【発明の詳細な説明】
後天性副甲状腺機能低下症患者における自己抗体およびその測定方法
本発明に関連する研究は、成長と発育のための遺伝子工学財団（Genetech Fou
ndation for Growth and Development）（94-338）、米国糖尿病協会（American
Diabetes Association）（Mentor Award）、および国立衛生研究所（National
Institute of Health）（R01 HD 19469）からの助成金による支持を得て実施さ
れたものである。米国政府は本発明に対し所与の権利を有する。
発明の背景 i ．発明の分野
本発明は、後天性副甲状腺機能低下症に関連する自己抗体、これらの自己抗体
によって認識される自己抗原、ならびに後天性副甲状腺機能低下症の検出および
治療に有用な検定方法に関する。ii ．背景
後天性副甲状腺機能低下症（AH）は副甲状腺ホルモン（PTH）分泌不全によっ
て生じ、低カルシウム血症をきたす。PTHは、骨からのカルシウムの再吸収を促
進し、腎臓におけるカルシウムの再吸収を増加させ、腎尿細管に作用して25-ヒ
ドロキシビタミンDから、その活性型であり小腸からのカルシウムの吸収を増加
する1,25-ジヒドロキシ代謝物への変換を促進するという点で、カルシウムの生
体恒常性に対して重要な役割を果たしている。（Conklin，1994;Lund,1980）。
低カルシウム血症の最も顕著な特徴は筋過敏、テタニーおよび発作である（Aurb
ach,1990）。
AHは、幼児または小児に発病する自己免疫性多発性内分泌腺機能低下症候群（
APS I）の一般的な病態として起こる。AHはまた、橋本甲状腺炎および／または
甲状腺機能低下症、成人女性が罹患することが極めて多い両者の合併疾患に関連
して起こる。APS Iは、粘膜皮膚のカンジダ症、副甲状腺機能低下症およびアジ
ソン病の発症を特徴とし、早期発症型悪性貧血、慢性活動性肝炎、脱毛症および
原発性性機能低下を併発することが多い（Neufeld,1980;Neufeld,1981;Winter,1
992;Maclaren,1985;Muir,1991）。APS Iは常染色体劣性病として、または外観上
の散発性疾患のいずれかとして起こる。APS IはHLA-DR領域の遺伝子とは関連が
ないが
（Ahonen,1988）、その原因遺伝子は最近21q22.3染色体上にマッピングされた（
Aaltonen,1994）。AHは、適切に認識され、活性型ビタミンD療法とカルシウム補
給とによる比較的簡単で高価でない手段による治療を行わなければ、精神遅滞ま
たは原因不明のてんかんを生じることがある。しかしながら、APS Iでは、ビタ
ミンD補剤によるカルシウム濃度の正常化は吸収不良により奏効しないことがあ
る。
他の自己免疫疾患と関連性があること（Ahonen,1990）および罹患個体の副甲
状腺組織に対する自己抗体が報告されていることから、AHの自己免疫的病因が示
唆されている。副甲状腺に対する自己抗体はブリザードら（Blizzard,1966）に
よって最初に報告された。その研究では、自己免疫性副甲状腺機能低下症患者74
例中38％が陽性で、これと比較して、健常対照被験者245例中わずか6％が陽性で
あることが判明した。その抗体はミトコンドリア抗原に対するものであると思わ
れることが何度もあったため、その後実施された研究で得られた結果は議論の対
象となった。ミトコンドリアが豊富に含まれる細胞は正常な副甲状腺組織内で見
られ、抗ミトコンドリア抗体は自己免疫疾患で普通に見られるため、これらは偽
陽性を示す結果であると考えられた（Betterle,1985）。しかしながら、散発性
成人発症型副甲状腺機能低下症患者の血清から得られた自己抗体は、ヒト副甲状
腺細胞の細胞表面に結合し、PTHの分泌を阻害することが報告された（Posillico
,1986）。さらに、AH患者の血清中の自己抗体は、補体結合および補体活性化に
依存する抗体介在細胞毒性により、培養ウシ副甲状腺細胞に対して細胞毒性を示
すことが報告された（Brandi,1986;Fattorossi,1988）。上記の所見は、AHにお
ける副甲状腺に対する自己抗体の関与の可能性を示唆するものであるが、標的自
己抗原の性質はごく最近になって、ソング（Song）ら（Abstract No．OR2-3，77
th Annual Meeting of the Endocrine Society，Washington，D.C.，June 14-17
，1995）によって同定された。
PTH分泌の調節には、副甲状腺細胞が細胞外液中の血清遊離カルシウムイオン
濃度を感知することが必要である。最近クローニングされたカルシウム感受性受
容体（CA-SR）は、ホスホリパーゼ-C（PLC）依存的経路を刺激することによって
、細胞外カルシウム濃度の増加に応答し、その成分であるPTHの分泌を低下する
ように副甲状腺を誘導する（Conklin,1994）。CA-SR遺伝子は3q2染色体上にマッ
ピン
グされ（Pollak,1993）、翻訳された蛋白質はアミノ酸1085残基の直鎖状ペプチ
ドであり、膜を7回貫通すると推定されているドメインとアミノ末端のアミノ酸6
13残基からなる大きな細胞外ドメインとを有する（Brown,1993）。細胞外ドメイ
ンがおそらく実際のカルシウムイオン検出器として機能する。これは、副甲状腺
で密に発現するが、甲状腺C-細胞、脳および腎臓でもある程度発現する新規のG-
蛋白質結合受容体ファミリーの1種である。CA-SR遺伝子の突然変異は家族性良性
低カルシウム尿性高カルシウム血症（FBHH）および常染色体優性低カルシウム血
症の原因であることが見いだされた（Pollak,1993）。
以下の参考文献について下記に詳細に考察する：
1．ベタール(Betterle),C.,ら（1985）Clin．Exp．Immunol．62：353-360。
2．ブリザード（Blizzard）,R.M.ら（1966）Clin．Exp．Immunol．1：119-128
。
3．ブランディ（Brandi）E.M.ら（1986）P.N.A.S．USA 83：8366-8369。
4．ブラウン（Braun）E.M.ら（1993）Nature 366：575-580。
5．ファトロッシー（Fattorossi）A.ら（1988）P.N.A.S．USA 85：4015-4019
。
6．アーバイン（Irvine）W.J.ら（1969）Clin．Exp．Immunol．4：505-510。
7．ジュリン（Juhlin）C.ら（1987）P.N.A.S．USA 84：2990-2994。
AH患者から検出された自己抗体が、副甲状腺主細胞で発現されるカルシウム感
受性受容体をその標的抗原としていることを開示または示唆している参考文献は
これらのうちにはない。また、本発明の一部である70または80キロダルトンの蛋
白質について言及している参考文献はこれらのうちにはない。
ブリザード（Blizzard）の参考文献では、器官特異的に副甲状腺組織と反応す
ると考えられる抗体が副甲状腺機能低下症患者に存在することを見いだした。反
応性抗原は同定されず、著者らは、このような自己抗体がAHの発症に因果関係を
有するか否かについて疑問視している。従って、ブリザード（Blizzard）らは、
このような関係を確立している本発明から学ぶことができるのである。しかしな
がら、ブリザード（Blizzard）らは、「潜在性副甲状腺機能低下症を検出するた
