JPH11514534A

JPH11514534A - 乳酸菌から誘導される塩誘発プロモーターおよび所望のタンパク質産生のための乳酸菌でのその使用

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Publication number: JPH11514534A
Application number: JP10512223A
Authority: JP
Inventors: サンデルス，ヤン・ウイレム; コツク，ヤン; ベネマ，ヘラルド; レデブール，アドリアヌス・マリヌス
Original assignee: ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ
Priority date: 1996-09-05
Filing date: 1997-08-20
Publication date: 1999-12-14
Also published as: CA2236770A1; ID18254A; US6140078A; AU4208797A; EP0865496A1; WO1998010080A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、配列番号１０に存在する塩誘発プロモーターであって、通常は野生型乳酸菌において該プロモーターにより制御されるコード配列から分離した、乳酸菌から誘導される塩誘発プロモーターを、その改変および重要部分とともに提供する。また、該プロモーターを含む組換えベクターおよび形質転換した乳酸菌、ならびに所望のタンパク質またはその前駆体をコードする遺伝子が該プロモーターの制御下で発現される、該形質転換した細菌による所望のタンパク質の産生方法も提供する。所望のタンパク質は、シグナル配列の存在により、該細菌によって分泌させることができる。塩誘発プロモーターの作用は、約4〜4.5のｐＨで、および／またはグルタミン酸の存在によって高められる。該方法は、所望のタンパク質が細胞の溶解および細胞の中身の遊離を引き起こす溶菌タンパク質である醗酵工程において使用できる。あるいは、所望タンパク質は、例えばドレッシング、スプレッド、ソーセージおよび醗酵生地の製造における風味の形成に関与する酵素、または、キモシンもしくはその前駆体などのチーズ製造工程で機能するタンパク質、またはチーズの風味の形成に関与する酵素であってもよい。

Description

【発明の詳細な説明】乳酸菌から誘導される塩誘発プロモーターおよび所望のタンパク質産生のための乳酸菌でのその使用本発明は、乳酸菌から誘導される塩誘発プロモーターに関する。発明の背景および従来技術塩誘発プロモーターは植物およびシアノバクテリアに存在することが知られており、後者は、自然の施肥としての土壌の窒素固定に使用でき、分類学的に他の細菌とは全く別である、かなり専門化した細菌である。誘発プロモーター系は、E．coliなどのグラム陰性菌およびグラム陽性菌Bacil lus subtilisにおいて知られており、一方、最近は、WO 95/31563（Quest Inter national B.V.(A.Nauta c.s.):参考文献36を参照）において、誘発プロモーター系が乳酸菌またはそれらのファージに対して記載されているが、上記したかなり専門化したシアノバクテリア以外の微生物において活性な塩誘発プロモーターに関する文献は見いだされなかった。「塩開始誘発系」の表現は、該WO 95/31563 （Quest International B.V．(A．Nauta c.s.):参考文献36）に示されていたが、具体的な塩開始誘導系は開示されていなかった。本発明は、乳酸菌に対する塩誘発プロモーターおよび乳酸菌によるポリペプチドの産生におけるその使用を初めて提供するものである。発明の概要本発明は、乳酸菌から誘導される塩誘発プロモーター、特にそのヌクレオチド配列が配列番号１０および図６に示される塩誘発プロモーターを提供する。乳酸菌において活性な塩誘発プロモーターの利点は、まず第一に、塩が自然食品成分であり、従って、食品醗酵工程において食品等級の誘導物質として使用できるということである。例えば、種々のタンパク質またはペプチドの生成を誘発するためにより高い塩濃度を使用する場合は、チーズ凝乳の塩析工程中に種々の工程を開始させることができる。そのような工程としては、最終チーズの性質に寄与し得る化合物、例えば芳香化合物の生成に寄与する酵素および／またはペプチドの誘導産生および分泌、ならびにペプチド分解酵素が遊離され、それによってチーズの成熟工程が高められる乳酸菌の溶解が挙げられる。塩−誘発プロモーターが有利に使用できるもう一つの工程は、食品等級の微生物、特に乳酸菌によるタンパク質または二次代謝物の産生工程であり、それによって、高い細胞密度での培養の終わりに、微生物が塩によって誘発されて所望のタンパク質または二次代謝物を産生する。実施例に示すように、本明細書では、「塩」は、通常の塩、すなわち塩化ナトリウムを意味するだけでなく、アルカリ金属、アルカリ土類金属およびアンモニウムのハロゲン化物などの他のハロゲン化物も含む。実施例１および２（下記表３も参照）に例示したＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮＨ₄Ｃｌ、ＣａＣｌ₂、ＭｇＣｌ₂ 、ＮａｌおよびＫＩによる塩−誘発の他に、他のハロゲン化物、すなわち臭化物および恐らくフッ素化物、ならびに置換アンモニウム化合物（例えば、テトラメチルアンモニウム）などの他の陽イオンとのハロゲン化物、または他の金属陽イオン、例えばＡｌ３＋も塩誘発効果を示すと考えられる。微生物における塩誘発プロモーターの存在により利益が得られるさらに別の工程は、塩の添加時のin situ醗酵産物での二次代謝物、例えば芳香または風味成分の産生であり、例としては、ドレッシングおよび水含有スプレッドならびにソーセージおよび醗酵生地が挙げられる。本発明はまた、各々そのような塩誘発プロモーターを含む組換えベクターおよび形質転換された乳酸菌も提供する。図面の簡単な説明図１．プラスミドpORI13の模式図。ori⁺：pWV01のプラス起点；Em^r：エリスロマイシン耐性遺伝子；Ｔ：ターミネーター；lacZ：lactococcal ORF32のリボソーム結合部位および翻訳開始コドンに融合した、プロモーターのないE．coliβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（下記実施例1.1を参照）。終止コドンは、星印で示す。図２．プラスミドpBSK+、pKL10およびpMG60から出発するプラスミドpLS12の構築図（実施例1.1.4を参照）。（１）BamHI部位にKm^r遺伝子を含むpBSK+の多重クローニング部位および（２）BamHI-消化したpLS11はpLS12（図には示していない）の前駆体である（下記1.1.4を参照）。この前駆体のBamHI-消化および自己連結の後、pLS12が生じる。これは、点線の矢印で示す。図３．プラスミドpORI28およびpLS12から出発するプラスミドpLS13の構築図（実施例 1.1.4を参照）。図４．プラスミドpLS13、pMG60およびpORI28から出発するプラスミドpORI13の構築図（実施例1.1.5を参照）。図５．欠失分析NS3（実施例1.3を参照）。これは、プラスミドpNS3（10kbのインサート）、pNS3d（2.4kbインサート）、pNS3b（1.0kbインサート）、pNS3e（0.5kbインサート）およびpNS3f（0.4kbインサート）の関係部分の摸式図を示す。図６． NS3遺伝子座のヌクレオチド配列ならびにrnhB、rggLの３’端およびorfXの５ ’端の推定アミノ酸配列（実施例1.5を参照）。向かい合う矢印：逆方向反復配列；rbs：リボソーム結合部位；−10および−35ヘキサヌクレオチドは太字で示し、下線が引いてある。垂直の矢印：転写開始点；終止コドンは、星印で示す。多数の関係する制限酵素部位を示す。図７． rggL（配列番号１１参照）ならびにS．gordonii由来のrgg（参考文献27: M.C ．Sulavik c.s.，1992および配列番号１２を参照）およびL．lactis C2 pip 遺伝子の下流に認められるORF3の一部（参考文献30: B.L．Geller c.s.，1993および配列番号１３を参照）の推定翻訳産物の配列。星印は、同一のアミノ酸を示し、保存アミノ酸は点で示す（実施例1.4を参照）。図８． L．lactis由来（配列番号１４参照）およびVibrio cholerae（U30472）由来（配列番号１５参照）のrnhBの３’部分ならびにE．coli由来（参考文献18: M．It aya，1990および配列番号１６を参照）およびHaemophilus influenzae由来（参考文献33: R.D．Fleischmann c.s.，1995および配列番号１７を参照）の完全なr nhB遺伝子の翻訳産物の配列。最も高い相同性はE．coli rnhBに対して認められた（44%が同一で、13.9%が類似のアミノ酸）。星印：同一アミノ酸；ピリオド：類似のアミノ酸（実施例1.4を参照）。図９． NS3遺伝子座のゲノム構成。Prgg：rggLプロモーター；IR：逆方向反復配列；PNaCl：塩誘発プロモーター（実施例1.4を参照）。図１０．配列分析NS3。図６に示す総PstI-XbaI断片を、関係する制限部位およびＤＮＡの主な特徴とともに模式図によって示す。指示した断片をサブクローニングするとプラスミドpNS3I、pNS3VIおよびpNS3i4が得られた(図２７および実施例1.4.1 も参照)。配列決定に使用するプライマーも示す。図１１． 0.5 MのＮａＣｌの不在または存在下で増殖させたMG1363またはMGNS3i3（rggL^- ）細胞から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラム。ブロットを、orfXの５’端をコードする放射能標識したXbaI-Sau3A断片とハイブリダイズさせた。ＲＮＡマーカーの大きさは、左の余白に示す（実施例1.6を参照）。図１２．培地におけるＮａＣｌ濃度の関数としてのNS3のβ−ガラクトシダーゼ活性。サンプルは、1:100に希釈した培地にＮａＣｌを添加して７時間後に採取した（実施例２を参照）。図１３． pNS3PR(パートＡ)またはpNS3AL3（パートＢ）におけるlytPRまたはacmAのいずれかによる切断orfXの融合点のヌクレオチド配列。各々、配列番号１８および配列番号１９ならびに実施例３および４も参照。両遺伝子の翻訳は、ＤＮＡ配列の下に示す。翻訳停止は、星印のトリプレットで示す。転写開始部位は垂直の矢印によって示し、一方、ＲＢＳは太字である。XbaI部位は図４の1981の位置に対応する。EcoRVおよびScaI部位は、融合のために使用した。図１４．ＮａＣｌ添加の６時間後に採取したサンプルから調製した細胞抽出物での細胞壁ヒドロラーゼ活性を示す再生ＳＤＳ−12.5%ＰＡＧＥ。レーン１および２：LL1 08（pNS378）；３および４：LL108（pNS3PR）；５および６：LL108（pNS3AL3）；１，３および５：ＮａＣｌを含まない；２，４および６：ＮａＣｌを含む。マーカータンパク質の分子量（キロダルトン）は、左側に示す（実施例３および４を参照）。図１５． GM17で増殖させたLL108（pNS378）（四角）およびLL108 (pNS3PR)（三角）の600nmでの光学密度。ＮａＣｌは、A600＝0.5の時点で培地の一部に0.5Mの最終濃度になるように添加した（白ぬき）。実施例３および５を参照。注：本明細書では、A600（吸収）の代わりにOD600（光学密度）の表示を使用する。図１６．プラスミドpIR1PRならびに、プラスミドNS3-7およびNS3-8（下記表２参照）および鋳型としてのpNS3を使用してＰＣＲにより増幅した、rggL遺伝子および塩誘発プロモーターを含む断片から出発したプラスミドpNS3PRの構築の模式図（実施例3.1を参照）。図１７． GM17で増殖させたLL108（pNS378）（四角）およびLL108(pNS3AL3)（三角）の6 00nmでの光学密度。ＮａＣｌは、A600＝0.5の時点で培養物の一部に0.5Mの最終濃度になるように添加した（白ぬき）。実施例４および５を参照。図１８．プラスミドpAL10、pORI28および図１６でも記載した断片から出発したプラスミドpNS3AL3の構築の模式図（実施例4.1 を参照）。図１９．（Ａ）ＮａＣｌ添加の６時間後に採取したL．lactis培養物の上清サンプルのクーマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−12.5%ＰＡＡゲル。（Ｂ）細胞壁ヒドロラーゼ活性を示す再生ＳＤＳ−12.5%ＰＡＧＥ。