JPH11508035A

JPH11508035A - 非分泌型遺伝子に対する発現系

Info

Publication number: JPH11508035A
Application number: JP50168597A
Authority: JP
Inventors: オカシンスキイ，グレゴリイ・エフ; シエーフアー，ベーリン・ジー; スハー，トーマス・エス; レスニーウスキイ，リチヤード・アール
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 1999-07-13
Also published as: CA2223182A1; US6020122A; EP0830602A1; WO1996041179A1

Abstract

(57)【要約】非分泌型遺伝子から組換え蛋白を生成できる哺乳動物発現系。融合蛋白を利用するアッセイ、融合蛋白を含む試験キット、融合蛋白を含む診断試薬、開示のプラスミドによって産生される融合蛋白を利用するワクチンも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】非分泌型遺伝子に対する発現系関連出願本出願は、１９９４年１月２８日出願の係属中の米国特許出願第０８／１８８２８１号（発明の名称「Mammalian Expression Systems for Hepatitis C Virus Envelope Genes」）と関連し、さらには１９９３年１０月２８日出願の係属中の米国特許出願第０８／１４４０９９号（発明の名称「Mammalian Expression S ystems for Hepatitis C Virus」）に関連するものであり、後者の出願は米国特許出願第０７／８３００２４号の一部継続出願であり、その両出願とも所有者が同一であり、参考として本明細書に含める。発明の背景本発明は、哺乳動物発現系に関するものであり、より詳細には、遺伝子の非分泌性のために従来あまり高レベルでは生成されなかった組換え蛋白を生成することができる哺乳動物発現系に関するものである。その組換え蛋白は、培地および哺乳動物細胞で発現される。１９８９年のスクリーニングアッセイとしての第１世代のＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）（ＨＣＶ１．０ＥＩＡ）および１９９２年の第２世代のＨＣＶＥＩＡ（ＨＣＶ２．０ＥＩＡ）の導入によって、供血品のスクリーニングを常時行っている国では輸血後ＨＣＶ（ＰＴ−ＨＣＶ）感染の発生率が大幅に低下した。ＨＣＶに対する抗体は、ウィルスのコア遺伝子、ＮＳ３（ウィルスプロテアーゼ）遺伝子およびＮＳ４（機能不明）遺伝子に由来する組換え蛋白を用いて検出される。ＮＳ５領域（ウィルスポリメラーゼと第２の未知機能を有する）からの別の抗原を含むＨＣＶの第３世代ＥＩＡ（ＨＶＣ３．０ＥＩＡ）が現在使用可能であり、数ヶ国で使用されている。ＨＣＶエンベロープ抗原は、これらのアッセイでは使用されていない。推定ＨＣＶウィルスエンベロープ蛋白（Ｅ１，Ｅ２）の発現および精製は困難であったために、血液スクリーニングアッセイでの標的としてのこれら蛋白についての詳細な研究およびそれらの組み込みはできなかった。ある細胞を得て異種蛋白を合成し、それからその蛋白を検出・回収する上で遭遇する困難にはいくつかの理由があると考えられる。例えば、異種遺伝子は、効果的にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写することができない。さらに、そのｍＲＮＡは不安定であって、蛋白に翻訳する前に分解する可能性がある。さらに、ｍＲＮＡに存在するリボソーム結合部位（ＲＢＳ）は翻訳を開始する能力が非常に低い。産生される異種蛋白が細胞中で不安定であるか、あるいはそれが細胞に対して有毒である可能性がある。蛋白に対する抗体が入手できない場合、あるいは蛋白アッセイの別法がない場合、合成された蛋白を検出することは困難であると考えられる。最後に、蛋白が産生されるとしても、精製が困難な場合がある。融合系は、上記の問題の多くを解決する手段を提供するものである。代表的には遺伝子の５’末端に認められるハイブリッド遺伝子の「担体」部分は、転写および翻訳の制限領域を提供するとともに、検出（Shuman et al., J.Biol.Chem. 255:168[1980]）および／または精製（Moks et al., Bio/Technology 5:379[198 7]）を促進するペプチドの遺伝コードを提供するものである。蛋白分解的開裂可能部位を融合蛋白に組み込んで、同種ペプチド部分の除去を可能とする場合が非常に多い（de Geus et al., Nucleic Acids Res. 15:3743[1987];Nambiar et al ., Eur.J.Biochem. 163:67[1987]; Imai et al., J.Biochem. 100:425[1986]）。融合系についての担体遺伝子を選択する場合、検出可能性および精製の容易さに加えて、強く発現される遺伝子で開始することが極めて有利であると考えられる。