めの試験法があれば、部分的副甲状腺機能低下症を検出することができるだろう
」という提唱を支持する、デービス（Davis）ら（Lancet ii,1432,1961）および
ジョーンズ（Jones）＆フォーマン（Fourman）（Lancet ii,119,1963;Lancet ii
,121,1963）の論文を参照していることが注目される。本発明の検定方法はこれ
らの参考文献に開示されている試験法とは異なる。
アーバイン（Irvine）の参考文献は、特発性副甲状腺機能低下症患者の副甲状
腺好酸性細胞および主細胞と反応する抗体の存在を報告した。しかしながら、こ
れらの免疫応答に関与する抗原の同一性は決定されなかった。
ベタール（Betterle）の参考文献は、特発性副甲状腺機能低下症における抗ミ
トコンドリア自己抗体の存在を示唆しており、AHで検出される自己抗体は副甲状
腺器官特異的であるというブリザード（Blizzard）らの示唆に異議を唱えている
。ベタール（Betterle）らによって同定された抗原は46キロダルトンの蛋白質で
あり、本発明において同定された抗原とは明らかに異なる。
ブランディ（Brandi）らの参考文献は、副甲状腺および副腎皮質細胞には細胞
毒性作用を示すが、下垂体細胞、甲状腺細胞、肝臓細胞または腎臓細胞には細胞
毒性作用を示さない、AH患者の抗体について開示している。開示された検定方法
は、細胞培養および細胞溶解（51Crの放出）または免疫蛍光測定法によるもので
ある。この方法に関与する抗原については同定されていない。このように、特異
的な抗原に基づいた検定方法は開示も示唆もされていない。
ジュリン（Juhlin）の参考文献は、副甲状腺細胞および腎尿細管細胞上の抗原
だけを認識する、副甲状腺細胞全体に対するモノクローナル抗体の開発に関する
。著者らは、抗体がこれらの細胞上の細胞表面カルシウム感受性受容体に結合し
て、遮断すると推定している。しかしながら、この研究に使用された抗体は自己
抗体ではなく、抗体が結合した結果観察される機能上の変化に基づいた推測によ
ってのみ、認識される抗原の性質が規定されただけであった。
ファトロッシー（Fattorossi）の参考文献は、ブランディ（Brandi）らによっ
て報告された研究を追跡調査し、それを拡大したものである。細胞毒性作用のあ
る抗体は、さらにIgMと分類され、器官特異的ではなく、内皮細胞と反応するこ
とが発見された。また、これらの研究者らは、1種は分子量200キロダルトンで、
もう1種は130キロダルトンである２種の標的抗原が認識されたことを発見した。
標的抗原が副甲状腺特異的カルシウム感受性受容体と関連があることは示されて
い
ない。
ブラウン（Brown）の参考文献は、分子量が約120キロダルトンの、ウシ副甲状
腺細胞外カルシウム感受性受容体のクローニングについて開示している。この受
容体と自己免疫性副甲状腺機能低下症との間にいかなる関係が存在するかという
ことは示唆されていない。
いくつかの特許公報についても以下に考察する：
1．ワシントン大学のカンセ（Cance）らに付与された米国特許第5,053,491号
および第4,864,020号：
これらの特許は、副甲状腺組織を同定するために用いられる、副甲状腺組織の
表面上に存在する抗原に特異的なモノクローナル抗体に関する。この抗原は、19
1キロダルトンの蛋白質である（未換算；換算後の分子量は約171キロダルトンで
ある）。一方、本願の方法および組成物は120kDa、70kDaおよび80kDaの抗原、並
びにそれらの断片に関する。
2．国際公開公報 88／03271号および関連外国出願特許明細書、ジュリン（Juh
lin）ら：
この特許公報は、上記のジュリン（Juhlin）の科学論文に関する。
3．国際公開公報 94／28019号および関連外国出願特許、ジュリン（Juhlin）
ら：
この特許公報は、ウシカルシウム感受性受容体のクローニングについて開示し
た上記のブラウン（Brown）らの研究に関する。この特許の用途は、この著者ら
がカルシウムセンサー蛋白質（calcium sensor protein）またはCSPと称する、
ヒトカルシウムセンサーのクローニングに関する。CSPクローンは、CSPに対する
アゴニスト／アンタゴニストを得るため、およびCSPに対する抗体を得るために
有用であると言われている。このようにして得られた抗体およびアゴニスト／ア
ンタゴニストは副甲状腺機能亢進症を含む多数の疾患状態の治療に有用であるこ
とが予測されている。このように、ブラウン（Brown）らの公報と同様に、この
公報はCSPと自己免疫性副甲状腺機能低下症とを関連づけていない。興味深いこ
とに国際公開公報 94／28019号の出願人らにより、この分子の分子量が500kDaで
あると同定されている。一方、本発明は120kDa分子としてのヒト副甲状腺カルシ
ウム感受
性受容体に関する。
4．米国特許出願第07／356,999号、米国保健福祉省（US Department of Healt
h and Human Services）、オールバッハ（Aurbach）：
この特許公報は、上記のブランディ（Brandi）らおよびその次のファトロッシ
（Fattorossi）らの公報に関する。この公報は、自己免疫性副甲状腺機能低下症
の抗体を特徴づけるために有用であると主張されているウシ副甲状腺培養細胞系
について言及している。特異的抗原に基づく検定方法については、開示も示唆も
されていない。
この参考文献の17ページから18ページにわたる節において、500kDa蛋白質のク
ローンを利用することは、自己免疫性副甲状腺機能低下症の研究の助力となると
仮定している。ブラウン（Brown）,E.M.の論文、Phys．Rev．71巻、371〜411ペ
ージ（1991）は、奇病である特発性副甲状腺機能低下症の病因に自己免疫性が関
与するとして引用されている。
上記で考察した参考文献とは対照的に、本発明は、AHにおける副甲状腺自己抗
体の存在を証明し、それと反応するヒト特異的副甲状腺自己抗原を特徴づけてい
る。副甲状腺反応性自己抗体はAHにおいて存在することが多く、CA-SRはこの疾
患の重要な標的自己抗原である。
CA-SRを誘導する副甲状腺細胞は自己抗体の標的とされるAHの主要自己抗原で
あるという出願人らの発見は、新規な所見であり、器官特異的自己免疫疾患にお
いて免疫応答によって標的にされる受容体である自己抗原の収載に追加されるも
のである（Wilkin,1990）。自己免疫性甲状腺疾患の甲状腺刺激ホルモン（TSH）
受容体（Davies,1981）、重症筋無力症の骨格筋のアセチルコリン(ACh)受容体（
Gonzales-Roz，1984; Fumagalli，1982;およびAesonki,1981）、悪性貧血のガス
トリン受容体（Loveridge,1980）、アジソン病の副腎皮質刺激ホルモン受容体（
Kendall-Taylor，1988）およびIDDのインスリン受容体（Maron,1983）はそれぞ
れの疾患の重要な自己抗原である。自己免疫応答における受容体関与の機序は複
雑であると思われる。第1の可能性は、細胞表面受容体に対する自己抗体により
、それらを発現する細胞の機能が異常化され、受容体が介在する標的細胞の刺激
または阻害が生じることである。生理的分子に類似したアゴニスト自己抗体によ
る刺激
の一例はバセドウ病で、自己抗体がTSH受容体に結合してTSH自体がTSH受容体に
結合するよりも刺激時間が延長されることによって生じる（長時間作用型甲状腺
