JPH1160595A - Peptide for selective adsorption of low density lipoprotein - Google Patents
Peptide for selective adsorption of low density lipoproteinInfo
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- JPH1160595A JPH1160595A JP9240280A JP24028097A JPH1160595A JP H1160595 A JPH1160595 A JP H1160595A JP 9240280 A JP9240280 A JP 9240280A JP 24028097 A JP24028097 A JP 24028097A JP H1160595 A JPH1160595 A JP H1160595A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、低比重リポ蛋白質
（以下、しばしば、”ＬＤＬ”と称す）選択吸着性ペプ
チド、および水不溶性担体に該ペプチドを結合させてな
るＬＤＬ吸着材に関する。さらに、本発明は、ＬＤＬを
含む溶液や体液を上記のペプチドと接触させることによ
り、溶液または体液からＬＤＬを除去する方法にも関す
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a low-density lipoprotein (hereinafter often referred to as "LDL") selectively adsorbing peptide, and an LDL adsorbent obtained by binding the peptide to a water-insoluble carrier. Furthermore, the present invention relates to a method for removing LDL from a solution or a body fluid by contacting a solution or a body fluid containing LDL with the peptide.
【０００２】[0002]
【従来の技術】血液中に存在するリポタンパクのうち、
ＬＤＬはａｐｏＢタンパク、リン脂質およびコレステロ
ール等からなる複合体であり、コレステロールを多く含
むため動脈硬化の原因になることが知られている。従
来、血液中のＬＤＬの量が多い家族性高コレステロール
血症患者において、ＬＤＬを吸着する吸着材を用いた血
液体外循環治療（以下、しばしば、ＬＤＬアフェレーシ
スと称す）が施され、患者の種々の症状が改善されてき
た。2. Description of the Related Art Among lipoproteins present in blood,
LDL is a complex composed of apoB protein, phospholipid, cholesterol, and the like, and is known to cause arteriosclerosis because it contains a large amount of cholesterol. Conventionally, in patients with familial hypercholesterolemia in which the amount of LDL in the blood is large, extracorporeal blood therapy (hereinafter often referred to as LDL apheresis) using an adsorbent that adsorbs LDL has been performed, and various types of patients have been treated. Symptoms have improved.
【０００３】ＬＤＬ除去用の吸着材としては、例えば、
ＥＰ特許第０ ２２５ ８６７号公報（日本国、特公昭
６２−５６７８２号公報及び日本国、特公昭６３−１９
２１４号公報に対応）に開示されている陰性の電荷を有
する硫酸化多糖をリガンドとして化学的に固定化させた
樹脂が公知であり、実際に、デキストラン硫酸をリガン
ドとしてセルロース粒子担体に固定化したものが市販さ
れている。As an adsorbent for removing LDL, for example,
EP Patent No. 0 225 867 (Japanese Patent Publication No. 62-56782 and Japanese Patent Publication No. 63-1967)
No. 214 (corresponding to Japanese Patent Publication No. 214), a resin in which a sulfated polysaccharide having a negative charge is chemically immobilized as a ligand is known. Actually, dextran sulfate is immobilized on a cellulose particle carrier as a ligand. Things are commercially available.
【０００４】しかし、デキストラン硫酸をリガンドとし
たＬＤＬ吸着材を用いてＬＤＬアフェレーシスを行う
と、デキストラン硫酸がもつ陰性電荷の影響により、血
液中にブラジキニンと呼ばれる生理活性物質が産生され
てしまう。ブラジキニンは血圧降下作用、平滑筋収縮作
用および膜透過性亢進作用等を有する物質であることが
知られている（例えば、ＥＰ特許出願公開第９３ １０
４ ３４８．３号公報を参照）。However, when LDL apheresis is performed using an LDL adsorbent using dextran sulfate as a ligand, a physiologically active substance called bradykinin is produced in blood due to the negative charge of dextran sulfate. Bradykinin is known to be a substance having a blood pressure lowering action, a smooth muscle contraction action, a membrane permeability enhancing action, and the like (for example, EP Patent Application Publication No. 9310).
4 348.3).
【０００５】また、例えば、ＷＯ９０／０４４１６号公
報には、アガロース粒子にヒト低比重リポタンパク質と
結合性をもつ抗体を結合させたものが開示されている。
しかし、抗体は、一般的に細胞培養や生物体内で産生さ
れるために、ＬＤＬが関与している疾患に対する治療に
用いるのに十分な量を調製するためには、多大な労力と
生産コストがかかる等の不利がかかるばかりでなく、体
外循環治療に用いるには滅菌操作等に対する安定性が低
い。[0005] For example, WO90 / 04416 discloses an agarose particle in which an antibody having a binding property to human low-density lipoprotein is bound.
However, since antibodies are generally produced in cell culture or living organisms, it takes a great deal of labor and production cost to prepare an amount sufficient for use in treating LDL-related diseases. Not only does such a disadvantage occur, but also the stability to sterilization operation or the like is low for use in extracorporeal circulation treatment.
【０００６】ＬＤＬに結合性が示唆されている物質とし
ては、例えば、約２５個〜２５０個のアミノ酸残基から
なるポリリジンやポリアルギニン（Ｏｌｏｖ Ｗｉｋｌ
ｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．： Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙ
ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｗ ｄｅｎｓ
ｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａｒｔｅ
ｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ， ｆｉｂｌｏ
ｂｌａｓｔｓ， ａｎｄ ａｒｔｅｒｉａｌｔｉｓｓｕ
ｅ． Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．１９９０，
１０，６９５−７０２）およびＶＶＷＲＬＴＲＫＲＧＬ
ＫＶＶＶの１５残基のアミノ酸残基からなるペプチド
（Ｕｒｂａｎ Ｏｌｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．： Ｂｉｎ
ｄｉｎｇｏｆ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｐｏｌｉｐ
ｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ−１００ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ
ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｔｏ ｃｈｏ
ｎｄｒｏｉｔｉｎ ６−ｓｕｌｆａｔｅ： Ｅｆｆｅｃ
ｔｓ ｏｆ ｔｈｅｌｉｐｉｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎ
ｔ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，１
８５８−１８６５）が知られている。[0006] Substances suggested to bind to LDL include, for example, polylysine and polyarginine (Olov Wikl) comprising about 25 to 250 amino acid residues.
und, et al. : Cationic poly
peptides modulate in vitro
o association of low dens
ity lipoprotein with arte
real proteoglycans, fiblo
blasts, and arterialtissu
e. Arteriosclerosis. 1990,
10,695-702) and VVWRLTRKRGL
A peptide consisting of 15 amino acid residues of KVVV (Urban Olsson, et al .: Bin
dingof a synthetic apolip
oprotein B-100 peptide and
peptide analogs to cho
ndroitin 6-sulfate: Effect
ts of thelipid environment
t. Biochemistry, 1993, 32, 1
858-1865) are known.
【０００７】しかし、上記の約２５個〜２５０個のアミ
ノ酸残基からなるポリリジンやポリアルギニン、および
ＶＶＷＲＬＴＲＫＲＧＬＫＶＶＶの１５個のアミノ酸残
基からなるペプチド等のポリペプチドは、いずれも１０
残基を越えるアミノ酸残基からなっているので、抗体と
同様に耐滅菌性や保存性に劣る。また、一般に極端な陽
性電荷を有する物質においては、このような物質の表面
に血液が接触した際に、血液中の赤血球や白血球ならび
に血小板等の細胞成分が活性化されてしまったり、強い
静電的相互作用によって、上記の物質の表面に吸着され
てしまうことが知られている。さらに、このような物質
は血漿タンパクの非特異吸着や血液凝固因子の活性化等
を惹起してしまうため、安全にＬＤＬアフェレーシス治
療を実施するためには、このような物質を吸着材に用い
ることは好ましくないと考えられる。[0007] However, the above-mentioned polypeptides such as polylysine and polyarginine consisting of about 25 to 250 amino acid residues and peptide consisting of 15 amino acid residues of VVWRLTRKRGLKVVV are all 10 polypeptides.
Since it is composed of amino acid residues exceeding the number of residues, it has poor sterilization resistance and storage properties like antibodies. Further, in general, when a substance having an extremely positive charge is in contact with the surface of such a substance, cell components such as red blood cells, white blood cells, and platelets in the blood are activated, or strong electrostatic charges are generated. Is known to be adsorbed on the surface of the above-mentioned substance due to a natural interaction. Furthermore, since such substances cause non-specific adsorption of plasma proteins and activation of blood coagulation factors, such substances should be used as an adsorbent for safe LDL apheresis treatment. Is considered undesirable.
【０００８】また、一般に透析治療や吸着除去治療等の
ような血液浄化療法に際しては、血液を凝固させずに体
外循環治療するために、通常ヘパリン等のような抗血液
凝固剤が用いられる。しかし、ヘパリンの長期使用によ
る副作用や、出血傾向にある患者には、ヘパリンの使用
が難しい等の問題点が指摘されており、ヘパリン等の抗
血液凝固剤の使用量を可能な限り、少なくすることが望
まれている。そこで、本発明者らは鋭意研究を重ねて、
下記式（１’）または式（２’）で表されるアミノ酸配
列を有し、総電荷数が＋１以上、＋４以内であり、か
つ、総アミノ酸残基数が２以上、１０以下であるペプチ
ドが、優れたＬＤＬ結合性を有し、それでいて、ブラジ
キニンの産生、血液細胞の活性化、血液凝固系の活性化
等を惹起しないために安全性に優れることを見いだし、
既に特許出願を行った（ＷＯ９７／００８８９号公
報）。In general, in blood purification treatments such as dialysis treatment and adsorption removal treatment, an anticoagulant such as heparin is usually used in order to perform extracorporeal circulation treatment without coagulating blood. However, side effects of long-term use of heparin and bleeding-prone patients have been pointed out as problems such as difficulty in using heparin, and the use of anticoagulants such as heparin should be minimized. It is desired. Therefore, the present inventors have conducted intensive research,
A peptide having an amino acid sequence represented by the following formula (1 ′) or formula (2 ′), having a total charge number of +1 or more and +4 or less, and a total amino acid residue number of 2 or more and 10 or less Has excellent LDL-binding properties, yet does not induce the production of bradykinin, activation of blood cells, activation of the blood coagulation system, etc., and is found to be excellent in safety,
A patent application has already been filed (WO 97/00889).
【０００９】 （Ｘ1 ）p ―（α）m ―（Ｘ2 ）q ―（β）n ―（Ｘ3 ）r （１’）または （Ｘ1 ）p ―（β）n ―（Ｘ2 ）q ―（α）m ―（Ｘ3 ）r （２’） ［但し、式（１’）および（２’）の左端および右端
は、それぞれＮ末端およびＣ末端であり、各αは、それ
ぞれ独立して、ＰｈｅまたはＴｒｐであり、各βは、そ
れぞれ独立して、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、各Ｘ1 、
各Ｘ2 および各Ｘ3は、それぞれ独立して、任意のアミ
ノ酸残基であり、ｍおよびｎは、それぞれアミノ酸残基
αおよびβの数であり、ｐ、ｑおよびｒはそれぞれアミ
ノ酸残基Ｘ1、Ｘ2 およびＸ3 の数であり（但し、ｐ、
ｑおよびｒは同じでも異なっていてもよい）；さらに、
ｍ、ｎ、ｐ、ｑおよびｒは次の関係を満足する。 ２≦ｍ＋ｎ＋ｐ＋ｑ＋ｒ≦１０ （但し、ｍおよびｎは次式： ２≦ｍ＋ｎ≦１０および １≦ｍ、ｎ≦９ の条件を満足し、ｐ、ｑおよびｒは次式： ０≦ｐ＋ｑ＋ｒ≦８、 ０≦ｐ、ｒ≦８および ０≦ｑ≦５ の条件を満足する。）］(X 1 ) p- (α) m- (X 2 ) q- (β) n- (X 3 ) r (1 ′) or (X 1 ) p- (β) n- (X 2 ) q- (α) m- (X 3 ) r (2 ′) [where the left and right ends of the formulas (1 ′) and (2 ′) are the N-terminal and the C-terminal, respectively, and each α is independently And Phe or Trp, each β is independently Arg or Lys, and each X 1 ,
Each X 2 and each X 3 are each independently an arbitrary amino acid residue, m and n are the numbers of amino acid residues α and β, respectively, and p, q and r are each an amino acid residue X 1 , X 2 and X 3 (where p,
q and r may be the same or different);
m, n, p, q and r satisfy the following relationship. 2 ≦ m + n + p + q + r ≦ 10 (where m and n satisfy the following conditions: 2 ≦ m + n ≦ 10 and 1 ≦ m, n ≦ 9, and p, q and r are the following expressions: 0 ≦ p + q + r ≦ 8, 0) ≤ p, r ≤ 8, and 0 ≤ q ≤ 5.)]
【００１０】ＥＰ特許第０ ２２５ ８６７号公報記載
の樹脂に結合した陰性の電荷を有する硫酸化多糖は、Ｌ
ＤＬのａｐｏＢタンパクの正電荷と相互作用し、この原
理に基づいてＬＤＬを結合していることが知られてい
る。一方、本発明者らがＷＯ９７／００８８９号公報に
記載したＬＤＬ結合性ペプチドは、総電荷数が＋１以上
＋４以内であり、正電荷をもつ該ペプチドがＬＤＬのリ
ン脂質と相互作用することにより、ＬＤＬを結合すると
推定されている。しかし、上記の原理に基づいてＬＤＬ
を吸着する際には、陰性または陽性電荷によるＬＤＬ以
外の血漿タンパクの非特異吸着があり、ＬＤＬ選択吸着
性には限界がある。The negatively charged sulfated polysaccharide bound to the resin described in EP Patent No. 0 225 867 is L
It is known that it interacts with the positive charge of the apoB protein of DL and binds LDL based on this principle. On the other hand, the LDL-binding peptide described in WO97 / 00889 by the present inventors has a total charge number of +1 or more and +4 or less, and the peptide having a positive charge interacts with the phospholipid of LDL. It is presumed to bind LDL. However, based on the above principle, LDL
When adsorbing LDL, there is nonspecific adsorption of plasma proteins other than LDL due to negative or positive charge, and there is a limit in LDL selective adsorption.
