JPH11514856A - バチルスアミロリケファシエンスからの精製マンナーゼおよびその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明により、バチルスアミロリケファシエンスから得られる精製マンナーゼ酵素を提供する。好ましくは、本発明のマンナーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合の約35,000およびゲル濾過により測定した場合の約20,000の分子量、約5.2-5.6の等電点（ｐＩ）、約4.8-5.2のｐＨ最適条件および80℃での約45秒の半減期を有する。本発明の別の実施の形態において、バチルスアミロリケファシエンス由来の精製マンナーゼを調製する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 バチルスアミロリケファシエンスからの精製マンナーゼおよびその調製方法 発明の背景 本発明は、新しいマンナーゼ酵素に関するものである。本発明は、より詳しく は、バチルスアミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)から得た新 しいマンナーゼ、およびこのマンナーゼの製造、精製並びに、特にパルプの漂白 における使用に関するものである。 近年、ヘミセルラーゼが工業的に使用され、商業的に重要になってきた。動物 の飼料および織物に加えて、ヘミセルラーゼを用いたパルプおよび紙の用途が拡 大し続けている。製紙工業では、ピッチ制御、脱水および脱墨に酵素が使用され ているが、これらの使用はまだ一般的に実験段階にある。しかしながら、キシラ ナーゼを用いたパルプの予備漂白は、定着した技術である。キシラナーゼは、ク ラフトパルプ表面の発色リグニンに関連する沈殿キシランを加水分解し、その結 果、リグニンの抽出性および漂白効率が改良されると考えられている。キシラナ ーゼを使用することにより、塩素薬品の消費が減少し、このことにより工場の廃 水中に放出される危険な廃物の水準が著しく減少する。ハロゲン化有機化合物が 、塩素および塩素含有化合物を用いた漂白工程の主要な副生成物である。パルプ 工場の廃水に関連する環境規則が増加するにつれ、製紙工業にとって、パルプを 漂白するための、塩素を含まない代替物が重要になってきている。塩素を含まな い漂白物質において、一部には過酸化水素の必要性が減少したために、明度を増 大させるため、またはパルプの品質を改良するために、酵素がうまく用いられて いる。 マンナンおよびグルコマンナンは、パルプ表面および内側層のキシランおよび リグニンに関連するヘミセルロースである。その結果、マンナーゼおよびキシラ ナーゼの組合せでパルプを予備処理することにより、キシラナーゼ単体により得 られる明度よりも高い明度が得られることが示された（例えば、Ross等のEnzyme -Microb．Technol．vol.14，no.2，90-95頁(1992)）。 マンナーゼは、いくつかのバチルス属の微生物内で確認されている。例えば、 Talbot等のAppl．Environ．Microbiol.，vol.56，no.11，3505-3510頁(1990)に は、162,000ダルトンの分子量および5.5-7.5の最適ｐＨを有する二量体形態にあ るバチルスステアロサーモフィラス由来のβ−マンナーゼが記載されている。Me ndoza等のWorld J．Microbio．Biotech.，vol.10，no.5，551-555頁(1994)には 、38,000ダルトンの分子量、ｐＨ5.0および55℃での最適活性および4.8のｐＩを 有する枯草菌由来のβ−マンナーゼが記載されている。JP0304706，Derwent Acc ession No.91-07734には、ゲル濾過により測定したときの37,000±3,000ダルト ンの分子量、8-10の最適ｐＨおよび5.3-5.4のｐＩを有するバチルスsp.由来のβ −マンナーゼが記載されている。しかしながら、従来技術では、以下の記載する ようなバチルスアミロリケファシエンス由来のマンナーゼが確認されていない。発明の概要 本発明により、バチルスアミロリケファシエンスから得られる精製マンナーゼ 酵素を提供する。好ましくは、本発明のマンナーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によ り分析したときの約35,000およびゲル濾過により測定したときの約20,000の分子 量、約5.2-5.6の等電点（ｐＩ）、約4.8-5.2のｐＨ最適条件および80℃での約45 秒の半減期を有している。