発現は、有効な転写および翻訳だけでなく、蛋白の安定性および良性（蛋白は細胞宿主に有害であったり、宿主を阻害するものであってはならない）の結果でもある。そのような発現は、アッセイに使用されるような融合蛋白の産生を可能にし得ることから有利である。そのような発現ができない遺伝子では、非分泌型遺伝子が市販アッセイまたはワクチン生産などの他の用途に有用となるだけの量で蛋白を分泌すなわち発現することができる系を提供することは有利であると考えられる。発明の概要本発明は、従来は遺伝子の非分泌性のために発現が困難であった発現蛋白を高レベルで得ることができる新規な哺乳動物発現系を提供するものである。詳細には本発明は、ＨＣＶＥ２抗原の発現のためのプラスミドを提供するものである。この特有の発現系により、高レベルのＨＣＶ蛋白を産生することができ、その系におけるウィルス蛋白の適切なプロセシング、糖付加およびコンホーメーション（折り畳み）が可能である。詳細には、本発明はプラスミド５７７を提供する。本発明の哺乳動物発現系でプラスミド５７７から発現されるＨＣＶＥ２融合蛋白は、細胞外および細胞内で回収することができる。図面の簡単な説明図１は、プラスミド５７７をグラフ表示したものである。図２は、ＨＣＶＥ２抗原発現カセットのＤＮＡ配列である。図３（標識翻訳図）は、ＨＣＶＥ２遺伝子およびシグナルプロテアーゼ開裂部位の概念的翻訳を示す図であり、「−−−」はシグナルペプチダーゼ開裂部位を示す。発明の詳細な説明本発明は、哺乳動物発現系で発現される糖付加ＨＣＶＥ２融合蛋白を製造する方法を提供するものである。これらの糖付加蛋白は、例えばスクリーニング用途および予知用途のためのアッセイ系などの各種用途で、ならびにワクチン製剤として有用である。哺乳動物細胞で発現されるこれらのＨＣＶウィルスエンベロープ蛋白は、特異的ウィルスの付着部位もしくは配列および／または肝細胞などの感受性細胞種でのウィルス受容体の解明などの阻害剤研究を可能とするものでもある。哺乳動物発現系で本明細書に記載のように形成される特異的発現クローンの獲得により、例えば急性感染と進行中もしくは持続性の感染、および／または最近の感染と過去の曝露などのＨＣＶ感染の段階を決定する上で役立ち得る診断アッセイ用の抗原が提供される。これらの特異的発現クローンは、ＨＣＶによって生じる慢性肝炎と疾患消散とを識別するための疾患消散の予知マーカーも提供するものである。糖付加構造抗原への早期血清変換を、これらの哺乳動物発現系で産生される蛋白を用いることで検出できると考えられる。モノクローナルとポリクローナルの両方の抗体も、これら哺乳動物発現系由来の蛋白から産生し、次にそれを診断、予後および治療の方面に利用することが可能である。これらの哺乳動物発現系から産生される蛋白およびその蛋白から製造される試薬は、各容器にモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のカクテルまたは組換え蛋白などの個々の試薬を入れた試薬瓶または瓶などの１以上の容器をアッセイ実施に便利な試験キットとして包装したキットの形態で提供することができる。本発明の他の態様には、固相に付着させたＨＣＶエピトープを有する組み換え蛋白および固相に付着させたＨＣＶエピトープに対する抗体などがある。さらに、ポリペプチドを発現させる条件下でＨＣＶエピトープを含むポリペプチドをコードする配列を有する哺乳動物発現ベクターで形質転換した宿主細胞をインキュベーションすることでＨＣＶエピトープを有する組換え蛋白を製造する方法、ならびにその方法によって製造されるＨＣＶエピトープを有するポリペプチドも含まれる。本発明は、本発明によって提供される組換え蛋白ならびに各種方式で本明細書に記載された抗体を利用するアッセイであって、アッセイで測定可能な信号を発生する信号発生化合物を使用できるものを提供する。信号発生化合物を利用せずに検出手段を提供するアッセイも提供される。記載のアッセイはいずれも、抗原もしくは抗体またはその両方を検出するものであり、被験サンプルと本発明で提供される１以上の試薬を混合して、１以上の抗原／抗体複合体を形成し、その複合体の存在を検出するものである。これらのアッセイについて、本明細書で詳細に説明する。本明細書に記載のようなＨＣＶからのエンベロープ遺伝子を有する哺乳動物発現系から得られた免疫原性ペプチドを有するＨＣＶ感染治療のためのワクチンが本発明に含まれる。さらに、対象者に対して、被接種者において免疫応答を引き起こすのに十分な量でＨＣＶエピトープを含む単離免疫原性ポリペプチドを投与する段階を含む、ＨＣＶに対する抗体を産生する方法も本発明に含まれる。「被験サンプル」という用語は、対象となる抗体の入手源である個人の身体の成分である。これらの成分は当業界では公知であり、本明細書に記載の方法によって調べることができる生物検体を含むものである。被験サンプルの例としては、全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液などのヒトおよび動物の体液、ならびに呼吸管、腸管および性尿器管の各種外分泌液、涙、唾液、乳汁、白血球、骨髄腫など、細胞培養上清などの生体液、固定組織検体、ならびに固定細胞検体などがある。