JPH1183859A - Detecting method for membrane-bound specific protein and adjusting kit for decoloring liquid - Google Patents
Detecting method for membrane-bound specific protein and adjusting kit for decoloring liquidInfo
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- JPH1183859A JPH1183859A JP9237493A JP23749397A JPH1183859A JP H1183859 A JPH1183859 A JP H1183859A JP 9237493 A JP9237493 A JP 9237493A JP 23749397 A JP23749397 A JP 23749397A JP H1183859 A JPH1183859 A JP H1183859A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、膜に結合した特定
タンパク質の検出方法および当該検出方法の実施に用い
る脱色液の調製キットに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for detecting a specific protein bound to a membrane and a kit for preparing a decolorizing solution used for carrying out the detection method.
【０００２】[0002]
【従来の技術】精製したタンパク質に含まれている共雑
タンパク質の存在、すなわち精製目的以外のタンパク質
の存在は、ポリアクリルアミド電気泳動法でタンパク質
を分離泳動後、タンパク質を泳動したポリアクリルアミ
ドゲルをアシッドブルー83として使用されている“クマ
シーブリリアントブルーR-250 （C.I.No.42,660 ）”や
アシッドブラック１として使用されている“アミドブラ
ック10Ｂ（C.I.No.20,470 ）”（尚、ここでC.I.はカラ
ーインデックスを意味している。）等の色素溶液に浸
し、該ゲル中で電気泳動分離された精製目的タンパク質
とそれ以外のタンパク質の電気泳動像の総てを色素染色
し前記タンパク質の色素染色像を残して他の部分の色素
は脱色することにより、一応観察することはできる。2. Description of the Related Art The presence of contaminating proteins contained in purified proteins, that is, the presence of proteins other than those intended for purification, is determined by polyacrylamide gel electrophoresis, separating the proteins and electrophoresing the polyacrylamide gel on which the proteins were migrated. "Coomassie Brilliant Blue R-250 (CINo.42,660)" used as Blue 83 and "Amid Black 10B (CINo.20,470)" used as Acid Black 1 (where CI means color index ), And all the electrophoretic images of the purified target protein and the other proteins electrophoretically separated in the gel are dye-stained, and the dye-stained image of the protein is retained. The pigment in the portion can be observed for the time being by decolorization.
【０００３】該泳動ゲルの色素染色法は、ポリアクリル
アミドゲルに含まれるタンパク質の総ての電気泳動像を
確認する方法としては優れた方法であるが、多種のタン
パク質が共存しているタンパク質溶液を電気泳動した場
合、精製目的タンパク質と他のタンパク質とを区別し
て、特定タンパク質を検出することは困難である。[0003] The dye staining method of the electrophoresis gel is an excellent method for confirming all electrophoresis images of proteins contained in a polyacrylamide gel, but a protein solution in which various proteins coexist is used. When electrophoresis is performed, it is difficult to distinguish a target protein from other proteins and detect a specific protein.
【０００４】通常、精製目的タンパク質のみの泳動位置
を特定する方法としては、ウェスタンブロッティング法
が用いられている。ウェスタンブロッティング法の一例
は、タンパク質をポリアクリルアミド電気泳動した後、
泳動された総てのタンパク質を電気的にポリアクリルア
ミドゲルからポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）や
ニトロセルロース等の膜へ転写し、タンパク質を膜に疎
水結合等で固定する。つまり、ポリアクリルアミドゲル
に電気泳動したタンパク質は、ｐＨを調製すると電荷を
帯びるので、これと前記ＰＶＤＦ膜などの膜を重ねてお
いて、ＰＶＤＦ膜側にタンパク質と反対の電荷をチャー
ジすることにより、タンパク質をＰＶＤＦ膜側に転写し
てＰＶＤＦ膜に疎水結合等で固定する。ただ、この状態
では全く無色であるので肉眼的には何も観察する事が出
来ないので、さらに該膜を目的タンパク質とのみ反応す
るペルオキシダーゼ標識抗体の水溶液に浸し、精製目的
タンパク質と該標識抗体を抗原抗体反応で結合させる。
続いて、該膜を水洗して過剰の標識抗体を除去後、抗体
を介して目的タンパク質に結合したペルオキシダーゼを
基質と反応させて発色させる。膜に結合したペルオキシ
ダーゼの発色は、無色の水溶性基質が酵素反応の結果と
して水不溶性色素に変化する基質類、例えばペルオキシ
ダーゼの基質である4-クロロ-1- ナフトール等、を用い
て行う。本技術は、タンパク質の同定に不可欠な技術で
あり、日経バイオテクノロジー辞典（日経マグロウヒル
社、第494 頁）等に技術内容が紹介されている。[0004] In general, Western blotting is used as a method for specifying the migration position of only the protein of interest for purification. One example of the Western blotting method is to perform polyacrylamide gel electrophoresis on a protein,
All the electrophoresed proteins are electrically transferred from the polyacrylamide gel to a membrane such as polyvinylidene difluoride (PVDF) or nitrocellulose, and the proteins are fixed to the membrane by hydrophobic bonding or the like. In other words, the protein electrophoresed on the polyacrylamide gel becomes charged when the pH is adjusted. By stacking this and a membrane such as the PVDF membrane and charging the PVDF membrane with an opposite charge to the protein, The protein is transferred to the PVDF membrane side and fixed to the PVDF membrane by hydrophobic bonding or the like. However, in this state, since it is completely colorless, nothing can be observed with the naked eye.Therefore, the membrane is further immersed in an aqueous solution of a peroxidase-labeled antibody that reacts only with the target protein, and the purified target protein and the labeled antibody are separated. It is bound by an antigen-antibody reaction.
Subsequently, the membrane is washed with water to remove excess labeled antibody, and then peroxidase bound to the target protein via the antibody is reacted with a substrate to develop color. The color development of the peroxidase bound to the membrane is performed using a substrate that converts a colorless water-soluble substrate into a water-insoluble dye as a result of the enzymatic reaction, such as 4-chloro-1-naphthol, which is a substrate of peroxidase. This technique is indispensable for protein identification, and its technical content is introduced in the Nikkei Biotechnology Dictionary (Nikkei McGraw-Hill, page 494) and the like.
【０００５】以上のように、複数のタンパク質の混合液
をポリアクリルアミド電気泳動して目的タンパク質の泳
動位置を特定するためには、該タンパク質混合液に含有
されている総てのタンパク質の泳動像を色素染色して確
認し、さらに別途にウェスタンブロッティング法による
特定タンパク質の検出を行う必要がある。しかし、これ
らの色素染色法とウェスタンブロッティング法を別途に
行う方法では、総てのタンパク質の泳動像を確認するた
めの電気泳動と、ウェスタンブロッティング法に使用す
るための電気泳動との少なくとも２度の電気泳動を行う
ため、それぞれが全く同じ位置に再現出来るとは限らな
い事と、電気泳動ゲルは非常に柔らかくウェスタンブロ
ッティング法でＰＶＤＦ膜と重ね合わせて転写するとき
に必ずしもしわや部分的な伸びなどがなく均一に重ね合
わせられるとは限らず、従って転写されたタンパク質の
位置が電気泳動ゲル上に本来存在した位置とずれて転写
されることがあり、目的タンパク質の泳動像の位置が両
法で一致せず、目的タンパク質の泳動位置を特定できな
い事がある。As described above, in order to specify the migration position of a target protein by polyacrylamide gel electrophoresis of a mixture of a plurality of proteins, the migration images of all proteins contained in the protein mixture must be determined. It is necessary to confirm by dye staining, and to separately detect a specific protein by Western blotting. However, in the method of separately performing the dye staining method and the Western blotting method, at least two times of electrophoresis for confirming electrophoretic images of all proteins and electrophoresis for use in the Western blotting method are performed. Because electrophoresis is performed, it is not always possible to reproduce each of them at exactly the same position, and the electrophoresis gel is very soft and not necessarily wrinkled or partially stretched when transferred by overlapping with PVDF membrane by Western blotting. Therefore, the position of the transferred protein may be shifted from the position originally existing on the electrophoresis gel, and the position of the electrophoretic image of the target protein may be shifted by both methods. In some cases, the migration position of the target protein cannot be specified.