【００１１】したがって、全血および血漿等の体液から
のＬＤＬの吸着除去を行う際に、ＬＤＬ以外の血漿蛋白
質、特に高比重リポ蛋白質（以下、しばしば”ＨＤＬ”
と称す）を吸着除去せず、優れたＬＤＬ選択吸着性を示
し、それでいて、ブラジキニンの産生を惹起しない等、
安全性に優れ、かつ、低ヘパリン投与条件下においても
体外循環治療することができるＬＤＬ除去用吸着材に有
利に使用することのできるＬＤＬ選択吸着性ペプチドの
開発が望まれていた。Therefore, when LDL is adsorbed and removed from body fluids such as whole blood and plasma, plasma proteins other than LDL, particularly high-density lipoprotein (hereinafter often referred to as “HDL”)
Is not removed by adsorption and shows excellent LDL selective adsorption, but does not induce the production of bradykinin.
There has been a demand for the development of an LDL-selective adsorbent peptide which is excellent in safety and can be advantageously used as an adsorbent for removing LDL which can be subjected to extracorporeal treatment even under low heparin administration conditions.
【００１２】[0012]
【発明が解決しようとする課題】本発明の１つの目的
は、優れたＬＤＬ選択吸着性を有し、それでいて、ブラ
ジキニンの産生を惹起しないために安全性に優れてお
り、かつ、低ヘパリン投与条件下においても血液を凝固
させることなく安全に、全血や血漿等の体液や溶液から
ＬＤＬを除去するための吸着材用の試薬、さらには、Ｌ
ＤＬが関与している疾患に対する医薬品および医薬品の
キャリアーとして有利に用いることができるＬＤＬ選択
吸着性ペプチドを提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION One object of the present invention is to provide an excellent LDL selective adsorption property, yet to be superior in safety because it does not induce the production of bradykinin, and to achieve low heparin administration conditions. A reagent for an adsorbent for removing LDL from a body fluid or a solution such as whole blood or plasma safely without coagulating blood even below,
It is an object of the present invention to provide an LDL-selective adsorptive peptide which can be advantageously used as a drug and a carrier for a drug against a disease involving DL.
【００１３】本発明の他の１つの目的は、上記の優れた
特性を有し、さらに、比較的容易に、しかも、低コスト
で調製することができるだけでなく、滅菌操作等に対す
る安定性や、保存性に優れたＬＤＬ選択吸着性ペプチド
を提供することにある。本発明のさらに他の１つの目的
は、水不溶性担体に本発明のペプチドを結合させてなる
ＬＤＬ除去用吸着材であって、ＬＤＬアフェレーシスに
用いる血液浄化処理装置等に用いると、効率よく、しか
も、低ヘパリン投与条件下でＬＤＬの除去を行うことが
できる吸着材を提供することにある。本発明のさらにま
た他の１つの目的は、ＬＤＬを含む溶液や体液を上記の
ペプチドと接触させることにより、効率よく、しかも、
安全に溶液や体液からＬＤＬを除去する方法を提供する
ことにある。Another object of the present invention is to provide not only the above-mentioned excellent properties, but also the ability to be prepared relatively easily and at low cost, as well as stability against sterilization operations and the like. It is an object of the present invention to provide an LDL selective adsorbing peptide having excellent storage properties. Still another object of the present invention is an LDL-removing adsorbent obtained by binding the peptide of the present invention to a water-insoluble carrier, and when used in a blood purification treatment device or the like used for LDL apheresis, it is efficient and Another object of the present invention is to provide an adsorbent capable of removing LDL under low heparin administration conditions. Still another object of the present invention is to efficiently and moreover bring a solution or a body fluid containing LDL into contact with the peptide.
An object of the present invention is to provide a method for safely removing LDL from a solution or body fluid.
【００１４】[0014]
【課題を解決するための手段】本明細書において、アミ
ノ酸およびペプチドは、下記に示すＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
生化学命名委員会（ＣＢＮ）で採用された略号を用いて
表される。なお、アミノ酸等に関し特に記載のない場合
は、Ｌ体もしくはＤ体のいずれかの立体構造をとるアミ
ノ酸残基を示すものとする。さらに、特に明示しない限
りペプチドのアミノ酸配列の左端および右端は、それぞ
れＮ末端およびＣ末端である。 ＡまたはＡｌａ：アラニン残基、 ＤまたはＡｓｐ：アスパラギン酸残基、 ＥまたはＧｌｕ：グルタミン酸残基、ＦまたはＰｈｅ：フェニルアラニン残基、 ＧまたはＧｌｙ：グリシン残基、 ＨまたはＨｉｓ：ヒスチジン残基、 ＩまたはＩｌｅ：イソロイシン残基、ＫまたはＬｙｓ：リジン残基、 ＬまたはＬｅｕ：ロイシン残基、 ＭまたはＭｅｔ：メチオニン残基、 ＮまたはＡｓｎ：アスパラギン残基、ＰまたはＰｒｏ：プロリン残基、 ＱまたはＧｌｎ：グルタミン残基、 ＲまたはＡｒｇ：アルギニン残基、 ＳまたはＳｅｒ：セリン残基、 ＴまたはＴｈｒ：スレオニン残基、 ＶまたはＶａｌ：バリン残基、 ＷまたはＴｒｐ：トリプトファン残基、 ＹまたはＴｙｒ：チロシン残基、 ＣまたはＣｙｓ：システイン残基。In the present specification, amino acids and peptides are represented by IUPAC-IUB shown below.
Expressed using abbreviations adopted by the Biochemical Nomenclature Committee (CBN). Unless otherwise specified, amino acids and the like refer to amino acid residues having either the L-form or the D-form. Further, the left and right ends of the amino acid sequence of the peptide are the N-terminal and C-terminal, respectively, unless otherwise specified. A or Ala: alanine residue, D or Asp: aspartic acid residue, E or Glu: glutamic acid residue, F or Phe: phenylalanine residue, G or Gly: glycine residue, H or His: histidine residue, I Or Ile: isoleucine residue, K or Lys: lysine residue, L or Leu: leucine residue, M or Met: methionine residue, N or Asn: asparagine residue, P or Pro: proline residue, Q or Gln : Glutamine residue, R or Arg: arginine residue, S or Ser: serine residue, T or Thr: threonine residue, V or Val: valine residue, W or Trp: tryptophan residue, Y or Tyr: tyrosine Residue, C or Cys: cysteine residue.
【００１５】本発明者らは、上記のような問題点を解決
するために鋭意研究を重ねた結果、５〜１０個のアミノ
酸残基からなるペプチドであって、少なくとも１つのＰ
ｈｅおよび少なくとも１つのＡｒｇまたはＬｙｓを含む
特定のアミノ酸配列を有し、かつ、特定の電荷（Ｅ）
［但し、Ｅは式：Ｅ＝（該ペプチド中の正電荷を有する
官能基の数）−（該ペプチド中の負電荷を有する官能基
の数）で定義される］が式：Ｅ＝０の条件を満足するペ
プチドが、驚くべきことに、優れたＬＤＬ選択吸着性を
有し、それでいてブラジキニンの産生を惹起せず、か
つ、低ヘパリン投与条件下においても血液凝固を起こさ
ないため、優れたＬＤＬ選択吸着性ペプチドであること
を見いだし、本発明を完成した。The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, it has been found that a peptide consisting of 5 to 10 amino acid residues,
has a specific amino acid sequence comprising he and at least one Arg or Lys, and has a specific charge (E)
[Where E is defined by the formula: E = (number of positively-charged functional groups in the peptide)-(number of negatively-charged functional groups in the peptide)] Surprisingly, a peptide that satisfies the conditions has an excellent LDL selective adsorption property, yet does not induce the production of bradykinin, and does not cause blood coagulation even under low heparin administration conditions. The present inventors have found that the peptide is a selective adsorptive peptide and completed the present invention.
【００１６】すなわち、本発明は、式（１）または式
（２）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであ
り、該ペプチドが有する電荷（Ｅ）がＥ＝０であるＬＤ
Ｌ選択吸着性ペプチドが提供される。 （Ｘ1 ）p ―α―Ｐｈｅ―β―Ｌｙｓ―γ―（Ｘ2 ）q （１）または （Ｘ1 ）p ―α―Ｐｈｅ―β―Ａｒｇ―γ―（Ｘ2 ）q （２） ［但し、式（１）および（２）の左端および右端は、そ
れぞれＮ末端およびＣ末端であり、各Ｘ1 および各Ｘ2
は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基であり、α
はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒのいずれか
のアミノ酸残基、βはＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
のいずれかのアミノ酸残基、γはＡｓｐ、Ｇｌｕのいず
れかのアミノ酸残基、ｐおよびｑはそれぞれアミノ酸残
基Ｘ1 およびＸ2 の数であり、さらに、ｐおよびｑは次
の関係を満足する。 ０≦ｐ＋ｑ≦５］That is, the present invention relates to a peptide having an amino acid sequence represented by the formula (1) or (2), wherein the peptide has an electric charge (E) of E = 0.
An L selective adsorptive peptide is provided. (X 1 ) p -α-Phe-β-Lys-γ- (X 2 ) q (1) or (X 1 ) p -α-Phe-β-Arg-γ- (X 2 ) q (2) [ However, the left and right ends of the formulas (1) and (2) are the N-terminal and the C-terminal, respectively, and X 1 and X 2
Are each independently any amino acid residue; α
Is any amino acid residue of Ala, Ile, Leu, Phe, Tyr, β is Ile, Lys, Phe, Tyr
Is an amino acid residue of Asp or Glu, p and q are the numbers of amino acid residues X 1 and X 2 , respectively, and p and q satisfy the following relationship: I do. 0 ≦ p + q ≦ 5]
【００１７】また、本発明は、上記のペプチドが結合し
た水不溶性担体からなるＬＤＬ吸着材を提供する。さら
に、本発明は、ＬＤＬを含む溶液や体液と上記のペプチ
ドを接触させた後、体液を回収することからなる、溶液
または体液からＬＤＬを選択的に除去する方法を提供す
る。さらにまた、本発明は、上記のペプチドからなるこ
とを特徴とするＬＤＬ結合用試薬を提供する。Further, the present invention provides an LDL adsorbent comprising a water-insoluble carrier to which the above-mentioned peptide is bound. Furthermore, the present invention provides a method for selectively removing LDL from a solution or a body fluid, which comprises contacting a solution or a body fluid containing LDL with the peptide and then collecting the body fluid. Furthermore, the present invention provides an LDL-binding reagent comprising the above-mentioned peptide.
【００１８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ＬＤＬ選択吸着性ペプチドは、式（１）または式（２）
で表されるアミノ酸配列を有し、芳香族炭化水素基を側
鎖とするアミノ酸残基であるＰｈｅを少なくとも１つ有
し、さらに、陽性電荷を有するグアニジノ基を側鎖にも
つＡｒｇ、または陽性電荷を有するアミノ基を側鎖にも
つＬｙｓから選ばれるアミノ酸残基を少なくとも１つ有
することが必要である。本発明において、上記のアミノ
酸残基であるＰｈｅおよびＡｒｇまたはＬｙｓは、いず
れもＬ型であってもＤ型であってもよい。本発明者ら
は、鋭意研究の結果、式（１）または式（２）で表され
るアミノ酸配列を有するペプチドがＬＤＬに存在するａ
ｐｏＢタンパクと結合するために、優れたＬＤＬ選択吸
着性を発揮することを知見した。Hereinafter, the present invention will be described in detail. The LDL-selective adsorbing peptide of the present invention has the formula (1) or the formula (2)
Arg having at least one Phe which is an amino acid residue having an aromatic hydrocarbon group as a side chain, and further having a positively charged guanidino group in the side chain, or It is necessary to have at least one amino acid residue selected from Lys having a charged amino group in the side chain. In the present invention, the above amino acid residues Phe and Arg or Lys may be either L-type or D-type. The present inventors have conducted intensive studies and found that a peptide having an amino acid sequence represented by Formula (1) or Formula (2) is present in LDL.
It has been found that, due to binding to the poB protein, it exhibits excellent LDL selective adsorption.
【００１９】すなわち、本発明者らは、式（１）または
式（２）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが結
合した水不溶性担体と、式（１）または式（２）で表さ
れるアミノ酸配列を有さないペプチドが結合した水不溶
性担体について、通常のＬＤＬに対する吸着性と、ａｐ
ｏＢタンパクを化学的に修飾したＬＤＬに対する吸着性
を比較した。その結果、式（１）または式（２）で表さ
れるアミノ酸配列を有さないペプチドが結合した水不溶
性担体においては、通常のＬＤＬに対する吸着性とａｐ
ｏＢタンパクを化学的に修飾したＬＤＬに対する吸着性
には、ほとんど差がなかった。一方、式（１）または式
（２）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドが結合
した水不溶性担体については、通常のＬＤＬに対する吸
着性に比べて、ａｐｏＢタンパクを化学的に修飾したＬ
ＤＬに対する吸着性が非常に低かった（実施例４および
比較例４を参照）。このことは、式（１）または式
（２）で表されるアミノ酸配列を有するペプチドは、ａ
ｐｏＢタンパクを化学的に修飾することによって、ＬＤ
Ｌに対する吸着性を失うことを意味する。すなわち、式
（１）または式（２）で表されるアミノ酸配列を有する
ペプチドの有するＬＤＬ吸着性は、ａｐｏＢタンパクを
認識することに起因していることを意味する。したがっ
て、本発明のペプチドは、優れたＬＤＬ選択吸着性を発
揮するものと考えられる。That is, the present inventors have shown that a water-insoluble carrier to which a peptide having an amino acid sequence represented by the formula (1) or (2) is bonded, and a water-insoluble carrier represented by the formula (1) or (2) For a water-insoluble carrier to which a peptide having no amino acid sequence is bound, ordinary LDL adsorptivity and ap
The adsorptivity of oB protein to LDL chemically modified was compared. As a result, in a water-insoluble carrier to which a peptide having no amino acid sequence represented by the formula (1) or (2) is bound, ordinary LDL adsorbability and ap
There was almost no difference in adsorptivity to LDL obtained by chemically modifying oB protein. On the other hand, for the water-insoluble carrier to which the peptide having the amino acid sequence represented by the formula (1) or (2) is bound, the Lpo obtained by chemically modifying the apoB protein is compared with the normal LDL adsorption.