本発明によって説明される方法によって組換え蛋白を製造した後、これらの組換え蛋白を用いて、本明細書に記載のような独特のアッセイを行って、ＨＣＶに対する抗原または抗体の存在を検出することができる。これらの組成物を用いて、ＨＣＶの免疫学的エピトープに特異的に結合する特異的組換え蛋白を有するモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を形成することもできる。さらに、本明細書に記載の方法によって製造される組換え蛋白を用いて、当業界で公知の方法に従ってワクチンを製造できると考えられる。代表的には、そのようなワクチンは、溶液もしくは懸濁液としての注射剤として調製され、注射に先だって溶液または懸濁液とするのに好適な固体製剤を調製することもできる。製剤を乳化させることができるか、あるいは蛋白をリポソーム中にカプセル封入することができる。活性な免疫原性成分は多くの場合、有効成分と相容性の薬理学的に許容される賦形剤と混合される。好適な賦形剤には、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールなどがあるが、これらに限定されるものではなく、これらの賦形剤を各種の量で組み合わせて使用することもできる。ワクチンにはさらに、ワクチンの有効性を高める、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤および／またはアジュバントなどの補助物質を少量含有させることもできる。例えば、そのようなアジュバントには、水酸化アルミニウム、Ｎ −アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称する）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称する）又はＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Tween-80（登録商標）乳剤中に含むものなどがあり得る。アジュバントの有効性は、やはり各種アジュバントを含有するワクチン中の免疫原性ポリペプチド投与によって生じる、ＨＣＶ抗原性配列を有するそのポリペプチドに対する抗体の量を測定することで求めることができる。ワクチンは通常、静脈内注射または筋肉内注射によって投与される。他の投与形態に好適な別の製剤としては坐剤などがあり、場合によっては経口投与製剤とする。坐剤の場合、従来使用される結合剤および担体としては、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどがあり得るが、これらに限定されるものではない。そのような坐剤は、有効成分を約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲で含有する混合物から得ることができる。経口製剤には、例えば医薬用グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含有させることができる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉末剤の形態とすることができ、有効成分を約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０％含有させることができる。ワクチンで使用される蛋白は、中性または塩の形でワクチンに製剤することができる。酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成）などの医薬的に許容される塩は、塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸、その他当業者に公知のもので形成する。遊離カルボキシル基で形成される塩を、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第２鉄の水酸化物などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンプロカインその他の当業者に公知のものから得ることもできる。ワクチンは投与形態と適合させて、予防上および／または治療上有効な量で投与する。投与量は通常、用量当たり抗原約５μｇ〜約２５０μｇであり、投与対象者、対象者の免疫系が抗体を合成する能力および要求される保護の程度によって決まるものである。投与する必要のある有効成分の正確な量も医師の判断によって決まり得るものであり、各対象者に特有であり得る。ワクチンは、単回投与または複数回投与で投与することができる。複数回投与とは、予防接種の最初の過程で１〜１０回に分けて投与し、その後は免疫応答を維持および／または強化するのに必要な時間間隔で他の投与を行う（例：２回目の投与を１〜４ケ月後に行い、対象者に必要な場合には数ヶ月後に次の投与を行う）ものである。投与法も少なくとも部分的には、対象者のニーズによって決まり、医師の判断による。免疫原性ＨＣＶエンベロープ抗原を含むワクチンを例えば免疫グロブリンなどの他の免疫調節剤と併用して投与できると考えられる。