【０００６】この問題を解決する試みとして、電気泳動
ゲルを色素染色した後、該泳動ゲルに含まれる色素染色
済みのタンパク質をウェスタンブロッティング法で膜に
転写し、該膜を目的タンパク質に結合する酵素標識抗体
と抗原抗体反応させて、目的タンパク質に結合した酵素
を発色検出する２重染色方法が報告されている（エレク
トロフォレシス誌、第5 巻第35頁、1984年。アナリティ
カルバイオケミストリー誌、第234 巻第102 頁、1996
年）。また別の方法は、泳動ゲルに含まれる総てのタン
パク質をウェスタンブロッティング法で膜に転写した
後、該膜をアシッドブラック１である“アミドブラック
10Ｂ（C.I.No.20,470 ）”等の色素液に浸し、膜に結合
した総てのタンパク質を染色後、目的タンパク質と結合
する酵素標識抗体を抗原抗体反応させて、目的タンパク
質に結合した酵素を発色検出する２重染色方法が報告さ
れている（エレクトロフォレシス誌、第8 巻第350 頁、
1987年）。As an attempt to solve this problem, after dyeing an electrophoretic gel with a dye, the dye-stained protein contained in the electrophoretic gel is transferred to a membrane by Western blotting, and an enzyme that binds the membrane to a target protein is used. A double staining method has been reported in which a labeled antibody reacts with an antigen-antibody to detect the color of the enzyme bound to the target protein (Electrophoresis, Vol. 5, p. 35, 1984. Analytical Biochemistry, ed. Volume 234, page 102, 1996
Year). Another method is to transfer all the proteins contained in the electrophoresis gel to a membrane by Western blotting, and then to apply the membrane to Acid Black 1, "Amid Black".
10B (CI No. 20,470) ”etc., and dye all the proteins bound to the membrane, and then react the antigen-labeled antibody that binds to the target protein with the antigen-antibody to detect the color of the enzyme bound to the target protein. A double staining method has been reported (Electrophoresis, Vol. 8, p. 350,
1987).
【０００７】これらの方法は、総てのタンパク質を色素
染色したのと同一の膜に対して酵素標識抗体を反応させ
て酵素を発色検出するため、泳動された総てのタンパク
質と目的タンパク質の泳動位置の関係を正確に把握する
ことができる。しかし、これらの方法が２重染色法であ
るために、目的タンパク質に近接する別タンパク質の色
素染色像が有る場合は、目的タンパク質の酵素発色像が
干渉されたり、目的タンパク質の色素染色像と酵素発色
像とが重なったりして、目的タンパク質の泳動位置が容
易に確認出来ないことが生じる。In these methods, the enzyme-labeled antibody is reacted with the same membrane on which all proteins have been dye-stained to detect the color of the enzyme. It is possible to accurately grasp the positional relationship. However, since these methods are a double staining method, when there is a dye-stained image of another protein close to the target protein, the enzyme-colored image of the target protein is interfered, or the dye-stained image of the target protein and the enzyme are stained. The electrophoresis position of the target protein may not be easily confirmed due to overlap with the color image.
【０００８】また別の方法は、電気泳動したタンパク質
を色素染色せずにウェスタンブロッティング法により膜
に転写した後、抗原抗体反応を行う前に該膜を20(V/V)
％メタノール水溶液に浸してタンパク質泳動像の部分を
透明化し、膜を光源にかざして泳動像を確認する方法
（アプライド アンド セオレティカル エレクトロフ
ォレシス誌、第1 巻第59頁、1988年）が報告されてい
る。この方法は、非常に簡易な方法であるが、微量のタ
ンパク質の泳動像を光源にかざして観ることは困難であ
る。Another method is to transfer the electrophoresed protein to a membrane by Western blotting without dye staining, and then to subject the membrane to 20 (V / V) before performing an antigen-antibody reaction.
A method has been reported in which a protein electrophoresis image is clarified by immersing it in an aqueous methanol solution, and the electrophoresis image is confirmed by holding the membrane over a light source (Applied and Theoretical Electrophoresis, Vol. 1, p. 59, 1988). . This method is a very simple method, but it is difficult to view the electrophoretic image of a trace amount of protein by holding it over a light source.
【０００９】[0009]
【発明が解決しようとする課題】上記のように、電気泳
動で分離した総てのタンパク質の泳動位置と目的タンパ
ク質の泳動位置の関係を正確に、簡易な手段で確認する
方法の開発が望まれ、多くの試みが行われて来たが、未
だに目的を達成するのに適切な方法は提案されていな
い。As described above, it is desired to develop a method for accurately confirming the relationship between the migration positions of all proteins separated by electrophoresis and the migration position of a target protein by simple means. Many attempts have been made, but no suitable method has yet been proposed to achieve the goal.
【００１０】本発明は、電気泳動で分離した総てのタン
パク質の泳動位置と目的タンパク質の泳動位置の関係を
正確に、簡易な手段で確認する方法、並びにこの方法の
実施に用いる脱色液の調製キットを提供する事を目的と
するものである。The present invention provides a method for accurately and simply confirming the relationship between the migration position of all proteins separated by electrophoresis and the migration position of a target protein by a simple means, and the preparation of a decolorizing solution used for carrying out this method. It is intended to provide a kit.
【００１１】本発明者は、タンパク質の色素染色像と酵
素発色像とが２重染色で重ならないように、同一膜上で
総てのタンパク質を色素染色して観察した後、該膜のタ
ンパク質の色素染色像を完全に脱色し、その後に該膜上
の目的タンパク質に特異的に反応する標識抗体を反応さ
せて、目的タンパク質に抗体を介して結合した標識物を
検出することにより目的タンパク質の泳動位置を確認す
る方法を発明した。The present inventors have observed all proteins by dye staining on the same membrane so that the dye-stained image of the protein and the enzyme-colored image do not overlap by double staining, and then observe the protein of the membrane. The dye-stained image is completely decolorized and then reacted with a labeled antibody that specifically reacts with the target protein on the membrane, and the labeled substance bound to the target protein via the antibody is detected, thereby migrating the target protein. We have invented a method to confirm the position.
【００１２】本発明は、ウェスタンブロッティング法で
電気泳動ゲルから転写したタンパク質が結合した膜をア
シッドブルー83である“クマシーブリリアントブルー
R-250 （C.I.No.42,660 ）”等の色素溶液に浸して色素
染色し、該膜に結合したタンパク質の色素染色像のみを
残してそれ以外の膜自体に結合した色素のみを脱色する
方法と、該膜に結合したタンパク質の抗原性を損なうこ
と無しに、該タンパク質の色素染色像を完全に脱色する
方法とを組み合わせて上記目的を達成したものである。According to the present invention, a membrane to which a protein transcribed from an electrophoresis gel by Western blotting has been bound is called “Coomassie Brilliant Blue” which is Acid Blue 83.
R-250 (CI No. 42,660) "or the like, and dye-stained by dyeing, leaving only the dye-stained image of the protein bound to the membrane and decoloring only the dye bound to the other membrane itself; The above object has been achieved by combining with a method of completely decolorizing a dye-stained image of the protein without impairing the antigenicity of the protein bound to the membrane.