The adsorptivity to DL was very low (see Example 4 and Comparative Example 4). This means that the peptide having the amino acid sequence represented by the formula (1) or (2)
By chemically modifying the poB protein, LD
It means that the adsorptivity to L is lost. That is, it means that the LDL adsorptivity of the peptide having the amino acid sequence represented by the formula (1) or (2) is caused by recognizing the apoB protein. Therefore, the peptide of the present invention is considered to exhibit excellent LDL selective adsorption.
【００２０】また、式（１）または式（２）のγは、側
鎖の電荷が負のアミノ酸であるＡｓｐまたはＧｌｕであ
ることが必須である。本発明のペプチドのγを除くアミ
ノ酸配列、特にα―Ｐｈｅ―β―Ｌｙｓ、またはα―Ｐ
ｈｅ―β―Ａｒｇの配列は、ＬＤＬのａｐｏＢタンパク
と強く結合すると考えられる。また、γであるところの
Ａｓｐ、Ｇｌｕの側鎖の持つ負電荷の効果により、ＬＤ
Ｌよりも当電点の低いＨＤＬを吸着させず、ＬＤＬをよ
り選択的に吸着させることができるものと考えられる。
さらに、Ａｓｐの側鎖のｐＫ値は、Ｇｌｕのそれよりも
低いので、ＨＤＬを吸着させずＬＤＬをさらによく選択
的に吸着させることができるので、γはＡｓｐであるこ
とが好ましい。It is essential that γ in the formula (1) or (2) is Asp or Glu whose side chain charge is a negative amino acid. Amino acid sequence excluding γ of the peptide of the present invention, particularly α-Phe-β-Lys or α-P
It is thought that the sequence of he-β-Arg binds strongly to the apoB protein of LDL. Also, due to the effect of the negative charge of the side chains of Asp and Glu, which is γ, LD
It is considered that LDL can be adsorbed more selectively without adsorbing HDL having a lower electric point than L.
Furthermore, since the pK value of the side chain of Asp is lower than that of Glu, γ is preferably Asp because LDL can be more selectively adsorbed without adsorbing HDL.
【００２１】さらに、ＬＤＬ選択吸着性の観点から、好
ましくは、式（１）または式（２）で表されるペプチド
中に、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ、Ｐｈｅ−Ｔｙ
ｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ａｓ
ｐ、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ａｒｇ−Ａｓｐのいずれかのアミノ酸配列を少なくと
も１つ有することが望ましい。なお、本明細書に記載さ
れるＬＤＬ選択吸着性とは、（ＬＤＬの吸着率／ＨＤＬ
の吸着率）の値、または（ＬＤＬの吸着量／ＨＤＬの吸
着量）の値をいう。例えば、（ＬＤＬの吸着率／ＨＤＬ
の吸着率）の値、または（ＬＤＬの吸着量／ＨＤＬの吸
着量）の値が１より大きいものは、ＨＤＬよりもＬＤＬ
を多く吸着し、ＬＤＬ選択吸着性があり、その値が大き
ければ大きいほど、ＬＤＬ選択吸着性に優れていること
になる。逆に、（ＬＤＬの吸着率／ＨＤＬの吸着率）の
値、または（ＬＤＬの吸着量／ＨＤＬの吸着量）の値が
１以下のものは、ＬＤＬ選択吸着性がないことになる。Further, from the viewpoint of LDL selective adsorption, preferably, the peptide represented by the formula (1) or (2) contains Phe-Phe-Lys-Asp, Phe-Ty
r-Lys-Asp, Phe-Ile-Lys-As
p, Phe-Ile-Arg-Asp, Phe-Lys
It is desirable to have at least one of the amino acid sequences of -Arg-Asp. The LDL selective adsorptivity described in this specification is (LDL adsorption rate / HDL)
Of LDL or the amount of (LDL adsorption amount / HDL adsorption amount). For example, (LDL adsorption rate / HDL
The value of (adsorption rate of LDL) or the value of (adsorption amount of LDL / adsorption amount of HDL) is larger than 1 than that of HDL.
And the LDL selective adsorption property. The larger the value, the better the LDL selective adsorption property. Conversely, when the value of (the adsorption rate of LDL / the adsorption rate of HDL) or the value of (the adsorption amount of LDL / the adsorption amount of HDL) is 1 or less, there is no LDL selective adsorption.
【００２２】式（１）または（２）で表されるアミノ酸
配列を有する本発明のペプチドにおいて、Ｘ1 およびＸ
2 として用いることのできるアミノ酸残基とは、１分子
内に少なくとも１つのアミノ基と少なくとも１つのカル
ボキシル基をもつ有機化合物分子であるアミノ酸に由来
するものであれば特に限定はなく、アミノ基の水素が分
子内の他の部分と置換して二級アミンとなった環状化合
物に由来する残基であってもよく、また、非タンパク質
性のアミノ酸に由来する残基であってもよい。上記のア
ミノ酸の例としては、Ｌ体の立体構造を有するαーアミ
ノ酸、Ｄ体の立体構造を有するαーアミノ酸、その他に
βーアミノ酸、γーアミノ酸およびδーアミノ酸が挙げ
られる。In the peptide of the present invention having the amino acid sequence represented by the formula (1) or (2), X 1 and X
The amino acid residue that can be used as 2 is not particularly limited as long as it is derived from an amino acid that is an organic compound molecule having at least one amino group and at least one carboxyl group in one molecule. It may be a residue derived from a cyclic compound that has become a secondary amine by replacement of hydrogen with another part in the molecule, or may be a residue derived from a non-protein amino acid. Examples of the above amino acids include α-amino acids having an L-configuration, α-amino acids having a D-configuration, and β-amino acids, γ-amino acids, and δ-amino acids.
【００２３】αーアミノ酸の例としては、グリシンや、
Ｌ体の立体構造を有するＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギ
ン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−
グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リ
ジン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギ
ン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、
Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−トリプ
トファン、Ｌ−チロシンおよびＬ−システインが挙げら
れる。Ｄ型の立体構造を有するアミノ酸の例としては、
上記したＬ型アミノ酸の光学異性体が挙げられる。Examples of α-amino acids include glycine and
L-alanine, L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-phenylalanine, L-
Glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-lysine, L-leucine, L-methionine, L-asparagine, L-proline, L-glutamine, L-arginine,
L-serine, L-threonine, L-valine, L-tryptophan, L-tyrosine and L-cysteine. Examples of amino acids having a D-shaped configuration include:
Examples include the optical isomers of the above-mentioned L-type amino acids.
【００２４】非タンパク質性のアミノ酸としては、β−
アラニン、γ−アミノ酪酸、ホモシステイン、オルニチ
ン、５−ヒドロキシトリプトファン、３，４−ジヒドロ
キシフェニルアラニン、トリヨードチロニンおよびチロ
キシンが挙げられる。本発明におけるペプチドとは、ア
ミノ酸がペプチド結合したものを言うが、さらに、アミ
ノ酸とＮ−置換グリシンモノマーが結合した組成物も本
発明におけるペプチドに含まれる。本発明においてペプ
チドの電荷（Ｅ）とは、ペプチドが担体に結合する前の
ペプチドの電荷を指し、式：Ｅ＝（該ペプチド中の正電
荷を有する官能基の数）−（該ペプチド中の負電荷を有
する官能基の数）で定義される。Non-protein amino acids include β-
Alanine, γ-aminobutyric acid, homocysteine, ornithine, 5-hydroxytryptophan, 3,4-dihydroxyphenylalanine, triiodothyronine and thyroxine. The peptide in the present invention refers to a peptide in which an amino acid is bound to a peptide, and a composition in which an amino acid is bound to an N-substituted glycine monomer is also included in the peptide in the present invention. In the present invention, the charge (E) of the peptide refers to the charge of the peptide before the peptide is bound to the carrier, and has the formula: E = (the number of functional groups having a positive charge in the peptide)-( The number of functional groups having a negative charge).
【００２５】本発明において、正電荷を有する官能基ま
たは負電荷を有する官能基とは、該ペプチドが有する官
能基の中で、中性（ｐＨ７．０）の水溶液中でイオン化
して正または負の電荷を帯びる官能基のことである。例
えば、ペプチド分子のＮ末端のアミノ基は正の電荷を有
し、Ｃ末端のカルボキシル基は負の電荷を有する。但
し、アミノ酸は水溶液中において、その種類および水溶
液のｐＨによって様々な電離状態を有するので、側鎖に
官能基を有するアミノ酸残基の場合、そのアミノ酸を有
するペプチドの中性（ｐＨ７．０）水溶液において、そ
のアミノ酸残基の８０％以上が有する電離状態に基づ
き、イオン化した官能基の数を求める。例えば、ペプチ
ドが、側鎖にグアニジノ基を有するＡｒｇを有する場
合、そのペプチドの中性（ｐＨ７．０）水溶液中におい
て、８０％以上のＡｒｇが、イオン化されて正電荷を帯
びたグアニジノ基を有するので、Ａｒｇが側鎖に有する
グアニジノ基は、正電荷を有する官能基とみなす。Ｌｙ
ｓが側鎖に有するアミノ基も、正電荷を有する官能基で
ある。一方、ＡｓｐやＧｌｕが側鎖に有するカルボキシ
ル基等は、負電荷をもつ官能基である。但し、該ペプチ
ド分子が有するアミノ基またはカルボキシル基が、該ペ
プチド分子以外の分子と反応して酸アミド結合等を形成
したり、保護基によって保護されたりして、電荷をもた
ない状態になった基は、もちろん、イオン化した官能基
とはみなさない。In the present invention, the term “functional group having a positive charge” or “functional group having a negative charge” refers to a functional group of the peptide which is positive or negative by ionizing in a neutral (pH 7.0) aqueous solution. Is a functional group that takes on the charge of For example, the N-terminal amino group of the peptide molecule has a positive charge and the C-terminal carboxyl group has a negative charge. However, amino acids have various ionization states in an aqueous solution depending on the kind and pH of the aqueous solution. Therefore, in the case of an amino acid residue having a functional group in a side chain, a neutral (pH 7.0) aqueous solution of a peptide having the amino acid is used. In, the number of ionized functional groups is determined based on the ionization state of 80% or more of the amino acid residues. For example, when the peptide has an Arg having a guanidino group in the side chain, in a neutral (pH 7.0) aqueous solution of the peptide, 80% or more of the Arg has a guanidino group which is ionized and has a positive charge. Therefore, the guanidino group that Arg has on the side chain is regarded as a functional group having a positive charge. Ly
The amino group that s has in the side chain is also a functional group having a positive charge. On the other hand, a carboxyl group or the like of Asp or Glu in the side chain is a functional group having a negative charge. However, an amino group or a carboxyl group of the peptide molecule reacts with a molecule other than the peptide molecule to form an acid amide bond or the like, or is protected by a protecting group, so that the peptide molecule has no charge. Such groups are, of course, not considered as ionized functional groups.
【００２６】本発明のペプチドの電荷（Ｅ）は、Ｅ＝０
であることが必須である。電荷（Ｅ）が負の場合、陰性
電荷の影響により、血液中にブラジキニンと呼ばれる生
理活性物質が生成されてしまう恐れがある。一方、通常
体外循環治療においては、血液を凝固させないように、
ヘパリン等のような抗凝固剤が用いられるが、電荷が極
端に正の場合、血液凝固を起こしやすいので、抗凝固剤
の使用量を増やす必要がある。このことは、ヘパリン使
用量にかかる経済性や、ヘパリンの長期使用による副作
用、および出血性の疾患を有する患者への使用に対する
危険性を考慮すると不利である。したがって、体外循環
治療においては、できるだけヘパリンの投与量を減らす
ことが望まれている。しかし、低ヘパリン投与条件下に
おいては、ペプチドの電荷が正の場合、血液中の細胞や
タンパク質が吸着または活性化され、血液凝固を起こし
やすい。The charge (E) of the peptide of the present invention is E = 0
Is essential. When the charge (E) is negative, a physiologically active substance called bradykinin may be generated in blood due to the negative charge. On the other hand, usually in extracorporeal circulation treatment, so as not to coagulate the blood,
An anticoagulant such as heparin is used, but when the charge is extremely positive, blood coagulation is likely to occur, so that it is necessary to increase the amount of the anticoagulant used. This is disadvantageous in view of the economics of heparin use, the side effects of long-term use of heparin, and the danger for use in patients with bleeding disorders. Therefore, in extracorporeal circulation treatment, it is desired to reduce the dose of heparin as much as possible. However, under low heparin administration conditions, when the charge of the peptide is positive, cells or proteins in the blood are adsorbed or activated, and blood coagulation is likely to occur.
【００２７】本発明者らは、ＷＯ９７／００８８９にお
いて、該ペプチドが臭化シアンセファロースに固定され
た樹脂を用いて、ヘパリン１ＩＵ／ｍｌを含んだ血液の
血球付着性を評価した。さらに、本発明者らは、電荷が
０である本発明のペプチドと＋１の正電荷を有するペプ
チドのカルボキシル基末端側のアミノ酸の官能基を利用
して、吸着担体に結合させたチオプロピルセファロース
を用いて、ヘパリン１ＩＵ／ｍｌ以下の低ヘパリン条件
下における血液凝固性を比較した。その結果、本発明の
ペプチドは、ヘパリン１ＩＵ／ｍｌより低いヘパリン条
件下でも、血液を凝固させないことを確認した（実施例
５および比較例５を参照）。The present inventors evaluated the blood cell adhesion of blood containing 1 IU / ml of heparin using a resin in which the peptide was immobilized on cyanogen sepharose bromide in WO97 / 00889. Furthermore, the present inventors utilize the functional group of the amino acid on the terminal side of the carboxyl group of the peptide of the present invention having a charge of 0 and the peptide having a positive charge of +1 to convert thiopropyl sepharose bound to an adsorption carrier. The blood coagulability under low heparin conditions of 1 IU / ml or less of heparin was compared. As a result, it was confirmed that the peptide of the present invention did not coagulate blood even under heparin conditions lower than 1 IU / ml of heparin (see Example 5 and Comparative Example 5).