（ａ）発現制御領域、（ｂ）ウサギ免疫グロブリン重鎖ガンマ分泌シグナル配列をコードする領域、（ｃ）真核生物細胞での選択のための細菌酵素、（ｄ）真核細胞での発現強化に好適な増幅系、（ｅ）対象蛋白をコードする領域を有するＤＮＡクローニングビヒクルを用いる対象蛋白をコードする遺伝子の発現が、本明細書において記載されている。本明細書に記載のクローニングビヒクルは、融合蛋白すなわち、商業的に有用なレベルで、免疫グロブリンシグナルペプチド配列と、異種蛋白に融合し且つ該シグナルペプチド配列に隣接する免疫グロブリンコーディング配列との融合蛋白を発現することができる。図１には、本発明の方法で使用される融合蛋白の製造に有用なプラスミドの特徴を一般的に示してある。図１のプラスミドは、部分１〜１３を有する一連の集合断片として開示してある。それら部分の寄託番号とは、遺伝子バンク（Genbank（登録商標））寄託番号を指す。このプラスミドには、制御領域（以下に記載）と、その後に免疫グロブリンシグナルペプチドをコードする遺伝子および対象の異種蛋白をコードする遺伝子に結合した隣接する免疫グロブリンコーディング配列を有する。プラスミド構築時には、若干の配列変動が生じ得るものであり、起こっている可能性のあることは留意すべき点である。図１に示したようなプラスミドへの異種遺伝子の挿入は、当業界で公知の各種方法によって行うことができる。これらの融合蛋白は、多くの方法で捕捉試薬または蛋白結合剤として各種アッセイ方式で利用することができる。本明細書に記載の方法で組換え蛋白を得た後、その組換え蛋白を用いて本明細書に記載のような特有のアッセイを行って、特異的結合対の特異的結合構成員のいずれかの存在を検出することができる。これらの組換え蛋白を使用して、特異的結合対の特異的結合構成員に特異的に結合する特異的な組換え蛋白または合成ペプチドを得ることもできる。本明細書に記載の融合蛋白を、ワクチンの有効成分として使用することもできる。ワクチン調製ワクチンは、対象の核酸配列または相当する対象ゲノムに由来する１以上の免疫原性ポリペプチドから調製することができる。ワクチンは、対象のエピトープを有する組換えポリペプチドを含むことができる。これらのポリペプチドは、細菌、酵母または哺乳動物細胞で発現することができるか、あるいはウィルス調製物から単離することができる。さらに、各種構造蛋白に、保護効果のある抗エピトープ抗体を生じる目的のエピトープを持たせ得ることも考えられる。従って、そのワクチンを調製する際に、合成ペプチドを利用することもできる。そうして、１以上の目的のエピトープを有するポリペプチドを単独もしくは組み合わせて、これらのワクチンで使用することができる。さらに、非構造蛋白および構造蛋白が中和抗体の産生を起こさない場合であっても、ウィルスの病原性に対して保護を提供し得ると考えられる。以上の内容を考慮して、多価ワクチンに１以上の構造蛋白および／または１以上の非構造蛋白を含有させることができる。これらのワクチンは例えば、本発明のプラスミドによって発現される組換えポリペプチド、および／またはビリオンから単離されるポリペプチドおよび／または合成ペプチドを有することができる。これらの免疫原性エピトープを組み合わせて、すなわち組換え蛋白、合成ペプチドおよび／またはビリオンから単離されたポリペプチドの混合物として使用することができ、それらは同時または時間をずらして投与することができる。さらに、ワクチン中に不活化ウィルスを使用することが可能である。そのような不活化は、ウィルス溶解物によって、または有機溶媒もしくは洗剤による処理またはホルマリン処理などの肝炎様ウィルスの不活化を起こす当業界で公知の他の手段によって行うことができる。弱毒化ウィルス株の調製も、本発明に開示されている。一部の蛋白は、他の公知のウィルスと交差反応して、対象ウィルスと他のウィルスとの間で共通のエピトープが存在することで、これら病原体によって生じる１以上の疾患に対する保護抗体を生じ得ると考えられる。この考え方に基づいて多目的ワクチンを得ることが可能であると考えられる。有効成分として１以上の免疫原性ペプチドを有するワクチンの調製は、当業者には公知である。代表的には、そのようなワクチンは、溶液もしくは懸濁液としての注射剤として調製され、注射に先だって溶液または懸濁液とするのに好適な固体製剤を調製することもできる。製剤を乳化させることができるか、あるいは蛋白をリポソーム中にカプセル封入することもできる。活性な免疫原性成分は多くの場合、有効成分と相容性の薬理学的に許容される賦形剤と混合される。好適な賦形剤には、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセリン、エタノールなどがあるが、これらに限定されるものではなく、これらの賦形剤を各種の量で組み合わせて使用することもできる。ワクチンにはさらに、ワクチンの有効性を高める、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤および／またはアジュバントなどの補助物質を少量含有させることもできる。