刺激物質（long acting thyroid stimulatorまたはLATS）。アンタゴニスト自己
抗体による阻害の一例は重症筋無力症で、抗体がACh受容体に結合することによ
って生じる。第2の可能性は、自己抗体が受容体に架橋形成して分解速度を増し
、最終的に枯渇することである。第3の可能性は、自己抗体が受容体に結合して
補体を結合し、それによって受容体を発現する細胞に損傷を与えることである。
出願人らの研究では、CA-SRの細胞外ドメインに対する自己抗体は、アゴニスト
自己抗体としてAHの病因に直接的な役割を果たしている可能性がある。自己抗体
は、受容体に結合、活性化することによって、正常な血清カルシウムイオンと同
じ作用を誘導して、シグナル伝達事象を刺激し、それによって細胞内カルシウム
イオン濃度を上昇させ、PTH分泌を抑制すると考えられる。出願人らが見いだし
たものは、AHの副甲状腺自己抗体の反応性エピトープを含むCA-SRの細胞外ドメ
インであって、細胞内ドメインではない。このことから自己抗体の機能的な役割
が示唆される。このことは、また、成人発症型AH患者の血清から得られた自己抗
体はヒト副甲状腺細胞の細胞表面に結合し、PTH分泌の阻害を誘導するという過
去の報告によっても裏付けられる（Posillico,1986）。また別に、自己抗体はPT
H分泌細胞の損傷を直接誘導する可能性もある。このことは、AH患者の血清中の
自己抗体は、抗体介在性の細胞毒性作用によって、ウシ副甲状腺培養細胞に細胞
毒性作用を示すことが見いだされた報告（Brandi,1986;Fattorossi,1988）およ
びAH患者の副甲状腺の上皮細胞は組織学的研究では数の低下または欠損が見られ
たり、リンパ球浸潤を併発することがあったという報告と一致する。しかし、T
細胞がAHの病因に寄与する可能性もあり（Wortsman,1992）、本発明者らは、AH
は主に抗体介在性疾患であると結論し、本願の検出および治療方法により重要な
解決法が提供される。
発明の簡単な概要
後天性副甲状腺機能低下症（AH）は自己免疫過程によって生じると考えられて
いるが、標的自己抗原はごく最近に同定されたばかりである。本発明は、I型自
己免疫性多発性内分泌腺機能低下症候群患者17例および自己免疫性甲状腺機能低
下症関連患者8例とからなる25例の患者を対象とした本発明者らの研究について
開示
する。免疫ブロット検定法を用いて増殖性ヒト副甲状腺の抗原に対する自己抗体
を探索した。本発明者らが試験した17種のAH血清のうち12種（70％）は70kDaの
細胞質ゾル抗原に反応し、16種（94％）は80kDaの細胞質ゾル抗原に反応した。
また、20種のAH血清うち4種（20％）は120〜140kDaの膜関連抗原にも反応した。
このカルシウム感受性受容体（CA-SR）の正確な大きさは糖鎖形成の程度に依存
する。AHではない自己免疫疾患患者50例または疾患のない正常対照22例から得ら
れた血清はいずれもこのような副甲状腺自己抗体を有していなかった。AH患者か
ら得られた20種の血清のうち6種（30％）はHEK-293細胞でトランスフェクション
されたCA-SRに反応したが、25例全てのAH血清のうち14種（56％）は、ウサギ網
状赤血球発現系によりインビトロで翻訳されたCA-SRの細胞外ドメイン（60〜70k
Da）に反応した。これらの発見からAHの病因に対するこの抗原の役割が確認され
る。
多数のAH患者における副甲状腺特異的自己抗体の発見により、この疾患の自己
免疫的性質が証明され、CA-SRの反応性エピトープが細胞外ドメインに局在化す
ることにより、この疾患においてはこの受容体が活性化されることによってPTH
分泌の阻害が誘発されるということが示唆される。
本発明は、AH発症患者またはAHを発症する危険性のある者における自己抗体の
検出に有用な方法である。この疾患に関連する自己抗体の特異的標的は以下のよ
うに同定される：（1）総分子量が約120〜140キロダルトンで、副甲状腺の主細
胞表面に発現するカルシウム感受性受容体の細胞外部分；（2）分子量が約70キ
ロダルトンの細胞質ゾル抗原および分子量が約80キロダルトンの細胞質ゾル抗原
である、さらに2種の細胞質ゾル抗原。AH抗血清のうち、70または80キロダルト
ンの蛋白質と反応する割合の方が、120〜140キロダルトンの受容体蛋白質と反応
する割合より大きいことが注目される。本発明の一有用性は、同定された自己抗
原またはその抗原性断片は、AHおよびAHと関連することが多く、自己免疫性であ
ると考えられる他の自己免疫疾患の早期診断と治療を達成するために用いられる
ことである。
従って、本発明の一つの目的は、患者における自己免疫性副甲状腺機能低下症
の検出方法、または自己免疫性副甲状腺機能低下症を発症する性向および自己免
疫性副甲状腺機能低下症の発症と通常関連する他の自己免疫疾患を発症する性向
の検出法を提供することである。
本発明の別の目的は、自己免疫性副甲状腺機能低下症関連自己抗原を検出する
方法を提供することである。
本発明の別の目的は、自己免疫性副甲状腺機能低下症関連自己抗原をコードす
る単離ポリヌクレオチドを得る方法を提供することである。
本発明の別の目的は、自己免疫性副甲状腺機能低下症関連自己抗原をコードす
る単離ポリヌクレオチドをトランスフェクションさせた組換え細胞を作出するた
めの方法を提供することである。
本発明の別の目的は、自己免疫性副甲状腺機能低下症患者または自己免疫性副
甲状腺機能低下症を発症する危険性のある患者を治療する方法を提供することで
ある。
図面の簡単な説明
図1は、ヒトCA-SR cDNAをトランスフェクションさせたHEK-293細胞の膜を使用
した免疫ブロット分析である。抗原を含む不動帯を、ウサギ抗CA-SR AbのIgG（
レーン1）、AH患者血清（レーン2）および正常ヒト血清（レーン3）と共にイン
キュベートした。
図2は、インビトロで翻訳されたCA-SRの細胞外ドメインの免疫沈降図である。
インビトロで翻訳された産物を、AH患者の血清（レーン1〜レーン3）および正常
ヒト血清（レーン4〜レーン6）と共にインキュベートした。
発明の詳細な説明
以下の実施例が証明するように、本発明者らの研究は、後天性副甲状腺機能低
下症（AH）の自己免疫性性質を確認し、AH患者の自己抗体が70、80および120〜1
40kDaのヒト副甲状腺蛋白質を標的とすることを証明している。自己抗原はAH患
者から得られた血清にのみ認識され、他の自己免疫疾患患者から得られた血清に
は認識されなかったため、この自己抗原は疾患特異的である。また、この自己抗
原はヒトメラニン形成培養細胞またはラット下垂体細胞を抗原源として使用した
免疫ブロット法によっては検出されなかったため、組織特異的である。本発明者
らは本研究において免疫ブロット法を実施する前に、遠心分離によってミトコン
ドリア蛋白質を注意深く除去したため、この自己抗原はミトコンドリア蛋白質で
は
ない。さらに、本発明者らは、副甲状腺に正常では存在しない抗原の同定が不確
定とならないように、副甲状腺細胞系または腫瘍ではなく、新鮮なヒト細胞充実
性副甲状腺および正常イヌ副甲状腺を選択した。120〜140kDa蛋白質はカルシウ
ム感受性受容体CA-SRである。
免疫ブロット検定法およびAH患者25例から得た血清を使用することにより、本
発明者らは、17種の血清のうち12種（70％）は副甲状腺細胞質ゾルの70kDaの抗