本発明の別の実施の形態において、バチルスアミロリ ケファシエンス由来の精製マンナーゼを調製する方法を提供する。 本発明の別の実施の形態において、本発明のマンナーゼをパルプおよび紙の漂 白に用いている。好ましくは、マンナーゼをキシラナーゼと組み合わせて用いる 。発明の詳細な説明 本発明の好ましい実施の形態によれば、バチルスアミロリケファシエンスの発 酵ブロスを調製する。全細胞、細胞断片および粒状物質を分離した後、上澄み中 のマンナーゼを濃縮して単離するように、上澄みを処理する。本発明の好ましい 実施の形態において、精製マンナーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定した約 33-37ｋＤおよびゲル濾過法により測定した約18-22ｋＤの分子量、約5.2-5.6の ｐＩ、約4.8-5.2のｐＨ最適条件および80℃で約45秒の半減期を有する。最も好 ましくは、精製マンナーゼは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定した約35ｋＤおよ びゲル濾過法により測定した約18-22ｋＤの分子量、約5.4のｐＩおよび約5.0の ｐＨ最 適条件を有する。 本発明によるマンナーゼを製造するバチルスアミロリケファシエンスの発酵は 、この微生物を培養する、この業界で知られているいかなる方法により行っても 差し支えない。好ましくは、そこでの条件を操作して、マンナーゼを最大限に製 造する。そのような条件はこの業界でよく知られている。 発酵ブロスからのマンナーゼの精製は、そのような組成物を精製する、この業 界で知られているいかなる方法により行っても差し支えない。例えば、濾過、遠 心分離、クロマトグラフィー、ゲル濾過または限外濾過の全てが、マンナーゼを 精製する適切な手段である。 本発明の別の実施の形態において、本発明のマンナーゼを、製紙用のパルプの 漂白に用いている。パルプの漂白にマンナーゼ単体を用いることにも利点がある が、本発明のマンナーゼをキシラナーゼと組み合わせて用いて、優れた漂白結果 を得ることが特に好ましい。漂白工程のどの段階で酵素処理（マンナーゼまたは マンナーゼ／キシラナーゼ）を用いても差し支えないが、塩素含有化学物質によ る漂白の前にマンナーゼを使用することが好ましい。酵素漂白を酸素漂白と組み 合わせて用いて、塩素含有化学物質の使用を制限するまたはその使用を漂白工程 から除去することがさらに好ましい。 パルプ漂白中のマンナーゼの適切な使用量は、活性をＤＮＳアッセイにより測 定した場合、約10-500ｎｋａｔ／ｇである。マンナーゼによるパルプ処理の条件 は、当業者により容易に確かめられるが、適切な温度は約40℃から約60℃までで あり、適切なｐＨは約4.0から約7.0までである。マンナーゼと組み合わせて使用 した場合のキシラナーゼの適切な使用量は、乾燥パルプの約0.1-200単位／ｇ、 より好ましくは0.50-50単位／ｇである。酵素調製のキシラナーゼ活性は以下の ように測定される：1.8ｍｌのキシラン溶液（0.05ｍの酢酸ナトリウム緩衝液中 に調製され、酢酸によりｐＨ5.3に調節された、0.6％のシグマ番号X-0627）に、 同一の緩衝液中で適切に希釈された0.200ｍｌの酵素を加える。この溶液を正確 に30分間に亘り40℃で保温する。次いで、３ｍｌのＤＮＳ試薬（３，５−ジニト ロソサシリエート10ｇ／ｌ；Ｎａ，Ｋ酒石酸300ｇ／ｌ）を加えることにより、 反応を停止させ、５分間に亘り試料を沸騰させることにより呈色させる。次いで 、吸光度を 540ｎｍの波長で測定する。アッセイ条件下において、１酵素単位により、１分 当たりのキシロースで計算した還元糖の１マイクロモルが遊離する。活性は、ア ッセイ条件下で４マイクロモルの還元糖を遊離させる酵素希釈から計算する。 様々な原料パルプまたは加工パルプを改良するのに、本発明を適用してもよい 。好ましくは、加工パルプ、すなわち、リグニンの含有量を減少させるようにす でに予め処理されたパルプを本発明による工程で処理して、さらにリグニンを除 去する。好ましくは、針葉樹のパルプを処理してパルプのリグニン除去および明 度を向上させるように本発明を適用する。本発明は、化学パルプ、すなわち、硫 酸（クラフト）または亜硫酸工程および／または酸素脱リグニンのような様々な 化学処理によりリグニン成分が化学的に改変されたパルプに特に適用され、好ま しくはクラフトパルプに適用される。