例えば、そのようなアジュバントは、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称する）、Ｎ−アセチルムラミル −Ｌ −アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称する）又はＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が２％スクアレン／Tween-80（登録商標）乳剤中に含むものなどがあり得る。アジュバントの有効性は、やはり各アジュバントを含有するワクチン中の免疫原性ポリペプチド投与によって生じる、本明細書に開示のプラスミドによって産生される抗原性配列を有するそのポリペプチドに対する抗体の量を測定することで求めることができる。ワクチンは通常、静脈内注射または筋肉内注射によって投与される。他の投与法に好適な別の製剤としては坐剤などがあり、場合によっては経口投与製剤とする。坐剤の場合、従来使用される結合剤および担体としては、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなどがあり得るが、これらに限定されるものではない。そのような坐剤は、有効成分を約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲で含有する混合物から得ることができる。経口製剤には、例えば医薬用グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含有させることができる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉末剤の形態とすることができ、有効成分を約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０％含有させることができる。ワクチンで使用される蛋白は、中性または塩の形でワクチンに製剤することができる。酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基と形成）などの医薬的に許容される塩は、塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸、その他当業者に公知のもので形成する。遊離カルボキシル基と形成される塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第２鉄の水酸化物などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジンプロカインその他の当業者に公知のものから得ることもできる。ワクチンは投与形態と適合させて、予防上および／または治療上有効な量で投与する。投与量は通常、用量当たり抗原約５μｇ〜約２５０μｇであり、投与対象者、対象者の免疫系が抗体を合成する能力および要求される保護の程度によって決まるものである。投与する必要のある有効成分の正確な量も医師の判断によって決まり得るものであり、各対象者に特有であり得る。ワクチンは、単回投与または複数回投与で投与することができる。複数回投与とは、予防接種の最初の過程で１〜１０回に分けて投与し、その後は免疫応答を維持および／または強化するのに必要な時間間隔で他の投与を行う（例：２回目の投与を１〜４ケ月後に行い、対象者に必要な場合には数ケ月後に次の投与を行う）ものである。投与法も少なくとも部分的には、患者のニーズによって決まり、医師の判断による。本明細書に記載の方法に従って製造される免疫原性抗原を含むワクチンを例えば免疫グロブリンなどの他の免疫調節剤と併用して投与できると考えられる。アッセイ方式アッセイに使用される試薬を、各容器にアッセイで使用されるモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のカクテルまたは組換え蛋白などの個々の試薬を入れた試薬瓶または瓶などの１以上の容器をキットとしてまとめた形態で提供することができると考えられる。本明細書で使用される「分析物」という用語は、被験サンプル中に存在し得る検出対象の物質である。分析物としては、天然の特異的結合構成員（抗体など）が存在するまたは特異的結合構成員を与え得る物質があり得る。従って、分析物は、アッセイにおける１以上の特異的結合構成員に結合し得る物質である。「分析物」としてはさらに、抗原物質、ハプテン、抗体およびそれらの組み合わせであることができる。例えば、特異的結合対の構成員として内因性蛋白を用いるビタミンＢ１２の測定、葉酸結合蛋白を用いた葉酸の測定、または特異的結合対の構成員としてレクチンを用いた炭水化物の測定のように、天然の特異的結合相手（対）によって、特異的結合対の構成員として分析物を検出することができる。分析物には、蛋白、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、治療目的で投与される薬剤および不法な目的で投与される薬剤などの薬物、細菌、ウィルス、ならびに上記の物質の代謝物もしくは抗体などがあり得る。そのような抗体の調製についての詳細および特異的結合構成員としての使用への適性については、当業者には公知である。