原と反応するが、17種の血清のうち16種（94％）は副甲状腺細胞質ゾルの80kDa
の抗原と反応することを発見した。20種の血清のうち4種（20％）は、これらの
血清とクローニングしてから発現させたCA-SRとを反応させることによって、本
発明者らがカルシウム感受性受容体CA-SRであると確認する、120〜140kDaの膜関
連抗原と反応した。
興味深いことに、CA-SR自己抗体陽性患者のほとんど（APS IのうちのAH患者4
例および甲状腺疾患と関連する成人発症型AH患者8例全員）が女性であった。こ
の所見は、主に女性に発症する他の自己抗体介在性受容体標的疾患において得ら
れた所見と一致する。本発明者らの成人発症型AH患者のうち4例は、出産後に疾
患を発症し、CA-SR自己抗体が検出されており、別の2例の成人発症型AH患者は閉
経後に疾患を発症したが、APS IのうちのAHを呈した1例は月経開始時に病気が発
症した。このことから、この疾患の病因に女性ホルモンが影響している可能性が
示唆される。
APS I患者のうちのAH患者の中にCA-SRに対する自己抗体が存在しなかった患者
がいたということは、研究開始前に、自己抗体の形成に必要な自己抗原が完全に
消失してしまったことで説明がつく。CA-SR自己抗体陰性AH患者のうち2例は、本
研究の32年前に疾患を発症したが、別の2例の自己抗体陰性AH患者は本研究の10
年以上前に疾患を発症した。全ての自己免疫疾患の一般的な特徴は、関連する基
礎疾患の進行過程が時間経過に伴って軽減および増悪するということである。イ
ンスリン依存性糖尿病（IDD）の場合は、膵島細胞自己抗体（ICA）が疾患の臨床
症状発現後に膵臓β細胞が破壊されると消失し、その結果、ICA反応性自己抗原
が消失する。AHは例外ではない。このように、本発明者らのAH罹患患者の中には
疾患の早期段階には確実にCA-SR自己抗体を有するが、本発明者らが研究する前
に消失
してしまった患者もいた。最後に、ウェスタンブロット法を使用することができ
、抗原の反応性に特異的であるが、ウェスタンブロット法は自己抗体を検出する
ためには比較的感度が悪い方法である。ウェスタンブロット法より感度が良い、
ラジオイムノアッセイまたはELISAなどの他の検定法は自己抗体検出頻度を増加
させることができるため、好ましい。
興味深いことに、本発明者らの研究において成人発症型AH患者8例は自己免疫
性甲状腺機能低下と関連があった。ノーザンブロット法によりCA-SR転写物は甲
状腺にも検出されたため（Brown,1993）、CA-SRに対する自己免疫性により両器
官の関与の説明がつく。このように、本明細書に開示される検出方法および治療
方法はAH並びに甲状腺機能低下関連病因に適用できる。APS Iの男性AH患者1例は
、甲状腺ミクロソームおよび甲状腺サイログロブリン自己抗体に加えて、CA-SR
自己抗体価が高かった。一方、年齢、性別および民族性が一致し、甲状腺機能低
下のみが認められる対照患者から得られた8種の血清からはCA-SRの自己抗体は、
検出されなかった。従って、CA-SRに対する免疫応答を引き起こすためには、さ
らに局所的な事象が必要であるかもしれない。さらに、副甲状腺のCA-SRに対す
る自己抗体はPTH欠損を引き起こす最初の現象であり、次いで甲状腺のCA-SRに自
己抗体が反応し、引き続いて免疫介在性の破壊による縮退が生じる。
受容体成分の糖鎖形成の違いにより、CA-SRは本発明者らが行った免疫ブロッ
ト法で120〜140kDaバンドとして出現し、CA-SRの細胞外ドメインは免疫沈降法で
60〜70kDaバンドとして出現した。しかしながら、120〜140kDaバンドおよび60〜
70kDaバンドは共にウサギ抗体でもAH患者血清でも十分に認識されたので、この
糖鎖形成の違いはCA-SRの抗原構造には影響しないと思われた。CA-SRをトランス
フェクションしたHEK-293細胞は、正常なヒト副甲状腺膜調製物よりもCA-SRを多
く含有する。本発明者らが研究したAH患者の多くが、ヒト副甲状腺膜ではなく、
CA-SRをトランスフェクションしたHEK-293膜を免疫ブロット法の抗原源として使
用したとき陽性であった理由が、このことによって説明される。また、本発明者
らは、インビトロで翻訳したCA-SRの細胞外ドメインは、トランスフェクション
したHEK-293細胞よりバックグラウンドがずっと小さいことを発見した。このこ
とにより、インビトロで翻訳したCA-SRの細胞外ドメインを免疫沈降試験の抗原
源として
使用したとき、本発明者らが試験し、その多くが長期発症型AHであったAH患者の
56％もが陽性であった理由が説明できる。
70および80kDaの副甲状腺蛋白質抗原は、分子量が70kDaで、副甲状腺にPTHと
ともに蓄えられ、PTHとともに分泌される副甲状腺分泌蛋白質（PSP）とは関係が
ないことを本発明者らは確認した（Leiser,1989）。この蛋白質は種々の神経内
分泌組織および内分泌組織の分泌顆粒中に含有され、副甲状腺および副腎髄質に
最も豊富であることが報告されている。しかしながら、AH陽性血清を使用した試
験では、インビトロの翻訳による免疫沈降法を用いて産生させたPSPは陽性反応
を示さなかった。
上記の開示および実施例、並びにさらに以下の開示を考慮すると、AH患者にお
けるCA-SR並びに70および80kDaの副甲状腺特異的抗原に対する自己抗原の本発明
者らによる発見から、この疾患の有用な診断試験が生み出されることは当業者に
は明らかであると思われる。以下に詳細に記載するように、診断試験の陽性結果
は、代償性カルシウム療法、活性型ビタミンD療法、免疫療法またはこれらの療
法を組み合わせたものを開始する必要があることを示している。
本発明の診断試験は、患者における自己免疫性副甲状腺機能低下症、または自
己免疫性副甲状腺機能低下症を発症する性向および自己免疫性副甲状腺機能低下
症の発症に通常関連する、甲状腺機能低下症などの他の自己免疫性疾患を発症す
る性向を検出するための方法である。本発明の方法は、ヒトカルシウム感受性受
容体（CA-SR）またはその抗原性部位と反応する血清抗体、または自己免疫性副
甲状腺機能低下症と関連する副甲状腺特異的細胞質ゾル抗原と反応する血清抗体
の存在を検出する段階を含む。
本発明の方法は、CA-SR全体を使用してもよいし、またはヒトカルシウム感受
性受容体の細胞外ドメインなどの抗原性部位だけを使用してもよい。CA-SRを発
現する副甲状腺細胞膜源またはCA-SRを発現する組換え細胞から膜調製物を、CA-
SRの周知の塩基配列を使用して、当技術分野において周知の方法によって入手し
（以下の材料および方法の項参照）、本発明の方法に使用してもよい。
別の方法として、または追加の方法として、本発明の方法は、副甲状腺細胞に
存在する70キロダルトンまたは80キロダルトンの細胞質ゾル抗原を精製またはク
ローニングし、発現、精製したものを利用することができる。これらの細胞質ゾ
ル蛋白質と反応することが周知のAH患者抗血清を固相化したアフィニティーカラ
ムを調製するなどの当技術分野において周知の方法によって、これらの蛋白質は
容易に精製される。AH陰性患者の血清から別のカラムを調製することによって、
70kDaまたは80kDaの蛋白質以外の全ての蛋白質は細胞質ゾル調製物から吸着され
る。この第1のカラムの溶出物を次いでAH血清カラムを通過させ、結合、精製さ
れた抗原を、pHを低下させまたは免疫アフィニティークロマトグラフィーに関す
る当技術分野において周知の他の手法によって溶出した。最後の精製段階として