レーン１および２：LL108(pNS378)；３および４：LL108(pNS3PR)；５および６：LL108（pNS 3AL3）；１，３および５：ＮａＣｌの添加なし。マーカータンパク質の分子量（キロダルトン）は、左側に示す。右側の矢印は、プレ-AcmAの位置を示す（実施例５参照）。図２０． MG1363acmAΔ1（pVE6007; pNS3PR）（丸）、MG1363acmAΔ1(pVE6007; pNS3AL3 )（三角）およびMG1363acmAΔ1（pVE6007; pNS378）（四角）の培養物の上清のP epXP活性。ｔ＝０（600nmでの光学密度＝0.5）で、ＮａＣｌを0.5M（黒）または0.1M（白ぬき）の最終濃度になるように添加して、各々、lytPR、acmAまたはlacZの発現を誘発した（実施例5.1を参照）。図２１． pNS378、pNS3PR、pNS3AL3またはpGKAL1を有するMG1363acmAΔ1（pVE6007）の上清画分（黒）および細胞の低浸透洗浄後に得られる画分（二重書きしたグレイ部）のPepXP活性。細胞は、培養物の光学密度が600nmにおいて0.5であるときに、0.025、0.05、0.1、0.25または0.5Mの加増ＮａＣｌで誘発した。負の対照として0.004MのＮａＣｌを含むM17を使用した。PepXPレベルは、誘発の２日後に測定した（実施例5.1を参照）。図２２． NS3遺伝子座の遺伝子構成。○付縦棒：逆方向反復配列；Ｐ：プロモーター。関係する制限酵素部位を示す（実施例６参照）。黒の矢印は、示した菌株の染色体におけるlacZ融合の位置を示す（lacZは、一定の比に応じて描かれてはいない）。gadR、gadCおよびgadB遺伝子の全配列を図２９および配列番号２１に示す。図２３． L．lactis由来のgadCおよびS．flexneri由来のgadCの推定翻訳産物の配列（Wa termanおよびSmall，1996: 参考文献４７）。星印：同一のアミノ酸；ピリオド：類似のアミノ酸。膜が及ぶ推定上のドメインは、二重下線が引いてある。推定上のグルタミン酸塩結合ボックスの残基は、フレームで示す（実施例６参照）。図２４． L．lactis MG1363由来のGadBおよびSynechocystis sp．菌株PCC6803由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼの配列（Kanekoら、1996: 参考文献44）。星印：同一のアミノ酸；ピリオド：類似のアミノ酸（実施例６参照）。図２５． gadC::lacZのｐＨおよびグルタミン酸塩−依存発現。菌株NS3は、2%のβグリセロホスフェートを含む（Ａ）または含まない（Ｂ）mM17培地で増殖させた。β −ガラクトシダーゼ活性を、0.3MのＮａＣｌの存在下（▲）または0.3MのＮａＣｌ＋50mMのグルタミン酸の存在下（■）のいずれかで増殖中（太線）に追跡した。ＡおよびＢの左側のＹ軸は目盛りが異なることに注意されたい。培養物の光学密度およびｐＨは、各々、点線および細い線で示す（実施例６参照）。図２６．グルタミン酸塩のγ−アミノ酪酸への脱カルボキシル化を含む、lactococciでの酸耐性機構を模式的に表す（実施例６参照）。図２７．プラスミドpNS3i4（実施例1.4.1を参照）、pNS3i5、pNS3i6およびpNS3i7（後者の３個のプラスミドについては、実施例６を参照）を模式的に表す。図２８．プラスミドpORI19Sを模式的に表す（実施例1.6.1参照）。図２９． gadR、gadCおよびgadB遺伝子の全ヌクレオチド配列（配列番号２１も参照）。発明の詳細な説明本発明は、通常は野生型乳酸菌において該プロモーターにより制御されるコード配列から分離した、乳酸菌から誘導される塩−誘発プロモーターを提供する。そのような塩誘発プロモーターは、本発明となる研究中に見いだされ、下記の実施例に記載した。この研究により、とりわけ、塩誘発プロモーターが存在している思われる L．lactis MG1363の染色体ＤＮＡに由来するＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は、図６および配列番号１０に示す。実施例1.3〜1.3.1に記載の欠失分析は、L．lactisM1363から単離した約１kbのゲノムＤＮＡがlacZ遺伝子の前に存在する場合（そのＤＮＡは、HindIII-Sau3A 断片に存在する。図６のポリヌクレオチド1476〜2426を参照）、lacZ遺伝子の塩誘発がまだなお可能であることを示した。lacZ遺伝子とL．lactis M1363から単離したゲノムＤＮＡとの融合点の上流にあるＤＮＡ断片がより短い、すなわち、 540bpのみを含む（図６のポリヌクレオチド1882〜2422を含むEcoRI-Sau3A断片を参照）か、440bpのみを含む（図６のポリヌクレオチド1982〜2422を含むXbaI-Sa u3A断片を参照）場合は、各々、塩誘発がごく弱いか、全く不可能である。従って、この塩誘発プロモーターの必須部分は、下記実施例1.3.1に記載のHindIII断片の一部であり、図６のrggLで示した遺伝子の３’部分を終止コドンまで含む（終止コドンを含む）、配列番号１０のポリヌクレオチド1482〜1925であると思われる。rggL遺伝子のこの部分は、乳酸菌において構造遺伝子の発現を誘導することができるどんなプロモーターとも結合させることができると考えられるが、rg gL遺伝子のこの部分は、−35領域の代わりに逆方向反復配列（図６のポリヌクレオチド1926〜1967）を含み、 −10領域（図６のポリヌクレオチド1987〜1992）を含むポリヌクレオチド1926〜 2000である、ゲノムクローンに存在する実際のプロモーター、およびORFX−コード遺伝子の上流にあるＤＮＡのさらに別の部分（図６のポリヌクレオチド2001〜 2068参照）と結合させるのが好ましい。すなわち、好ましい必須部分は、配列番号１０のポリヌクレオチド1482〜2068 を含む。最良の結果は、自身のプロモーターが前にあり、その制御下にある全rg gL遺伝子を含む、実施例1.4に記載の約2.4kbのPstI-Sau3AＤＮＡ断片によって得られたので、配列番号１０のポリヌクレオチド1〜2068を含む塩−誘発プロモーターがより好ましく、さらに好ましくは、2.4kbの完全な断片、すなわち、配列番号１０のポリヌクレオチド1〜2426を一緒に形成するORF X遺伝子の一部をさらに含む塩−誘発プロモーターである。いま述べたプロモーターの種々の部分の他に、その改変も本発明に従って使用できるものである。すなわち、本発明は、本発明に係る塩誘発プロモーターまたはその必須部分の改変も提供し、それは、下記配列：（ａ）配列番号１０のポリヌクレオチド1482〜1925およびそれに続く乳酸菌で機能するプロモーター、（ｂ）配列番号１０のポリヌクレオチド1482〜2068、（ｃ）配列番号１０のポリヌクレオチド1〜2068、ならびに（ｄ）配列番号１０のポリヌクレオチド1〜2426 から成る群から選択されるポリヌクレオチドに本質的に対応するＤＮＡ配列を含む。「ポリヌクレオチドに本質的に対応する」とは、調節領域などの他の相同または異種ＤＮＡ配列に結合した塩誘発プロモーターまたはその一部を含むハイブリッド配列、ならびに塩誘発プロモーターの改変を含む配列または塩誘発プロモーターおよびその遺伝変異体の相補鎖とのハイブリダイゼーションがなおも可能であり、一方、プロモーター機能はなおも示すことができる突然変異などの突然変異を有する配列などの遺伝的変異体を含むものとして理解される。 rggL遺伝子、または実際にはrggLポリペプチドは、本発明によって単離され、他の乳酸菌を形質転換してそれらに他の所望の特性を付与するために使用される L．lactis MG1363のゲノムに存在する塩誘発プロモーターの有効性に重要な役割を果たすと考えられる。しかし、さらに、配列番号１０のポリヌクレオチド1095 〜1925によって示されるrggL遺伝子のみがこの点に関して機能するだけでなく、同じポリヌクレオチドをコードする他のＤＮＡ断片および該rggLポリペプチドの改変をコードする他のＤＮＡ断片すらも同じまたは同様の機能をなおも有すると考えられる。すなわち、本発明の一側面は、乳酸菌において活性である塩誘発プロモーターを調節することができるＤＮＡ断片であり、それは、配列番号１０のポリヌクレオチド1095〜1925、または（ａ）該ポリヌクレオチド1095〜1925と同じポリペプチドをコードし、もしくは（ｂ）本質的に同じ調節能力をなおも有する該ポリペプチドの改変をコードするその改変を含む。本発明のさらに別の側面は、上記した塩誘発プロモーターもしくはその必須部分を含む、または上記した乳酸菌において活性な塩誘発プロモーターを調節することができるＤＮＡ断片と、配列番号１０のポリヌクレオチド1926〜2000を含むＤＮＡ断片および本質的に同じプロモーター能力をなおも有するその改変から成る群から選択されるＤＮＡ断片との組み合わせを含む組換えベクターである。本発明はまた、上記した塩誘発プロモーターもしくはその必須部分を含む、または、上記した乳酸菌において活性な塩誘発プロモーターを調節することができるＤＮＡ断片と、配列番号１０のポリヌクレオチド1926〜2000を含むＤＮＡ断片および本質的に同じプロモーター能力をなおも有するその改変から成る群から選択されるＤＮＡ断片との組み合わせを含む形質転換された乳酸菌を提供する。プロモーター、その必須部分および上記した他のＤＮＡ断片は、好ましくは、乳酸菌の染色体に存在するが、乳酸菌の増殖中、維持することができるプラスミドの一部として存在することもできる。本発明に係る塩誘発プロモーターを含む乳酸菌は、塩誘発プロモーターが誘導できる天然の宿主であってもよく、または、異なる乳酸菌であってもよい。本発明に適用される乳酸菌および塩誘発プロモーターが共に天然の状況にあるのと同じである場合は、乳酸菌を１個以上のＤＮＡ断片を挿入することにより形質転換し、または、乳酸菌由来の塩誘発プロモーターを、通常は野生型乳酸菌において該プロモーターにより制御されるコード配列から分離して使用する。さらに本発明は、所望のタンパク質またはその前駆体をコードする遺伝子が誘発プロモーターの制御下で発現される形質転換された乳酸菌による所望のタンパク質の製造法において、プロモーターが本発明に係る塩誘発プロモーターもしくはその必須部分であるか、または、上記した乳酸菌において活性な塩−誘発プロモーターを調節することができるＤＮＡ断片と、配列番号１０のポリヌクレオチド1926〜2000を含むＤＮＡ断片および本質的に同じプロモーター能力をなおも有するその改変から成る群から選択されるＤＮＡ断片との組み合わせであることを特長とする方法を提供する。いくつかの態様の場合、所望のタンパク質が、所望のタンパク質をコードし、所望のタンパク質またはその前駆体の分泌を行う遺伝子に融合したＤＮＡ断片の存在により、乳酸菌によって分泌されるのが好ましい。所望の遺伝子の発現に対して塩誘発プロモーターを使用する本発明に係る方法は、所望のタンパク質が細菌細胞の溶解を引き起こす溶菌タンパク質であり、その結果、細胞の中身を遊離させることができる醗酵工程、または所望のタンパク質が芳香もしくは風味成分としての二次代謝物のin situ産生に関与する酵素である醗酵工程で使用できる。最終物質の例としては、ドレッシングおよび水含有スプレッド、ならびにソーセージおよび醗酵生地が挙げられる。微生物中に塩誘発プロモーターが存在することにより利益が得られるさらに別の工程は、所望のタンパク質が、キモシンもしくはその前駆体などの、チーズ製造工程において機能を有するタンパク質、またはチーズの風味の形成に関与する酵素である醗酵工程である。本発明を、下記実施例１〜６によって説明するが、その前に、使用した材料および方法を記載する。材料および方法細菌株、プラスミドおよび増殖条件記載する実験で使用した細菌株およびプラスミドを上記表１に列挙する。 L．lactisは、0.5%のグルコースを含むM17培地中、30℃で増殖させた。固化したM17培地は、1.5%の寒天を含んでいた。エリスロマイシン(Em)およびクロラムフェニコール(Cm) は、５μg/mlの最終濃度で使用し、スペクチノマイシン(Sp)は、100μg/mlで使用した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（X-Gal）は、0.008%の最終濃度で使用した。E．coliは、TY培養基中、37℃で激しく攪拌しながら、または1.5%の寒天を補充したTY培地上で増殖させた。アンピシリン(Ap)およびEmは、100μg/mlで使用し、Spは50μg/mlで使用した。分子クローニング法ＤＮＡおよびＲＮＡ技術は、本質的には、Sambrook c.s．（参考文献16を参照）の記載に従って行った。ＤＮＡは、E．coli（参考文献19: E.R．