調べることができるウィルスには、肝炎の原因となるウィルス（例：Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、デルタ型肝炎およびＥ型肝炎ウィルス、ならびにＧＢ型肝炎ウィルス）、ヒト免疫不全ウィルス（例：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩウィルスなどがある。本発明は、特異的結合構成員を利用するアッセイを提供する。本明細書で使用される「特異的結合構成員」とは、特異的結合対の一方の構成員である。すなわち、化学的もしくは物理的手段によって一方の分子が第２の分子に特異的に結合する２個の異なる分子である。従って、通常のイムノアッセイの抗原および抗体の特異的結合対以外に、他の特異的結合対には、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクタ分子と受容体分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素などがあり得る。さらに特異的結合対には、例えば分析物類似体などの元の特異的結合構成員の類似体である構成員もあり得る。免疫反応性特異的結合構成員には、抗原、抗原断片、抗体および抗体断片（モノクローナルおよびポリクローナルの両方）およびそれらの複合体などがあり、組換えＤＮＡ分子によって形成されるものも含まれる。本明細書で使用される「ハプテン」という用語は、抗体に結合することができるが、担体蛋白に結合しなければ抗体形成を誘発することができない部分抗原または非蛋白結合構成員を指す。本明細書で使用される「捕捉試薬」という用語は、サンドイッチアッセイでの場合のような分析物、競争的アッセイでの場合のような指示薬もしくは分析物、あるいは間接アッセイでの場合のようなそれ自体が分析物に対して特異的である補助的特異的結合構成員に特異的である未標識の特異的結合構成員を指す。捕捉試薬は、アッセイ実施前またはアッセイ実施時に固相材料に直接もしくは間接に結合することで、被験サンプルからの固定化複合体の分離を可能とすることができる。「指示薬」は、本明細書に記載の各種アッセイ形態で使用することができる。「指示薬」は、分析物についての特異的結合構成員に接合（付着）した外部手段によって検出可能な測定可能信号を発生する能力を有する「信号発生化合物」（標識）を有するものである。本明細書で使用される「特異的結合構成員」とは、特異的結合対の一方の構成員である。すなわち、化学的もしくは物理的手段によって一方の分子が第２の分子に特異的に結合する２個の異なる分子である。分析物に対する特異的結合対の抗体構成員である以外に指示薬は、ビオチンもしくは抗ビオチン、アビジンもしくはビオチン、炭水化物もしくはレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクタ分子もしくは受容体分子、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤もしくは酵素のようないずれかのハプテン−抗ハプテン系などの特異的結合対の一方の構成員であることもできる。免疫反応性特異的結合構成員は、サンドイッチアッセイでの場合のような分析物、競争アッセイでの場合のような捕捉試薬、あるいは間接アッセイでの場合のような補助的特異的結合構成員のいずれかに対して結合することができる抗体、抗原または抗体／抗原複合体であることができる。考えられる各種「信号発生化合物」（標識）には、色素原、酵素などの触媒、フルオレセインおよびローダミンなどの発光化合物、化学発光化合物、放射性元素および直接視覚標識などがある。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼなどがある。特定の標識の選択は必須ではないが、標識はそれ自体でまたは１以上の別の物質と組み合わせて信号を発生することができる。「固相」（「固体支持体」）は当業者には公知であり、反応トレーのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子などの微粒子などがある。「固相」は必須ではないが、当業者であれば選択可能である。そこで、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチック管、微量定量ウェルの壁、ガラスもしくはシリコンのチップならびにヒツジ赤血球がいずれも好適な例である。ペプチドを固相に固定化するための好適な方法には、イオン的、疎水的、共有結合的な相互作用などがある。本明細書で使用される「固相」とは、不溶性であるか、または後の反応によって不溶性とすることができる材料を指す。固相の選択は、捕捉試薬を引きつけて固定化する固有の能力を考慮して行うことができる。別法として、捕捉試薬を引きつけて固定化する能力を有する別の受容体を固相に保持させることができる。その別の受容体は、捕捉試薬自体または捕捉試薬に接合した帯電物質に関して反対の電荷を持つ帯電物質などがあり得る。さらに別の代替法として、受容体分子を、固相に固定化（付着）された、特異的結合反応によって捕捉試薬を固定化する能力を有する特異的結合構成員とすることができる。