、70kDa蛋白質と80kDa蛋白質とを分離するために、分子サイズ排除カラムまたは
逆相HPLCカラムによる分離を行った。得られた単離抗原は、本発明の診断方法に
直接使用される。
別の方法として、当技術分野において周知の方法により、蛋白質のアミノ酸分
析を実施し、それによって誘導されたアミノ酸配列を使用してオリゴヌクレオチ
ドプローブを設計し、これらの蛋白質をコードする遺伝子をクローニングしても
よい。これは、市販品または当技術分野において周知の方法によって調製した（
Maniatisら著、コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）、Molecuar
Cloning,1982）、ヒトゲノムライブラリーまたはヒト副甲状腺cDNAライブラリ
ーをスクリーニングすることによって達成される。同定されたら、核酸塩基配列
をコードする70および80キロダルトンのクローンを制限酵素で切断することによ
って単離し、細菌細胞、酵母細胞および哺乳類細胞を含むがこれらに制限されな
い、好ましいいかなる所定の組換え細胞においてもコードした抗原を発現させる
ために、適当な発現ベクターにサブクローニングする。当業者は、適当な転写開
始および終結のシグナルを提供する必要性、および適当な翻訳開始および停止コ
ドンを提供する必要性を十分理解している。また、選択した細胞種中で発現率が
高い蛋白質の配列と一致するコドン利用の最適化などによって、70または80kDa
の副甲状腺細胞質ゾル抗原をコードする核酸について、コード配列を調整して選
択した細胞種における発現が最適になるように改変してもよい。
発現させたら、上記の天然型抗原の単離方法と本質的に同じ方法を用いて、こ
の抗原を発現させた組換え細胞種の特異性に基づいたわずかな改良を加え、組換
え蛋白質を回収し、単離する。周知の方法により、単離した抗原を使用して、モ
ノクローナル抗体を含む、70または80キロダルトンの蛋白質を認識する抗体を作
成する。例えば、これらの抗体を下記の検定方法に使用することができる。標識
抗原を使用して競合実験を実施するため、放射性標識、蛍光標識、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼなどの酵素、アビジン、ビオチン、または他の多数の周知の標識
のいずれかで70および80kDa抗原を標識してもよい。
天然型蛋白質の単離、または上記の組換え発現のいずれかにより、CA-SRを豊
富に含む膜、またはCA-SRならびに／もしくは70および80kDa副甲状腺抗原の抗原
性部位の適当な抗原源が確保されたら、本発明の診断試験を以下のように実施で
きる。
自己免疫性副甲状腺機能低下症の疑いのある患者またはこの疾患の可能性のあ
る状態を排除することが重要である患者から血清を単離する。
この血清とCA-SRが豊富な膜と、または単離した70および80kDaの蛋白質とを反
応させ、当技術分野において周知の多数の方法によってこの相互作用を定量する
。このように、例えば、患者の血清とビオチン標識AH抗原（70kDa蛋白質、80kDa
蛋白質、CA-SR膜またはその抗原性断片）とを接触させることによって、AH特異
的自己抗体の存在が検出される。次に反応物を、AH抗原に結合したビオチンと反
応するアビジンを固相化したビーズと反応させる。いかなる抗原-抗体複合体が
形成されても、ビーズと、放射性標識、蛍光標識、酵素標識または他の成分など
の検出可能な標識を有する抗ヒト抗血清とを接触させることによって、複合体は
検出される。
例えば、CA-SR発現膜を使用して、先ず（例えば、マイクロタイタープレート
の表面に）膜を固定し、膜と試験血清とを接触させ、次いでこの反応物と、上記
のように標識した抗ヒト抗血清とを接触させることによって、同様の検出検定法
を実施してもよい。
上記の例に加えて、検出方法は、固相化した抗原と試験血清とを反応させ、次
いで標識した抗血清と接触させることによって検出されるウェスタンブロット法
の形をとってもよい。
上記の開示内容および実験結果から、CA-SR、70kDa蛋白質および80kDa蛋白質
は
AHの病因における主要な抗原であり、従ってこの疾患の診断および治療に有用で
あることは明らかである。これらの蛋白質に対する自己抗体は、AHに罹患した患
者のAHではない親族並びに一般集団における疾患の予測に有用である。このよう
な抗体は、単離または組換え蛋白質、ペプチドまたはその抗原性断片を使用した
ラジオイムノアッセイ、本明細書で概略する枯渇(deple1tion)またはD-ELISAお
よび／もしくはELISAまたは免疫沈降法によって検出可能である。バキュロウィ
ルスによる真核細胞発現系は、抗体結合能を増大する場合には、蛋白質を適当に
折りたたんだり、蛋白質をグリコシル化するのに好ましいと思われる。しかしな
がら、当業者には容易に認識されるように、COS細胞、酵母細胞および大腸菌な
どの細菌の発現系をこの目的のために使用することができる。
関連の自己抗体はほとんどが直線状エピトープではなく立体構造によって対応
する自己抗原と反応するので、本発明の抗原と抗体とを使用した流相の免疫検定
法を使用することによって、本発明の方法は最も高い感度を得ることができる。
RIAおよびD-ELISA方法はこれらの特徴を満たすという点で極めて有用である。従
って、本明細書において同定された自己抗原により、AHおよびAHの疑いを同定す
るための、より優れた精度、再現性および、特異性を有する化学反応に基づいた
検定法が提供される。
上記の検出方法の提供に加えて、本発明者らによるAH抗原の同定により、AHに
おける免疫寛容を回復させるための治療剤として、組換え蛋白質抗原の使用に基
づいた、抗原を介した免疫療法が提供される。従って、自己免疫性副甲状腺機能
低下症患者または自己免疫性副甲状腺機能低下症を発症する危険性のある患者を
治療する方法には以下の段階が含まれる
（a）120〜140kDa抗原、70kDa抗原、80kDa抗原またはこれらの抗原を組み合わせ
たものに対する自己抗体に関して、患者の血清をスクリーニングすることにより
、この疾患またはこの疾患を発症する性向を検出する段階；
（b）段階（a）の試験で陽性の患者を、以下を用いて治療する段階
（i）代償性PTH療法、
（ii）段階（a）で使用される抗原を認識する自己抗体に対して生ずる抗体
、
（iii）AH関連抗原に対する免疫寛容を回復させるための段階（a）の抗原、
または
（iv）治療法（i）〜（iv）を組み合わせたもの。
インビトロでのAH自己抗原との接触後の増殖またはサイトカイン形成などによ
る細胞応答も疾患の予測および治療に有用である。
自己抗原ペプチド誘導体は、アネルギーを誘導するための抗原の静脈内投与、
ヘルパー2型Tリンパ球が介在する抗体応答を誘導して病原性ヘルパー1型Tリンパ
球サブセットに対する免疫抑制作用を誘導するなどの抗原に対する意図的な免疫
、またはアネルギーおよび抑制作用を誘導するためなどの抗原の経口投与を含む
、抗原による療法に使用される。インスリン依存性糖尿病（IDD）の分野におい
ては、GAD65抗原をNODマウスの若年期に静脈内投与すると、炎症性浸潤または膵
島炎の程度を低下させ、高血糖の発症が予防されることが報告されている（Kauf
fmanら、Nature 1994:366:69-72）。
フロイント不完全アジュバントと混合したインスリンおよびインスリンB鎖の