Zabarovsky & G．Winberg，1990を参照）およびL．lactis（参考文献15：H．Holo & I.F．Nes ，1989を参照）において電気トランスフォーメーションによって導入した。ＤＮＡ配列決定は、ジデオキシチェーンターミネーション法（参考文献４：F．Sange r c.s.，1977を参照）および製造者の指示によるＴ７シークエンシングキット（ Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，スウェーデン）によって、二重鎖プラスミドＤＮＡ上で行った。記載する実験で調製し、使用したいくつかのオリゴヌクレオチドを表２に列挙する。オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems 392A ＤＮＡ合成機（Applied Bi osystems Inc．Foster City，CA）で合成した。ＤＮＡ配列は、PC／Gene配列分析プログラム（IntelliGenetics Inc.，Geneva，スイス）によって分析した。遺伝子バンクに対するタンパク質相同性の研究は、FASTAプログラムを使用して行った（参考文献12：W.R．Pearson & D.J．Lipman; 1988を参照）。タンパク質の配列は、構造遺伝子マトリックスを使用したPC／GeneのPALIGNプログラム、またはCLUSTALプログラムにより、共に標準設定で行った。本明細書では、下記のエンドヌクレアーゼ制限部位を使用する。 β−ガラクトシダーゼアッセイ細胞抽出物を、指数関数的に増殖中培養物から調製した。β−ガラクトシダーゼ活性は、Millerの記載（参考文献２：J.H.Miller，1972を参照）に従って測定した。細胞抽出物中のタンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを規準物質として、 Bradfordの方法（参考文献３：M.M．Bradford，1976を参照）により測定した。実施例１塩誘発プロモーターの単離塩誘発プロモーターの単離を可能にする前に、いくつかのプラスミドおよび形質転換した菌株を準備しなければならなかった。すなわち、最初のいくつかのヘルパー菌株を、pWV01のrepA遺伝子を含んで構築した。すなわち、L．lactis LL1 08およびL．lactis LL302（下記1.1.2を参照）ならびにE．coli EC1000（下記1. 1.1を参照）である。本実験は、EP-A1-0487159に記載された技術に基づいている（参考文献26：Unilever N.V./PLC(C.J．Leenhouts c.s.)，1992を参照）。その結果、いくつかのプラスミドが構築された。 −プラスミドpTC2、pUK24およびpORI24を中間体とするプラスミドpORI28（下記1 .1.3を参照）、 −プラスミドpLS10 、pLS11、pLS12およびpORI28を中間体とするプラスミドpLS1 3（下記1.1.4を参照）、 −lactococcalヘルパー菌株LL108およびLL302を使用して、プラスミドpORI28、p LS28およびpLS13を中間体とするプロモータースクリーニングベクタープラスミドpORI13（下記1.1.5を参照）。これらのプラスミドは、pWV01のORI⁺を有するが、複製開始タンパク質に対するrepA遺伝子に欠ける。しかし、pWV01のrepA遺伝子を含むヘルパー菌株において複製することができる。 1.1 pORI13におけるlactococcalゲノムバンク染色体遺伝子の発現を評価するために、プロモータースクリーニングベクター pORI13を構築した（図１）。転写可能な融合のみになるように、各リーディングフレームに１個の終止コドンをE．coli lacZ遺伝子のすぐ上流に存在させた。la cZ遺伝子の前には、ORF32（参考文献24:M．van de Guchte c.s.，1991および参考文献10：J.M.B.M．van der Vossen c.s.，1987を参照）から誘導されたlactoc occal翻訳シグナルがある。プラスミドpORI13はpWV01のORI⁺を有するが、複製開始タンパク質のためのrepA遺伝子に欠けるので、Campbell型の組込みに使用できる。L．lactis MG1363の全染色体ＤＮＡから得られた、大きさが1〜10kbの範囲であるランダムなSau3A断片を、pORI13のBamHI部位でクローン化した。連結混合物により、48個のEC1000形質転換体が得られ、それらのプラスミド含量をチェックした。これらの約73%は染色体挿入物を有するpORI13を含み、残りは、pORI13を含んでいた。挿入物の平均の大きさは 3.3kbであった。制限酵素による消化パターンは、全48個のクローンに対して異なっていた。プラスミドＤＮＡを、2,460, 000個のプールしたEC1000形質転換体から単離し（下記1.1.6を参照）、L．lacti s MG1363(pVE6007)の形質転換に使用した。温度を上げてpORI13誘導体を組込ませた後、9000個のEm^rクローンが、X-galおよび0.3MのＮａＣｌを含む選択的ショ糖GM17プレート上に37℃で16時間プレーティングし、30℃で長時間インキュベートした後に青色に染色される195個のコロニーを生じることにより得られた（下記1.1.7を参照）。 1.1.1 MC1000のrepA⁺誘導体であり、Km^rであり、glgB遺伝子にpWV01 repA遺伝子の１個のコピーを有するE．coli EC1000の構築 pWV01由来のrepA遺伝子を、Law c.s.がJM101について記載されているように（参考文献37：J．Law c.s.，1995を参照）、E.coli MC1000の染色体上に導入した。pKVB2（参考文献37および11：J.A.K.W.Kiel c.s.，1987を参照）は、pBR322の複製起点を含む1 1.7kbのTc^rKm^rプラスミドである。それは、1.2kbの内部BamHI断片がStreptococc us faecalisプラスミドpJH1由来のKm^r遺伝子によって置き換えられたE．coli染色体glgB遺伝子を有する。lactococcal共通プロモーターP23によって働く pWV0 1由来のrepA遺伝子は、pUC23rep3からHindIII-PvuII断片として取り出し（参考文献37および22: K.J．Leenhouts c.s.，Sept．1991を参照）、Km^r遺伝子を中断することなくglgB内の700-bpのSamI断片との置き換えに使用した。得られたプラスミドpEC1およびpEC2は、repAの方向のみが異なる（参考文献37：J．Lawc.s.， 1995を参照）。プラスミドpEC1およびpEC2を、E．coli JM101の形質転換に使用した。選択的培地上にプレーティングする前に、形質転換混合物を、抗生物質の不在下で、30 世代の間、伝達し、次いで、Km含有プレートにプレーティングした。コロニーのグリコーゲン産生を試験した。グリコーゲンを産生しないコロニーは、Kmおよび Tcを含むプレートならびにKmのみを含むプレート上に移した。Km^rTc^sコロニーが確認された。それは、プラスミドを含まず、染色体上の特定の部位にrepAが組み込まれていた。菌株（E ．coli EC1000）の一つのRepA⁺性の確認は、この菌株のORI⁺RepA^-プラスミドによる形質転換の成功によって得られた。本研究は、1996年発行分のMol．Gen．Ge net．によって受理されたLeenhouts c.s．による発表にも記載する（参考文献39 : K．Leenhouts c.s.，1996を参照）。 1.1.2 RepA⁺L．lactis菌株LL108およびLL302の構築 pWV01 repA、pKL15AおよびpUK30を有する２個の組込みプラスミドを構築した。プラスミドpKL15Aは、プラスミドpUC23rep3由来のrepA遺伝子（参考文献22: K .J．Leenhouts，Sept．1991を参照）が挿入された、pBR322をベースとするCampb ell型の組込みプラスミドpHV60の誘導体である(参考文献14: K.J．Leenhouts，1 989を参照）。pKL15Aを、クロラムフェニコール耐性を選択することにより、L． lactis MG1363の染色体に組込むと、類似のプラスミドに対して先に記載されているように（参考文献14: K.J．Leenhouts，1989を参照）、組込みプラスミドの約15個のタンデムコピーを有するL．lactis菌株LL108が得られた。置換型組込みベクターpUK30は、pUK29の多重クローニング部位でpUC23rep3のrepA断片をクローニングすることにより得られた。プラスミドpUK29は、pUK21の誘導体であり（参考文献23: J．Vieira & J．Messing， 1991を参照）、XhoI部位にpUC19E（参考文献17: K.J．Leenhouts，1990を参照）のEm耐性遺伝子を、XbaI部位に1.5kbのXbaI断片としてのL．lactis pepXP遺伝子（参考文献20: B．Mayo c.s.，1991を参照）の３’一端を、BglIIおよびSphI部位に1.5kbのSpeI-MluI断片としてのpepXPの５’一端を有する。プラスミドpUK30 を２工程遺伝子置換方法（参考文献21: K.J．Leenhouts c.s.，Aug．1991を参照）で使用して、L．lactis MG1363を形質転換し、L．lactis菌株LL302を得た。この菌株は、pepXP遺伝子に挿入されたpWV01 repAの一つのコピーを含んでいた。菌株LL302および菌株LL108は共に、repAに欠けたpWV01をベースとするベクターの複製を可能にする。本研究は、1996年発行分に対して提出されたLeenhouts c. s.による発表にも記載される（参考文献40を参照）。 1.1.3 pORI28の構築 pLS1(参考文献９:S.A.Lacks，1986を参照)のTc^rを、pMTL25（参考文献13: S.P ．Chambers c.s.，1988を参照）のSamI部位に導入して、pTC2を作製した。このTc耐性遺伝子を、プラスミドpTC2から1.6k bのBamHI断片として単離し、プラスミドpUK21（上記参照）をXhoIで消化した。２個の断片を連結する前に、クレノウ酵素処理によって平滑末端を作った。連結により、Tc^r遺伝子に２個のXhoI制限部位がフランキングしたpUK24が得られた。 Tc^r遺伝子を有するpUK24の1.7kbのSepI断片は、平滑末端を作るためにクレノウ酵素で処理した。＋複製起点（Ori⁺）は有するが、複製開始タンパク質をコードする遺伝子に欠けるpWV01の601bpのTaqI断片もクレノウ酵素で処理し、両方の断片を連結すると、pORI24が得られた。Tc^r遺伝子を有するpORI24のXhoI断片を、１kbのSalI断片上に位置するプラスミドpUC19E由来のEm^r遺伝子で置き換えると、プラスミドpORI28が得られた。本研究は、1996年発行分のMol．Gen．Genet．によって受理されたLeenhouts c.s.による発表にも記載する(参考文献39：K.Lee nhouts c.s.，1996を参照）。 1.1.4 pLS13の構築 pMG60(参考文献24: M．van de Guchte c.s.，1991を参照)のlacZ遺伝子をpKL1 0(参考文献17：K.J．Leenhouts，1990 を参照）で２工程によりクローン化した。最初の工程では、lacZ遺伝子の５’一端およびORF32のlactococcal RBSを含むpMG60由来の1250bpのSspI断片をpKL10のクレノウ処理したXbaI部位と連結した。得られた構築物pLS10をHindIIIで切断し、HindIII付着末端を平滑にした後、その断片をClaIで処理した。次いで、得られた断片を、転写ターミネーターを含めたlacZ遺伝子の別の部分を含むpMG60のC laI-XmnI断片と連結してpLS11を得た。次の工程では、pBSK+の多重クローニング部位（mcs）を、lacZ遺伝子の前にあるRBSの上流に挿入しなければならなかった。pBSK+のmcsが選択できるようにするために、Km^r遺伝子をコードするpUC7K由来のBamHI断片をmcsのBamHI部位に入れてクローニングすることにより印をつけた。次いで、mcsをNotIおよびXhoIを使用してこのプラスミドから切り出した。付着末端を平滑末端にし、その断片を、lacZ遺伝子の前にあるpLS11のBamHI部位（これも平滑末端にしてある）に連結した。最後に、Km^r遺伝子をBamHIを使用して欠失させ、次いで、自己連結させた。この結果、組込み発現ベクターpLS12が得られた（図２参照）。 