【００１３】[0013]
【課題を解決するための手段】本発明者は、ポリアクリ
ルアミド電気泳動ゲルのタンパク質をウェスタンブロッ
ティング法で膜に転写し、総てのタンパク質泳動像を色
素染色して観察後、さらに目的タンパク質の泳動位置を
酵素標識抗体の抗原抗体反応を利用して検出する方法を
鋭意研究した。その際に、アシッドブルーである“クマ
シーブリリアントブルー”色素液に浸して色素染色した
膜をアルコールと酢酸の混合液で脱色することにより、
膜に結合したタンパク質の色素染色像だけを残して脱色
することが可能であり、さらに別組成のアルコールと酢
酸の混合液に該膜を浸すことにより、タンパク質の抗原
性を損なうこと無しに色素染色像が完全に脱色できるこ
とを見出した。そしてこのタンパク質の色素染色像を完
全に脱色した膜は、通常の酵素標識抗体の抗原抗体反応
を行うことができるものであることも見出だし、本発明
に到達した。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention transferred proteins on a polyacrylamide electrophoresis gel onto a membrane by Western blotting, dyed all protein electrophoresis images, observed them, and then migrated the target protein. We studied the method of detecting the position using the antigen-antibody reaction of the enzyme-labeled antibody. At that time, the membrane stained by immersing it in Acid Blue "Coomassie Brilliant Blue" dye solution is decolorized with a mixture of alcohol and acetic acid,
It is possible to decolorize only the dye-stained image of the protein bound to the membrane, and by immersing the membrane in a mixture of alcohol and acetic acid of another composition, the dye is stained without impairing the antigenicity of the protein. It has been found that the image can be completely decolorized. The inventors have also found that a membrane in which the dye-stained image of the protein is completely decolorized can perform an antigen-antibody reaction of a normal enzyme-labeled antibody, and have reached the present invention.
【００１４】即ち、本発明は次に示す膜結合した特定タ
ンパク質の検出方法及び当該検出に使用する脱色液の調
製キットを提供するものである。 （１）複数種のタンパク質の各々を膜の異なった部分に
結合させ、該膜をアシッドブルー83又はアシッドブルー
90色素溶液に浸し、さらに該膜を該膜に結合した総ての
タンパク質の色素染色像は脱色しないがその他の部分の
該膜自体に結合した色素を脱色し得る脱色液１に浸すこ
とにより、該膜に結合した総てのタンパク質の色素染色
像を残して、該膜自体に結合した色素を脱色することに
より該総てのタンパク質の色素染色像の位置関係を確認
した後、該膜を該タンパク質の色素染色像の総てを脱色
し得る脱色液２に浸して該タンパク質の色素染色像の総
てを脱色し、次いで該膜に結合している特定タンパク質
に対して特異的に反応する酵素標識抗体の溶液に浸した
後、前記特定タンパク質と未反応の該標識抗体を洗浄除
去し、前記特定タンパク質と結合した該標識抗体の酵素
を検出することを特徴とする膜結合した特定タンパク質
の検出方法。That is, the present invention provides the following method for detecting a membrane-bound specific protein and a kit for preparing a decolorizing solution used for the detection. (1) Each of a plurality of proteins is bound to a different part of the membrane, and the membrane is acid blue 83 or acid blue.
By immersing the membrane in a decolorizing solution 1 capable of decolorizing the dye-stained images of all the proteins bound to the membrane without decoloring the dye bound to the membrane itself, After leaving the dye-stained images of all the proteins bound to the membrane and decoloring the dyes bound to the membrane itself to confirm the positional relationship of the dye-stained images of all the proteins, the membrane was removed. Enzyme that specifically reacts with a specific protein bound to the membrane by immersing the entire dye-stained image of the protein in a decolorizing solution 2 capable of decoloring to decolor all of the dye-stained image of the protein After immersion in a solution of a labeled antibody, the labeled antibody unreacted with the specific protein is washed away, and the enzyme of the labeled antibody bound to the specific protein is detected, thereby detecting a membrane-bound specific protein. Method.
【００１５】（２） 脱色液１が （イ）メタノール又はエタノールを10〜90(V/V) ％濃度
で含む酢酸溶液、（ロ）10〜50(V/V) ％濃度のメタノー
ル又はエタノールと10〜50(V/V) ％濃度の酢酸との組み
合わせによりアルコールと酢酸の合計濃度を20〜60(V/
V) ％濃度とした水溶液、（ハ）4 〜13(V/V) ％濃度の
メタノール又はエタノールと6 〜20(V/V) ％濃度の１−
ブタノール又は１−ペンタノールとの組み合わせにより
アルコールを10〜33(V/V) ％濃度とし、さらに10〜21(V
/V) ％濃度の酢酸との組み合わせで最終的なアルコール
と酢酸の合計濃度を26〜46(V/V) ％濃度とした水溶液、
の何れかから選ばれた１種である前記（１）項に記載の
膜結合した特定タンパク質の検出方法。(2) The decolorizing solution 1 contains (a) an acetic acid solution containing methanol or ethanol at a concentration of 10 to 90 (V / V)%, and (b) methanol or ethanol at a concentration of 10 to 50 (V / V)%. By combining with 10 to 50 (V / V)% acetic acid, the total concentration of alcohol and acetic acid is increased to 20 to 60 (V / V).
(C) 4-13 (V / V)% methanol or ethanol and 6-20 (V / V)% 1-
The alcohol is brought to a concentration of 10 to 33 (V / V)% by combination with butanol or 1-pentanol,
/ V) Aqueous solution with a final concentration of 26-46 (V / V)% in combination with acetic acid at a concentration of 26%
The method for detecting a membrane-bound specific protein according to the above (1), which is one kind selected from any of the above.
【００１６】（３）脱色液２が10〜30(V/V) ％濃度のメ
タノール又はエタノールと30〜40(V/V) ％濃度の１−ブ
タノール又は１−ペンタノールとの組み合わせによりア
ルコールを40〜60(V/V) ％濃度とし、さらに10〜30(V/
V) ％濃度の酢酸との組み合わせにより最終的なアルコ
ールと酢酸の合計濃度を50〜90(V/V) ％濃度とした水溶
液である前記（１）項又は（２）項に記載の膜結合した
特定タンパク質の検出方法。(3) The decolorizing solution 2 is an alcohol prepared by combining methanol or ethanol at a concentration of 10 to 30 (V / V)% with 1-butanol or 1-pentanol at a concentration of 30 to 40 (V / V)%. 40 ~ 60 (V / V)% concentration, and 10 ~ 30 (V / V)
V) The membrane binding as described in the above item (1) or (2), which is an aqueous solution in which the final concentration of alcohol and acetic acid is adjusted to 50 to 90 (V / V)% by combining with acetic acid having a concentration of%. Method for detecting specific proteins.
【００１７】（４）20〜60(V/V) ％濃度の酢酸を含む水
溶液（ａ液）、および20〜60(V/V)％濃度のメタノール
又はエタノールと60〜80(V/V) ％濃度の１−ブタノール
又は１−ペンタノールとの組み合わせによりアルコール
濃度を80〜100(V/V)％濃度とした水溶液（ｂ液）の２溶
液から成ることを特徴とする前記（１）項に記載の脱色
液１および脱色液２を調製するための脱色液調製キッ
ト。(4) An aqueous solution (solution a) containing acetic acid at a concentration of 20 to 60 (V / V)%, and methanol or ethanol at a concentration of 20 to 60 (V / V)% and 60 to 80 (V / V). (1) characterized in that it comprises two solutions of an aqueous solution (solution b) having an alcohol concentration of 80 to 100 (V / V)% by a combination with 1-butanol or 1-pentanol having a concentration of 1%. A decolorizing solution preparation kit for preparing the decolorizing solution 1 and the decolorizing solution 2 described in 1.
【００１８】[0018]
【発明の実施の形態】本発明の特定タンパク質の検出方
法によれば、膜上の総タンパク質の泳動像を色素染色し
て観察する際に、鉛筆等で泳動位置に印を付けておけ
ば、色素染色を完全に脱色しても総タンパク質の泳動位
置の目安が付くので、標識抗体を利用して該膜上の目的
タンパク質のみの泳動像を検出する時に、総タンパク質
の泳動像における目的タンパク質の泳動位置を正確に特
定することができる。また、酵素標識抗体を反応させる
前に総タンパク質の色素染色像を完全に脱色するので、
目的タンパク質が数ng程度の微量であっても他のタンパ
ク質の色素染色像に妨害されずに、目的タンパク質に結
合した酵素標識抗体の酵素発色像を観察することが容易
である。According to the method for detecting a specific protein of the present invention, when the electrophoretic image of the total protein on the membrane is observed by dye staining, if the electrophoretic position is marked with a pencil or the like, Even if the dye staining is completely decolorized, the migration position of the total protein can be estimated, so when detecting the migration image of only the target protein on the membrane using the labeled antibody, the target protein in the migration image of the total protein is detected. The migration position can be specified accurately. In addition, since the dye-stained image of the total protein is completely decolored before the enzyme-labeled antibody is reacted,
Even if the amount of the target protein is as small as about several ng, it is easy to observe an enzyme-colored image of the enzyme-labeled antibody bound to the target protein without being disturbed by a dye-stained image of another protein.