【００２８】また、ＬＤＬ選択吸着性という観点から、
ＬＤＬとＨＤＬの等電点を比較すると、ＨＤＬの方がＬ
ＤＬよりも等電点が低く、血液中では、ＨＤＬの方がＬ
ＤＬよりも、より陰性の電荷を帯びていると考えられ
る。したがって、ペプチドが正電荷の場合、ＨＤＬを吸
着しやすくなるものと考えられるので、ＨＤＬの吸着が
少なく、ＬＤＬを多く吸着させるＬＤＬ選択吸着性ペプ
チドの電荷は、できるだけ、正電荷を持たない方がよ
い。以上の理由により、ペプチドの電荷は０でなければ
ならない。From the viewpoint of LDL selective adsorption,
Comparing the isoelectric points of LDL and HDL, HDL is lower than L
Isoelectric point is lower than DL, and in blood, HDL is lower than L
It is considered to have a more negative charge than DL. Therefore, when the peptide is positively charged, it is considered that HDL is easily adsorbed. Therefore, the LDL-selective adsorbing peptide that adsorbs less HDL and adsorbs more LDL should have no positive charge as much as possible. Good. For the above reasons, the charge of the peptide must be zero.
【００２９】本発明のペプチドの総アミノ酸残基数は、
最低５残基が必要である。また、アミノ酸残基数は一般
に多くなれば物理化学的な安定性が悪くなり、１０個を
越えるアミノ酸残基からなるペプチドは、耐滅菌性や保
存性が低下する傾向にある。さらに、経済性を考慮する
と、できるだけ短い方が好ましく、より好ましくは５残
基である。但し、通常ペプチドの吸着担体への固定化反
応は、ペプチドのＮ末端のアミノ基やＣ末端のカルボキ
シル基を利用して固定化されるが、吸着担体への固定化
のしやすさを考慮し、ペプチドのＮまたはＣ末端側にチ
オール基等の官能基を有したＣｙｓ等のアミノ酸を一つ
導入し、その官能基を利用して固定化することができ、
その場合６残基となる。The total number of amino acid residues of the peptide of the present invention is
A minimum of 5 residues is required. In general, as the number of amino acid residues increases, the physicochemical stability deteriorates, and peptides having more than 10 amino acid residues tend to have reduced sterilization resistance and storage stability. Further, in consideration of economy, it is preferable that the length is as short as possible, more preferably 5 residues. However, the immobilization reaction of the peptide on the adsorption carrier is usually immobilized using the amino group at the N-terminus or the carboxyl group at the C-terminus of the peptide. A single amino acid such as Cys having a functional group such as a thiol group on the N or C terminal side of the peptide can be introduced and immobilized using the functional group;
In that case, there are six residues.
【００３０】本発明において、例えば、アミノ酸残基に
その光学異性体や光学異性体の混合物を用いたり、該ペ
プチドのＮ末端部分のアミノ基やＣ末端部分のカルボキ
シル基、および該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の側
鎖に有するアミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、
カルボキシル基、カルバミド基、水酸基、メルカプト基
およびインドリル基等を保護基にて保護してもよい。In the present invention, for example, an amino acid residue may be an optical isomer or a mixture of optical isomers, or may be an amino group at the N-terminal part or a carboxyl group at the C-terminal part of the peptide, and may be contained in the peptide Amino group, guanidino group, imidazolyl group,
A carboxyl group, a carbamide group, a hydroxyl group, a mercapto group, an indolyl group and the like may be protected by a protecting group.
【００３１】ペプチドのＮ末端部分のアミノ基や、アミ
ノ酸残基の側鎖に存在するアミノ基の保護基の例として
は、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、ｐ−メトキシ
ベンジルオキシカルボニル（Ｚ（ＯＭｅ））基、ｐ−ク
ロロベンジルオキシカルボニル（Ｚ（Ｃｌ））基、ｐ−
ニトロベンジルオキシカルボニル（Ｚ（ＮＯ2 ））基、
ｐ−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル（Ｐｚ）
基、ｐ−メトキシフェニルアゾベンジルオキシカルボニ
ル（Ｍｚ）基、３，５−ジメトキシベンジルオキシカル
ボニル（Ｚ（ＯＭｅ）2 ）基、３，４，５−トリメトキ
シベンジルオキシカルボニル（Ｚ（ＯＭｅ）3 ）基、第
三ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、第三アミロキシカ
ルボニル（Ａｏｃ）基、ｐ−ビフェニルイソプロピルオ
キシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、ジイソプロピルメチロ
キシカルボニル（Ｄｉｐｍｏｃ）基、アダマンチルオキ
シカルボニル（Ａｄｏｃ）基、イソボルニルオキシカル
ボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル（Ｐｏｃ）
基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、フルフリルオ
キシカルボニル基、ベンズヒドリルオキシカルボニル
基、ピペリジノオキシカルボニル基、ホルミル（ＨＣ
Ｏ）基、トリフルオロアセチル（Ｔｆａ）基、フタリル
（Ｐｈｔ）基、トシル（Ｔｏｓ）基、ｏ−ニトロフェニ
ルスルフェニル（Ｎｐｓ）基、ベンゾイル（Ｂｚ）基、
クロロアセチル基、アセトアセチル基、トリチル（Ｔｒ
ｔ）基、ベンジリデン基、ベンジル基、２−ベンゾイル
−１−メチルビニル（Ｂｍｖ）基、トリメチルシリル
（Ｔｍｓ）基、２−ヒドロキシアリリデン基、エナミン
基、ジメドン（５，５−ジメチルシクロヘキサン−１，
３−ジオン）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボ
ニル（Ｆｍｏｃ）基等が挙げられる。Examples of the amino group at the N-terminal part of the peptide or the protecting group for the amino group present on the side chain of the amino acid residue include a benzyloxycarbonyl (Z) group and a p-methoxybenzyloxycarbonyl (Z (OMe )) Group, p-chlorobenzyloxycarbonyl (Z (Cl)) group, p-
A nitrobenzyloxycarbonyl (Z (NO 2 )) group,
p-phenylazobenzyloxycarbonyl (Pz)
Group, p-methoxyphenylazobenzyloxycarbonyl (Mz) group, 3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl (Z (OMe) 2 ) group, 3,4,5-trimethoxybenzyloxycarbonyl (Z (OMe) 3 ) Group, tert-butoxycarbonyl (Boc) group, tertiary-amyloxycarbonyl (Aoc) group, p-biphenylisopropyloxycarbonyl (Bpoc) group, diisopropylmethyloxycarbonyl (Dipmoc) group, adamantyloxycarbonyl (Adoc) group, iso- Bornyloxycarbonyl group, cyclopentyloxycarbonyl (Poc)
Group, cyclohexyloxycarbonyl group, furfuryloxycarbonyl group, benzhydryloxycarbonyl group, piperidinooxycarbonyl group, formyl (HC
O) group, trifluoroacetyl (Tfa) group, phthalyl (Pht) group, tosyl (Tos) group, o-nitrophenylsulfenyl (Nps) group, benzoyl (Bz) group,
Chloroacetyl group, acetoacetyl group, trityl (Tr
t) group, benzylidene group, benzyl group, 2-benzoyl-1-methylvinyl (Bmv) group, trimethylsilyl (Tms) group, 2-hydroxyallylidene group, enamine group, dimedone (5,5-dimethylcyclohexane-1,
3-dione) group, 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group and the like.
【００３２】ペプチドのＣ末端部分のカルボキシル基
や、アミノ酸残基の側鎖に存在するカルボキシル基の保
護基の例としては、アミド、ジメチルアミド、メチルエ
ステル（―ＯＭｅ）、エチルエステル（―ＯＥｔ）、ベ
ンジルエステル（―ＯＢｚｌ）、ｐ−ニトロベンジルエ
ステル（―ＯＢｚｌ（ＮＯ2 ））、ｐ−メトキシベンジ
ルエステル、２，４，６−トリメチルベンジルエステ
ル、ペンタメチルベンジルエステル、第三ブチルエステ
ル（―ＯＢｕt ）、ジフェニルメチルエステル（―ＯＤ
ＰＭ）、ベンズヒドリルエステル、トリチルエステル、
フタルイミドメチルエステル、シクロペンチルエステ
ル、β―メチルチオエチルエステル、β―（ｐ−ニトロ
チオフェニル）―エチルエステル、フェナシルエステ
ル、４−ピコリルエステルなどが挙げられる。その他ア
ミノ酸残基が側鎖に有する官能基に対して、種々の保護
基を用いることができる。（例えば、泉屋信夫、加藤哲
夫、青柳東彦、脇道典著「ペプチド合成の基礎と実験」
日本国、丸善株式会社（１９８５年）参照）。Examples of the carboxyl group at the C-terminal part of the peptide or the carboxyl group protecting group on the side chain of the amino acid residue include amide, dimethylamide, methyl ester (—OMe), and ethyl ester (—OEt). , benzyl ester (-OBzl), p-nitrobenzyl ester (-OBzl (NO 2)), p- methoxybenzyl ester, 2,4,6-trimethyl benzyl ester, pentamethyl benzyl ester, tert-butyl ester (-OBu t ), diphenyl methyl ester (-OD
PM), benzhydryl ester, trityl ester,
Examples include phthalimide methyl ester, cyclopentyl ester, β-methylthioethyl ester, β- (p-nitrothiophenyl) -ethyl ester, phenacyl ester, 4-picolyl ester, and the like. In addition, various protecting groups can be used for the functional group of the amino acid residue in the side chain. (For example, Nobuo Izumiya, Tetsuo Kato, Higashihiko Aoyagi, Michinori Waki, "Basics and experiments of peptide synthesis"
Japan, Maruzen Co., Ltd. (1985)).
【００３３】ペプチドの合成は、ペプチド合成において
通常用いられる方法、例えば、固相合成法または液相合
成法により行われるが、固相合成法により行う方が、操
作が簡便であるため好ましい（例えば、日本国、日本生
化学会編「新生化学実験講座１タンパク質ＩＶ 合成お
よび発現」日本国、東京化学同人（１９９２年）参
照）。The peptide is synthesized by a method usually used in peptide synthesis, for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method, but the solid phase synthesis method is preferred because the operation is simpler (for example, See, Biochemical Society of Japan, edited by The Chemical Society of Japan, "Course for New Chemistry Experiment 1 Protein IV Synthesis and Expression", Tokyo Kagaku Dojin, Japan (1992)).
【００３４】固相合成法によるペプチドの合成は、市販
のペプチド合成用の樹脂、例えば、ジビニルベンゼンを
含むポリスチレンなどの重合体にペプチド固相合成に適
した反応性をもつ官能基を結合させた樹脂を用い、目的
とするペプチドの合成をそのＣ末端側からＮ末方向に向
かって行う。例えば、α−カルボキシル基以外のアミノ
基などの官能基を保護したアミノ酸と、α−アミノ基以
外の、カルボキシル基等の官能基を保護したアミノ酸と
を縮合させて結合させる操作と、結合したアミノ酸にお
けるα−アミノ基などのペプチド結合を形成するアミノ
基が有する保護基のみを除去する操作を、順次繰返して
いくことによってペプチド鎖を伸長させ、所望のアミノ
酸配列をもつペプチドを形成し、次いで、該ペプチドを
樹脂から脱離させ、かつ、保護基が付加されている全て
の官能基から保護基を除去することにより、目的とする
ペプチドを得ることができる。必要に応じてこのペプチ
ドを、さらに精製することにより、純度の高いものを得
ることができる。ペプチドの精製は有機化合物の精製に
一般的に用いられている方法が使用できる。特にカラム
クロマトグラフィーによる精製は、効率良く精製を行え
るので好ましい。In the peptide synthesis by the solid phase synthesis method, a functional group having a reactivity suitable for solid phase peptide synthesis is bonded to a commercially available resin for peptide synthesis, for example, a polymer such as polystyrene containing divinylbenzene. Using a resin, the target peptide is synthesized from its C-terminal side toward the N-terminal. For example, an operation of condensing and bonding an amino acid having a protected functional group such as an amino group other than an α-carboxyl group with an amino acid having a protected functional group such as a carboxyl group other than an α-amino group, The sequence of removing only the protecting group of the amino group forming a peptide bond such as an α-amino group in is sequentially repeated to extend the peptide chain, to form a peptide having a desired amino acid sequence, The desired peptide can be obtained by removing the peptide from the resin and removing the protecting group from all functional groups to which the protecting group has been added. If necessary, the peptide can be further purified to obtain a highly pure peptide. For the purification of the peptide, a method generally used for the purification of an organic compound can be used. In particular, purification by column chromatography is preferable because purification can be performed efficiently.
【００３５】本発明のペプチドを水不溶性担体に、直接
またはスペーサーを介して間接的に結合させることによ
って、ＬＤＬを含んだ溶液や腹水、組織液、全血および
血漿等の体液からＬＤＬを除去するための吸着材として
使用することができる。例えば、血液を人工的な装置に
よって体外循環させ、血液中のＬＤＬを除去する際に用
いる吸着材として用いることができ、例えば、家族性高
コレステロール血症等の疾病を有する患者に対し、ＬＤ
Ｌアフェレーシスを行う際に、上記の吸着材を利用した
装置を用いると、効率よく、しかも、安全にＬＤＬを除
去することができるので、高い治療効果を得ることが可
能である。上記の吸着材は、該ペプチドのＮ末端部分の
アミノ基や、Ｃ末端部分のカルボキシル基、またはアミ
ノ酸の側鎖が有する官能基を利用して水不溶性担体に固
定化することにより得ることができる。By removing the LDL from a solution containing LDL or a body fluid such as ascites fluid, tissue fluid, whole blood and plasma by binding the peptide of the present invention to a water-insoluble carrier directly or indirectly via a spacer. Can be used as an adsorbent. For example, blood can be extracorporeally circulated by an artificial device and used as an adsorbent for removing LDL in blood. For example, for patients with diseases such as familial hypercholesterolemia, LD
When L apheresis is performed, if an apparatus using the above adsorbent is used, LDL can be efficiently and safely removed, so that a high therapeutic effect can be obtained. The above adsorbent can be obtained by immobilizing the peptide on the water-insoluble carrier using an amino group at the N-terminal part, a carboxyl group at the C-terminal part, or a functional group of an amino acid side chain. .
【００３６】ペプチドを水不溶性担体に固定化する具体
的な方法としては、例えば、水不溶性担体上に、保護基
を外す条件においても切断されない結合性の基を付加
し、上記水不溶性担体上でペプチドを上記のペプチドの
固相合成法で合成し、保護基が付加されている全ての官
能基から保護基を除去することにより得る方法が挙げら
れる。As a specific method for immobilizing the peptide on the water-insoluble carrier, for example, a binding group that is not cleaved even under the condition of removing the protecting group is added to the water-insoluble carrier, and the peptide is immobilized on the water-insoluble carrier. Examples of the method include a method in which a peptide is synthesized by the above-described solid phase synthesis method of the peptide, and the peptide is obtained by removing the protecting group from all functional groups to which the protecting group is added.