pLS12のエリスロマイシン耐性遺伝子を、pORI28からStuI-XbaI断片を単離することにより多重クローニング部位を含む、pORI28由来のもので置き換えた。この断片は、EcoRIで消化したpLS12に連結し、クレノウ酵素で平滑末端にした後、Xb aIで消化した。得られた構築物は、pLS13と命名した（図３を参照）。 1.1.5 pORI13の構築プロモータースクリーニングベクターの構築の場合、pMG60に存在する（参考文献24: M．van de Guchte c.s.，1991を参照）、lactococcal翻訳シグナルに融合したE．coli lacZ遺伝子を使用した。lacZ遺伝子は、組込みベクターpORI28に２工程で入れた（参考文献40: K.J．Leenhouts，1996年発行分に対して提出）。第一工程では、pMG60の2.5kbのClaI-XmnI断片を、そのXbaI部位がクレノウにより平滑にしてあるXbaI-ClaI線状化pORI28に連結した。連結混合物は、EcoRIで消化してpMG60の複製を防ぎ、RepA⁺lactococcalヘルパー菌株LL108の形質転換に使用した。得られた構築物pLS28は、BglIIおよびBssHIIで切断した。lacZ遺伝子の５’端を、同じ制限エンドヌクレアーゼを使用してpLS13から遊離させた。この1.6kbの断片をpLS28に連結し、連結混合物を使用してRepA⁺L．lactisヘルパー菌株LL302の形質転換を行った。得られたプラスミドは、pORI13と命名した（図４参照）。 1.1.6 pORI13中ゲノムバンクの構築 L．lactis MG1363の全染色体ＤＮＡを、Sau3Aで部分的に消化して、大きさが1 〜10kbの範囲である断片を得、これを、BamHIおよびアルカリホスファターゼ処理したpORI13に連結した。染色体断片は、線状化したpORI13に連結した。この連結混合物を使用して、RepA⁺E．coliヘルパー菌株EC1000を形質転換した（上記1. 1.1を参照）。形質転換体を、2mlのTY培養基を各プレート上に注入することにより寒天プレートから集め、それらのプラスミドＤＮＡを単離した。 1.1.7 L．lactisゲノムへのバンクの組込み先の工程で得たプラスミド混合物を使用して、L．lactis MG1363（pVE6007）を形質転換した。電気穿孔の後、細胞を30℃の回収培地に懸濁した（参考文献15 : H.Holo & I.F.Nes，1989を参照）。1.5時間後、５μg/mlのエリスロマイシンを添加し、30℃でのインキュベーションを0.5時間延長した。細胞を２時間37℃にした後、X-gal、エリスロマイシンおよび0.3MのＮａＣｌを含むショ糖（0.5M）GM17寒天上にプレーティングした。インキュベーションを37℃で 24時間行い、次いで、30℃にした。選択した組込み体の染色体からのpORI13誘導体の回収を、Law c.s.の記載に従って行った（参考文献37: J.Law c.s.，1995を参照）。 1.2 塩に依存する方法でのlacZを発現するクローンの同定ＮａＣｌの存在下でβ−ガラクトシダーゼを発現するコロニーを、0.5MのＮａＣｌを含む、または含まないGM17寒天プレートに移した。195個の選択した青色のコロニー(上記1.1を参照）のうち、80個はＮａＣｌを含まないプレート上では白色であった。これは、β−ガラクトシダーゼ発現がないことを示す。ＮａＣｌの存在下での青色の強度は、80個全てのクローンに対して同じであった。これらのクローンのうちの５個（NS1〜NS5と言う）において組込まれたpORI13誘導体を拾いだすと、制限酵素レベルで同一であるように見えた。５個のプラスミドは全て、塩依存性表現型を発現した。これらのうちの一つである、クローンNS3から単離したpNS3を選択してさらに解析を行った。 1.3 NS3のゲノム領域の欠失分析 pNS3の制限酵素分析は、約10kbの染色体ＤＮＡがクローン化されていることを示した。多数の制限酵素部位を使用して塩依存性プロモーターの地図を作成した。PstI欠失（pNS3d）は、ＮａＣｌ依存性lacZ発現が、最初の融合点であるSau3A 部位（図５および図６の２４２３の位置を参照）のすぐ上流の2.4kbの断片に関係することを示した。融合点の上流に1.0kbを残すより大きな欠失は、ＮａＣｌの存在下ではβ−ガラクトシダーゼを高レベルで発現させたが、ＮａＣｌの不在下でも低レベルで発現させた。一方、最初のクローンでは、ＮａＣｌ不在下での β−ガラクトシダーゼの発現はなかった。540bp（pNS3e）または440bp（pNS3f）断片を有する他の２個の欠失構築物は、各々、ＮａＣｌの存在下での発現レベルが低いかゼロを示した。これは、ＮａＣｌ依存性遺伝子発現に関与するＤＮＡ領域が、融合点の1000〜440bp上流に位置することを示している（図５参照）。 1.3.1 NS3の欠失マッピング塩一誘発遺伝子発現に必須の配列の一を知るために、NS3（pNS3）の染色体から回収したpORI13誘導体の多数の欠失誘導体を構築した。pNS3をHindIIIで消化して、lacZおよび上流の1.0kbのlactococ cal ＤＮＡを有する断片を得た。この断片を、Em耐性マーカーおよびpWV01の＋複製起点を有するpORI13のHindIII断片に連結した。得られた構築物pNS3bをE．c oli EC1000から単離した。pNS3dは、PstI消化したpNS3の自己連結によって作製した。lacZに融合した2.4kbの染色体ＤＮＡを有する。適切な構築物は、L．lact is LL108において得られた。プラスミドpNS3eは、pNS3のEcoRI消化の自己連結混合物を使用してE．coli EC1000を形質転換することにより得た。lacZの上流に約 540bpの染色体ＤＮＡ断片を有する。pNS3fは、pNS3III（下記1.4.1を参照）由来のXbaI断片のpORI13のXbaI部位への連結およびE．coli EC1000の形質転換により構築した。pNS3fは、lacZの上流に約440bpの染色体ＤＮＡ断片を有する（図５参照）。 1.4 NS3ゲノム領域の配列分析 pNS3dに存在する2.4kbのPstI-Sau3A断片の配列決定を行った（図６；これは、下記1.4.1に記載する561bpのSau3A-XbaI断片のヌクレオチド配列も示す）。これは、lacZに融合している切頭オープンリーディングフレーム orfXを示した。 orfXは、クローニングに使用されるSau3A部位の約360bp上流で始まり、その推定上の切頭産物は、膜タンパク質と相同性であることを示す。最も広範囲にわたる相同性は、未知の機能を有する２個のE．coliタンパク質、YJEMおよびYGJI（遺伝子バンク登録は、各々、U14003およびU18997）で見いだされた。orfXの前には、リボソーム結合部位（RBS）がある。orfXの上流では、弱いRBSを有するORFが2 76アミノ酸残基（配列番号１０および１１参照）のタンパク質をコードすることができ、計算による分子量は32990である。それは、Streptococcus gordonii rg g遺伝子産物（配列番号１２を参照）に対して相同性を示し、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現（参考文献27：M.C．Sulavik c.s.，1992を参照）およびL．lactispip遺伝子の下流の部分的に配列決定されたORFの発現（図７、配列番号１３および参考文献30: B.L．Geller c.s.，1993を参照）を調節する。S ．gordonii遺伝子と同様に、推定上のlactococcal調節物質遺伝子を、rggLと命名した。rggLとrggとの間の全体的な同一性は24.3%であり、さらに残基の15.9% が類似している。rggLのすぐ下流の、それに一続きのＴ残基が続いているΔG[25 ℃]が-37.8kcal/molを有する21bpの逆方向反復構造は、ρ非依存性ターミネーターとして機能すると考えられる。rg gLの上流に第三の不完全なORFが存在し、それは、ＲＮＡse HII（図８および配列番号１４〜１７）をコードするいくつかのrnhB遺伝子に対する相同性を示す。 rnhB遺伝子に続いて、ΔG[25℃]が-10.6kcal/molであるρ非依存性ターミネーター様構造があり、それは、rnhB遺伝子がrggLから独立して転写されることを示唆している。 NS3遺伝子座のゲノム構成を図９に示す。それは、２個の珍しい制限酵素部位、すなわちNotIに対するもの（ヌクレオチド306〜313、図６）およびApaIに対するもの（ヌクレオチド2382〜2387、図６）が配列決定された断片上に存在し、それらは約2070bpだけ離れていることを示す。L．lactis MG1363の遺伝子マップとの比較から（参考文献32: P．LeBourgeois c.s.，1995を参照）、NS3遺伝子座は ldh遺伝子とleu-ilv遺伝子クラスターとの間に位置することが明らかである。 1.4.1 NS3遺伝子座の配列決定 L．lactis NS3の染色体のlacZ融合点の上流2.5kb領域をいくつかのサブクローンとして回収し、配列決定を行った。pNS3b由来の401bpのEcoRI-HindIII断片をp UC19でクローン化し、pNS3bIと命名した。pNS3由来の784bpおよび470bpのXbaI断片をpUC18 のXbaI部位でクローン化して、各々、pNS3IIおよびpNS3IIIを得た。pNS3由来の6 04bp HindIII断片をpUC18でクローン化して、そのプラスミドをpNS3IVと命名し、pNS3由来の743bpのEcoRI-XbaT断片を有するpUC18誘導体をpNS3Vと命名した。p NS3からHindIIIおよびPstIにより745bpの断片を遊離させ、pUC19でクローン化して、pNS3VIを得た。E．coli NM522をpUC18またはpUC19構築物のクローニング宿主として使用した。pNS3の染色体挿入物の３’一端に位置する断片を逆ＰＣＲによって増幅した。染色体XbaI消化物の自己連結した環状断片を鋳型として使用し、NS3-5およびNS3-11をプライマーとして使用した。561bpのSau3A-XbaI断片をＰＣＲ断片から単離し、XbaI-BamHI消化したpORI19に連結して、pNS3i4を得た（図２７参照）。ＤＮＡ配列決定を、ジデオキシチェーンターミネーション法（参考文献４：F．Sanger c.s.，1977を参照）および製造者の指示によるＴ７シークエンスキット（Pharmacia LKB Biotechnology AB，Uppsala，スウェーデン）により、二重鎖プラスミドＤＮＡに対して行った。二重鎖配列は、合成オリゴヌクレオチドプライマーNS3-1、 NS3-2、NS3-6、NS3-9およびNS3-10の使用により完成した（上記表２および図１０を参照）。 1.5 NS3における塩誘発プロモーター構造の同定欠失研究およびヌクレオチド配列に基づいて、転写のＮａＣｌ依存開始点は、逆方向反復配列とorfXの開始コドンとの間の100bpの領域にあると予想した。プライマー伸長は、0.5MのＮａＣｌの不在下および存在下で増殖させたLL108（pNS 3d）から単離したＲＮＡ上で行った。プライマーNS3-11の使用により、転写は、 orfXのAUG開始コドンの68bp上流のＡ残基で開始することが分かった（図６、位置2001）。プライマー伸長産物は、ＮａＣｌの不在下で増殖させた細胞のＲＮＡでは得られなかった。転写開始部位の９bp上流の−10ヘキサヌクレオチドは、共通配列と１個のヌクレオチドだけが異なることが確認された（参考文献25: M．v an de Guchte c.s.，1992を参照）。さらに上流には、−35様ヘキサヌクレオチドは認められなかった。その代わり、−10ヘキサヌクレオチドの17bp上流には、逆方向反復配列が位置しており、遺伝子発現でのこの構造の役割を示唆している。 1.5.1 ＲＮＡ分析ＲＮＡを、先の記載に従って(参考文献29: M．van Asseldonk，1993を参照）、0.5MのＮａＣｌを含む、または含まないで、指数関数的増殖中のL．lactis培養物（600nmでの光学密度が0.5）から単離した。ノーザンハイブリダイゼーションを、50%のホルムアミド、7%のＳＤＳ、2%の遮蔽試薬(Boehringer，Mannheim，ドイツ)、5xＳＳＣ、50mMのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）および0.1%のＮ−ラウリルサルコシンを含む緩衝液中、40℃で行った。pNS3IIIの470bpのXbaI断片をプローブとして使用し、［α３２Ｐ−ｄＣＴＰ］で標識した。ｍＲＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチド（NS3-11）（転写開始点の下流＋96〜＋133の位置）をプライマー伸長に使用した。25ngのプライマーを、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびα３５Ｓ−ｄＡＴＰを含む反応混合物における５μｇのＲＮＡに添加し、ｃＤＮＡをＡＭＶ逆転写酵素(Boehringer，Mannheim，ドイツ）を使用して合成した。42℃で10分インキュベートした後、過剰の冷ｄＡＴＰを添加し、インキュベーションを42℃でさらに10分延長した。生成物を、サイズマーカーを提供することにより、同じプライマーとのシークエンス反応に次いでシークエンシングゲル上で分析した。 1.6 アクチベーターとしてのrggL機能ＮａＣｌ−誘発遺伝子発現におけるrggLの関与を、rggL挿入突然変異体MGNS3i 3を使用して調べた（下記1.6.1を参照）。ＲＮＡをＮａＣｌを使用して、および使用しないで培養したMG1363およびMGNS3i3から単離し、フィルターに移した。o rfXの５’一端を有する440bpのXbaI-Sau3A断片をノーザンハイブリダイゼーションにおけるプローブとして使用した。強いハイブリダーゼーションシグナルは、ＮａＣｌを使用して増殖させたMG1363からのＲＮＡの場合に認められた（図１１参照）。ＮａＣｌの不在下では非常に弱いシグナルのみが検出され、lacZ融合によって得られた結果が確認された。同じく弱いシグナルは、ＮａＣｌを使用して、および使用しないで増殖させた細胞由来のrggL挿入突然変異体からのＲＮＡの場合に認められた。これは、rggLがorfXのＮａＣｌ依存性発現における正の調節物質として作用することを示す。MG1363におけるＮａＣｌ依存性転写産物の大きさは、約3.0kbであると推定された。 1.6.1 rggL挿入突然変異体の構築 rggL遺伝子の内部XbaI-HindIII断片を、RepA⁺E．coliヘルパー菌株EC101を使用して、組込みベクターpORI19Sでクローン化した（図２８参照）。このプラスミドpNS3i3を、先の記載に従って（参考文献37: J．Law c.s.，1995を参照）、L ．lactis MG1363でのrggL遺伝子の破壊に使用した。組込みプラスミドの適切な染色***置がサザンハイブリダイゼーションによって確認され（図示しない）、菌株をNGNS3i3と命名した。実施例２ NS3からのlacZ発現は、ハライドイオン依存性である寒天プレートにおいて多数の化合物を試験し、誘発条件の性質を明らかにした（下記表３参照）。lacZ発現は、培地の浸透性には無関係であるように見えたが、厳密にＣｌ^-またはＩ^-の存在に関係した。β−ガラクトシダーゼ活性は、ＮａＣｌ濃度の増加とともに増加した（図１２）。β−ガラクトシダーゼ活性の誘発がないことは、増殖温度の上昇によって確認した。実施例３ファージr1-t lytPR遺伝子の塩誘発発現は、lactococcal培養物の自然増殖を防ぐ orfZおよびrggLの上流の転写開始点を、プライマーNS3-7およびNS3-8を使用してカセットとして増幅し、lactococcalテンペレートバクテリオファージr1-tのholinおよび溶菌酵素（lysin）遺伝子（lytPR）の上流でクローン化した（参考文献38: D．van Sinderen c.s.，1996および参考文献35: Ques t International B.V．(A．Nauta c.s.)； WO 95/31562を参照）。orfXの開始コドンを、lytPの開始コドンの13bp上流で終結するr1-tのORF5にin-franme融合して、lytPおよびlytRの効率的な翻訳を得た（図１３Ａおよび配列番号１８）。得られた菌株LL108（pNS3PR）の培養物をGM17で増殖させ、0.5MのＮａＣｌの添加により、0.5の600nmでの光学密度（CD600）で誘発した。図１４のレーン４は、誘発の６時間後に、誘発細胞には、野生型自己溶菌酵素活性の他に、ファージ溶菌酵素活性が存在し、ＮａＣｌを含まないで増殖させた細胞には存在しないことを示す。ＮａＣｌの添加は、誘発の４時間後には、LL108(pNS3PR)のOD600の増加の停止および続く光学密度の減少を引き起こした（図１５）。lacZを発現する対照の菌株LL108(pNS378)は、速度はより小さいにもかかわらず、ＮａＣｌ添加の後も増殖を続けた。 3.1 NS3プロモーターとファージr1-tのholinおよび溶菌酵素遺伝子との転写融合体の構築 rggLおよび塩誘発プロモーターをコードする1280bpの断片を、プライマーNS3- 7およびNS3-8（上記表２参照）ならびに鋳型としてのpNS3を使用してＰＣＲにより増幅した。この断片をSacIおよびEcoRVで消化し、SacIおよびScaIで線状化したpIR1PR（参考文献35: Quest International B.V．(A.Nauta c.s.)； WO 95/31 562を参照）に連結した。連結混合物を使用してL．lactis LL108を形質転換し、得られたプラスミドをpNS3PRと命名した（図１６参照）。溶菌酵素活性に対する負の対照として、同じＰＣＲ断片をpORI13においてlacZの上流でクローン化した。ＰＣＲ断片をBglIIおよびEcoRVで切断し、BglII-SmaI消化したpORI13に連結した。連結混合物を使用してLL108を形質転換し、得られたプラスミドをpNS378とした。実施例４ lactococcal acmA遺伝子の塩誘発発現は培養物のOD600の安定化をもたらす rggL、塩誘発プロモーターならびにorfXのRBSおよび開始コドンを含むカセットを、Lactococcus lactisの主要ペプチドグリカンヒドロラーゼの遺伝子であるacmA（参考文献34: Quest International B.V．(G．Buist c .s.); WO 95/31561および参考文献31: G．Buist c.s.，1995を参照）の上流においた。融合領域に２個の突然変異が生じた。すなわち、転写産物の非翻訳リーダーにおけるＡ→Ｇの転位（図１３Ａおよび１３Ｂのヌクレオチド64ならびに配列番号１８および配列番号１９を参照）および融合点でのScaI部位の欠損を生じるＡ残基の欠失（図１３Ｂのヌクレオチド99および配列番号１９を参照）。融合転写産物の翻訳は、orfXのRBSからのヘプタペプチドの形成および自身のRBSからの acmAの翻訳を生じる（図１３Ｂおよび配列番号１９）。小さいペプチドの翻訳は、acmAのRBSの10bp上流で終結する。得られたプラスミドpNS3AL3を有する菌株の増殖は、GM17培養基での対照菌株と異なるものではなかった（図１７）。しかし、ＮａＣｌを添加すると、細胞はよりゆっくり増殖し、４時間後にはOD600が安定化した。対照菌株のOD600は、塩の存在下ではより高いレベルに増加した。ＮａＣｌによって誘発した細胞では、非誘発細胞および同じ誘発カセットの制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現する対照細胞と比較して、より大きいacmA活性が検出された（図１４）。明らかに、pNS3AL3からのacmAの発現はＮａＣｌによって誘導される。 4.1 NS3プロモーターとlactococcal自己溶菌酵素遺伝子acmAとの転写融合体の構築 pAL10上でSacI断片によって中断されるacmA遺伝子をベースとして使用した（参考文献34: Quest International B.V．(G．Buist c.s.); WO 95/31561を参照）。pAL10におけるBglII部位を、BglIIにより切断し、突き出た両端にクレノウポリメラーゼを充填し、Ｔ４リガーゼで再環状化し、EC1000の形質転換を行うことにより欠失させた。この構築物pAL101をBamHIおよびXbaIで線状化し、やはりB amHIおよびXbaIで線状化したpORI28に連結した。適切な構築物pAL102をE．coli EC1000から単離した。pNS3上のNS3-7およびNS3-8を鋳型として使用して増幅することにより作製し、上記実施例3.1に記載したＰＣＲ断片を、BglIIおよびScaIで切断して、同じ制限酵素で線状化したpAL102に連結した。その連結混合物を使用してL．lactis LL302を形質転換し、pNS3AL3Sを回収した。このプラスミドをSca Iで消化してacmAの挿入物を欠失させた。自己連結した後、混合物を使用してLL302を形質転換した。その結果得られる、N S3塩誘発プロモーターに融合した完全なacmAコピーを有する構築物をpNS3AL3と命名した（図１８参照）。実施例５細胞内タンパク質が溶菌酵素遺伝子の誘発時に遊離される holin−溶菌酵素を発現する菌株の上清（参考文献35: QuestInternational B. V．(A．Nauta c.s.); WO 95/31562を参照）は、ＮａＣｌ添加の６時間後にかなりの量の細胞質タンパク質を含むが、誘発しないで増殖させた同じ菌株の上清には、分泌したタンパク質のみが見られる（図１９Ａ、レーン３）。対照菌株へのＮａＣｌの添加は、細胞質タンパク質の小部分の遊離を引き起こす（図１９Ａ、レーン２）。細胞を過発現するAcmAの上清には、LL108(pNS3PR)から遊離した細胞内タンパク質の量と比較すると、かなり多い量の細胞質タンパク質が認められた（図１９Ａ、レーン６）。溶菌活性を検出するために、0.2%のオートクレーブ処理して凍結乾燥したMicrococcus lysodeikticus細胞がゲルに含まれる（参考文献31: G．Buist c.s.，1995を参照）ドデシル硫酸ナトリウム(12.5%)ポリアクリルアミドゲル−電気泳動を記載に従って(参考文献１：U.K.Laemmli，1970を参照）行った。図１９Ｂ、レーン４は、LytR活性が、誘導されたLL108(pNS3PR) の上清において検出可能であることを示した。同じ方法を使用して、高レベルの AcmA活性が、誘発されたLL108(pNS3AL3)の上清に存在することも示した。AcmAの多数の破壊産物が、通常は細胞質に存在するAcmAの前駆体形状とともに認められた（参考文献34: Wuest International B.V．(G．Buist c.s.); WO 95/31561および参考文献31: G．Buist c.s.，1995を参照）。この後者のタンパク質は、タンパク質輸送機構によっては処理されないので、細胞溶解によって遊離されたにちがいない。LL108(pNS378)およびll108（pNS3PR）のＮａＣｌ誘発サンプルにおけるAcmA活性は、誘発していないサンプルにおけるよりも低かった。これは、恐らく、サンプリング時の対応する培養物のODがより低いことによる（図１５および図１７参照）。 5.1 L．lactis培養物の上清におけるペプチダーゼ活性の測定細胞内タンパク質の遊離を定量するために、PepXPを細胞内マーカー酵素として選択した。細胞溶解は、染色体自己溶菌酵素遺伝子に欠ける細胞からのPepXP 遊離を測定することにより定量した。MG1363acmAΔ1-(pVE6007)を、pNS3PRまたはpNS3AL3のいずれかで形質転換した。上清サンプル中のPepXP活性は、96−ウェルマイクロタイタープレート中、37℃で20分間、405nmで合成基質Ala-Pro-p-ニトロアニリドの加水分解をThermomaxマイクロプレートリーダー(Molecular Devices Co.，Menlo Park，C A)を使用して追跡することにより測定した。誘発培養物中のプロトプラストの存在を、最初の培養物中と同じＮａＣｌ濃度を含む培地において1mlの細胞を洗浄することにより試験した。次いで、細胞の半分を0.5mlの（低浸透性）M17に再懸濁し、もう半分は、最初のＮａＣｌ濃度を含む0.5mlのM17に再懸濁した。サンプルを37℃で30分間インキュベートし、上清のPepXP活性を測定した。低浸透性の抽出可能な細胞画分のPepXP活性は、最初の0.5mlでの活性を後者の0.5mlでの活性に対して補正して示す。塩誘発溶菌酵素遺伝子のみの効果を調べるために、培養上清のPepXP活性を、培養物のOD600を0.5とし、いずれかの溶菌酵素遺伝子を0.5MのＮａＣｌで誘発した後に追跡した。誘発後の最初の数時間は、低レベルのPepXPが培養上清で検出された（図２０）。最適なPepXPレベルは、MG1363acmAΔ 1(pVE6007)-(pNS3AL3)の培養物の誘発の８時間後、およびMG1363acmAΔ1-(pVE60 07)(pNS3PR)の誘発の30時間後に得られた。最高レベルのPepXP活性は、0.1MのＮａＣｌで誘発した後に存在した(図２１)。最高のPepXPレベルは、NS3::lytPR融合体を有する菌株の0.1MのＮａＣｌによる誘発の30時間後、およびNS3::acmA菌株の誘発の70時間後に到達した（図２０）。