【００１９】また、本発明の脱色液調製キットは、20〜
60(V/V) ％濃度の酢酸を含む水溶液（ａ液）、および20
〜60(V/V) ％濃度のメタノール又はエタノールと60〜80
(V/V) ％濃度の１−ブタノール又は１−ペンタノールと
の組み合わせによりアルコール濃度を80〜100(V/V)％濃
度とした水溶液（ｂ液）の２溶液から成り、ａ液とｂ液
を混合したり、さらに水で希釈することにより、本発明
の膜結合タンパク質の色素染色像の脱色に使用する脱色
液１および脱色液２を簡単に調製することができるの
で、アシッドブルー83である“クマシーブリリアントブ
ルー R-250 （C.I.No.42,660 ）”又はアシッドブルー
90である“クマシーブリリアントブルーG-250 （C.I.N
o.42,655 ）”色素溶液に浸して色素染色した膜結合タ
ンパク質の色素染色像を確認したり、該染色像を脱色を
する操作を容易に行うことができる。また、該キット
は、酢酸とアルコール成分とを別溶液にしているので、
該キットを室温で長期保管しても酢酸エステル発生等が
無く、脱色液組成の変化を心配する必要が無い。The kit for preparing a decolorizing solution of the present invention comprises
Aqueous solution containing 60% (V / V)% acetic acid (solution a), and 20%
~ 60 (V / V)% methanol or ethanol and 60 ~ 80
(V / V)% solution consisting of two solutions of an aqueous solution (solution b) having a concentration of 80 to 100 (V / V)% by combining with 1-butanol or 1-pentanol having a concentration of 1%. By mixing the solution and further diluting with water, the decolorizing solution 1 and the decolorizing solution 2 used for decoloring the dye-stained image of the membrane-bound protein of the present invention can be easily prepared. Certain "Coomassie Brilliant Blue R-250 (CINo.42,660)" or Acid Blue
90 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CIN
o.42,655) "It is possible to easily confirm the dye-stained image of the membrane-bound protein stained with the dye by immersion in the dye solution, and to easily perform the operation of decolorizing the stained image. Because the components are in a separate solution,
Even if the kit is stored at room temperature for a long period of time, there is no generation of acetate and the like, and there is no need to worry about a change in the composition of the decolorizing solution.
【００２０】本発明の脱色液調製キットは、例えば、40
(V/V) ％濃度の酢酸を含む水溶液（ａ液）と、40(V/V)
％濃度のエタノール又はメタノールと60(V/V) ％濃度の
１−ブタノール又は１−ペンタノールとの混合液（ｂ
液）との２溶液から成り、本発明の脱色液１は、該キッ
トのａ液：ｂ液：水を容量比で2:1:3 の割合で混合する
ことにより得られ、脱色液２は、該キットのａ液：ｂ液
を容量比で1:1 の割合で混合することにより得られる。The decolorizing solution preparation kit of the present invention comprises, for example, 40
(V / V) Aqueous solution (solution a) containing acetic acid at a concentration of 40% (V / V)
Liquid mixture of ethanol or methanol at a concentration of 60% (V / V) and 1-butanol or 1-pentanol at a concentration of 60% (b / b)
Solution) of the present invention is obtained by mixing solution a: solution b: water of the kit at a volume ratio of 2: 1: 3. The mixture can be obtained by mixing solution a: solution b of the kit at a volume ratio of 1: 1.
【００２１】本発明の特定タンパク質の検出方法に置い
て用いるタンパク質を結合させる膜としては、ポリビニ
リデンジフロリド（ＰＶＤＦ）やニトロセルロース等の
ウェスタンブロッティング法で使用されている膜を用い
ることができる。これらの膜は、通常、タンパク質を疎
水結合等で固定し得る膜である。As a membrane for binding a protein used in the method for detecting a specific protein of the present invention, a membrane used in Western blotting such as polyvinylidene difluoride (PVDF) or nitrocellulose can be used. . These membranes are usually membranes that can immobilize proteins by hydrophobic bonds or the like.
【００２２】また、本発明に於いて用いられる色素とし
てはアシッドブルー83である“クマシーブリリアントブ
ルー R-250 （C.I.No.42,660 ）”又はアシッドブルー
90である“クマシーブリリアントブルー G-250 （C.I.
No.42,655 ）”が用いられるこれらの色素溶液として
は、特に限定するものではないが、前記色素の0.1 〜0.
5(W/V)％を含む1〜50(V/V)％メタノールまたはエタノー
ル、 1〜20(V/V) ％酢酸水溶液が通常用いられる。The dye used in the present invention is Acid Blue 83, "Coomassie Brilliant Blue R-250 (CI No. 42,660)" or Acid Blue.
90 Coomassie Brilliant Blue G-250 (CI
No. 42,655) "is not particularly limited, and the dye solution may be 0.1 to 0.
1 to 50 (V / V)% methanol or ethanol containing 5 (W / V)%, and 1 to 20 (V / V)% acetic acid aqueous solution are usually used.
【００２３】本発明の酵素標識抗体の標識酵素は、ペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の通常のウェ
スタンブロッティング法で使用されている酵素を用いる
ことができる。また、酵素標識抗体と特定タンパク質の
反応で結合した酵素の検出は、無色の水溶性基質が酵素
反応の結果として水不溶性色素に変化する基質類、例え
ばペルオキシダーゼの基質である4-クロロ-1- ナフトー
ル等、アルカリホスファターゼの基質は５−ブロモ−４
−クロロ−１−インドリルリン酸とニトロブルーテトラ
ゾリウムの組合せ等、として通常のウェスタンブロッテ
ィング法で使用されている酵素基質を用いて行うことが
できる。本技術に関しては、日経バイオテクノロジー辞
典（日経マグロウヒル社、第494 頁）等に技術内容が紹
介されている。As the labeling enzyme of the enzyme-labeled antibody of the present invention, an enzyme used in a usual Western blotting method such as peroxidase and alkaline phosphatase can be used. In addition, the detection of the enzyme bound by the reaction between the enzyme-labeled antibody and the specific protein is performed by converting a colorless water-soluble substrate into a water-insoluble dye as a result of the enzymatic reaction, for example, 4-chloro-1-, which is a substrate of peroxidase. The substrate of alkaline phosphatase such as naphthol is 5-bromo-4
-Chloro-1-indolyl phosphate and nitroblue tetrazolium, etc., can be carried out using an enzyme substrate used in a usual Western blotting method. The technical contents of this technology are introduced in the Nikkei Biotechnology Dictionary (Nikkei McGraw-Hill, page 494) and the like.
【００２４】以下、本発明について実施例をあげて詳細
に述べるが、下記に挙げる物質および物質群に限定され
るものではない。なお、本発明に於いて(V/V) ％とは、
全成分100ml 中に含まれているある特定成分の体積(ml)
を示し、また、(W/V) ％は、全成分100ml 中に含まれて
いるある特定成分の重量(g )を示すものである。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following substances and substance groups. In the present invention, (V / V)% means
Volume of a specific component contained in 100 ml of all components (ml)
And (W / V)% indicates the weight (g) of a specific component contained in 100 ml of all components.