【００３７】また、ペプチドの水不溶性担体への固定化
は、一般にペプチドまたはタンパク質を担体上に固定化
する方法を用いて行うことができる。そのような方法と
しては、例えば、カルボキシル基を有する担体を用い、
このカルボキシル基をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと
反応させることによって、スクシンイミドオキシカルボ
ニル基に変換し、これにペプチドをアミノ基の部分で反
応させる方法（活性エステル法）、アミノ基またはカル
ボキシル基を有する担体を用い、ジシクロヘキシルカル
ボジイミドなどの縮合試薬の存在下で、担体のアミノ基
またはカルボキシル基とペプチドのカルボキシル基また
はアミノ基を縮合反応させて結合させる方法（縮合
法）、担体とペプチドとをグルタルアルデヒドなどの２
個以上の官能基を有する化合物を用いて架橋させて結合
させる方法（担体架橋法）、水酸基を有する担体を用
い、臭化シアンなどのハロゲン化シアンを担体に作用さ
せ、ペプチドやタンパク質のアミノ基の部分で反応させ
て結合させる方法、メルカプト基を有する担体を用い、
ペプチドやタンパク質のメルカプト基の部分で反応させ
る方法、およびエピクロロヒドリンなどのエポキシドを
担体に作用させ、ペプチドのアミノ基の部分や水酸基の
部分で反応させて結合させる方法等が挙げられる。本発
明のペプチドを水不溶性担体に固定する際には、上記の
ごとくペプチドが有するいずれのアミノ酸の官能基を利
用して固定化することができるが、ＬＤＬ選択吸着性を
発揮するためには、式（１）または式（２）で表される
ペプチドのＸ2 に存在するアミノ酸の官能基を利用する
ことが望ましい。The immobilization of the peptide on the water-insoluble carrier can be generally carried out by a method for immobilizing the peptide or protein on the carrier. As such a method, for example, using a carrier having a carboxyl group,
A method in which this carboxyl group is reacted with N-hydroxysuccinimide to convert it into a succinimidooxycarbonyl group, and a peptide is reacted with an amino group (active ester method); a carrier having an amino group or a carboxyl group; A method of condensing an amino group or a carboxyl group of a carrier with a carboxyl group or an amino group of a peptide by condensation reaction in the presence of a condensing reagent such as dicyclohexylcarbodiimide (condensation method); 2
A method of cross-linking and bonding with a compound having two or more functional groups (carrier cross-linking method), using a carrier having a hydroxyl group, a cyanogen halide such as cyanogen bromide is allowed to act on the carrier, and the amino group of a peptide or protein is Using a carrier having a mercapto group, the method of reacting and binding at the portion of
Examples thereof include a method of reacting with a mercapto group of a peptide or protein, a method of reacting an epoxide such as epichlorohydrin on a carrier, and reacting and binding with an amino or hydroxyl group of the peptide. When the peptide of the present invention is immobilized on a water-insoluble carrier, it can be immobilized using the functional group of any amino acid of the peptide as described above, but in order to exhibit LDL selective adsorption, It is desirable to use a functional group of an amino acid present in X 2 of the peptide represented by the formula (1) or (2).
【００３８】さらに、必要に応じて水不溶性担体とペプ
チドを任意の長さの分子（スペーサー）を介して結合さ
せてもよい。スペーサーの詳細に関しては、例えば、
「アフィニティクロマトグラフィー」笠井献一ら、日本
国、東京化学同人、１９９１年、１０５〜１０８頁を参
照することができる。スペーサーを使用することは、本
発明のＬＤＬ結合用ペプチドと水不溶性担体との間に距
離をもたせることにより、該ペプチドとＬＤＬの結合部
位を増加させる観点から好ましい。スペーサーの例とし
ては、ポリメチレン鎖およびポリエチレングリコール鎖
等が挙げられる。スペーサーの長さは５００Å以下であ
ることが好ましく、２００Å以下であることがさらに好
ましい。スペーサーを介して水不溶性担体にペプチドを
結合させる方法としては、例えば、水不溶性担体として
アガロースを用いる場合、アガロースの水酸基とスペー
サーとして用いるヘキサメチレンジイソシアナートの片
側のイソシアナート基を反応、結合させ、残ったイソシ
アナート基とペプチドのアミノ基、水酸基またはカルボ
キシル基等を反応、結合させる方法が挙げられる。Further, if necessary, the water-insoluble carrier and the peptide may be bound via a molecule (spacer) of any length. For details of the spacer, for example,
"Affinity Chromatography," Kenichi Kasai et al., Tokyo Chemical Dojin, 1991, pp. 105-108. The use of a spacer is preferred from the viewpoint of increasing the binding site between the LDL-binding peptide of the present invention and the water-insoluble carrier, thereby increasing the binding site between the peptide and LDL. Examples of the spacer include a polymethylene chain and a polyethylene glycol chain. The length of the spacer is preferably not more than 500 °, more preferably not more than 200 °. As a method of binding a peptide to a water-insoluble carrier via a spacer, for example, when agarose is used as the water-insoluble carrier, a hydroxyl group of agarose is reacted with an isocyanate group on one side of hexamethylene diisocyanate used as a spacer. A method of reacting and bonding the remaining isocyanate group with the amino group, hydroxyl group or carboxyl group of the peptide.
【００３９】水不溶性担体としては、親水性の表面を有
し、かつ、ペプチドとの間で共有結合を形成することが
できるアミノ基、カルボキシル基および水酸基などの反
応性の官能基を有するものが好ましい。また、上記の不
溶性担体は、吸着させ得る有効表面積が広い多孔質性で
あるものが好ましい。多孔質の担体は、排除限界分子量
が２．０×１０6 〜１．０×１０8 の範囲であることが
好ましく，２．２×１０6 〜８．０×１０7 の範囲であ
ることがさらに好ましい。また、多孔質の担体の平均細
孔径については、２０〜１００ｎｍの範囲であることが
好ましく、２２〜８０ｎｍの範囲であることがさらに好
ましい。担体は粒子状、繊維状、シート状、中空糸状な
どの任意の形状を用いることができる。As the water-insoluble carrier, those having a hydrophilic surface and having a reactive functional group such as an amino group, a carboxyl group and a hydroxyl group capable of forming a covalent bond with a peptide are used. preferable. Further, the insoluble carrier is preferably a porous material having a large effective surface area capable of being adsorbed. The porous carrier preferably has an exclusion limit molecular weight in the range of 2.0 × 10 6 to 1.0 × 10 8 , and preferably in the range of 2.2 × 10 6 to 8.0 × 10 7. More preferred. The average pore diameter of the porous carrier is preferably in the range of 20 to 100 nm, and more preferably in the range of 22 to 80 nm. The carrier may have any shape such as a particle shape, a fiber shape, a sheet shape, and a hollow fiber shape.
【００４０】使用できる担体の材質としては、表面にペ
プチドを担持できるものであれば特に限定されず、無機
化合物、有機化合物であってもよく、また、通常のアフ
ィニティクロマトグラフィーに用いられる担体用の材料
は全て用いることができる。有機化合物からなる担体の
具体例としては、旭化成マイクロキャリア（日本国、旭
化成工業（株）社製）、ＣＭ−セルロファインＣＨ（排
除限界タンパク質分子量：約３×１０6 、日本国、生化
学工業（株）社販売）などのセルロース系担体；セファ
デックス［Ｓｅｐｈａｄｅｘ：スウェーデン国、ファル
マシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ ＡＢ）社製］等のデキストラン系担体；日本国、特
公平１−４４７２５号公報記載の全多孔質活性化ゲル
や、ＣＭ−トヨパール６５０Ｃ（排除限界タンパク質分
子量：５×１０6 、日本国、東ソー（株）社製）等のポ
リビニルアルコール系担体；ＣＭ−トリスアクリルＭ
（ＣＭ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ Ｍ）〔排除限界タンパク
質分子量：１×１０7 、スウェーデン国、ファルマシア
−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕等のポ
リアクリルアミド系担体；およびセファロースＣＬ−４
Ｂ（ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂ）〔排除限界タンパ
ク質分子量：２×１０7 、スウェーデン国、ファルマシ
ア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）社製〕、Ｔ
ｈｉｏｐｒｏｐｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂ［排除
限界タンパク質分子量：４×１０6 、スウェーデン国、
ファルマシア−ＬＫＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）
社製］等のアガロース系担体が挙げられる。The material of the carrier that can be used is not particularly limited as long as it can support the peptide on the surface, and may be an inorganic compound or an organic compound, and may be a carrier material used for ordinary affinity chromatography. All materials can be used. Specific examples of the organic compound carrier include Asahi Kasei Microcarrier (manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd., Japan) and CM-Cellulofine CH (exclusion limit protein molecular weight: about 3 × 10 6 , Japan, Seikagaku Corporation) Sephadex [Sephadex: Pharmacia Biotec, Sweden]
h AB) Co., Ltd.]; porcine activated gel described in JP-B 1-44725, and CM-Toyopearl 650C (exclusion limit protein molecular weight: 5 × 10 6 , Japan; Polyvinyl alcohol carrier such as Tosoh Corporation; CM-Trisacryl M
A polyacrylamide-based carrier such as (CM-Trisacryl M) [exclusion limit protein molecular weight: 1 × 10 7 , manufactured by Pharmacia-LKB (Pharmacia-LKB), Sweden]; and Sepharose CL-4
B (Sepharose CL-4B) [exclusion limit protein molecular weight: 2 × 10 7 , manufactured by Pharmacia-LKB, Sweden], T
hypropyl-Sepharose 6B [exclusion limit protein molecular weight: 4 × 10 6 , Sweden,
Pharmacia-LKB (Pharmacia-LKB)
Agarose-based carrier.
【００４１】無機化合物からなる担体の具体例として
は、ＣＰＧ−１０−１０００〔排除限界タンパク質分子
量：１×１０8 、平均細孔径：１００ｎｍ、米国エレク
トロ−ニュークレオニクス（Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｕｃｌ
ｅｏｎｉｃｓ）社製〕などの多孔性ガラス等が挙げられ
る。水不溶性担体に固定化するペプチドの量は、一般的
には、０．００１μｍｏｌ／ｍｌ（担体）〜１，０００
μｍｏｌ／ｍｌ（担体）の範囲であり、０．０１μｍｏ
ｌ／ｍｌ〜５００μｍｏｌ／ｍｌの範囲であることが好
ましく、０．１μｍｏｌ／ｍｌ〜２００μｍｏｌ／ｍｌ
の範囲であることがより好ましい。Specific examples of the carrier comprising an inorganic compound include CPG-10-1000 [exclusion limit protein molecular weight: 1 × 10 8 , average pore size: 100 nm, US Electro-Nuclonics (Electro-nucl).
eons). The amount of the peptide immobilized on the water-insoluble carrier generally ranges from 0.001 μmol / ml (carrier) to 1,000 μmol / ml.
μmol / ml (carrier), 0.01 μmo
1 / ml to 500 μmol / ml, preferably 0.1 μmol / ml to 200 μmol / ml
More preferably, it is within the range.
【００４２】また、上記の水不溶性担体として、アガロ
ースゲルなどのソフトゲルまたは架橋されたポリビニル
アルコールなどのハードゲルを用いた場合には、液体ク
ロマトグラフィー等においてＬＤＬの分離、精製用ゲル
として用いることもできる。水不溶性担体にペプチドを
結合させてなる吸着材のＬＤＬおよびＨＤＬに対する結
合性を評価する方法の例としては、吸着材にＬＤＬまた
はＨＤＬを吸着させ、ＬＤＬまたはＨＤＬの吸着した担
体を用いて発色させる方法が挙げられる［ＡＢＣ法（ a
vidin-biotin complex method ）］。例えば、ビオチン
標識化されたＬＤＬまたはＨＤＬを血漿中に添加し、吸
着材をその血漿中に、一定時間浸漬後、吸着材を取り出
して洗浄し、これを西洋ワサビペルオキシダーゼで標識
されたストレプトアビジン溶液に浸漬し、上記酵素の基
質であるオルトフェニレンジアミン溶液を添加すること
によって発色させることにより、ＬＤＬまたはＨＤＬの
結合性を評価することができる。なお、ＬＤＬおよびＨ
ＤＬの結合性の評価方法に関しては、例えば、S.M. Hs
u, L. Raine, H. Fanger: J. Histchem. Cytochem., 2
9, 577 (1981) および H. Towbin, T. Staehelin, J. G
ordon: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,76, 4350 (1
979)を参照することができる。When a soft gel such as agarose gel or a hard gel such as cross-linked polyvinyl alcohol is used as the water-insoluble carrier, it may be used as a gel for separating and purifying LDL in liquid chromatography and the like. it can. As an example of a method for evaluating the binding property of an adsorbent obtained by binding a peptide to a water-insoluble carrier to LDL and HDL, LDL or HDL is adsorbed to the adsorbent, and coloring is performed using the carrier to which LDL or HDL is adsorbed. [ABC method (a
vidin-biotin complex method)]. For example, biotin-labeled LDL or HDL is added to plasma, the adsorbent is immersed in the plasma for a certain period of time, the adsorbent is taken out and washed, and this is treated with a horseradish peroxidase-labeled streptavidin solution. , And by adding an orthophenylenediamine solution which is a substrate of the enzyme, the color is developed, so that the binding property of LDL or HDL can be evaluated. Note that LDL and H
Regarding the method for evaluating the binding property of DL, for example, SM Hs
u, L. Raine, H. Fanger: J. Histchem. Cytochem., 2
9, 577 (1981) and H. Towbin, T. Staehelin, J. G
ordon: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4350 (1
979).
