly 215 220 225 Ala His Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ala Lys Ser Ala Phe Asn 230 235 240 Ser Ala Val Asp Ala Leu Arg Ala Gly Gly Arg Phe Val Ala Val 245 250 255 Gly Leu Pro Pro Glu Ala Met Ser Leu Asp Ile Pro Arg Leu Val 260 265 270 Leu Asp Gly Ile Glu Val Val Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln 275 280 285 Asp Leu His Glu Ala Phe Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Val Val 290 295 300 Pro Lys Val Thr Leu Arg Pro Ile Glu Asp Ile Asn Asp Ile Phe 305 310 315 Glu Glu Met Gln Ala Gly Lys Ile Arg Gly Arg Met Val Met His 320 325 330 Phe Ala Asp 333SEQ ID NO: 2 Sequence length: 333 Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: protein Sequence: Met Lys Ala Ala Val Val Ala Lys Gly Arg Arg Val Asp Val Val 5 10 15 Glu Lys Thr Leu Arg Pro Leu Ala His Gly Glu Ala Leu Leu Lys 20 25 30 Met Gln Cys Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Val Lys Asn 35 40 45 Gly Asp Phe Gly Asp Lys Thr Gly Val Ile Leu Gly His Glu Gly 50 55 60 Ile Gly Val Val Val Glu Val Gly Pro Gly Val Thr Ser Leu Lys 65 70 75 Pro Gly Asp Arg Ala Ser Val Ala Trp Phe Phe Gln Gly Cys Gly 80 85 90 His Cys Glu Tyr Cys Asn Ser Gly Asn Glu Thr Leu Cys Arg Glu 95 100 105 Val Lys Asn Ser Gly Tyr Thr Val Asp Gly Gly Met Ala Glu Ala 110 115 120 Cys Ile Val Val Ala Asp Tyr Ala Val Lys Val Pro Asp Gly Leu 125 130 135 Asp Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ile Thr Cys Ala Gly Val Thr Thr 140 145 150 Tyr Lys Ser Ser Asn Ile Arg Pro Gly Gln Trp Leu Ala Ile Tyr 155 160 165 Gly Leu Gly Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu Gln Tyr Ala Lys Asn 170 175 180 Phe Phe Asn Ala Gly Val Ile Ala Ile Asp Val Asn Asp Asp Gln 185 190 195 Leu Ala Phe Ala Arg Glu Met Gly Ala Asp Leu Val Val Asn Pro 200 205 210 Arg Asp Glu Asp Ala Ala Lys Val Ile Gln Ala Lys Thr Gly Gly 215 220 225 Ala His Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ala Lys Ser Ala Phe Asn 230 235 240 Ser Ala Val Asp Ala Leu Arg Ala Gly Gly Arg Phe Val Ala Val 245 250 255 Gly Leu Pro Pro Glu Ala Met Ser Leu Asp Ile Pro Arg Leu Val 260 265 270 Leu Asp Gly Ile Glu Val Val Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln 275 280 285 Asp Leu His Glu Ala Phe Glu Phe Ala Ala Ala Gln Gly Lys Val Val 290 295 300 Pro Lys Val Thr Leu Arg Pro Ile Glu Asp Ile Asn Asp Ile Phe 305 310 315 Glu Glu Met Gln Ala Gly Lys Ile Arg Gly Arg Met Val Met His 320 325 330 Phe Ala Asp 333

【００３８】配列番号３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： GTT GAT GTC TTC GAT CGG GCG CAG 24SEQ ID NO: 3 Sequence length: 24 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Sequence characteristics: Synthetic DNA primer Sequence: GTT GAT GTC TTC GAT CGG GCG CAG 24

【００３９】配列番号４ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： GCC GCG TIG ACG TIG TIG AGA AGA C 25SEQ ID NO: 4 Sequence length: 25 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Sequence characteristics: Synthetic DNA primer Sequence: GCC GCG TIG ACG TIG TIG AGA AGA C 25

【００４０】配列番号５ 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： TTG CCT TGG GCG GCA AAC TCG AAG GCT T 28SEQ ID NO: 5 Sequence length: 28 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Sequence characteristics: Synthetic DNA primer Sequence: TTG CCT TGG GCG GCA AAC TCG AAG GCT T 28

【００４１】配列番号６ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列の特徴：合成ＤＮＡプライマー 配列： TGG CGC ACG GTG AAG CGT TGC TGA A 25SEQ ID NO: 6 Sequence length: 25 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Sequence characteristics: Synthetic DNA primer Sequence: TGG CGC ACG GTG AAG CGT TGC TGA A 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） ──────────────────────────────────────────────────の Continued on front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12N 9/04 C12R 1:19)

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 以下の(a)または(b)のアルコール脱水素
酵素。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質1. An alcohol dehydrogenase of the following (a) or (b): (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence (a) in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an alcohol dehydrogenase activity protein 【請求項２】 以下の(a)または(b)のタンパク質をコー
ドするアルコール脱水素酵素遺伝子。 (a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b)アミノ酸配列(a)において１もしくは複数のアミノ酸
が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつアルコール脱水素酵素活性を有するタンパク質2. An alcohol dehydrogenase gene encoding the following protein (a) or (b): (a) a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (b) an amino acid sequence consisting of an amino acid sequence (a) in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and having an alcohol dehydrogenase activity protein 【請求項３】 請求項２記載のアルコール脱水素酵素遺
伝子をベクターＤＮＡに挿入したことを特徴とする新規
な組み換え体ＤＮＡ。3. A novel recombinant DNA obtained by inserting the alcohol dehydrogenase gene according to claim 2 into a vector DNA. 【請求項４】 請求項３記載の組み換え体ＤＮＡを含む
形質転換体または形質導入体。4. A transformant or transductant containing the recombinant DNA according to claim 3. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体または形質導
入体を培地に培養し、培養物からアルコール脱水素酵素
を採取することを特徴とするアルコール脱水素酵素の製
造法。5. A method for producing an alcohol dehydrogenase, comprising culturing the transformant or the transductant according to claim 4 in a medium, and collecting the alcohol dehydrogenase from the culture.