【００２５】[0025]
実施例１ タンパク質の色素染色像だけを残して脱色する脱色液組
成 10μg/mlヤギγグロブリン水溶液をドットブロッターに
固定したポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）膜に1
0、50及び100 μl 添加し、ヤギγグロブリンの100 、5
00 及び1000ngを膜に物理吸着させた。そして、該膜を
該ブロッターから外し、0.25(W/V) ％“クマシーブリリ
アントブルーR-250 ”を含む10(V/V) ％エタノール、10
(V/V) ％酢酸水溶液に浸して１分間振とうした。次に、
該膜に結合したタンパク質の色素染色像を残し、膜自体
に結合したその他の部分の色素を脱色するための脱色液
組成を検討する目的で、メタノール、酢酸、水の混合比
を変えた表１に記載の各種混合液を調製し、色素染色し
た該膜を３分間浸して膜自体の脱色程度を観察した。こ
の場合、“クマシーブリリアントブルー R-250 ”の色
素染色によるタンパク質検出感度が通常20〜100ng 程度
であることから、100ng のヤギγグロブリンの色素染色
像が明確に目視で確認できることを用途適合の判断基準
とした。Example 1 Composition of decolorizing solution for decoloring leaving only the dye-stained image of protein 1 μg / ml goat gamma globulin aqueous solution was applied to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane fixed on a dot blotter.
Add 0, 50 and 100 μl and add 100, 5
00 and 1000 ng were physically adsorbed on the membrane. Then, the membrane was removed from the blotter, and 10 (V / V)% ethanol containing 0.25 (W / V)% "Coomassie brilliant blue R-250" was added.
It was immersed in a (V / V)% acetic acid aqueous solution and shaken for 1 minute. next,
Table 1 was prepared by changing the mixing ratio of methanol, acetic acid, and water in order to leave a dye-stained image of the protein bound to the membrane and to examine the composition of a decolorizing solution for decolorizing the other part of the dye bound to the membrane itself. Were prepared, and the dye-stained film was immersed for 3 minutes to observe the degree of decolorization of the film itself. In this case, since the protein detection sensitivity by dye staining of "Coomassie brilliant blue R-250" is usually about 20 to 100 ng, it is judged that the dye staining image of 100 ng of goat gamma globulin can be clearly visually confirmed. The standard was used.
【００２６】表１は、横軸にメタノール、縦軸に酢酸の
(V/V) ％濃度を示しており、100 ％満たない(V/V) ％濃
度は水の分量である。表１で○印を付した液組成は、膜
自体が十分に脱色され、100ng のヤギγグロブリンの色
素染色像が目視で確認可能な脱色液組成である。表１の
×印を付した組成は、膜自体の脱色が不十分であった
り、100ng のヤギγグロブリンの色素染色像が脱色され
過ぎて、目視で確認困難な液組成である。この結果よ
り、脱色液組成は、メタノールを10〜90(V/V) ％濃度で
含む酢酸溶液、および、10〜50(V/V) ％濃度のメタノー
ルと10〜50(V/V) ％度の酢酸との組み合わせによりアル
コールと酢酸の合計濃度を20〜60(V/V) ％濃度とした水
溶液が適していると判明した。また、該脱色液のメタノ
ールは、エタノールに置き換えても同様の効果が得られ
た。Table 1 shows that the horizontal axis represents methanol and the vertical axis represents acetic acid.
(V / V)% concentration is shown, and less than 100% (V / V)% concentration is the amount of water. The liquid compositions marked with a circle in Table 1 are those in which the membrane itself has been sufficiently decolorized and a dye-stained image of 100 ng of goat gamma globulin can be visually confirmed. Compositions marked with x in Table 1 are liquid compositions that are difficult to visually confirm because the decolorization of the membrane itself is insufficient or the dye-stained image of 100 ng of goat gamma globulin is too decolorized. From these results, the composition of the decolorizing solution was as follows: an acetic acid solution containing methanol at a concentration of 10 to 90 (V / V)%, and methanol at a concentration of 10 to 50 (V / V)% and 10 to 50 (V / V)%. An aqueous solution in which the total concentration of alcohol and acetic acid was adjusted to 20 to 60 (V / V)% by combination with acetic acid was found to be suitable. The same effect was obtained even when the methanol in the decolorizing solution was replaced with ethanol.
【００２７】[0027]
【表１】 [Table 1]
【００２８】実施例２ タンパク質の色素染色像を完全に脱色する脱色液組成
（１） 実施例１の操作と同様に、ＰＶＤＦ膜にヤギγグロブリ
ンを固定し、0.25(W/V) ％“クマシーブリリアントブル
ーR-250 ”を含む10(V/V) ％エタノール、10(V/V) ％酢
酸水溶液に浸して１分間振とうした。続いて、該膜を実
施例１で用途適合と考えられた脱色液に３分間浸し、タ
ンパク質の色素染色像を残し、膜自体の色素染色を脱色
した。次に、膜上のタンパク質の色素染色像を完全脱色
するための脱色液の適正組成を検討する目的で、メタノ
ール、ブタノール、酢酸、水の混合比を変えた表２と表
３に記載の各種混合液を調製し、該膜を３分間浸してタ
ンパク質の色素染色像が脱色される程度を目視で観察し
た。タンパク質の色素染色像を完全に脱色する脱色液組
成は、1000ngのヤギγグロブリンの色素染色像が完全脱
色されることを用途適合の判断基準とした。表２は、酢
酸を10(V/V) ％濃度に固定して、メタノールと１−ブタ
ノール濃度を変化させた場合の結果を示しており、100
％に満たない(V/V) ％濃度は水の分量である。表２の○
印を記したメタノールの10〜30(V/V) ％濃度、１−ブタ
ノールの30〜40(V/V) ％濃度の組み合わせが用途適合で
あった。表３はメタノールの10〜30(V/V) ％濃度、１−
ブタノールの30〜40(V/V) ％濃度の範囲で、酢酸濃度を
変化させた結果を示しており、100 ％に満たない(V/V)
％濃度は水の分量である。表３の○印を記した酢酸濃度
の10〜30(V/V) 濃度の範囲が用途適合と考えられた。Example 2 Decolorizing solution composition for completely decolorizing a dye-stained image of a protein (1) In the same manner as in Example 1, goat gamma globulin was immobilized on a PVDF membrane, and 0.25 (W / V)% It was immersed in a 10 (V / V)% ethanol / 10 (V / V)% acetic acid aqueous solution containing Brilliant Blue R-250 "and shaken for 1 minute. Subsequently, the film was immersed in a decolorizing solution considered to be suitable for use in Example 1 for 3 minutes to leave a dye-stained image of the protein and to decolorize the dye of the film itself. Next, for the purpose of examining the appropriate composition of the decolorizing solution for completely decolorizing the dye-stained image of the protein on the membrane, various mixing ratios shown in Tables 2 and 3 where the mixing ratio of methanol, butanol, acetic acid and water was changed. A mixed solution was prepared, the membrane was immersed for 3 minutes, and the extent to which the dye image of the protein was decolorized was visually observed. For the composition of the decolorizing solution for completely decolorizing the dye-stained image of the protein, the completeness of the dye-stained image of 1000 ng goat gamma globulin was used as a criterion for applicability. Table 2 shows the results when the acetic acid was fixed at a concentration of 10 (V / V)% and the concentrations of methanol and 1-butanol were changed.
Less than% (V / V) The% concentration is the amount of water. ○ in Table 2
The combination of the marked 10-30% (V / V) concentration of methanol and the 30-40% (V / V)% concentration of 1-butanol was suitable for use. Table 3 shows the 10-30 (V / V)% concentration of methanol, 1-
Shows the results of varying the acetic acid concentration in the range of 30-40% (V / V) concentration of butanol, less than 100% (V / V)
The% concentration is the amount of water. The range of the acetic acid concentration of 10 to 30 (V / V) indicated by a circle in Table 3 was considered to be suitable for use.
【００２９】すなわち、タンパク質の色素染色像を完全
に脱色する脱色液組成は、10〜30(V/V) ％濃度のメタノ
ールと30〜40(V/V) ％濃度の１−ブタノールとの組み合
わせによりアルコールを40〜60(V/V) ％濃度とし、さら
に10〜30(V/V) ％濃度の酢酸との組み合わせにより最終
的なアルコールと酢酸の合計濃度を50〜90(V/V) ％濃度
とした水溶液であることが判明した。また、該脱色液の
メタノールはエタノールに、１−ブタノールは１−ペン
タノールに置き換えても同様の効果が得られた。That is, the composition of the decolorizing solution for completely decolorizing the dye-stained image of the protein is a combination of methanol having a concentration of 10 to 30 (V / V)% and 1-butanol having a concentration of 30 to 40 (V / V)%. To make the alcohol 40 ~ 60 (V / V)% concentration, and the final combined alcohol and acetic acid concentration 50 ~ 90 (V / V) by combination with 10 ~ 30 (V / V)% concentration acetic acid % Aqueous solution. The same effect was obtained by replacing methanol in the decolorizing solution with ethanol and 1-butanol with 1-pentanol.