【００４３】また、水不溶性担体に固定化されたペプチ
ドのＬＤＬおよびＨＤＬの吸着量を測定する方法の例と
しては、吸着材にＬＤＬまたはＨＤＬを吸着させ、ＬＤ
ＬまたはＨＤＬの減少率を測定する方法が挙げられる。
例えば、ペプチドが固定化された担体を、一定時間ＬＤ
ＬまたはＨＤＬ溶液に浸漬させ、その後、ＬＤＬまたは
ＨＤＬの減少率をコレステロールを定量して求めること
ができる。As an example of a method for measuring the amount of LDL and HDL adsorbed on a peptide immobilized on a water-insoluble carrier, LDL or HDL is adsorbed on an adsorbent,
A method of measuring the rate of decrease of L or HDL is exemplified.
For example, the carrier on which the peptide is immobilized is placed on LD for a certain period of time.
After immersion in an L or HDL solution, the reduction rate of LDL or HDL can be determined by quantifying cholesterol.
【００４４】また、吸着材を、一定時間血漿に浸漬さ
せ、その後、ＬＤＬコレステロールまたはＨＤＬコレス
テロールを分離し、そのそれぞれの減少率をコレステロ
ールを定量して求めることができる。なお、ＬＤＬおよ
びＨＤＬの吸着量の測定方法については、例えば、Rich
mond, W,: Scand. J. Clin. Lab. Invest., 29(supp
l.), 126 (1972)や Allain, C.C., Poon, L.S., Chan,
C.S.G., Richmond, W. andFu, P.C.: Clin. Chem., 2
0, 470-475 (1974)および Burstein, M., Scholnick,
H.R. and Morfin, R: J. Lipid Res., 11, 583-595 (19
70)を参照することができる。さらには、本発明のペプ
チドは、ＬＤＬが関与している疾患、例えば、動脈硬化
などの血管壁にＬＤＬが沈着している病巣に直接作用す
るペプチド医薬品、およびＬＤＬが存在している病巣に
医薬品を運ぶためのキャリヤーペプチドとして有利に用
いることができる。Further, the adsorbent is immersed in plasma for a certain period of time, and thereafter, LDL cholesterol or HDL cholesterol is separated, and the respective reduction rates can be determined by quantifying cholesterol. In addition, about the measuring method of the adsorption amount of LDL and HDL, for example, Rich
mond, W ,: Scand. J. Clin. Lab. Invest., 29 (supp
l.), 126 (1972), Allain, CC, Poon, LS, Chan,
CSG, Richmond, W. andFu, PC: Clin. Chem., 2
0, 470-475 (1974) and Burstein, M., Scholnick,
HR and Morfin, R: J. Lipid Res., 11, 583-595 (19
70) can be referred to. Furthermore, the peptide of the present invention can be used for a peptide drug which directly acts on a disease in which LDL is involved, for example, a lesion in which LDL is deposited on a blood vessel wall such as arteriosclerosis, and a drug in a lesion in which LDL is present. Can be used advantageously as a carrier peptide for carrying
【００４５】[0045]
【発明の実施の形態】以下、実施例および比較例を挙げ
て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、何らこ
れに限定されるものではない。また、実施例中ではアミ
ノ酸残基は１文字で表記する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited thereto. In the examples, amino acid residues are represented by one letter.
【００４６】[0046]
（実施例１および比較例１）表１に示す一連のペプチド
をペプチド合成キットＳＰＯＴｓ（米国、Ｇｅｎｏｓｙ
ｓ社製）を用いて、添付の取り扱い説明書に従い、添付
のセルロースｍｅｍｂｒａｎｅ上の SPOT 部分にそれぞ
れ合成した。また、ペプチドとＬＤＬとの結合性の測定
は、以下の手順にて行った。すなわち、それぞれのペプ
チドが合成されたｍｅｍｂｒａｎｅ上の SPOT 部分を直
径５ｍｍの円形状に切り取り、９６穴プレートにそれぞ
れ一枚ずつ入れた。(Example 1 and Comparative Example 1) A series of peptides shown in Table 1 were synthesized using a peptide synthesis kit SPOTs (Genosy, USA).
(manufactured by s Co., Ltd.) and synthesized into SPOT portions on the attached cellulose membrane according to the attached instruction manual. The measurement of the binding property between the peptide and LDL was performed according to the following procedure. That is, the SPOT portion on the membrane where each peptide was synthesized was cut out into a circular shape having a diameter of 5 mm, and each was placed in a 96-well plate.
【００４７】その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰ
ＢＳ（−）ｂｕｆｆｅｒで４倍に希釈したブロックエー
ス（日本国、大日本製薬製）溶液１５０μｌを加えて、
４℃で一昼夜放置した。その後、上記溶液を除去後、２
００μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）
ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、続いて２００μｌの蒸留水
で３回洗浄除去後、予めＬＤＬを除去した１０分の１量
の３．８％クエン酸ナトリウム溶液を含む健常人血漿
に、ビオチン標識キット（米国、アマシャム社製）を用
いて、その添付された操作手順書に従いＬＤＬ（米国、
シグマ社製）をビオチン標識した溶液を終濃度が０．２
５μｇ／ｍｌになるように加えた血漿を１００μｌ添加
し、室温で１時間放置した。その後、上記溶液を除去
後、２００μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸
緩衝溶液（以後、ＰＢＳと略す）で３回洗浄し、続いて
２００μｌの蒸留水で３回洗浄除去後、０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むＰＢＳで１０倍に希釈したブロックエー
ス（日本国、大日本製薬製）溶液で５０００倍に希釈さ
れた西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジ
ン溶液（０．２μｇ／ｍｌ）１００μｌを添加し、３０
分間室温で放置した。その後、上記溶液を除去後、２０
０μｌの０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで５回洗
浄し、続いて２００μｌの蒸留水で５回洗浄除去後、
０．００８％の過酸化水素水を含むオルトフェニレンジ
アミン溶液（０．５５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え
て、１５分間室温で反応させた。その後、２Ｎの硫酸溶
液１００μｌを加えて反応停止させ、反応溶液１５０μ
ｌを別の９６穴プレートに移し替え、その溶液の４９０
ｎｍにおける吸光度を測定し、それぞれのペプチドに対
するＬＤＬの吸着率は、ＷＦＷＲＲＧＧＧＧＧの場合を
１００％としたときの相対値（％）として求めた。Thereafter, P containing 0.1% Tween 20 was added.
150 μl of Block Ace (Dainippon Pharmaceutical, Japan) solution diluted 4-fold with BS (−) buffer was added,
It was left overnight at 4 ° C. Then, after removing the above solution, 2
PBS (-) containing 00 μl of 0.1% Tween 20
After washing with a buffer three times, followed by washing and removing three times with 200 μl of distilled water, a healthy human plasma containing a 1/10 amount of a 3.8% sodium citrate solution from which LDL was previously removed was added to a biotin labeling kit ( LDL (U.S.A., manufactured by Amersham Co., USA) according to the attached operation manual.
Sigma) was biotin-labeled to a final concentration of 0.2
100 μl of the plasma added to 5 μg / ml was added and left at room temperature for 1 hour. Thereafter, after removing the above solution, the substrate was washed three times with 200 μl of a phosphate buffer solution (hereinafter abbreviated as PBS) containing 0.1% Tween 20, and then washed and removed three times with 200 μl of distilled water. % Twe
100 μl of a horseradish peroxidase-labeled streptavidin solution (0.2 μg / ml) diluted 5000-fold with a block ace (Dainippon Pharmaceutical, Japan) solution diluted 10-fold with PBS containing en20 was added, and 30
Allowed to stand at room temperature for minutes. Then, after removing the above solution, 20
After washing 5 times with 0 μl of PBS containing 0.1% Tween 20, followed by washing and removing 5 times with 200 μl of distilled water,
100 µl of an orthophenylenediamine solution (0.55 mg / ml) containing 0.008% aqueous hydrogen peroxide was added, and the mixture was reacted at room temperature for 15 minutes. Thereafter, 100 μl of a 2N sulfuric acid solution was added to stop the reaction, and the
was transferred to another 96-well plate and 490 of the solution
The absorbance at nm was measured, and the LDL adsorption rate for each peptide was determined as a relative value (%) when WFWRRGGGGG was taken as 100%.
【００４８】なお、ペプチドとＨＤＬとの結合性の測定
は、上記記載のペプチドとＬＤＬとの結合性測定の操作
において、ビオチン標識したＬＤＬの代わりにビオチン
標識されたＨＤＬ（米国、パーイミューン社製）の溶液
を、終濃度が１．０２μｇ／ｍｌになるように加えた血
漿を用いて同様に測定し、それぞれのペプチドに対する
ＨＤＬの吸着率は、ＷＦＷＲＲＧＧＧＧＧの場合を１０
０％としたときの相対値（％）として求めた。また、Ｌ
ＤＬ選択吸着性は、ＬＤＬの吸着率（％）／ＨＤＬの吸
着率（％）として数値化して求めた。以上の結果を表１
に示した。明らかに、実施例１のペプチドは、式
（１’）または式（２’）のＬＤＬ結合性ペプチドであ
る比較例１に比べて、ＬＤＬ選択吸着性が優れているこ
とがわかる。The measurement of the binding property between the peptide and HDL was carried out in the above-described procedure for measuring the binding property between the peptide and LDL, in place of biotin-labeled LDL, instead of biotin-labeled LDL (manufactured by Perimune, USA). ) Was measured in the same manner using plasma added to a final concentration of 1.02 μg / ml, and the HDL adsorption rate for each peptide was 10% in the case of WFWRRGGGGG.
It was determined as a relative value (%) with 0%. Also, L
The DL selective adsorptivity was numerically determined as LDL adsorption rate (%) / HDL adsorption rate (%). Table 1 shows the above results.
It was shown to. Obviously, the peptide of Example 1 is superior in LDL selective adsorptivity to Comparative Example 1 which is the LDL-binding peptide of Formula (1 ′) or Formula (2 ′).
【００４９】[0049]
【表１】 [Table 1]
【００５０】（実施例２および比較例２）表２に示す一
連のペプチドをペプチド合成キットＳＰＯＴｓ（米国、
Ｇｅｎｏｓｙｓ社製）を用いて、添付の取り扱い説明書
に従い、添付のセルロースｍｅｍｂｒａｎｅ上の SPOT
部分にそれぞれ合成した。また、ペプチドとＬＤＬおよ
びＨＤＬとの結合性については、実施例１と同様の方法
で測定した。以上の結果を表２に示した。明らかに、実
施例２のペプチドは、式（１’）または式（２’）のＬ
ＤＬ結合性ペプチドである比較例２に比べて、ＬＤＬ選
択吸着性が優れていることがわかる。(Example 2 and Comparative Example 2) A series of peptides shown in Table 2 were synthesized with a peptide synthesis kit SPOTs (US,
Genosys) and according to the attached instruction manual, SPOT on the attached cellulose membrane
Each part was synthesized. The binding between the peptide and LDL and HDL was measured in the same manner as in Example 1. Table 2 shows the above results. Obviously, the peptide of Example 2 has the L of formula (1 ′) or (2 ′)
It can be seen that the LDL selective adsorption is superior to Comparative Example 2 which is a DL-binding peptide.
【００５１】[0051]
【表２】 [Table 2]
【００５２】（実施例３および比較例３）カルボキシル
基末端がカルボン酸であるすべてＬ体のアミノ酸からな
るＩＦＦＫＤＣ−ＣＯＯＨの配列をもつペプチドを、ペ
プチド自動合成機（９０５０ ｐｌｕｓペプチドシンセ
サイザー、日本国、日本パーセプティブ・リミテッド
社）を用いて固相合成法により合成した。すなわち、Ｆ
ｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）を０．１８ｍｍｏｌ／ｇ
（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共
重合体からなる粒状樹脂（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒ
ｔ）−ＰＥＧ−ＰＳ：日本国、日本パーセプティブリミ
テッド社製）を用い、すべてＬ体のＦｍｏｃ−アミノ酸
を用いて、定法に従って固相合成を行った。Example 3 and Comparative Example 3 A peptide having a sequence of IFFFKDC-COOH consisting of all L-amino acids in which the carboxyl group terminal is a carboxylic acid was synthesized with an automatic peptide synthesizer (9050 plus peptide synthesizer, Japan). (Nippon Perceptive Limited) using a solid phase synthesis method. That is, F
0.18 mmol / g of moc-L-Cys (Trt)
(Resin) and a granular resin comprising a styrene-divinylbenzene copolymer (Fmoc-L-Cys (Tr
(t) -PEG-PS: manufactured by Nippon Perceptive Limited, Japan), and solid-phase synthesis was performed according to a standard method using all L-form Fmoc-amino acids.
【００５３】得られたペプチドを分析用高速液体クロマ
トグラフィーにて、逆相系カラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤ
Ｓ−８０ＴＳ：日本国、東ソー（株）社製）を用いて、
２２０ｎｍの波長で分析し、単一のピークであることを
確認した。同様にしてカルボキシル基末端がカルボン酸
であるすべてＬ体のアミノ酸からなるＬＦＦＫＤＣ−Ｃ
ＯＯＨ、ＦＦＩＲＤＣ−ＣＯＯＨ、ＦＦＫＲＤＣＤ−Ｃ
ＯＯＨの配列をもつペプチドと、比較例としてＩＦＦＫ
ＰＣ−ＣＯＮＨ2 、ＷＦＷＲＲＣ−ＣＯＮＨ2 も合成し
た。The obtained peptide was subjected to high-performance liquid chromatography for analysis, using a reversed-phase column (TSKgel OD).
S-80TS: Tosoh Corporation, Japan)
Analysis at a wavelength of 220 nm confirmed a single peak. Similarly, LFFKDC-C comprising all L-form amino acids having a carboxylic acid terminal at the carboxyl group
OOH, FFIRDC-COOH, FFKRCDD-C
A peptide having an OOH sequence, and IFFK as a comparative example.
PC-CONH 2, WFWRRC-CONH 2 was also synthesized.
【００５４】上記のペプチドを定法に従い、Thiopropyl
-Sepharose 6B （スウェーデン国、ファルマシア社製）
に、ペプチドの固定化量が９．８〜１０．９μｍｏｌ／
ｍｌゲルになるように樹脂に固定化した。すなわち、樹
脂を秤り取り、脱気した０．２Ｍの食塩を含む０．１Ｍ
のｐＨ７．０のトリス塩酸緩衝溶液で洗浄後、精製した
ペプチド１６０μｍｏｌを上記の緩衝溶液１６ｍｌに溶
解し、膨潤したゲル８ｍｌに加えて室温で２時間反応さ
せた。反応終了後、上記の緩衝溶液で洗浄し、反応を終
了させた。According to a conventional method, the above peptide was converted to Thiopropyl
-Sepharose 6B (Pharmacia, Sweden)
In addition, the amount of immobilized peptide was 9.8 to 10.9 μmol /
It was immobilized on a resin so as to form a ml gel. That is, the resin was weighed, and 0.1M containing degassed 0.2M salt was used.