好ましい方法において、クラフト消化また は酸素脱リグニンの後であるが、化学漂白の前に、本発明の酵素をパルプに適用 する。クラフト消化および酸素脱リグニンの両方を同一のパルプに行う場合、好 ましくは、酵素を酸素脱リグニン後に適用する。本発明はまた、オゾン漂白パル プまたはオゾン含有物質内で漂白されたパルプにも適用できる。 パルプの漂白にしばしば抽出剤を用いて、漂白後に改変リグニン成分を除去す る。本発明の好ましい実施の形態において、本発明の酵素により処理したパルプ を、続いて、塩素、二酸化塩素および過酸化物のようなリグニン分解化学物質に より処理し、次いで、適切な抽出剤により処理する。さらに別の実施の形態にお いて、酵素処理パルプを適切な抽出剤により処理し、続いて、化学漂白または酵 素によるリグニン分解および適切な抽出剤による最終処理を行ってもよい。影響 を受けたリグニン成分を溶解性にする抽出剤は、アルカリ金属水酸化物（Ｅ）の ような塩基、ＤＭＦ、ジオキサン、アセトン、およびアルコールを含有している 。水酸化物抽出物を過酸化水素（Ｅｐ）または酸素（Ｅｏ）と組み合わせてもよ い。次いで、得られたパルプをさらに二酸化塩素（ＤＥＤ）または過酸化物（Ｐ −Ｐ）のような化学漂白物質により所望の明度まで漂白してもよい。使用した塩 素含有化学物質または過酸化物の量を減少させることにより酵素処理を用いない ことを除いて、同一の物質により同一の明度まで漂白されるパルプの調製と比較 して本発明による方法を実施した場合、実質的に化学物質を節約できる。同様に 、上述 した酵素により本発明を実施することにより、パルプに同量の漂白化学物質を適 用して、処理パルプの明度を向上させてもよい。 本発明をさらに以下の実施例を参照して記載する。実施例は、説明を目的とし たものであり、制限を意図したものではない。実施例 実施例１ バチルスアミロリケファシエンスの発酵ブロスからのマンナーゼの精製 8.2ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄、91.2ｇ／ｌのＮａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、５ｇ／ｌのＭ ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、11.8ｇ／ｌのクエン酸ナトリウム・２Ｈ₂Ｏおよび20ｇ／ｌ の酵母抽出物からなる67.5ｍｌの媒質、１％のイナゴマメのさやのガムおよび１ ％のプロフロ（proflo）を含む条件下で、バチルスアミロリケファシエンス、Ａ ＴＣＣ＃２３８４２を増殖させた。バッフル付き振とうフラスコ内において約25 0ｒｐｍで一定に撹拌しながら、37℃で４−６日に亘り発酵を行った。以下に記 載するように、限外濾過、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーの組合せを 用いて、精製マンナーゼを得た。アミコンスターセル（350ｍｌの容量、ＰＭ− １０膜）を用いて、マンナーゼを豊富に含む培養上澄み375ｍｌを75ｍｌの最終 容量まで濃縮した。この濃縮物の25ｍｌを、10ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ9.0 により平衡にしたゲル濾過カラム（セファシルＳ−100ＨＲが充填されたＸＫ26/ 100、ファーマシア）に適用した。使用した流量は0.5ｍｌ／分であり、15ｍｌの 分画を採集し、ＵＶ吸光度を280ｎｍでモニタした。得られた分画のマンナーゼ 活性をＲＢＢ−グルコマンナン基質アッセイ（以下参照）を用いて検出した。主 な吸光度ピークの最初の部分に向かう４つの分画において、活性が溶離した。こ の方法をさらに２回繰り返した。マンナーゼ活性分画の全てを集積した。次いで 、集積した物質100ｍｌを、10ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ9.0により平衡にした 陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（Ｑ−セファロースが充填されたＦＰＬ Ｃ10/10カラム、ファーマシア）に適用した。流量は２ｍｌ／分であり、ＵＶ吸 光度を280ｎｍでモニタし、1.5ｍｌの分画を集積した。カラムを10ｍｌ（間隙の ２倍の容量）で洗浄した後、10ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ9.0から、10ｍＭの トリス−ＨＣｌ、ｐＨ9.0までの100ｍｌの線形増加ＮａＣｌ勾配により溶離を行 った。