【００３０】[0030]
【表２】 [Table 2]
【００３１】[0031]
【表３】 [Table 3]
【００３２】実施例３ タンパク質の色素染色像を完全に脱色する脱色液組成
（２） 30(V/V) ％濃度のメタノール、20(V/V) ％濃度の酢酸溶
液に炭素数２〜１０のアルコールを30(V/V) ％濃度で共
存させた溶液を調製し、実施例２の操作で用途適合性を
確認した。表４は、炭素数２〜１０の直鎖状アルコール
を用いた場合の結果を示しており、○印を付した炭素数
４〜５のアルコールがタンパク質の色素染色像を完全に
脱色する脱色液組成として良好な結果を与えた。Example 3 Composition of a decolorizing solution for completely decolorizing a dye-stained image of a protein (2) A methanol solution having a concentration of 30 (V / V)% and a acetic acid solution having a concentration of 20 (V / V)% have 2 to 10 carbon atoms. Was prepared in which 30% (V / V)% alcohol was coexisted, and the suitability for use was confirmed by the operation of Example 2. Table 4 shows the results when linear alcohols having 2 to 10 carbon atoms were used. The decolorizing solution in which the alcohols having 4 to 5 carbon atoms marked with a circle completely decolorized the dye-stained image of the protein was used. The composition gave good results.
【００３３】[0033]
【表４】 [Table 4]
【００３４】実施例４ ウェスタンブロッティングによる目的タンパク質の検出 100ng のウシ血清アルブミンと100ng のヤギγグロブリ
ンとをポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、泳
動分離したタンパク質を泳動ゲルからＰＶＤＦ膜に電気
的に転写した。そして、該膜を実施例１のクマシーブリ
リアントブルーＲ−２５０溶液により染色した。染色し
た膜は、５０(V/V) ％メタノール、１０(V/V) ％酢酸溶
液からなる脱色液１に１分間浸してタンパク質の固着し
た部分以外の部分の染色色素を脱色し、ウシ血清アルブ
ミンとヤギγグロブリンの電気泳動像を色素染色像とし
て検出した。その後、該膜を２０(V/V) ％のメタノー
ル、３０(V/V) ％１−ブタノールおよび２０(V/V) ％の
酢酸を含む脱色液２に浸して５分間振とうし、色素染色
像を完全に脱色した。Example 4 Detection of Target Protein by Western Blotting 100 ng of bovine serum albumin and 100 ng of goat gamma globulin were electrophoresed on a polyacrylamide gel, and the separated proteins were electrophoresed from the electrophoresis gel to a PVDF membrane. Transcribed. Then, the membrane was stained with the Coomassie Brilliant Blue R-250 solution of Example 1. The stained membrane was immersed in a decolorizing solution 1 consisting of 50 (V / V)% methanol and 10 (V / V)% acetic acid solution for 1 minute to decolor the stained dye other than the portion where the protein was fixed, and to remove bovine serum. Electrophoresis images of albumin and goat gamma globulin were detected as dye-stained images. Thereafter, the membrane was immersed in a destaining solution 2 containing 20% (V / V)% methanol, 30% (V / V)% 1-butanol and 20% (V / V)% acetic acid, and shaken for 5 minutes. The stained image was completely decolorized.
【００３５】色素染色像を完全に脱色した該膜は、リン
酸緩衝生理食塩水で充分に洗浄後、１０(W/V) ％スキム
ミルク溶液に３０分間浸してブロッキングを行った。続
いて該膜を、ペルオキシダーゼ標識抗ヤギγグロブリン
抗体のリン酸緩衝生理食塩水溶液に３０分間浸した。そ
して、リン酸緩衝生理食塩水で５回洗浄することによ
り、未反応のペルオキシダーゼ標識抗ヤギγグロブリン
抗体を除去した。膜に固定されているヤギγグロブリン
と結合したペルオキシダーゼ標識抗ヤギγグロブリン抗
体は、ペルオキシダーゼの発色基質である4-クロル-1-
ナフトール溶液（0.5mg/mlの4-クロル-1- ナフトールと
15(V/V) ％濃度のメタノールと0.015(W/V)％濃度の過酸
化水素とを含む20mmol/lトリス塩酸緩衝液pH7.5 ）に浸
して酵素発色させた。その結果、ウシ血清アルブミンの
電気泳動像は酵素発色せず、ヤギγグロブリンの電気泳
動像だけが鮮明に青色に酵素発色した。The membrane, from which the dye-stained image was completely decolorized, was sufficiently washed with a phosphate buffered saline and then immersed in a 10 (W / V)% skim milk solution for 30 minutes to perform blocking. Subsequently, the membrane was immersed in a phosphate buffered saline solution of a peroxidase-labeled anti-goat gamma globulin antibody for 30 minutes. Then, unreacted peroxidase-labeled anti-goat gamma globulin antibody was removed by washing five times with phosphate buffered saline. A peroxidase-labeled anti-goat gamma globulin antibody bound to goat gamma globulin immobilized on the membrane is 4-chloro-1-, a chromogenic substrate for peroxidase.
Naphthol solution (0.5mg / ml 4-chloro-1-naphthol
The enzyme was developed by immersion in a 20 mmol / l Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 15% (V / V)% methanol and 0.015 (W / V)% hydrogen peroxide. As a result, the electrophoresis image of bovine serum albumin did not show enzyme coloration, and only the electrophoresis image of goat gamma globulin developed a clear blue enzyme color.
【００３６】実施例５ 脱色液調製キットで作成する本発明の脱色液 本発明の脱色液調製キットは、例えば、40(V/V) ％濃度
の酢酸を含む水溶液（ａ液）と、40(V/V) ％濃度のエタ
ノールと60(V/V) ％濃度の１−ブタノールとの混合液
（ｂ液）の組み合わせであり、ａ液とｂ液を容量比で
１：１の割合で混合することにより、脱色液２が容易に
調製できる。本発明の脱色液１に適合した溶液は、該キ
ットのａ液とｂ液とを混合し、さらに水で希釈すること
により調製することができる。脱色液１の調製方法を検
討するために、ａ液とｂ液を容量比で１：１、２：１、
３：１、４：１の割合で混合し、これらの混合液を水で
１．５倍釈した場合（表５）と２．０倍に希釈した場合
（表６）の脱色液の脱色性能を確認した。Example 5 Decolorizing Solution of the Present Invention Prepared by Decolorizing Solution Preparation Kit The decolorizing solution preparation kit of the present invention comprises, for example, an aqueous solution (solution a) containing acetic acid having a concentration of 40 (V / V)%, (V / V)% concentration ethanol and 60 (V / V)% concentration 1-butanol mixture (solution b). Solution a and solution b are mixed at a volume ratio of 1: 1. By doing so, the decolorizing liquid 2 can be easily prepared. A solution suitable for the decolorizing solution 1 of the present invention can be prepared by mixing solution a and solution b of the kit and further diluting with water. In order to study the preparation method of the decolorizing solution 1, the solution a and the solution b were mixed in a volume ratio of 1: 1, 2: 1,
Decolorizing performance of the decolorizing solution when mixed at a ratio of 3: 1, 4: 1, and when these mixed solutions were diluted 1.5 times with water (Table 5) and when diluted 2.0 times (Table 6). It was confirmed.
【００３７】表５は、水で１．５倍希釈して調製した脱
色液の液組成を示しており、脱色液は5 〜13(V/V) ％濃
度のエタノール、8 〜20(V/V) ％濃度の１−ブタノー
ル、13〜21(V/V) ％濃度の酢酸、および54〜66(V/V) ％
濃度の水から成っている。Table 5 shows the composition of the decolorizing solution prepared by diluting with water 1.5-fold. The decolorizing solution is ethanol having a concentration of 5 to 13 (V / V)% and 8 to 20 (V / V). V)% 1-butanol, 13-21 (V / V)% acetic acid, and 54-66 (V / V)%
Consists of water in concentration.