After washing with Tris-HCl buffer solution (pH 7.0), 160 μmol of the purified peptide was dissolved in 16 ml of the above buffer solution, added to 8 ml of swollen gel, and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, the reaction was washed with the above buffer solution to terminate the reaction.
【００５５】その後、樹脂を生理食塩水で洗浄後、膨潤
状態の樹脂１００μｌに、高脂血症患者の血漿４００μ
ｌを添加した。ＬＤＬの吸着量は、ＬＤＬコレステロー
ル分離キット（米国、SIGMA DIAGNOSTICS 社製）を用い
て、ＬＤＬコレステロールを血漿中から分離し、添加前
後でのＬＤＬの含有量を、コレステロールＥ−テストワ
コー（日本国、和光純薬製）を用いて求めた。ＨＤＬの
吸着量は、添加前後でのＨＤＬの含有量を、ＨＤＬコレ
ステロールＥ−テストワコー（日本国、和光純薬製）を
用いて求めた。Thereafter, the resin was washed with physiological saline, and 100 μl of the swollen resin was added to 400 μl of the plasma of a hyperlipidemic patient.
1 was added. The amount of LDL adsorbed was determined by separating LDL cholesterol from plasma using an LDL cholesterol separation kit (manufactured by SIGMA DIAGNOSTICS, USA), and measuring the LDL content before and after the addition of cholesterol E-Test Wako (Japan, (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The amount of HDL adsorbed was determined by measuring the HDL content before and after the addition using HDL cholesterol E-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Japan).
【００５６】また、ＬＤＬ選択吸着性は、ＬＤＬの吸着
量／ＨＤＬの吸着量として数値化して求めた。その結果
を表３に示す。実施例３のペプチドは、式（１’）また
は式（２’）のＬＤＬ結合性ペプチドである比較例３の
ペプチドに比べて、明らかにＬＤＬ選択吸着性が高く，
低比重リポタンパク質吸着材への使用において有効であ
ることがわかる。The LDL selective adsorbability was obtained by numerically expressing LDL adsorption amount / HDL adsorption amount. Table 3 shows the results. The peptide of Example 3 has clearly higher LDL selective adsorptivity than the peptide of Comparative Example 3 which is an LDL-binding peptide of the formula (1 ′) or (2 ′),
It turns out that it is effective in use for a low density lipoprotein adsorbent.
【００５７】[0057]
【表３】 [Table 3]
【００５８】（実施例４および比較例４）カルボキシル
基末端がカルボキシル基であるすべてＬ体のアミノ酸か
らなるＬＦＦＫＤＣ−ＣＯＯＨ、ＦＦＩＲＤＣ−ＣＯＯ
Ｈの配列をもつペプチドを、ペプチド自動合成機（９０
５０ ｐｌｕｓペプチドシンセサイザー、日本国、日本
パーセプティブ・リミテッド社）を用いて固相合成法に
より合成した。すなわち、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒ
ｔ）を０．１８ｍｍｏｌ／ｇ（樹脂）の割合で有するス
チレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる粒状樹脂
（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＰＥＧ−ＰＳ：日
本国、日本パーセプティブリミテッド社製）を用い、す
べてＬ体のＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて、定法に従って
固相合成を行った。Example 4 and Comparative Example 4 LFFKDC-COOH, FFIRDC-COO consisting of all L-form amino acids having a carboxyl group at the terminal of the carboxyl group
The peptide having the sequence of H is converted into a peptide automatic synthesizer (90
It was synthesized by a solid phase synthesis method using a 50 plus peptide synthesizer (Perceptive Limited, Japan, Japan). That is, Fmoc-L-Cys (Tr
(Fmoc-L-Cys (Trt) -PEG-PS: manufactured by Nippon Perceptive Limited, Japan) comprising a styrene-divinylbenzene copolymer having a ratio of (t) of 0.18 mmol / g (resin). ), And solid-phase synthesis was performed according to a standard method using all L-form Fmoc-amino acids.
【００５９】得られたペプチドを分析用高速液体クロマ
トグラフィーにて、逆相系カラム（ＴＳＫｇｅｌ ＯＤ
Ｓ−８０ＴＳ：日本国、東ソー（株）社製）を用いて、
２２０ｎｍの波長で分析し、単一のピークであることを
確認した。同様にしてカルボキシル基末端がアミドであ
るすべてＬ体のアミノ酸からなるＦＦＫＲＤＣ−ＣＯＮ
Ｈ2 の配列をもつペプチドを、式（２）で表され、ペプ
チドの電荷Ｅが、Ｅ＞０であるペプチドの参考例とし
て、また、ＷＦＷＲＲＣ−ＣＯＮＨ2 の配列をもつペプ
チドを、式（１’）のＬＤＬ結合性ペプチドの比較例と
して合成した。The obtained peptide was subjected to high-performance liquid chromatography for analysis, using a reversed-phase column (TSKgel OD).
S-80TS: Tosoh Corporation, Japan)
Analysis at a wavelength of 220 nm confirmed a single peak. Similarly, FFKRDC-CON consisting of all L-amino acids whose carboxyl group ends are amides
The peptide having the sequence of H 2 is represented by the formula (2), and the charge E of the peptide is a reference example of the peptide having E> 0. The peptide having the sequence of WFWRRC-CONH 2 is represented by the formula (1) ') Was synthesized as a comparative example of the LDL-binding peptide.
【００６０】上記のペプチドを定法に従い、Thiopropyl
-Sepharose 6B （スウェーデン国、ファルマシア社製）
に、ペプチドの固定化量が９．４〜１０．８μｍｏｌ／
ｍｌゲルになるように樹脂に固定化した。すなわち、樹
脂を秤り取り、脱気した０．２Ｍの食塩を含む０．１Ｍ
のｐＨ７．０のトリス塩酸緩衝溶液で洗浄後、精製した
ペプチド１６０μｍｏｌを、上記の緩衝溶液１６ｍｌに
溶解し、膨潤したゲル８ｍｌに加えて室温で２時間反応
させた。反応終了後、上記の緩衝溶液で洗浄し、反応を
終了させた。The above peptide was converted to Thiopropyl
-Sepharose 6B (Pharmacia, Sweden)
In addition, the amount of immobilized peptide was 9.4 to 10.8 μmol /
It was immobilized on a resin so as to form a ml gel. That is, the resin was weighed, and 0.1M containing degassed 0.2M salt was used.
After washing with Tris-HCl buffer solution (pH 7.0), 160 μmol of purified peptide was dissolved in 16 ml of the above buffer solution, added to 8 ml of swollen gel, and reacted at room temperature for 2 hours. After the reaction was completed, the reaction was washed with the above buffer solution to terminate the reaction.
【００６１】ａｐｏＢタンパクを化学修飾したＬＤＬの
作製は、Basu,S.K. et.al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.
S.A. 73, 3178-3182(1976) に記載の方法で行った。す
なわち、タンパク量含量２２ｍｇのＬＤＬ（米国、シグ
マ社製）に１．３８ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチル−１，３−
プロパンジアミン（日本国、和光純薬社製）を氷冷しな
がら添加し、その後さらに、１３８ｍｇのＥＤＣ（１−
エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド）（日本国、和光純薬社製）を添加し、３時間氷
冷、攪拌し、続いて４℃で１６時間攪拌した。その後、
この反応溶液をセロファンチューブに入れ、ｐＨ７．４
の０．３ｍＭＥＤＴＡを含む０．１５ＭＮａＣｌ水溶液
２５ｌ中で２４時間透析し、その後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒ
ｅｐ ５０を用いて濃縮後、生理食塩水で希釈してコレ
ステロール量０．７４ｍｇ／ｍｌの化学修飾ＬＤＬを調
製した。また、通常のＬＤＬ溶液についても、０．７４
ｍｇ／ｍｌになるように生理食塩水で希釈して調製し
た。The production of LDL obtained by chemically modifying apoB protein is described in Basu, SK et. Al., Proc. Natl. Acad. Sci.
SA 73, 3178-3182 (1976). That is, 1.38 ml of N, N-dimethyl-1,3- 3-LDL (produced by Sigma, USA) with a protein content of 22 mg was added.
Propanediamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Japan) was added while cooling with ice, and then 138 mg of EDC (1-
Ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Japan) was added, and the mixture was stirred under ice-cooling for 3 hours, and subsequently stirred at 4 ° C. for 16 hours. afterwards,
This reaction solution was placed in a cellophane tube, and the pH was 7.4.
Dialysis for 24 hours in 25 l of 0.15 M NaCl aqueous solution containing 0.3 mM EDTA, and then Centripr
After concentration using ep 50, the mixture was diluted with physiological saline to prepare a chemically modified LDL having a cholesterol amount of 0.74 mg / ml. In addition, for a normal LDL solution, 0.74
It was prepared by diluting with physiological saline to a concentration of mg / ml.
【００６２】通常のＬＤＬ溶液および化学修飾ＬＤＬの
吸着実験は以下のごとく実施した。すなわち、樹脂を生
理食塩水で洗浄後、膨潤状態の樹脂１００μｌに、通常
のＬＤＬ溶液または化学修飾ＬＤＬ４００μｌを添加し
た。通常のＬＤＬおよび化学修飾ＬＤＬの吸着量は、添
加前後でのＬＤＬの含有量を、コレステロールＥ−テス
トワコー（日本国、和光純薬製）を用いて求めた。以上
の結果を表４に示した。明らかに、実施例４および参考
例のペプチドは、比較例４のペプチドに比べて、化学修
飾ＬＤＬの吸着率が低かった。このことは、実施例４お
よび参考例のペプチドがＬＤＬのａｐｏＢタンパクと結
合することを示している。The ordinary LDL solution and chemically modified LDL adsorption experiments were carried out as follows. That is, after washing the resin with physiological saline, 400 μl of a normal LDL solution or chemically modified LDL was added to 100 μl of the swollen resin. The adsorption amount of ordinary LDL and chemically modified LDL was determined by measuring the LDL content before and after the addition using cholesterol E-Test Wako (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Japan). Table 4 shows the above results. Clearly, the peptides of Example 4 and Reference Example had a lower adsorption rate of the chemically modified LDL than the peptide of Comparative Example 4. This indicates that the peptides of Example 4 and Reference Example bind to the apoB protein of LDL.
【００６３】[0063]
【表４】 [Table 4]
【００６４】（実施例５および比較例５）実施例３で合
成したペプチドＩＦＦＫＤＣ−ＣＯＯＨおよびＬＦＦＫ
ＤＣ−ＣＯＯＨを、実施例３と同様の方法でThiopropyl
-Sepharose 6B （スウェーデン国、ファルマシア社製）
に結合させた。ブラジキニンの測定については以下の手
順で行った。ヘパリン（５ＩＵ／ｍｌ）を添加した健常
人の血液を遠心分離器で分離し、得られた血漿にカプト
プリル（５０ｎｇ／ｍｌ、米国、シグマ社製）を添加し
た血漿成分５ｍｌを、膨潤状態の樹脂０．５ｍｌの入っ
たポリカーボネート製三角フラスコに加え、３７℃で５
分間放置した。Example 5 and Comparative Example 5 Peptides IFFDC-COOH and LFFK synthesized in Example 3
DC-COOH was converted to Thiopropyl in the same manner as in Example 3.
-Sepharose 6B (Pharmacia, Sweden)
Was bound. The measurement of bradykinin was performed according to the following procedure. Blood of a healthy person to which heparin (5 IU / ml) was added was separated by a centrifuge, and 5 ml of a plasma component obtained by adding captopril (50 ng / ml, manufactured by Sigma, USA) to the obtained plasma was added to a swelled resin. Add to 0.5 ml of polycarbonate Erlenmeyer flask and add 5 ml at 37 ° C.
Let stand for minutes.
【００６５】その後、直ちに血漿成分を分離し、その血
漿成分にトラジロール、大豆トリプシンインヒビター、
硫酸プロタミンおよびＥＤＴＡ−２Ｎａの入ったインヒ
ビター溶液２ｍｌを加え反応を停止させ、血漿中に産生
されたブラジキニン量をＲＩＡ法にて測定した。なお、
比較のために、樹脂として市販のデキストラン硫酸固定
化セルロースも用いて本操作を行った。また、参考のた
めに、ブラジキニン産生を顕著に促進させると考えられ
るガラス製三角フラスコを用い、樹脂を入れずにこの操
作を行った。その結果を表５に示した。明らかに、ＩＦ
ＦＫＤＣ−ＣＯＯＨ固定化Thiopropyl-Sepharose 6B 、
およびＬＦＦＫＤＣ−ＣＯＯＨ固定化Thiopropyl-Sepha
rose6B は、対照として行った空容器のブラジキニン産
生量と同等のレベルであった。Thereafter, the plasma component was immediately separated, and trazilol, soybean trypsin inhibitor,
The reaction was stopped by adding 2 ml of an inhibitor solution containing protamine sulfate and EDTA-2Na, and the amount of bradykinin produced in the plasma was measured by the RIA method. In addition,
For comparison, this operation was performed using commercially available dextran sulfate-immobilized cellulose as a resin. In addition, for reference, this operation was performed without using a resin, using a glass Erlenmeyer flask that is considered to significantly promote bradykinin production. Table 5 shows the results. Obviously, IF
FKDC-COOH immobilized Thiopropyl-Sepharose 6B,
And LFFKDC-COOH immobilized Thiopropyl-Sepha
rose6B was at a level equivalent to the bradykinin production of an empty container used as a control.