皮下免疫により、膵島炎を低減させることなく、長期にわたってNODマウスの糖
尿病が予防される。しかしながら、浸潤細胞は、大量のインターフェロンγを産
生する細胞から生産しない細胞へとその表現型を変える。この方法で糖尿病を予
防したマウスの脾臓リンパ球を導入することによっても、予防期間は最長1ヶ月
までになる。このように、この治療は、Th1からTh2応答への移行に関連し、破壊
性のものではなく、保護性の活発な免疫抑制作用と膵島炎を誘導する。さらに、
β細胞の破壊が阻止されるので、この作用は単にインスリンに対する自己免疫性
に関与するだけの作用を上回るはずである。膵島環境へ予防としてサイトカイン
を放出することは、第三者的影響による他の自己抗原に対する隣接自己免疫応答
をも阻止するはずである（Muir，Maclarenら、J Clin Invest 1995:95:628-634;
Ramiya，MuirおよびMaclaren，Clin immunotherapy 1995:3:177-183.）。進行
中の自己免疫疾患を阻止するために所定の自己抗原の反復投与を行ってもよい。
NODマウスの場合には、これは、インスリンの経口投与（Weinerら Natl Acad Sc
i USA 1991:88:10252-10256）だけでなくインスリンおよびGADの経口摂取（Muir
，Maclarenら Diabetes/Metabolism Reviews 1994:9:279-287）として行われた
。従って、AH自己抗原単独で、または他の抗原と併用する治療方法は、上記に概
略したIDDの
研究での治療と同じように応答することが期待される、AHの治療に対する、新規
な治療的アプローチである。
他の自己免疫疾患患者はAHを発症する危険性があることまたはAHであることを
考慮するべきであり、従って本明細書に記載する方法によってAH自己抗体のスク
リーニングを行うべきであるということが重要である。自己抗体について陽性で
あることが判明した患者およびその家族には、本明細書に記載する方法による治
療を考えるべきである。本発明の信頼性のある免疫学的検定法は、自動化するこ
ともできるし、またフィンガースティック式のスクリーニング試験として開発す
ることもできる。さらに、本発明は、患者またはAHを発症する危険性のある者に
おいてAHを検出するためのキットを提供する。キットは、以下の抗原：CA-SRま
たはその抗原性部位、70kDa蛋白質、80kDa蛋白質のいずれか1種または全てを含
む。また、特に標識した動物抗ヒト免疫グロブリンを用いた場合、固相化した抗
原にAH自己抗体が結合し、次いで標識した動物抗ヒト免疫グロブリンと抗原-自
己抗体複合体とが反応することによって、検出することができる。
材料および方法 a ．患者：
本発明者らは、AH患者25例の血清を調査した。これらのうち、17例の患者はAP
S Iであった（全患者がAHを発症し、14例は粘膜皮膚カンジダ症を発症し、10例
はアジソン病を発症し、多数の患者が関連する白斑、脱毛、慢性活動性肝炎およ
び／または原発性性機能低下症を発症していた）。別の8例の患者は甲状腺ミク
ロソーム抗体および／またはサイログロブリン抗体の存在によって確認された、
甲状腺腫および自己免疫性甲状腺機能低下症に関連する成人発症型副甲状腺機能
低下症を発症していた（表1）：
また、年齢および性別が一致し、カルシウム濃度が正常で、AHの徴候を示してい
ない成人発症型副甲状腺機能低下症患者8例を対照として使用した。本発明者ら
は、アジソン病患者10例、バセドウ病10例、橋本甲状腺炎12例、インスリン依存
性糖尿病（IDD）10例および白斑8例（いずれの患者もAHを発症していなかった）
、並びに疾患のない正常対照22例の血清を試験した。正常対照はいずれも、甲状
腺ミクロソーム自己抗体、サイログロブリン自己抗体または膵島細胞自己抗体な
どの内分泌関連血清抗体を有していなかった。b ．抗原の調製
腎不全による副甲状腺機能亢進症および骨軟化症のために治療を受けている3
例の患者から外科的に切除して、細胞充実性ヒト副甲状腺を得た。副甲状腺は、
プロテアーゼ阻害剤（1,10-フェナントロリン、アプロチニン、EDTAおよびベン
ザミジン）混合物を添加したリン酸緩衝生理食塩液（PBS,pH7.4）中に入れて氷
上に置いた。ガラス製の組織粉砕器を用いて組織をホモジナイズし、15,000xgで
遠心分離して細胞の砕片、核およびミトコンドリア蛋白質を除去した。上清を10
0,000xgの超遠心分離によってさらに膜分画と細胞質ゾル分画とに分離した。膜
分画および細胞質ゾル分画は共に免疫ブロット実験の抗原源として使用した。
CA-SRを発現するHEK-293細胞の血漿膜調製物、および野生型HEK-293細胞の膜
調製物を、以下の免疫ブロットおよび免疫沈降試験の抗原源として使用した。c ．免疫ブロット法
細胞質ゾル分画および膜分画を、DL-ジチオトレイトール（DTT）を含有するド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）ゲル泳動緩衝液に溶解し、スポットする前に100℃
で3分間加熱した。SDS-PAGEによる分離後、蛋白質をイモビロン-P（Immobilon-P
）膜（Millipore，Bedford，MA）に移した。膜に相当する切片を切り取り、1％B
SAおよび0.05％ツイーン（Tween）-20（TBST）を含むトリス緩衝生理食塩液を用
いてインキュベートし、遊離している可能性のある結合部位を遮断した。1／100
に希釈した試験血清、並びにウサギ抗CA-SR抗血清の精製IgGおよび免疫前のウサ
ギ血清のIgGを抗原含有切片とともにインキュベートした。次いで、切片を抗ヒ
トまたは抗ウサギ多価免疫グロブリンアルカリホスファターゼ複合体とインキュ
ベートし、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート（BCIP）およびニトロ
ブルーテトラゾリウム（NBT）（Promega，Madison,WI）で展開した。d ．インビトロ翻訳および免疫沈降法
CA-SRはアミノ酸1085残基の直鎖状ペプチドで、膜を7回貫通すると推定される
ドメインとアミノ末端にアミノ酸613残基の大きな細胞外ドメインとを有する。
ヒトのCA-SR cDNA（Brown,1993;Pollak，1993）の細胞外ドメインおよび細胞内
ドメインはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。PCR産物は、pcDNA3構
築物のSP6プロモーターの下流に配置した。組換えプラスミドを大腸菌で増殖さ
せ、マジック（登録商標）ミニプレップス システム（Magic Minipreps System
）（Promega）によって精製した。製造業者の指示に従ってCA-SR cDNAを転写し
、翻訳した。簡略に説明すると、1μgの環状プラスミドDNAを、RNAsin（Promega
）の存在下にて、SP6 RNAポリメラーゼ（Stratagene，La Jolla，CA）を使用し
て、40℃で2時間、100μl反応液中で、転写した。4μlの35S-メチオニン（10mCi
／ml）（Amersham，Arlington Heighs，IL）の存在下にて、基質として20％合成
RNAを用いた50μl反応液中で、メチオニンを含有しないウサギ網状赤血球溶解産
物を使用して翻訳を実施した。
翻訳反応が終了した後、5μl量を採取しSDS試料緩衝液20μlと混合することに