分画内のマンナー ゼ活性を上述したように測定した。活性のほとんどが、４つの分画において、塩 勾配によりほぼ中間で溶離することが分かった。ファストシステム（ファーマシ ア）上で銀染色等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを用いて、純度を測定した。ＩＥ Ｆゲルは、上述した４つの分画の最初の３つにおいて、均質なマンナーゼを示し た。 実施例２ バチルスアミロリケファシエンスからのマンナーゼの特徴付けおよび特性 技術 レマゾールブリリアントブルーにより染色したカバ木材グルコマン ナン（ＲＢＢ−マンナン）基質（オーストラリア国、シドニー、メガザイム）を 用いて、相対的なマンナーゼ活性を測定した。200μｌの試料を250μｌの基質溶 液（300ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ4.0中の２％(w/v)ＲＢＢ−マンナン）と混合 し、10分間に亘り40℃で保温した。未消化マンナンを、１ｍｌの95％エタノール の添加により沈殿させ、遠心分離により除去した。溶液中に残留した放出染料は 、吸光分光分析（ＯＤ₅₉₀）により量を測定し、マンナーゼ活性に比例した。 マンナーゼ活性を、得られた還元糖を定量するＤＮＳ法を用いて測定した。20 0μｌの試料を1.8ｍｌのガラクトグルコマンナン基質（50ｍＭのクエン酸ナトリ ウム、ｐＨ5.3中の0.5％(w/v)イナゴマメのさやのガム）と混合し、10分間に亘 り50℃で保温した。３ｍｌのＤＮＳ溶液（30％(w/v)の酒石酸ナトリウムカリウ ムおよび1.6％(w/v)のＮａＯＨを含有する１％(w/v)のジニトロサリチル酸）を 加え、溶液を５分間に亘り沸騰させた。540ｎｍでのＯＤを測定した。このＯＤ は、標準曲線と比較して、糖放出／マンナーゼ活性の分画であった。単位は、ｎ ｋａｔ／ｍｌで報告した。 等電点電気泳動法（ＩＥＦ）およびナトリウムドデシル硫酸鉛ポリアクリロア ミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を製造業者の指示にしたがってファス トシステム（ファーマシア）を用いて行った。ｐＩ測定に用いたマーカーは、ブ ロードｐＩキットｐＨ3.5-9.3（ファーマシアバイオテック）であった。使用し た分子量マーカーは、シグマケミカル社（ミズーリ州、セントルイス）からのも のであった。タンパク質の視覚化は、指示にしたがって、ファストシステム展開 銀 染色により行った。 タンパク質濃度は、ＢＣＡ法（ピアース社）を用いて測定した。 分子量測定は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル濾過を用いて以下のように行った ：ファーマシアＦＰＬＣシステムを用いて、100ｍＭのＮａＣｌ−50ｍＭのクエ ン酸塩／リン酸塩緩衝液、ｐＨ6.0により平衡にした、縦に連結した２つのゲル 濾過カラム（ファーマシアスーパーデックスＧ−200 10/30の後にファーマシア スーパーデックスＧ−75 10/30）に１ｍｌの精製マンナーゼを適用した。流量は 0.5ｍｌ／分であった。ＵＶ吸光度を280ｎｍでモニタし、１ｍｌの分画を集積し た。ＲＢＢ−マンナン基質アッセイを用いて、マンナーゼ活性について分画を検 定した。マンナーゼ活性は、このシステムを用いて52.5分後に溶離することが分 かった。上述した条件を用いて、ファーマシア低分子量ゲル濾過基準（1.25ｍｇ ／ｍｌ）をこのシステムに適用し、溶離結果を用いて、分子量標準曲線を作成し た。バチルスマンナーゼの溶離は、標準曲線と比較した場合、18-22キロダルト ンの分子量に対応した。 ＲＢＢ−マンナンアッセイを用いて、上述した温度およびｐＨ並びに上述した 検定により、熱安定性およびアルカリ安定性を測定した。 多数のマンナーゼの存在を検出し、それらの等電点（ｐＩ）を測定するゲル上 塗法も、ＲＢＢ−マンナン基質を用いて開発した。ＩＥＦゲル、ｐＨ３−９の上 に、溶融アガロース−基質懸濁液（50ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ4.5中の４％( w/v)のアガロース、７ｍｇ／ｍｌのＲＢＢ−マンナン、0.5％(w/v)のグリセロー ル）を上塗りし、37℃で保温した。１時間後、キシラナーゼの活性が、透明区域 として明確となった。