【００６６】[0066]
【表５】 [Table 5]
【００６７】（実施例６および比較例６）実施例３と同
様の方法で合成した式（１’）のＬＤＬ結合性ペプチド
である比較例６のＦＦＫＲＤＣ−ＣＯＯＨと、実施例３
で合成したペプチドＩＦＦＫＤＣ−ＣＯＯＨ、ＬＦＦＫ
ＤＣ−ＣＯＯＨ、ＦＦＩＲＤＣ−ＣＯＯＨ、ＦＦＫＲＤ
ＣＤ−ＣＯＯＨ、およびアミノ基末端がアセチル化され
たＡｃ−ＦＦＫＲＤＣ−ＣＯＯＨを、実施例３と同様の
方法でThiopropyl-Sepharose 6B （スウェーデン国、フ
ァルマシア社製）に結合させた。(Example 6 and Comparative Example 6) FFKRDC-COOH of Comparative Example 6, which is an LDL-binding peptide of the formula (1 ′) synthesized by the same method as in Example 3, and Example 3
IFFFDC-COOH, LFFK synthesized by
DC-COOH, FFIRDC-COOH, FFKRD
CD-COOH and Ac-FFKRDC-COOH having an amino group terminal acetylated were bound to Thiopropyl-Sepharose 6B (Pharmacia, Sweden) in the same manner as in Example 3.
【００６８】血球凝固性の測定は、以下の手順で行っ
た。終濃度が１ＩＵ／ｍｌ、０．５ＩＵ／ｍｌになるよ
うにヘパリンを添加して得た健常人の血液１ｍｌを、ポ
リスチレン製チューブに入った生理食塩水にて膨潤させ
た状態の上記作製の樹脂０．２５ｍｌに添加し、３７℃
で３０分間放置した。その後、ポリプロピレン製チュー
ブを転倒し血液の凝固性を観察し、血液凝固が認められ
たものを×、血液凝固が認められなかったものを○で評
価した。その結果を表６に示した。比較例６のサンプル
は、０．５ＩＵ／ｍｌで血液凝固を認めたが、実施例６
のサンプルについては、本実験条件においていずれも血
液凝固を認めなかった。The measurement of blood coagulation was carried out in the following procedure. The above-prepared resin prepared by swelling 1 ml of healthy human blood obtained by adding heparin to a final concentration of 1 IU / ml and 0.5 IU / ml with a physiological saline solution contained in a polystyrene tube. Add to 0.25 ml, 37 ° C
For 30 minutes. Thereafter, the polypropylene tube was inverted to observe the coagulation property of the blood, and those with blood coagulation were evaluated as x, and those without blood coagulation were evaluated as o. Table 6 shows the results. In the sample of Comparative Example 6, blood coagulation was observed at 0.5 IU / ml.
No blood coagulation was observed in any of the samples under the present experimental conditions.
【００６９】[0069]
【表６】 [Table 6]
【００７０】[0070]
【発明の効果】本発明のペプチドは、ＬＤＬのａｐｏＢ
タンパクと結合するために優れたＬＤＬ選択吸着性を有
し、それでいて、ブラジキニンの産生を惹起せず、か
つ、低ヘパリン投与条件下において血液を凝固させるこ
とがないため、全血や血漿等の体液からＬＤＬを除去す
るための試薬として有利に用いることができる。The peptide of the present invention is apoB of LDL.
It has excellent LDL selective adsorptivity for binding to proteins, yet does not induce the production of bradykinin, and does not coagulate blood under low heparin administration conditions, so that body fluids such as whole blood and plasma Can be advantageously used as a reagent for removing LDL from glycerol.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成９年９月１６日[Submission date] September 16, 1997
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００３４[Correction target item name] 0034
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００３４】固相合成法によるペプチドの合成は、市販
のペプチド合成用の樹脂、例えば、ジビニルベンゼンを
含むポリスチレンなどの重合体にペプチド固相合成に適
した反応性をもつ官能基を結合させた樹脂を用い、目的
とするペプチドの合成をそのＣ末端側からＮ末端方向に
向かって行う。例えば、α−カルボキシル基以外のアミ
ノ基などの官能基を保護したアミノ酸と、α−アミノ基
以外の、カルボキシル基等の官能基を保護したアミノ酸
とを縮合させて結合させる操作と、結合したアミノ酸に
おけるα−アミノ基などのペプチド結合を形成するアミ
ノ基が有する保護基のみを除去する操作を、順次繰返し
ていくことによってペプチド鎖を伸長させ、所望のアミ
ノ酸配列をもつペプチドを形成し、次いで、該ペプチド
を樹脂から脱離させ、かつ、保護基が付加されている全
ての官能基から保護基を除去することにより、目的とす
るペプチドを得ることができる。必要に応じてこのペプ
チドを、さらに精製することにより、純度の高いものを
得ることができる。ペプチドの精製は有機化合物の精製
に一般的に用いられている方法が使用できる。特にカラ
ムクロマトグラフィーによる精製は、効率良く精製を行
えるので好ましい。In the peptide synthesis by the solid phase synthesis method, a functional group having a reactivity suitable for solid phase peptide synthesis is bonded to a commercially available resin for peptide synthesis, for example, a polymer such as polystyrene containing divinylbenzene. a resin, carried towards the N-terminal direction the synthesis of the peptide of interest from its C-terminus. For example, an operation of condensing and bonding an amino acid having a protected functional group such as an amino group other than an α-carboxyl group with an amino acid having a protected functional group such as a carboxyl group other than an α-amino group, The sequence of removing only the protecting group of the amino group forming a peptide bond such as an α-amino group in is sequentially repeated to extend the peptide chain, to form a peptide having a desired amino acid sequence, The desired peptide can be obtained by removing the peptide from the resin and removing the protecting group from all functional groups to which the protecting group has been added. If necessary, the peptide can be further purified to obtain a highly pure peptide. For the purification of the peptide, a method generally used for the purification of an organic compound can be used. In particular, purification by column chromatography is preferable because purification can be performed efficiently.
【手続補正２】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００４５[Correction target item name] 0045
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００４５】[0045]
【発明の実施の形態】以下、実施例および比較例を挙げ
て本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、何らこ
れに限定されるものではない。また、実施例中ではペプ
チドのアミノ酸残基は１文字で表記する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited thereto. In the examples, pep
Tide amino acid residues are designated by one letter.
【手続補正３】[Procedure amendment 3]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００６１[Correction target item name] 0061
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【００６１】ａｐｏＢタンパクを化学修飾したＬＤＬの
作製は、Ｂａｓｕ，Ｓ．Ｋ． ｅｔ．ａｌ．， Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．
Ａ．７３， ３１７８−３１８２（１９７６） に記載
の方法で行った。すなわち、タンパク量含量２２ｍｇの
ＬＤＬ（米国、シグマ社製）に１．３８ｍｌのＮ，Ｎ−
ジメチル−１，３−プロパンジアミン（日本国、和光純
薬社製）を氷冷しながら添加し、その後さらに、１３８
ｍｇのＥＤＣ（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド）（日本国、和光純薬社製）を
添加し、３時間氷冷、攪拌し、続いて４℃で１６時間攪
拌した。その後、この反応溶液をセロファンチューブに
入れ、ｐＨ７．４の０．３ｍＭＥＤＴＡを含む０．１５
ＭＮａＣｌ水溶液２５ｌ中で２４時間透析し、その後、
Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ ５０（米国、アミコン社製）を
用いて濃縮後、生理食塩水で希釈してコレステロール量
０．７４ｍｇ／ｍｌの化学修飾ＬＤＬを調製した。ま
た、通常のＬＤＬ溶液についても、０．７４ｍｇ／ｍｌ
になるように生理食塩水で希釈して調製した。The production of LDL obtained by chemically modifying apoB protein is described in Basu, S .; K. et. al. , Pro
c. Natl. Acad. Sci. U. S.
A. 73, 3178-3182 (1976). That is, 1.38 ml of N, N- was added to LDL (produced by Sigma, USA) having a protein content of 22 mg.
Dimethyl-1,3-propanediamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Japan) was added while cooling with ice, and then 138 was further added.
mg of EDC (1-ethyl-3 (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Japan) was added, and the mixture was stirred under ice-cooling for 3 hours, followed by stirring at 4 ° C. for 16 hours. Thereafter, the reaction solution was placed in a cellophane tube, and 0.15 containing 0.3 mM EDTA at pH 7.4 was added.
Dialysis for 24 hours in 25 l of MNaCl aqueous solution,
After concentration using Centriprep 50 (manufactured by Amicon, USA) , it was diluted with physiological saline to prepare a chemically modified LDL having a cholesterol amount of 0.74 mg / ml. In addition, about the usual LDL solution, 0.74 mg / ml
It was prepared by diluting with physiological saline so that
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 14/775 7/06 17/00 14/775 Ｇ０１Ｎ 30/00 Ｃ 17/00 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＸ Ｇ０１Ｎ 30/00 ＡＤＮ (72)発明者 渡邊 勝哉 静岡県富士市鮫島２番地の１ 旭化成工業 株式会社内──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C07K 1/22 C07K 14/775 7/06 17/00 14/775 G01N 30/00 C 17/00 A61K 37/02 ABX G01N 30 / 00 ADN (72) Inventor Katsuya Watanabe 2-1, Samejima, Fuji City, Shizuoka Prefecture Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.
Claims (9)
ノ酸配列を有するペプチドであり、該ペプチドが有する
電荷（Ｅ）がＥ＝０であることを特徴とする低比重リポ
蛋白質選択吸着性ペプチド。 （Ｘ1 ）p ―α―Ｐｈｅ―β―Ｌｙｓ―γ―（Ｘ2 ）q （１）または （Ｘ1 ）p ―α―Ｐｈｅ―β―Ａｒｇ―γ―（Ｘ2 ）q （２） 〔但し、式（１）および（２）の左端および右端は、そ
れぞれＮ末端およびＣ末端であり、各Ｘ1 および各Ｘ2
は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基であり、α
はＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒのいずれか
のアミノ酸残基、βはＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ
のいずれかのアミノ酸残基、γはＡｓｐ、Ｇｌｕのいず
れかのアミノ酸残基、ｐおよびｑはそれぞれアミノ酸残
基Ｘ1 およびＸ2 の数であり、さらに、ｐおよびｑは次
の関係を満足する。 ０≦ｐ＋ｑ≦５］1. A method for selecting a low-density lipoprotein, which is a peptide having an amino acid sequence represented by the formula (1) or (2), wherein the charge (E) of the peptide is E = 0. Adsorbable peptide. (X 1 ) p -α-Phe-β-Lys-γ- (X 2 ) q (1) or (X 1 ) p -α-Phe-β-Arg-γ- (X 2 ) q (2) [ However, the left and right ends of the formulas (1) and (2) are the N-terminal and the C-terminal, respectively, and X 1 and X 2
Are each independently any amino acid residue; α
Is any amino acid residue of Ala, Ile, Leu, Phe, Tyr, β is Ile, Lys, Phe, Tyr
Is an amino acid residue of Asp or Glu, p and q are the numbers of amino acid residues X 1 and X 2 , respectively, and p and q satisfy the following relationship: I do. 0 ≦ p + q ≦ 5]
項１に記載の低比重リポ蛋白質選択吸着性ペプチド。2. The low-density lipoprotein selective adsorbing peptide according to claim 1, wherein γ is Asp.
請求項１に記載の低比重リポ蛋白質選択吸着性ペプチ
ド。3. The selectively adsorbed low-density lipoprotein peptide according to claim 1, wherein 0 ≦ p + q ≦ 1.
ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ
−Ａｓｐ、Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ａｓｐ、Ｐｈｅ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐのいずれかのアミノ酸配列を少
なくとも１つ有することを特徴とする請求項１に記載の
低比重リポ蛋白質選択吸着性ペプチド。4. Phe-Phe-Lys-Asp, Ph
e-Tyr-Lys-Asp, Phe-Ile-Lys
-Asp, Phe-Ile-Arg-Asp, Phe-
The low-density lipoprotein selective adsorption peptide according to claim 1, wherein the peptide has at least one amino acid sequence of Lys-Arg-Asp.
プチドが結合した水不溶性担体からなることを特徴とす
る低比重リポ蛋白質吸着材。5. A low-density lipoprotein adsorbent, comprising a water-insoluble carrier to which the peptide according to claim 1 is bound.
プチドが水不溶性担体に直接結合していることを特徴と
する請求項５に記載の低比重リポ蛋白質吸着材。6. The low-density lipoprotein adsorbent according to claim 5, wherein the peptide according to any one of claims 1 to 4 is directly bound to a water-insoluble carrier.
プチドが水不溶性担体にスペーサーを介して結合してい
ることを特徴とする請求項５に記載の低比重リポ蛋白質
吸着材。7. The low-density lipoprotein adsorbent according to claim 5, wherein the peptide according to any one of claims 1 to 4 is bound to a water-insoluble carrier via a spacer.
質を除去するに当たり、請求項１ないし４のいずれかに
記載のペプチドに溶液または体液を接触させることを特
徴とする低比重リポ蛋白質の除去方法。8. A method for removing a low-density lipoprotein, which comprises contacting a peptide or a solution according to any one of claims 1 to 4 with a solution or a body fluid when removing the low-density lipoprotein from a solution or a body fluid.
プチドからなることを特徴とする低比重リポ蛋白質結合
用試薬。9. A low-density lipoprotein-binding reagent comprising the peptide according to claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9240280A JPH1160595A (en) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | Peptide for selective adsorption of low density lipoprotein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9240280A JPH1160595A (en) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | Peptide for selective adsorption of low density lipoprotein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1160595A true JPH1160595A (en) | 1999-03-02 |
Family
ID=17057147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9240280A Withdrawn JPH1160595A (en) | 1997-08-22 | 1997-08-22 | Peptide for selective adsorption of low density lipoprotein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1160595A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6582386B2 (en) | 2001-03-06 | 2003-06-24 | Baxter International Inc. | Multi-purpose, automated blood and fluid processing systems and methods |
| US6706008B2 (en) | 2001-03-06 | 2004-03-16 | Baxter International Inc. | Automated system and method for withdrawing compounds from blood |
| US6884228B2 (en) | 2001-03-06 | 2005-04-26 | Baxter International Inc. | Automated system adaptable for use with different fluid circuits |
-
1997
- 1997-08-22 JP JP9240280A patent/JPH1160595A/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6582386B2 (en) | 2001-03-06 | 2003-06-24 | Baxter International Inc. | Multi-purpose, automated blood and fluid processing systems and methods |
| US6706008B2 (en) | 2001-03-06 | 2004-03-16 | Baxter International Inc. | Automated system and method for withdrawing compounds from blood |
| US6884228B2 (en) | 2001-03-06 | 2005-04-26 | Baxter International Inc. | Automated system adaptable for use with different fluid circuits |
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