よって、翻訳産物を試験した。試料を100℃で、2分間加熱し、SDS-ポリアクリル
アミドゲル（SDS-PAGE）にスポットした。オートラジオグラフィーのために、ゲ
ルを乾燥させ、室温で一晩、X線フィルム（XAR-2 ready pack，Sigma，St Louis
，MO）に曝露した。CA-SRは糖蛋白質なので、成熟糖鎖形成受容体を得るために
、イヌ膵臓ミクロソーム（Promega）1μlを翻訳反応混合液に添加した。
自己抗体の反応性を特徴づけるために、翻訳産物1μlを血清2μlとともに4℃
で
、一晩インキュベートした。免疫複合体を氷冷PBSで3回洗浄し、プロテインA-セ
ファロース（Sepharose）ビーズとともにさらに45分間インキュベートした。洗
浄後、SDSゲル泳動緩衝液50μlをビーズに添加して、2分間沸騰させた。代謝的
に標識され、抗体結合によって沈降した蛋白質のオートラジオグラフィーを上記
のように実施した。
以下は本発明を実施するための、最良の形態を含む方法を例示する実施例であ
る。これらの実施例に制限されるものではない。全ての割合は、重量によるもの
で、溶媒混合の割合は全て、特に記載しない限り、容量によるものである。実施例1-自己抗体の特徴付け
本発明者らが上記のように免疫ブロット法によって試験した17種のAH血清から
は、いくつかの副甲状腺特異的蛋白質に対する自己抗体が検出された。12種（70
％）は70kDaの蛋白質に反応し、16種（94％）は80kDaの蛋白質に反応した。70お
よび80kDaの蛋白質は副甲状腺抽出物の細胞質ゾル分画に局在化していた。この
ように試験した20種の血清のうち4種（20％）は、膜分画中の120〜140kDaの対の
蛋白質と反応する自己抗体を有していた。他の自己免疫性疾患患者50例並びに正
常対照22例の血清も試験したが、いずれの血清も上記の特異的副甲状腺蛋白質の
いずれとも反応しなかった（表2）：
免疫ブロット法において、正常イヌ副甲状腺を抗原源として使用しても、自己
抗体は検出可能であった。しかしながら、培養ヒトメラノーマ形成細胞またはラ
ット下垂体細胞を抗原源として使用した場合、自己抗体は検出できなかった。実施例2-自己抗原の同定
副甲状腺120〜140抗原は、その糖鎖形成の程度に応じてCA-SRと同じ分子量を
有するため、本発明者らは受容体自体が自己抗原である可能性を、3種の実験法
によって試験した。
第1の方法において、ウサギ抗CA-SR IgGと患者血清との反応性を、抗原源とし
て副甲状腺膜を用いた免疫ブロット法によって試験した。患者の血清は、ウサギ
抗CA-SR IgGによって認識されるものと極めて一致する、120〜140kDa蛋白質に反
応した。正常対照の血清と、免疫前のウサギから得た同じ濃度のIgGはこのよう
には反応しなかった。
第2の方法において、ウサギ抗CA-SR IgGと患者の血清との反応性を、免疫ブロ
ット実験において、抗原源としてたHEK-293トランスフェクション細胞を用いて
、試験した。この細胞系はヒトCA-SR cDNAでトランスフェクションされたもので
ある。患者の血清は再度、ウサギにおいて生じた抗CA-SR IgGによって認識され
るものと極めて一致する、120〜140kDaの蛋白質に反応した（図1）。6種のAH患
者の血清（30％）はこの抗原源のCA-SRに反応したが、15種の正常対照の血清は
いずれもこのように反応しなかった。また、6種の陽性血清はCA-SR蛋白質を発現
していない非トランスフェクション細胞または野生型HEK-293細胞には反応しな
かった（表3）：
第3の方法において、抗原性エピトープの局在化を、ウサギ網状赤血球発現系
の溶解物中でインビトロで翻訳したCA-SR抗原の免疫沈降法によって測定した。
患者血清は、分子の細胞外ドメインの70kDaおよび60kDaの蛋白質の両者に反応し
たが、正常対照の血清はいずれもそのように反応しなかった（図2）。60kDaはcD
NA導入サイズ（1.6kb）による糖鎖形成はされていないが、70kDaはイヌ膵臓ミク
ロソ
ーム膜の添加による糖鎖形成が十分に行われたものである。
細胞質ゾルドメインは60kDaの蛋白質として翻訳され、予測されたように、ミ
クロソーム膜に接触させても、糖鎖形成は起こらなかった。患者の血清はいずれ
も、CA-SRの細胞質ゾルまたは細胞内ドメインとは反応しなかった（データは示
していない）。要約すると、AH患者の血清のうち14種（56％）は組換えによって
発現させたCA-SRの細胞外ドメインに反応したが、25種のAH患者の血清はいずれ
も分子の細胞内ドメインに反応しなかった。新たに診断された患者のみを研究対
象とすれば、自己抗体の検出頻度はもっと高くなっていたかもしれない（表4）
：
実施例3-70および80キロダルトンの自己抗原の単離、クローニングおよび発現
副甲状腺細胞に存在する、70キロダルトンまたは80キロダルトンの精製細胞質
ゾル抗原またはクローニングし、発現、精製した細胞質ゾル抗原は、アフィニテ
ィーカラムを調製することによって得られる。これらの細胞質ゾル蛋白質と反応
することが周知のAH患者の抗血清を固相化することによって得られる。この目的
のための活性化セファロース（SEPHAROSE）ビーズは、ファルマシア社（Pharmac
ia）から入手し、10gの血清に対して1グラムのビーズの比率で血清と反応させる
。AH陰性患者の血清を使用した以外は、同じ方法で第2のカラムを調製する。
好ましくは、霊安室から得られた新鮮な副甲状腺を、プロテアーゼ阻害剤混合
物を含む低張液中でホモジナイズして、副甲状腺の細胞質ゾル抽出物を調製する
。少なくとも25,000rpmで、1時間遠心分離して、膜および砕片を除去し、細胞質
ゾル上清をデカントして得る。抽出物をAH陰性血清を固定して調製したカラムに
通すことによって、細胞質ゾル調製物から70kDaまたは80kDa蛋白質以外の全ての
蛋白質を吸着させる。この第1のカラムの溶出液を次いでAH血清を固相化したカ
ラムに通して、結合させ、pHを低下させることによって溶出し、抗原を精製する
。次いで、アフィニティーカラムの溶出液を濃縮し、分子サイズ排除HPLCに通し
て
、70kDa抗原と80kDa抗原とを分離した。得られた単離抗原は、本発明の診断方法
に直接用いることができる。
別の方法として、蛋白質のアミノ酸分析を実施し、アミノ酸配列を用いて、こ
れらの蛋白質をコードする遺伝子をクローニングするためのオリゴヌクレオチド
プローブを設計する。ヒト副甲状腺cDNAライブラリーをスクリーニングして、陽
性のクローンを単離する。クローンを配列決定して、70または80kDaの蛋白質を
コードする配列を有することを確認し、陽性クローンについては、抗原をコード
する配列が発現ベクター上に位置するようにサブクローニングし、次いで哺乳類
の細胞にトランスフェクションし、培養によって増殖させる。
発現したら、組換え蛋白質を、上記の天然抗原の単離と本質的に同じ方法で回
収、単離した。実施例4-AHまたはAHの性向および他の自己免疫疾患を検出するための検定法：
CA-SRを豊富に含む膜並びに70および80kDa副甲状腺抗原と、自己免疫性副甲状
腺機能低下症が疑われる患者、またはこの疾患状態の可能性を排除することが重
要である者の血清とを接触させる。
患者の血清とビオチン標識AH抗原（70kDa蛋白質、80kDa蛋白質、CA-SR膜、ま
たはその抗原性断片）とを接触させることによって、AH特異的自己抗体の存在を
検出する。次いで、反応物をAH抗原上のビオチンと反応するアビジンをコーティ