NS3::lacZを有する対照菌株は、長時間のインキュベートの後に、低レベルのPepXP活性を遊離した。PepXP活性は、 M17での細胞抽出物中では、ＮａＣｌを含んでいてもいなくても、少なくとも40 時間は安定である（データは示さない）。培養物へのＮａＣｌの添加は、NS3プロモーターの活性を誘発するだけでなく、培地の浸透性も増加させる。この結果、恐らく、溶菌酵素活性により生成した浸透性が弱い細胞の培養物の安定性をもたらす。低浸透性培地でのインキュベートにより、0.1、0.25または0.5MのＮａＣｌで誘発したNS3::lytPR融合体を有する細胞から余分のPepXP活性を遊離させることができた。これは、LytPRの作用により、こわれやすい細胞が生成したことを示す（図２１）。ＮａＣｌによるacmA 発現の誘発の結果、培地でのPepXPのレベルは、LytPRの誘発と比較して、かなり低くなった。しかし、かなり多い量のPepXPが、NS3::acmAを有する細胞から低浸透性培地により抽出できた。上清のPepXPと細胞から抽出可能なP epXPとの合計は、0.25MのＮａＣｌで誘発したNS3::acmAおよびNS3::lytPR細胞に対して匹敵し得る。NS3::acmA細胞から抽出されるPepXPの量は、誘発のために使用したＮａＣｌの量とともに増加した。0.5MのＮａＣｌで誘発した後だけ、抽出されるPepXPの量が少なかった。AcmA｛MG1363(pGKAL1)｝を構成的に過発現する細胞は、ＮａＣｌの添加のないM17と比較して、0.1MのＮａＣｌの存在下では、わずかに多いPepXPを遊離した。ＮａＣｌ濃度を高くすると、これらの細胞から遊離されるPepXPは少なくなった。0.25または0.5MのＮａＣｌ中でインキュベートしたこの菌株からも、高レベルのPepXPが低浸透性M17によって抽出できた。Ac mA活性の結果、明らかに、細胞壁はより弱くなるが、ＮａＣｌを含む培地での細胞溶解は生じない。誘発物質としてのＮａＣｌの代わりにＫＣｌを使用することができ、その結果、PepXPの遊離レベルはほんのわずか低くなった（データは示さない）。実施例６ Lactococcus lactisにおける塩化物および低ｐＨ−誘発酸耐性機構本実施例では、グルタミン酸塩依存酸耐性に関与する遺伝子群を示すためにga dの用語を使用する。従って、rggLおよびorfXによって上記で示した遺伝子は、ここでは、各々、gadRおよびgadCと再命名してある。略号「rggL」の理由は、上記実施例1.4で説明した。略号「gadB」「gadC」「gadR」を使用する理由は、下記の結果と題するところで説明する。追加の材料および方法細菌株、プラスミドおよび増殖条件本実施例で使用する（追加の）細菌株およびプラスミドは、表４に列挙する。 L．Lactisを、0.5%のグルコースおよび1.9%のβ−グリセロホスフェートを含む１／２強度のM17（1/2M17）培養基中、30℃で増殖させた。固化した1/2M17は、1 .5%の寒天を含んでいた。変更M17（mM17）には、β−グリセロホスフェートもso ytoneも含めなかった。指示した場合は、0.2%の最終濃度でβ−グリセロホスフェートを添加した。一般的なＤＮＡ法遺伝子バンクに対するタンパク質相同性研究を、BLASTプログラム（Altschulら、1990; 参考文献41）を使用して行った。タンパク質配列は、構造遺伝子マトリックスを使用して、PC／GeneのPALIGNプログラムにより行った。膜貫通セグメントは、Kleinら（1985; 参考文献45）の方法を使用して予測した。 L．lactisのgadCBのクローニング L．lactis NS3のlacZ融合部位の下流にある領域を、プライマーNS3-5およびNS 3-11を使用して、L．lactis MG1363染色体ＤＮＡからの0.56kbのSau3A-XbaI断片の逆ＰＣＲ増幅により得た（上記表２参照）。ＰＣＲ産物は、E．coli EC101を宿主として使用してpORI19でクローン化し、pNS3i4を得た（上記実施例1．4．1 および図２７を参照）。続く逆ＰＣＲでは、隣接する0.9kbのXbaI-Sau3A染色体ＤＮＡ断片を、プライマー NS3-14（5'-GGCAGTCCGTTGCGTCCCACC）およびNS3-15( 5'-GAGTTATCATTAAGTGCAGGGG)を使用して増幅し、L．lactis LL108をクローニング宿主として使用することにより、pORI19でクローン化した。この構築物をpNS3 i5と命名し（図２７参照）、これを１個の交差組込みのために使用して菌株MGNS 3i5を得た。MGNS3i5の染色体ＤＮＡをEcoRIで消化して、pNS3i5の挿入部位の下流の配列をクローン化した。染色体EcoRI断片を自己連結により環状化し、連結混合物を使用してL．lactis LL108を形質転換した。形質転換体は、4.8kbのプラスミド（pNS3i6; 図２７参照）を含んでいた。それは、染色体由来の2.6kbのXbaI-EcoRI断片を含むpORI19である（図２２）。挿入突然変異体の構築 gadRの内部XbaI-HindIII断片を、RepA⁺ E．coliヘルパー菌株EC101の使用により、pORI19SのSmaI部位において（図２８参照）平滑断片としてクローン化した。得られたプラスミドpNS3i3を使用し、先の記載に従って（Lawら、1995; 参考文献37）、L．lactis MG1363のgadRを破壊した。組み込まれたプラスミドの適切な染色体の位置は、サザンハイブリダイゼーションによって確認し、その菌株は MGNS3i3と命名した。プラスミドpNS3i7は、E．coli EC101を宿主として使用し、 pORI19のSmaI部位において、0.5-kbのAsnI断片（gadBに対して内在的）を平滑断片としてクローン化することにより構築した（図２７参照）。L．lactis MG1363 染色体でのpNS3i4およびpNS3i7の１個の交差組込みにより、各々、菌株MGNS3i4( gadC)およびMGNS3i7(gadB)が得られた。 β−ガラクトシダーゼアッセイ細胞を含まない抽出物を、ガラスビーズの存在下、細胞を激しく攪拌することにより調製した（van de Guchteら、1991; 参考文献24）。β−ガラクトシダーゼ活性は、Miller（1972; 参考文献２）の記載に従って測定した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを規準物質として、Bradford（1976; 参考文献３）の方法によって測定した。酸耐性試験 0.3MのＮａＣｌを含む、または含まない１／２強度のGM17（1/2GM17）におけるL．lactisの指数関数的増殖中培養物の細胞を採取し、水で洗浄して、グルコースおよびグルタミン酸塩を含まず、培養物と同じ量のＮａＣｌを含む同体積の MS15（Cocaign-Bousquetら、1995; 参考文献42）に再懸濁した。MS15のｐＨを、細胞の再懸濁の前に乳酸または塩酸のいずれかで3.5に調整した。30℃で２時間インキュベートした後、生きている細胞の数を、グルコース1/2M17プレート上にプレーティングすることにより測定した。酸耐性細胞の割合（％）を、酸処理後のコロニー形成単位（cfu）数を採取時のcfu数で割ることにより計算した。結果塩化物依存性プロモーターによって転写される遺伝子のヌクレオチド配列先の実施例では、塩化物依存性プロモーター（Ｐｇａｄ）を、ランダムなlacZ 染色体組込み法を使用して同定した。ここでは、ヌクレオチド配列を、L．lactis NS3におけるlacZ組込み部位の下流の染色体領域に対して示す。 lacZ組込み体L．lactis NS3における元のSau3A融合部位は、P gadのすぐ下流の503コドンのORFに位置する。このORFは、その推定アミノ酸配列（図２３）がS higella flexneri由来のGadC（51%が同一で、17%が類似している、WatermanおよびSmall，1996; 参考文献47）およびそのE．coli同等物XasA（Hershら、1996; 参考文献43）と相同性であるため、gadCと命名した。gadCは、E．coli由来のリシン−カダベリン対向輸送体(antiporter)CadB(MengおよびBennet，1992; 参考文献46)を含めた、多数のアミノ酸対向輸送体に対して相同性である。Lactococc al GadCの推定される分子量は55369であり、ｐＩは9.73であり、疎水性が高い。疎水性残基は、12個のドメインでクラスターを形成する（図２３）。それらのクラスターの位置は、S．flexneri GadCにおける疎水性ドメイン（多数のトポロジー予測コンピュータープログラムによって予測される）と一致する。これは、Ga dCが内在性膜タンパク質であることを示唆する。グルタミン酸塩輸送タンパク質に存在する保存ドメインも、L．Lactis GadCに存在する（図２３、 WatemanおよびSmall，1996; 参考文献47）。gadCは、推定されるタンパク質がグルタミン酸デカルボキシラーゼに対して相同性である別のORFから19-bpだけ隔てられている。最も高い相同性は、Synechocystis sp．由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼに対して見いだされる（48%が同一で15%が類似、図２４、Kanekoら、1996; 参考文献44）。E．coliおよびS．flexneriの両方において、gadBは、推定上のグルタミン酸塩−γ−アミノ酪酸対向輸送体遺伝子（各々、xasAおよびga dC）とつながりがある。このlactococcal遺伝子を、E．coliおよびS．flexneri と同様に、gadBと命名した。L．lactisでのgadBおよびgadCの遺伝子の順序は、これらの生物と比較して逆である。オペロンの形成を示唆するgadCとgadBとの間の19-bpの遺伝子間領域における可能な転写シグナルは確認できなかった。gadB の下流では、16-bpの逆方向反復配列（ＩＲ）が、ρ−非依存性転写ターミネーターとして機能すると考えられる。 gadRが構成的に発現される gadRの発現を、単一コピーのgadR::lacZ転写融合体を有する菌株MGNS32で研究した（図２２参照）。指数関数的に増殖中MGNS32におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は、ＮａＣｌの存在に関係なく3.0U /mgであった。言い換えると、P gadからのＮａＣｌ−依存性発現は、gadRの転写レベルの変化による調節を受けない。21-bpのＩＲのすぐ下流に位置するもう一つのlacZ融合体を使用して、gadRの転写がこのＩＲによって効果的に終結することを示した。この融合体を有する菌株MGNS31では、β−ガラクトシダーゼ活性は検出できなかった（図２２参照）。gadRの転写はAUG開始コドンの116bp上流のＣ −残基から開始する（図２２）。gadRプロモーターは、18bpだけ離れている標準的な−35および−10ヘキサヌクレオチドから成る（図６よび２９）。 gadCBの発現は、低いｐＨおよびグミタミン酸塩によって高められる S．flexneriおよびE．coliでは、gadCおよびxasAが、グルタミン酸塩の存在下、低ｐＨでの生存において役割を果たすことが示されている（WatermanおよびSm all，1996; 参考文献47; Hershら、1996; 参考文献43）。そのような条件下での lactococcal gadCの発現を、L．lactis NS3において研究した。菌株NS3は、前に、その塩化物依存性lacZ発現により同定し、その染色体上に単一コピーのgadC::lacZ融合体を有する（先の実施例を参照）。培養物のｐＨを調節するために緩衝剤β−グリセロホスフェートに欠けた変更M17培地（mM17）を使用した。mM17は、soytoneにも欠ける。NS3におけるβ−ガラクトシダーゼ活性は、0.3MのＮａＣｌおよび2%のβ−グリセロホスフェート緩衝剤の存在下では、この変更培地でなおも誘発されたが、誘発レベルは、標準の1/2M17の場合と比較して５倍低かった（データは示さない）。ＮａＣｌの存在下でのmM17におけるlacZ発現は、指数関数的増殖の初期段階では低く、定常期の開始時には最適レベルに増加した（図２５）。緩衝剤の不在下では、培養物のｐＨは、定常増殖期に 4.0〜4.5に低下し、一方、緩衝剤を含む培養物は、達した最も低いｐＨが5.5であった。lacZの発現は、緩衝剤を含まないmM17において10倍増加した。50mMのグルタミン酸塩を存在させると、緩衝剤を含む、および含まないmM17培養基でのlacZの発現がさらに約２倍増加した（図２５）。