【００３８】表６は、水で２．０倍希釈して調製した脱
色液の液組成を示しており、脱色液は4 〜10(V/V) ％濃
度のエタノール、8 〜15(V/V) ％濃度の１−ブタノー
ル、10〜16(V/V) ％濃度の酢酸、および65〜74(V/V) ％
濃度の水から成っている。Table 6 shows the liquid composition of the decolorizing solution prepared by diluting it 2.0 times with water. The decolorizing solution is ethanol having a concentration of 4 to 10 (V / V)% and 8 to 15 (V / V). V)% 1-butanol, 10-16 (V / V)% acetic acid, and 65-74 (V / V)%
Consists of water in concentration.
【００３９】表５と表６に示した各脱色液は、実施例１
の操作で評価した結果、総ての脱色液が本発明の脱色液
１としての性能を満たしていると考えられた。すなわ
ち、調製した各脱色液は、実施例１の操作に従い、膜結
合させた100ng のヤギγグロブリンの色素染色像を残
し、膜自体の色素染色を洗い流すことができた。Each of the decolorizing liquids shown in Tables 5 and 6 was obtained in Example 1.
As a result of evaluation by the above operation, all the decolorizing liquids were considered to satisfy the performance as the decolorizing liquid 1 of the present invention. That is, according to the procedure of Example 1, each of the prepared decolorizing solutions was able to leave a dye-stained image of 100 ng of goat gamma globulin bound to the membrane, and to wash off the dye stain of the membrane itself.
【００４０】以上より、本発明の脱色液１は、4 〜13(V
/V) ％濃度のメタノール又はエタノールと6 〜20(V/V)
％濃度の１−ブタノール又は１−ペンタノールとの組み
合わせによりアルコールを10〜33(V/V) ％濃度とし、さ
らに10〜21(V/V) ％濃度の酢酸との組み合わせで最終的
なアルコールと酢酸の合計濃度を26〜46(V/V) ％濃度と
した水溶液でも良いことが確認できた。As described above, the decolorizing solution 1 of the present invention has a viscosity of 4 to 13 (V
/ V)% concentration of methanol or ethanol and 6 to 20 (V / V)
% Alcohol in combination with 1-butanol or 1-pentanol at a concentration of 10-33 (V / V)%, and the final alcohol in combination with acetic acid at a concentration of 10-21 (V / V)%. It was also confirmed that an aqueous solution having a total concentration of acetic acid and acetic acid of 26 to 46 (V / V)% could be used.
【００４１】[0041]
【表５】 [Table 5]
【００４２】[0042]
【表６】 [Table 6]
【００４３】実施例６ 脱色液調製キットの実用例 実施例１に従って、10μg/mlヤギγグロブリン水溶液を
ドットブロッターに固定したポリビニリデンジフロリド
（ＰＶＤＦ）膜に1 、10、50及び100 μl 添加し、ヤギ
γグロブリンの10、100 、500 及び1000ngを膜に物理吸
着させた。該膜を該ブロッターから外し、0.25％(W/V)
“クマシーブリリアントブルーR-250 ”を含む10(V/V)
％エタノール、10(V/V) ％酢酸水溶液に浸して１分間振
とうした。Example 6 Practical Example of Decolorizing Solution Preparation Kit According to Example 1, 1, 10, 50 and 100 μl of a 10 μg / ml goat γ globulin aqueous solution were added to a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane fixed on a dot blotter. Then, 10, 100, 500 and 1000 ng of goat gamma globulin were physically adsorbed on the membrane. The membrane was removed from the blotter and 0.25% (W / V)
10 (V / V) including “Coomassie Brilliant Blue R-250”
% Ethanol and 10% (V / V) aqueous solution of acetic acid and shaken for 1 minute.
【００４４】本発明の脱色液１は、本発明の脱色液調製
キットの40(V/V) ％濃度の酢酸を含む水溶液、40(V/V)
％濃度のエタノールと60(V/V) ％濃度の１−ブタノール
との混合液、および水とを容量比で２：１：３の割合で
混合して調製した。色素液に浸して色素染色した該膜
は、脱色液１に浸して３分間振とうした。その結果、膜
に結合した10〜1000ngの総てのヤギγグロブリンの色素
染色像を残して、膜自体に結合した色素を脱色すること
が出来た。The decolorizing solution 1 of the present invention is prepared by using a 40 (V / V) aqueous solution containing acetic acid at a concentration of 40 (V / V)% of the decolorizing solution preparation kit of the present invention.
The mixture was prepared by mixing a mixed solution of ethanol at a concentration of 60% and 1-butanol at a concentration of 60% (V / V), and water at a volume ratio of 2: 1: 3. The film stained with the dye by immersing in the dye solution was immersed in the decolorizing solution 1 and shaken for 3 minutes. As a result, the dyes bound to the membrane itself could be decolorized, leaving the dye-stained images of all goat gamma globulin of 10 to 1000 ng bound to the membrane.
【００４５】本発明の脱色液２は、本発明の脱色液調製
キットの40(V/V) ％濃度の酢酸を含む水溶液、40(V/V)
％濃度のエタノールと60(V/V) ％濃度の１−ブタノール
との混合液とを容量比で１：１の割合で混合して調製し
た。脱色液１で脱色後の該膜を、脱色液２に浸して１０
分間振とうした。その結果、膜に結合した10〜1000ngの
総てのヤギγグロブリンの色素染色像を脱色することが
出来た。この膜は、実施例４のペルオキシダーゼ標識抗
ヤギγグロブリン抗体を用いたウェスタンブロッティン
グ法の操作に従って、酵素発色させた。その結果、10〜
1000ngの総てのヤギγグロブリンの酵素発色像を確認す
ることが出来た。また、本実施例は、本発明の脱色液調
製キットの40(V/V) ％のエタノールと60(V/V) ％の１−
ブタノールとの混合液で、エタノールをメタノールに、
１−ブタノールを１−ペンタノールに置き換えても、同
様の結果を得ることが出来た。The decolorizing solution 2 of the present invention is prepared by using a 40 (V / V) aqueous solution containing acetic acid at a concentration of 40 (V / V)% of the decolorizing solution preparation kit of the present invention.
% Of ethanol and 60 (V / V)% of 1-butanol were mixed at a volume ratio of 1: 1. The film after decolorization with the decolorizing solution 1 is immersed in the decolorizing solution 2 for 10 minutes.
Shake for a minute. As a result, the dye-stained images of all goat gamma globulin of 10 to 1000 ng bound to the membrane could be decolorized. This membrane was subjected to enzyme color development according to the Western blotting operation using the peroxidase-labeled anti-goat gamma globulin antibody of Example 4. As a result, 10 ~
Enzyme coloring images of all goat gamma globulin of 1000 ng could be confirmed. In this example, the kit for preparing the decolorizing solution of the present invention was prepared by using 40 (V / V)% ethanol and 60 (V / V)% 1-%.
Ethanol to methanol in a mixture with butanol,
Similar results could be obtained by replacing 1-butanol with 1-pentanol.
【００４６】[0046]
【発明の効果】本発明の膜結合した特定タンパク質の検
出方法は、膜結合した総てのタンパク質の色素染色し
て、色素染色像を観察した後に完全に色素脱色し、さら
に同じ膜上で特定タンパク質の泳動像を酵素標識抗体の
抗原抗体反応を用いて酵素発色させることができるの
で、従来の様に別途に色素染色法とウェスタンブロッテ
ィング法の操作を行う必要が無く、総てのタンパク質泳
動像中の特定タンパク質泳動像の位置確認が容易に正し
く行える。また、従来の２重染色法のように、酵素標識
抗体の抗原抗体反応で酵素発色させた目的タンパク質の
泳動像が色素染色像と重ならないので、特定タンパク質
が微量でも酵素発色像を容易に観察することができる。According to the method for detecting a specific protein bound to a membrane according to the present invention, all the proteins bound to the membrane are dye-stained, the dye-stained image is observed, the dye is completely decolorized, and the specific protein is identified on the same membrane. Enzymatic coloring of protein migration images can be performed using the antigen-antibody reaction of the enzyme-labeled antibody, eliminating the need for separate dye staining and western blotting operations as in the past, and all protein migration images The position of the specific protein electrophoresis image inside can be easily and correctly confirmed. In addition, unlike the conventional double staining method, the electrophoretic image of the target protein, which was developed by the enzyme-antibody reaction of the enzyme-labeled antibody, does not overlap with the dye-stained image, so that even if the amount of the specific protein is very small, the enzyme-colored image can be easily observed. can do.