ングして固定したビーズと接触させる。いかなる抗原-抗体複合体が形成されて
いても、このビーズと、放射性、蛍光、酵素または他の成分のような検出可能な
標識を有する抗ヒト抗血清とを接触させることによって、この複合体が検出され
る。実施例5-治療方法
上記の検出方法の提供に加えて、本発明者らによるAH抗原の同定により、組換
えまたは精製蛋白質抗原をAHの免疫寛容を回復させるための治療薬として使用す
ることに基づいた、抗原を介する免疫療法が提供される。従って、自己免疫性副
甲状腺機能低下症患者または自己免疫性副甲状腺機能低下症を発症する危険性の
ある患者を治療する方法には以下の段階が含まれる：
（a）120〜140kDa抗原、70kDa抗原、80kDa抗原、またはこれらの抗原を組み合わ
せたものに対する自己抗体に関して、患者の血清をスクリーニングすることによ
って、疾患または疾患を発症する性向を検出する段階と、
（b）段階（a）の試験で陽性の患者を、以下により治療する
（i）代償性PTH療法、
（ii）段階（a）で用いた抗原を認識する抗体に対して生じた抗体、
（iii）AH関連抗原に対する免疫寛容を回復させるための段階（a）の抗原
、または
（iv）治療法（i）〜（iii）を組み合わせたもの。
これらの抗原は好ましくは、アナフィラキシーの誘発を回避するために比較的
小用量で用いる。自己反応性成分のアネルギーを誘導するため、投与方法は、自
己抗原またはその抗原性断片もしくはそのペプチドの静脈内投与とする。このよ
うな治療を繰り返すための用量および療法は通常の臨床研究によって規定される
。また、Th2からTh1応答への移行または阻害抗体の形成を誘導するため、蛋白質
およびペプチドを、皮下免疫に用いることもできる。さらに別の方法は、経口投
与であり、アネルギーおよび第三者的な免疫応答に対する免疫抑制作用を誘導す
る。
本発明の好ましい方法において、予防または治療は、罹患しやすい個体に対す
る自己抗原の投与に関係する。本明細書で開示するように、AHは自己免疫的病因
病理を有する。予防的治療として自己抗原を投与することの有用性を説明する種
々の機序が提唱されている。また、自己抗原を投与して、免疫学的無応答を誘導
する、すなわち、抗原特異的寛容を誘導することができるのは当業者に周知でも
ある。米国特許第5,114,844号；ナグラー-アンダーソン（Nagler-Anderson）ら
（1986）Proc．Natl．Acad．Sci USA 83:7443-7446；ミラー（Miller）ら（1984
）Clin．Immunol．Immunopathol．31:231-240；シルバーマン（Silverman）ら(1
983)J．Immunol．131:2651-2661；ミカエル（Michael）（1989）Immune Invest
．18:1049-1054を参照のこと。本発明によるAH自己抗原の投与は、当技術分野に
おいて周知の方法、処方、および投与経路を用いることができる。本開示の利益
を有する当業者に認識されるように、AH自己抗原またはペプチドの投与は、例え
ば、非経口、経口、鼻腔内によっても、または、抗原エピトープを発現する患者
のゲノムの改変によっても実施できる。実施例6-後天性副甲状腺機能低下症に関連する自己抗体を検定するためのキット
本発明の抗原を使用することにより、血清試料を簡便かつ容易に分析すること
のできる試薬キットが提供される。キットは、自己抗体の抗原として、組換えま
たは合成によって生成させたペプチドを利用するものである。抗体を検出するた
めのELISA法およびRIA法の原理および方法は十分に確立されている。
ELISA検定の一例として、このようなキットは以下の成分を含む：
1．本発明のAH抗原の1種または複数種；
2．酵素（例えば、ペルオキシダーゼ）；
3．動物抗ヒト免疫グロブリン複合体；および
4．陽性対照および陰性対照。
上記のキットは、96ウェルプラスチックプレート、発色試薬、ELISAリーダー
、停止試薬および洗浄用緩衝液を含むように改良することができる。
また、RIAの一例として、このようなキットは以下の成分を含む：
1．本発明のAH抗原の1種または複数種；
2．洗浄用緩衝液；
3．ポリエチレングリコール；
4．ヤギまたはヒツジ抗ヒト沈降用（第2）抗体；および
5．陽性対照および陰性対照。
上記のキットはいずれも、適当な実験材料を含むように改良することができる
。
免疫沈降法の使用に加えて、本発明は、AH自己抗体の存在の検出を容易にする
他のいかなる方法を利用して実施してもよい。例えば、利用することができる、
他の免疫学的方法には、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）およびラジオイムノ
アッセイ（RIA）が挙げられる。これらの方法の原理および実験方法は当業者に
周知である。AH自己抗体と結合する天然または組換え蛋白質を使用することによ
って、迅速かつ効率的にこの検定法を実施することができる。完全細胞法および
細胞溶解法は共に当業者に周知であり、AH抗体の検出に容易に使用される。
本明細書で同定されたAH自己抗原のアミノ酸配列を分析して、免疫学的に反応
性エピトープを確認することができる。これらのエピトープは、免疫学的に自己
抗体と反応するアミノ酸配列である。次いで、これらの配列を組換え法によって
産生させる。組換え産生については、エピトープをコードするDNAをベクターに
導入し、次いでこれを用いて所望のアミノ酸配列を発現させるように適当な宿主
細胞を形質転換する。細菌、昆虫、酵母および哺乳類細胞は全て適当な宿主とな
るが、蛋白質の折りたたみがエピトープの反応性の重要な要因である場合には、
真核細胞が好ましい宿主であると考えられる。
精製蛋白質または蛋白質を産生する細胞の溶解物は検定に用いることができる
。
また、AH自己抗原を用いるかわりに、AH自己抗原に対して産生される抗抗体と
して周知である抗体を使用してもよい。この抗体はAH自己抗原と免疫沈降し、そ
の検出は上記のように実施される。
本明細書に記載した実施例および態様は例示目的のためだけであること、また
この点を考慮して、当業者に示唆される種々の改良または変更が、本出願の精神
および範囲内であり添付の請求の範囲内に含まれることを理解すべきである。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/47
Ｃ０７Ｋ 14/47 14/705
14/705 16/18
16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｃ１２Ｐ 21/02 33/564 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
33/564 Ａ６１Ｋ 37/24
//(Ｃ１２Ｎ 5/10
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ
，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，
ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，Ｍ
Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ
，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