β− ガラクトシダーゼ活性は、グルタミン酸塩が存在していてもいなくても、また培養物のｐＨにかかわらず、ＮａＣｌの不在下では検出できなかった（データは示さない）。従って、gadCBの発現は、ＮａＣｌおよびグルタミン酸塩の存在下、低いｐＨで、定常増殖期の開始時が最適である。 gadCBは酸耐性を付与する L．lactis MG1363が酸のストレスにもかかわらず生き残る能力を、gadCBが発現される条件下およびgadCBが発現されない条件下で試験した。MG1363を1/2GM17 で増殖させ、MS15においてｐＨ3.5で２時間、酸による誘発を行うと、細胞の生存力は劇的に減少した（表５）。乳酸は、塩酸よりもかなり有害であったが、ｐＨ6.5では、生存力に影響はなかった。1mMのグルタミン酸塩のみの存在は、ｐＨ3.5での生存力に影響を及ぼさなかった。増殖中0.3MのＮａＣｌの存在下でgadCBを発現させ、次いで、0.3MのＮａＣｌおよび1mMのグルタミン酸塩の存在下で酸衝撃を与えると、生存力は、乳酸を使用した場合、200倍だけ減少した。後者の条件下では、塩酸でｐＨ3.5に調整したMS15での生存力もかなり高められた。gadCB発現の条件下（0.3MのＮａＣｌの存在による）では、酸耐性は、グルタミン酸塩が存在する場合よりも不在下の方が低かった（表５）。このことは、グルタミン酸塩が、gadCB発現の誘導に関与するだけでなく、酸耐性の付与にも直接必要とされることを示す。gadCB の酸耐性における直接の関与を確認するために、L．lactis MGNS3i3（gadCBを発現しない、先の実施例を参照）に酸衝撃を与えた。ＮａＣｌおよびグルタミン酸塩の存在下での生存は、ＮａＣｌおよびグルタミン酸塩の不在下での野生型菌株のものに匹敵するレベルに低下した（表６）。gadCにおける挿入突然変異体（菌株MGNS3i4）は、同様の表現型を示した。この突然変異は、恐らく、gadBに対する極性効果を有し、その結果、GadCおよびGadBの両方が不在となる。gadBにおける挿入突然変異体（菌株MGNS3i7）は、同様に酸感受性であり、これは、酸耐性プロセスでのGad Bに対する中心的役割を示している。pORI19の組込みコピーによって隔てられたg adCおよびgadBの完全なコピーを有する菌株MGNS3i5は、酸感受性であり、これは、gadB発現が破壊されることを示唆している。これらのデータは、塩化物依存性 gadプロモーターPgadから転写されるgadCBが、図２６に示すように、グルタミン酸塩依存性酸耐性に関与することを示す。要約 −Lactococcus lactis MG1363は、塩化物の存在下で活性である、グルタミン酸塩依存性酸耐性機構を有する。 −L．lactisは、２個の遺伝子、gadCおよびgadBを有する。それらは、各々、E． coliおよびShigella flexneri由来の推定上のグルタミン酸塩−γ−アミノ酪酸対向輸送体およびグルタミン酸デカルボキシラーゼに対して相同性のタンパク質をコードする。これらの遺伝子は、E．coliおよびS．flexneriにおけるグルタミン酸塩依存性酸耐性に関与している。 −L．lactisにおけるgadCBの発現は、塩化物によって誘発され、グルタミン酸塩の存在下では低ｐＨで最適である。 −***したgadBを有するL．lactis挿入突然変異体またはgadBびgadCを共に発現することができない突然変異体は、ＮａＣｌおよびグルタミン酸塩が存在する場合、野生型よりも低ｐＨに対する感受性が大きい。このことは、lactococcal ga dCBオペロンがグルタミン酸塩依存性酸耐性に関与することを示している。図２６を参照。実施例６から引き出される結果実施例６に示したさらに別の研究の結果は、この塩誘発プロモーターがより低いｐＨでより活性であることを示している。例えば、図２５Ａは、0.3MのＮａＣｌで誘発すると、β−ガラクトシダーゼの収量は、培地のｐＨが5.5以下にならないように培地を緩衝剤処理した場合、約８単位/mg以下であることを示している。これと反対に、図２５Ｂは、緩衝剤の不在下ではｐＨは約４に下がる可能性があるが、これらの条件下では、β−ガラクトシダーゼの収量は、約80単位/mgであることを示している。塩誘発プロモーターは、ｐＨが低いほど活性が大きく、従って、塩の存在下では、ｐＨ誘発性にもなっている。塩−およびｐＨ−誘発プロモーターの活性は、図２５Ａおよび２５Ｂに示すように、グルタミン酸塩／グルタミン酸の存在下でさらに高めることができる。これらの図は、β−ガラクトシダーゼの産生が、緩衝培地では８から15単位/mgに増加し、非緩衝培地（醗酵中のｐＨは約4.3に低下している）では80から225単位/mgに増加することを示している。本発明の範囲は、どんな理論にも制限されるものではないが、これらの増加効果は、グルタミン酸塩の取込みおよび脱炭酸によってγ−アミノ酪酸が形成され、次いで、この実施例に記載したgadBおよびgadC遺伝子の影響下で分泌されることによる内部ｐＨの制御によって引き起こされていると考えられる。すなわち、実施例６は、所望のタンパク質が、所望のタンパク質をコードする遺伝子が塩−およびｐＨ−誘発性プロモーターの制御下にある構築物と、緩衝剤処理せずに、好ましくはグルタミン酸塩／グルタミン酸を含む形質転換された乳酸菌を培養する培地とを、使用することにより、改善された収量で乳酸菌中に産生できることを示している。回収を容易にするために、所望のタンパク質は、そのタンパク質の分泌を可能にする分泌シグナル配列を含むのが一般には望ましい。あるいは、形質転換した乳酸菌が、塩−およびｐＨ−誘発性プロモーターの制御下で溶菌タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む場合は、分泌シグナル配列のないタンパク質を容易に回収することができる。というのは、溶菌タンパク質が細胞壁に孔をあけ、その結果、所望のタンパク質を含む中身が細胞から遊離できるからである。参考文献 1．U.K．Laemmli; Nature（London）227（1970）680-685; バクテリオファージＴ４の頭部がアッセンブリーする際の構造タンパク質の開裂 2．J.H．Miller; (1972); Experiments in molecular genetics Cold Spring Ha rbor laboratory，Cold Spring Harbor New York p.352-359; β−ガラクトシダーゼ誘発のアッセイ；β−ガラクトシダーゼ誘発の時間経過 3．M.M．Bradford; Anal．Biochem．72（1976）248-254; タンパク質−染料結合の原理を使用したタンパク質のμg量の迅速かつ感度の高い定量法 4．F．Sanger，S．Nicklen，およびA.R．Coulson; Proc．Natl．Acad．Sci．USA 74（1977）5463-5467; チェーンターミネーティング阻害剤によるＤＮＡ配列決定 5．M.J．Gasson; J．Bacteriol．154（1983）1-9; プロトプラスト誘発キュアリング後のStreptococcus lactis NCDO712および他のLactic Streptococciのプラスミド相補体 6．J.A．Gough，およびN.E．Murray; J．Mol．Biol．166（1983）1-19; ＤＮＡ分子における特異的標的の認識に関する関連遺伝子間の配列多様性 7．G.M．Weinstock，M.L．Berman，およびT.J．Silhavy; In:T.S．Papas，M．Ro senberg，およびJ.G．Chirikjian（編），Geneamplification and analysis III ．Elsevier，North Holland，new York，（1983）pp．27-64; βガラクトシダーゼを有するキメラ遺伝子 8．C．Yanisch-Perron，J．Vieira，およびJ．Messing; Gene 33(1985)103-119; 改善されたM13ファージクローニングベクターおよび宿主菌株：M13mp18およびp UC19ベクターのヌクレオチド配列 9．S.A．Lacks，P．Lopez，B．Greenberg,およびM．Espinosa; J．Mol．Biol．1 92（1986）753-765; 宿主範囲の広いプラスミドpLS1におけるテトラサイクリン耐性および複製機能の遺伝子の同定ならびに分析 10．J.M.B.M．van der Vossen，D．van der Lelie，およびG．Venema; Appl．En viron．Microbiol．53（1987）2452-2457; Streptococcus cremoris Wg2-特異的プロモーターの単離および解析 11．J.A.K.W．Kiel，J.P.M.J．Vossen，およびG．Venema; Mol． Gen．Genet．207（1987）294-301; 相同組換えおよびプラスミド分離によるE．c oli突然変異体の一般的な構築法 12．W.R．PearsonおよびD.J．Lipman; Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85（1988） 2444-2448; 生物学的配列比較のための改善された手段 13．S.P．Chambers，S.E．Prior，D.A．Barstow，およびN.P.Minton; Gene 68（ 1988）139-149; pMTL nic − クローニングベクター、Ｉ．ヌクレオチド配列決定のための超音波処理したＤＮＡの使用を促進するための改善されたpUCポリリンカー領域 14．K.J Leenhouts，J.Kok，およびG．Venema; Appl．Environ．Microbiol．55 （1989）394-400; Lactococcus lactis subsp.lactisの染色体への異種プラスミドＤＮＡの Campbell様組込み 15．H．Holo，およびI．F．Nes; Appl．Environ．Microbiol．55（1989）3119-3 123; 浸透性が安定化した培地でグリシンとともに増殖させたLactococcus lacti s subsp．cremorisの電気穿孔法による高頻度形質転換 16．J．Sambrook，E.F．Fritsch,およびT．Maniatis; Molecular cloning: a laboratory manual，第２版(1989); Cold Spring Harbor Laoratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y．17．K.J．Leenhouts，J．Kok，およびG．Ve ne,a; Appl．Environ Micobiol．56（1990）2726-2735; Lactococcus lactisの染色体での組み込みプラスミドの安定性 18．M．Itaya; proc．Natl．Acad．Sci．USA 87（1990）8587-8591; rnhB遺伝子によってコードされるE．coliK-12の第二のRNAse H(RNAse HII)の分離および解析 19．E.R．ZabarovskyおよびG．Winbrg; Nucleic Acids Res．18（1990）5912;連結ＤＮＡの細菌への高効率電気穿孔法 20．B．Mayo，J．Kok，K．Venema，W．Bockelmann，M．Teuber，H．Reinke，およびG．Venema; Appl．Environ．Microbiol．57(1991)38-44;Lactococcus lacti s subsp．cremoris由来のＸ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ遺伝子の分子クローニングおよび配列 21．K.J．Leenhouts，J．Kok，およびG．Venema; J．Bacteriol．173（Aug．199 1）4794-4798; Lactococcus lactisにおける置換組換え 22．K.J．Leenhouts，J．Kok，およびG．Venema; Appl．Environ． Microbiol．57（Sept．1991）2562-2567; Lactococciの組込みベクターとしての LactococcalプラスミドpWV01。 23．J．VieiraおよびJ．Messing; Gene 100（1991）189-194; 種々の選択可能なマーカーおよびＤＮＡ複製起点を有する新規pUC−誘導クローニングベクター 24．M．van de Guchte，J．Kok，およびG．Venema; Mol．Gen．Genet．