ゲルを完全に乾燥させ、貯蔵した。個別に展開させた、銀 染色ｐＩ基準を含有するＩＥＦゲルとの比較により、マンナーゼｐＩを測定した 。 実施例３ マンナーゼベースの組成物によるパルプの漂白 漂白工程は、以下の段階からなった：酵素処理、キレート化および２つのアル カリ性過酸化物の段階。10％のコンシステンシーおよびマンナーゼの豊富な培養 上澄み（セルラーゼおよびほとんどのキシラナーゼを含まないように精製された ）を用いたことを除いて、酵素処理段階を、上述したものと同一の条件下で行っ た。酵素段階の濾液を酸で加水分解して、全糖をＨＰＬＣにより検出した。キレ ート化段階において、0.2％のＥＤＴＡを、３％のコンシステンシー、ｐＨ5.5お よび85℃で、30分間に亘り用いて、金属を除去した。過酸化物段階を10％のコン システンシーおよび85℃で４時間に亘り行った。最初の過酸化物段階において、 Ｈ２Ｏ２濃度は3.5％であり、ＮａＯＨ濃度は2.2％であり、２回目においては、 濃度は、それぞれ、1.5および0.85％であった。漂白段階後において、パルプを 酸性にし、明度の測定のためにハンドシェットを調製した。ＩＳＯ2469法にした がって、明度を測定した。パルプのリグニン濃度を示すカッパー数をＳＣＡＮ− Ｃ１：７７法により測定した。表２は、ＸＱＰＰ工程を用いたパルプ漂白の結果 を示している。「ｘｙｌ＋ｍａｎｎ２００」は、イルガザイム40処理（30ｌ／ｔ ）に200ｎｋａｔ／ｇパルプで加えたマンナーゼを示している。酵素濾過の酸加 水分解後、単糖をＨＰＬＣにより検出した（「Ｘ段階」）。 もちろん、上述した好ましい実施の形態に、様々な変更および改変を行っても 差し支えない。したがって、本発明の範囲を定義するのは、全ての同等物を含む 以下の請求の範囲であることが理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 キューヴァス，ウィリアム エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304−1013 パロ アルト ペイジ ミ ル ロード 925 ジェネンコア インタ ーナショナル インコーポレーテッド (72)発明者 カンテリーネン，アン ケイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94304−1013 パロ アルト ペイジ ミ ル ロード 925 ジェネンコア インタ ーナショナル インコーポレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．バチルスアミロリケファシエンスから得た精製マンナーゼ。 ２．前記マンナーゼが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した約33-37ｋＤの分子量 を有することを特徴とする請求の範囲１記載の精製マンナーゼ。 ３．前記マンナーゼが約5.2-5.6のｐＩを有することを特徴とする請求の範囲１ 記載の精製マンナーゼ。 ４．前記マンナーゼが約4.8-5.2のｐＨ最適条件を有することを特徴とする請求 の範囲１記載の精製マンナーゼ。 ５．前記マンナーゼが、約80℃の温度で約45秒の半減期を有することを特徴とす る請求の範囲１記載の精製マンナーゼ。 ６．バチルスアミロリケファシエンス由来の精製マンナーゼを製造する方法であ って、 (a) バチルスアミロリケファシエンスの発酵ブロスを調製し、 (b) 該発酵ブロスから細胞、細胞断片および粒状物質を分離して前記マンナ ーゼを精製し、 (c) 必要に応じて、該マンナーゼを濃縮して、濃縮マンナーゼ溶液を製造す る各工程からなることを特徴とする方法。 ７．前記マンナーゼが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した約33-37ｋＤの分子量 を有することを特徴とする請求の範囲６記載の方法。 ８．前記マンナーゼが約5.2-5.6のｐＩを有することを特徴とする請求の範囲６ 記載の方法。 ９．前記マンナーゼが約4.8-5.2のｐＨ最適条件を有することを特徴とする請求 の範囲６記載の方法。 10．前記マンナーゼが、約80℃の温度で約45秒の半減期を有することを特徴とす る請求の範囲６記載の方法。 11．バチルスアミロリケファシエンス由来のマンナーゼを含む組成物にパルプを 接触させる工程を含むことを特徴とするパルプの漂白方法。 12．前記組成物がキシラナーゼを含むことを特徴とする請求の範囲11記載の方法 。