【００４７】また、本発明の脱色液を調製するための脱
色液調製キットは、該キットの２液を混合・水希釈する
だけで本発明の脱色液１および脱色液２を得ることがで
きるので、本発明の膜結合した特定タンパク質の検出方
法を簡易に行うことができる。The decolorizing solution preparation kit for preparing the decolorizing solution of the present invention can obtain the decolorizing solution 1 and the decolorizing solution 2 of the present invention simply by mixing and diluting the two solutions of the kit. In addition, the method for detecting a membrane-bound specific protein of the present invention can be easily performed.
Claims (4)
た部分に結合させ、該膜をアシッドブルー83又はアシッ
ドブルー90色素溶液に浸し、さらに該膜を該膜に結合し
た総てのタンパク質の色素染色像は脱色しないがその他
の部分の該膜自体に結合した色素を脱色し得る脱色液１
に浸すことにより、該膜に結合した総てのタンパク質の
色素染色像を残して、該膜自体に結合した色素を脱色す
ることにより該総てのタンパク質の色素染色像の位置関
係を確認した後、該膜を該タンパク質の色素染色像の総
てを脱色し得る脱色液２に浸して該タンパク質の色素染
色像の総てを脱色し、次いで該膜に結合している特定タ
ンパク質に対して特異的に反応する酵素標識抗体の溶液
に浸した後、前記特定タンパク質と未反応の該標識抗体
を洗浄除去し、前記特定タンパク質と結合した該標識抗
体の酵素を検出することを特徴とする膜結合した特定タ
ンパク質の検出方法。1. A method for binding each of a plurality of proteins to different parts of a membrane, immersing the membrane in an Acid Blue 83 or Acid Blue 90 dye solution, and further attaching the membrane to all proteins bound to the membrane. Decoloring solution 1 which does not decolorize the dye-stained image but can decolorize the dyes bound to the film itself in other portions
After leaving the dye-stained images of all the proteins bound to the membrane by immersion in the membrane, decolorizing the dyes bound to the membrane itself to confirm the positional relationship of the dye-stained images of all the proteins The membrane is immersed in a decolorizing solution 2 capable of decolorizing all of the dye-stained images of the protein to decolorize all of the dye-stained images of the protein, and then specific to a specific protein bound to the membrane. Membrane-binding comprising immersing in a solution of an enzyme-labeled antibody that reacts specifically, washing and removing the unreacted labeled antibody with the specific protein, and detecting the enzyme of the labeled antibody bound to the specific protein. Method for detecting specific proteins.
で含む酢酸溶液、 （ロ）10〜50(V/V) ％濃度のメタノール又はエタノール
と10〜50(V/V) ％濃度の酢酸との組み合わせによりアル
コールと酢酸の合計濃度を20〜60(V/V) ％濃度とした水
溶液、 （ハ）4 〜13(V/V) ％濃度のメタノール又はエタノール
と6 〜20(V/V) ％濃度の１−ブタノール又は１−ペンタ
ノールとの組み合わせによりアルコールを10〜33(V/V)
％濃度とし、さらに10〜21(V/V) ％濃度の酢酸との組み
合わせで最終的なアルコールと酢酸の合計濃度を26〜46
(V/V) ％濃度とした水溶液、の何れかから選ばれた１種
である請求項１に記載の膜結合した特定タンパク質の検
出方法。2. The decolorizing solution 1 comprises (a) an acetic acid solution containing methanol or ethanol at a concentration of 10 to 90 (V / V)%, and (b) methanol or ethanol at a concentration of 10 to 50 (V / V)%. An aqueous solution in which the total concentration of alcohol and acetic acid is adjusted to 20 to 60 (V / V)% by combining with acetic acid having a concentration of 50 to 50 (V / V), (c) 4 to 13 (V / V)% Combination of methanol or ethanol with 6-20% (V / V) 1-butanol or 1-pentanol at a concentration of 10-33 (V / V)
%, And combined with 10-21 (V / V)% acetic acid to give a final total alcohol and acetic acid concentration of 26-46.
2. The method for detecting a membrane-bound specific protein according to claim 1, wherein the method is one selected from the group consisting of an aqueous solution having a (V / V)% concentration.
ール又はエタノールと30〜40(V/V) ％濃度の１−ブタノ
ール又は１−ペンタノールとの組み合わせによりアルコ
ールを40〜60(V/V) ％濃度とし、さらに10〜30(V/V) ％
濃度の酢酸との組み合わせにより最終的なアルコールと
酢酸の合計濃度を50〜90(V/V) ％濃度とした水溶液であ
る請求項１又は２に記載の膜結合した特定タンパク質の
検出方法。3. The decolorizing solution 2 is prepared by combining alcohol of 10 to 30 (V / V)% with methanol or ethanol and 30 to 40 (V / V)% of 1-butanol or 1-pentanol in combination with alcohol. ~ 60 (V / V)% concentration and 10 ~ 30 (V / V)%
3. The method for detecting a membrane-bound specific protein according to claim 1 or 2, wherein the aqueous solution is an aqueous solution having a final total concentration of alcohol and acetic acid of 50 to 90 (V / V)% by a combination of acetic acid at a concentration.
（ａ液）、および20〜60(V/V) ％濃度のメタノール又は
エタノールと60〜80(V/V) ％濃度の１−ブタノール又は
１−ペンタノールとの組み合わせによりアルコール濃度
を80〜100(V/V)％濃度とした水溶液（ｂ液）の２溶液か
ら成ることを特徴とする請求項１に記載の脱色液１およ
び脱色液２を調製するための脱色液調製キット。4. An aqueous solution (solution a) containing acetic acid at a concentration of 20-60 (V / V)%, and methanol or ethanol at a concentration of 20-60 (V / V)% and 60-80 (V / V)%. 2. The solution according to claim 1, comprising two solutions of an aqueous solution (solution b) having an alcohol concentration of 80 to 100 (V / V)% by a combination with a concentration of 1-butanol or 1-pentanol. Decolorizing solution preparation kit for preparing decolorizing solution 1 and decolorizing solution 2.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23749397A JP3204932B2 (en) | 1997-09-02 | 1997-09-02 | Method for detecting specific protein bound to membrane and kit for preparing decolorizing solution |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1183859A true JPH1183859A (en) | 1999-03-26 |
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ID=17016146
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23749397A Expired - Lifetime JP3204932B2 (en) | 1997-09-02 | 1997-09-02 | Method for detecting specific protein bound to membrane and kit for preparing decolorizing solution |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3204932B2 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0482726A2 (en) * | 1990-10-26 | 1992-04-29 | Nippon Telegraph And Telephone Corporation | Heterojunction field-effect transistor |
| EP0562551A2 (en) * | 1992-03-23 | 1993-09-29 | Sumitomo Electric Industries, Limited | Heterojunction field effect transistor |
| WO2005111616A1 (en) * | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Toray Industries, Inc. | Method of rapidly and easily detecting target substance and enzymoimmunological kit |
| JP2005351889A (en) * | 2004-05-14 | 2005-12-22 | Toray Ind Inc | Method for speedily and easily detecting target substance, and enzyme immunological kit for the same |
| JP2020180890A (en) * | 2019-04-25 | 2020-11-05 | 株式会社明治 | Method of detecting protein |
-
1997
- 1997-09-02 JP JP23749397A patent/JP3204932B2/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3204932B2 (en) | 2001-09-04 |
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