227（199 1）65-71; Lactococcus lactisにおける距離依存性翻訳連携および妨害 25．M．van de Guchte，J．Kok，およびG．Venema; FEMS Microbiol．Rev．88（ 1992）73-92; Lactococcus lactisにおける遺伝子発現 26．C.J．Leenhouts，J.D．MaruggおよびC.T．Verrips(Unilever N.V./PLC); 19 92年５月27日に公開された特許出願EP-A1-0487159; 食品等級の宿主細胞の形質転換に適する食品等級のベクター、食品等級の宿主細胞を形質転換するための該ベクターの使用、および生物形質転換プロセスでの該形質転換細胞の使用 27．M.C．Sulavik，G．Tardif，およびD.B．Clewell; J．Bacteriol．174（1992 ）3577-3586; グリコシルトランスフェラーゼの発現を調節し、Streptococcus gordonii ChallisのSpp表現型に影響を及ぼす遺伝子rggの同定 28．E．Maguin，P．Duwat，T．Hege，D．EhrlichおよびA．Gruss; J．Bacetriol ．174（1992）5633-3638; グラム陽性菌に対する新規熱感受性プラスミド 29．M．van Asseldonk，A．Simons，H．Visser，W.M．de Vos，およびG．Simons ; J．Bacteriol．175（1993）1637-1644; Lactococcus lactis dnaJ遺伝子のクローニング、ヌクレオチド配列および調節分析 30．B.L．Geller，R.G．Ivey，J.E．Trempy，およびB．Hettinger-Smith; J．Ba cteriol．175（1993）5510-5519; Lactococcus lactis subsp．lactis C2のファージ感染に必要な染色体遺伝子のクローニング 31．G．Buist，J．Kok，K.J．Leenhouts，M．Dabrowska，G．Venema，およびA． Haandrikman; J．Bacteriol．177（1995）1554−1563; 細胞分離に必要なムラミダーゼである Lactococcus lactisの主なペプチドグリカンヒドロラーゼをコードする遺伝子の分子クローニングおよびヌクレオチド配列 32．P．Le Bourgeois，M．Lautier，L．van den Berghe， M.J.Gasson，およびP．Ritzenthaler; J．Bacteiol．177(1995)2840-2850; Lact ococcus lactis subsp．cremoris MG1363染色体の物理的および遺伝子的マップ: Lactococcus lactis subsp．lactis IL1403との比較は、大きいゲノム逆位を示す 33．R.D．Fleischmann c.s.; Science 269（1995）496-512; Haemophilus influ enzae Rdの完全ゲノムのランダム配列決定およびアツセンブリー 34．G．Buist，G．Venema，J．Kok，およびA.M．Ledeboer(Quest International B.V.): 1995年11月23日に公開された国際特許出願WO-A1-95/31561(PCT); 溶菌酵素による乳酸菌培養物の溶菌法および得られた溶菌培養物の使用 35．A．Nauta，G．Venema，J．Kok,およびA.M．Ledeboer(Quest International B.V.): 1995年11月23日に公開された国際特許出願WO-A1-95/31562(PCT); 乳酸菌培養物の増殖を阻害すし、所望により該細菌細胞を溶菌する方法、および得られた溶菌培養物の使用 36．A．Nauta，G．Venema，J．Kok,およびA.M．Ledeboer(Quest International B.V.): 1995年11月23日に公開された国際特許出願WO-A1-95/31563(PCT); 乳酸菌 (LAB)のファージから誘導される複合誘発プロモーター系および所望のタンパク質を産生するための実験室でのその使用 37．J．Law，G．Buist，A．Haandrikman，J．Kok，G．Venema,およびK．Leenhou ts，J．Bacteriol．177（1995）7011-7018; 標的遺伝子の迅速な分析を可能にする、Lactococcus lactisにおいて染色体突然変異を生じるさせる系 38．D．van Sinderen，J．Karsens，J．Kok，P．Terpstra，M.H.J．Ruitrs，G． Venema，およびA．Nauta; Mol．Microbiol．19(No.6)（1996）1343-1355; テンペートlactococcalバクテリオファージr1tの配列分析および分子解析 39．K．Leenhouts，G．Buist，A．Bolhuis，A．ten Berge，J．Keil，I．Mierau ，M．Dabrowska，G．Venema,およびJ．Kok; Mol．Gen.Genet．(1996年発行に対して受理); 細菌染色体において未標識遺伝子置換を生じさせるための一般的系 =K．J．Leenhouts，G．Buist，A．Bolhuis，A．ten Berge，J．Keil，I．Mierau ，M．Dabrowska，G．Venema，およびJ．Kok; Mol．Gen.Genet．253（1996）217- 224; 細菌染色体において未標識遺伝子置換を生じさせるための一般的系 40．K.J．Leenhouts，A．Bolhuis，G．Venema,およびJ．Kok; (1996年発行用に提出); Lactococcus lactisに対する食品等級の多コピー組込み系の構築 41．S.F．Altschul，M．Gish，W．Miller，E.W．Myers,およびD．J．Lipman; J ．Mol．Biol．215（1990）403-410; 基本的な局所配列研究手段 42．M．Cocaign-Bousquet，C．Garrigues，L．Novak，N.D．Lindley,およびP．L oubiere; J．Appl．Bacteriol．79（1995）108-116; Lactococcus lactisの維持増殖に対する簡単な合成培地の理論的開発 43．B.M．Hersh，F.T．Farooq，D.N．Barstad，D.L．Blankenhorn,およびJ.L．S lonczewski; J．Bacteriol．178;（1996）3978-3981; E．coliにおけるグルタミン酸塩依存性酸耐性遺伝子 44．T．Kaneko，S．Sato，H．Kotani，A．Tanaka，E．Asamizu，Y．Nakamura，N ．Miyajima，M．Hirosawa，M．Sugiura，S．Sasamoto，T．Kimura，T．Hosouchi ，A．Matsuno，A．Muraki，N．Nakazaki，K．Naruo，S．Okumura，S．Shimpo，C ．Takeuchi，T．Wada，A．Watanabe，M．Yamada，M．YasudaおよびS．Tabata; J ．DNA Res．3（1996）109-136; 単細胞シアノバクテリウムSynechocystis sp.菌株PCC6803のゲノムの配列分析、II．全ゲノムの配列決定および可能なタンパク質コード領域の割り当て 45．P．Klein，M．Kanehisa,およびC．DeLisi; Biochim．Biophys．Acta 815（1 985）468-476; 膜貫通タンパク質の検出および分類 46．S．MengおよびG.N．Bennett; J．Bacteriol．174（1992）2659-2669; E．co licadオペロンのヌクレオチド配列; 低い細胞外ｐＨを中和するための系 47．S.R．Waterman，およびP.L.C．Small; Mol，Microbiol．21(1996)925-940; Shigella flexneriの定常期酸耐性表現型に関連するσＳ依存性遺伝子の同定

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ベネマ，ヘラルドオランダ国、エヌ・エル−9751・エヌ・エヌ・ハーレン、ケルクラーン・26 (72)発明者レデブール，アドリアヌス・マリヌスオランダ国、エヌ・エル−3055・エム・エル・ロツテルダム、ベー・ルフエブレ・ド・モンテニイプレイン・８

Claims

【特許請求の範囲】１．乳酸菌から誘導される塩誘発プロモーターであって、通常は野生型乳酸菌において該プロモーターにより制御されるコード配列から分離した塩誘発プロモーター。２．配列番号１０のポリヌクレオチド1482〜1925を含む、請求項１に記載の塩誘発プロモーターの必須部分。３．配列番号１０のポリヌクレオチド1482〜2068を含む、請求項２に記載の必須部分。４．配列番号１０のポリヌクレオチド１〜2068を含む、請求項１に記載の塩誘発プロモーター。５．一緒になって配列番号１０のポリヌクレオチド１〜2426を形成するORF X遺伝子の一部をさらに含む、請求項４に記載の塩誘発プロモーター。６．（ａ）配列番号１０のポリヌクレオチド1482〜1925およびそれに続く乳酸菌で機能するプロモーター、（ｂ）配列番号１０のポリヌクレオチド1482〜2068、（ｃ）配列番号１０のポリヌクレオチド1〜2068、および（ｄ）配列番号１０のポリヌクレオチド1〜2426 から成る群から選択されるポリヌクレオチドに本質的に対応するＤＮＡ配列を含む、請求項１に記載の塩誘発プロモーターまたはその必須部分の改変。７．配列番号１０のポリヌクレオチド1095〜1925または（ａ）該ポリヌクレオチド1095〜1925と同じポリペプチドをコードするか、（ｂ）本質的に同じ調節能力をなおも有する該ポリペプチドの改変をコードするその改変を含む、乳酸菌で活性な塩誘発プロモーターを調節することができるＤＮＡ断片。８．請求項１〜６のいずれか一項に記載の塩誘発プロモーターもしくはその必須部分を含む、または請求項７に記載のＤＮＡ断片と配列番号１０のポリヌクレオチド1926〜2000を含むＤＮＡ断片および本質的に同じプロモーター能力をなおも有するその改変から成る群から選択されるＤＮＡ断片との組み合わせを含む組換えベクター。９．請求項１〜６のいずれか一項に記載の塩誘発プロモーターもしくはその必須部分を含む、または請求項７に記載のＤＮＡ断片と配列番号１０のポリヌクレオチド1926〜2000を含むＤＮＡ断片および本質的に同じプロモーター能力をなおも有するその改変から成る群から選択されるＤＮＡ断片との組み合わせを含む形質転換された乳酸菌。１０．所望のタンパク質またはその前駆体をコードする遺伝子が誘発プロモーターの制御下で発現される、形質転換された乳酸菌による所望のタンパク質の産生方法において、プロモーターが請求項１〜６のいずれか一項に記載の塩誘発プロモーターもしくはその必須部分、または請求項７に記載のＤＮＡ断片と配列番号１０のポリヌクレオチド1926〜2000を含むＤＮＡ断片および本質的に同じプロモーター能力をなおも有するその改変から成る群から選択されるＤＮＡ断片との組み合わせであることを特徴とする方法。１１．所望のタンパク質をコードし、所望のタンパク質またはその前駆体の分泌を行う遺伝子に融合したＤＮＡ断片の存在により、所望のタンパク質が乳酸菌によって分泌される、請求項１０に記載の方法。１２．塩誘発プロモーターの作用を、乳酸菌を培養する培地のｐＨを約４〜約4. 5の値に低下させることにより高める、請求項１０に記載の方法。１３．塩誘発プロモーターの作用を、乳酸菌を培養する培地に十分な量、好ましくは約50mMのグルタミン酸塩またはグルタミン酸を混入するすることにより高める、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。１４．所望のタンパク質が細菌細胞の溶解を引き起こして細胞の中身を遊離させることができる溶菌タンパク質である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法の醗酵工程における使用。１５．所望のタンパク質が芳香の形成に関与する酵素である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法の醗酵工程における使用。１６．所望のタンパク質が、キモシンもしくはその前駆体などのチーズ製造工程において機能を有するタンパク質、またはチーズの風味の形成に関与する酵素である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法の醗酵工程における使用。