受容体分子は、アッセイ実施前またはアッセイ実施時に、捕捉試薬を固相材料に間接的に結合させることができる。そこで、固相には例えば、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、ガラスもしくは試験管のシリコン表面、微量定量ウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップその他の当業者に公知の構造などがあり得る。固相がさらに、検出抗体が接近できるだけの有孔率および抗原を結合させるのに好適な表面親和性を有する好適な多孔性材料を有し得ることも意図され、本発明の範囲に含まれる。微孔性構造が通常は好ましいが、水和状態でゲル構造を持つ材料も使用することもできる。そのような有用な固体支持体には、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、セルロースエステル（特に硝酸およびカルボン酸とのエステル）、混合セルロースエステルおよびセルロースエーテルなどの天然重合性炭水化物およびそれの合成的に変性、架橋または置換された誘導体；蛋白や架橋もしくは変性ゼラチンなどの誘導体のような含窒素天然ポリマー；ラテックスおよびゴムなどの天然炭化水素ポリマー；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびそれの部分加水分解誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリレートなどのビニルポリマー、ポリエステル，ポリアミドなどの上記重縮合体の共重合体および三元重合体、ならびにポリウレタンもしくはポリエポキシドなどの他のポリマーのような好適な有孔性構造で製造することができる合成ポリマー；硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムなどのアルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩もしくは炭酸塩、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムの珪酸塩などの多孔性無機材料；クレー、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルまたはガラス（これらの材料は、上記のポリマー材料とともにフィルターとして使用することができる）などのアルミニウムもしくはケイ素の酸化物もしくは水和物；ならびに、すでに存在する天然ポリマー上で合成ポリマーの重合を開始することで得られるグラフト共重合体のような上記の種類のものの混合物もしくは共重合体などがある。これらの材料はいずれも、フィルム、シートまたはプレートなどの好適な形状で使用することができるか、あるいは紙、ガラス、プラスチックフィルムまたはファブリック（繊維織物）などの適切な不活性担体にコーティングまたは結合もしくは積層させることができる。ニトロセルロースの多孔性構造は、モノクローナル抗体を含む非常に多様な試薬について優れた吸収性および吸着性を有する。ナイロン（登録商標）も同様の特性を有し、やはり好適である。上記のそのような多孔性固体支持体は好ましくは、厚さ約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍのシートの形状とすることが考えられる。孔径は広い範囲で変動し得るものであり、好ましくは０．０２５〜１５μｍ、特には０．１５〜１５μｍである。そのような支持体の表面は、支持体に対する抗原もしくは抗体の共有結合的結合を起こす化学的方法によって活性化することができる。しかしながら、抗原または抗体の不可逆的結合は通常、ほとんど解明されていない疎水的力による多孔性材料への吸着によって得られる。好適な固体支持体は、米国特許出願第２２７２７２号にも記載されている。「被験サンプル」という用語には、本明細書に記載の本発明の方法によって調べることができる生物サンプルが含まれ、それには全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液などのヒトおよび動物の体液、ならびに呼吸管、腸管および性尿器管の各種外分泌液、涙、唾液、乳汁、白血球、骨髄腫など、細胞培養上清などの生体液、固定組織検体、ならびに固定細胞検体などがある。本明細書に記載の組換え蛋白を用いた試験および本発明のアッセイ方式に使用することができる物質は本発明の範囲に含まれるものと考えられる。他の各種固相を利用する他の実施態様も意図され、本発明の範囲に含まれるものである。例えば、ＥＰ公開第０３２６１００号に対応する同時係属の米国特許出願第１５０２７８号および米国特許出願第３７５０２９号（ＥＰ公開第０４０６４７３号）（これらはいずれも所有者が同じであり、参考として本明細書に含める）に記載の負に帯電したポリマーとの固定化可能な反応複合体を固定化するイオン捕捉法を、本発明に従って使用して、迅速な溶液相免疫化学反応を行うことができる。固定化可能な免疫複合体は、負に帯電したポリアニオン／免疫複合体と予め処理した正に帯電した多孔性基材との間のイオン性相互作用によって反応混合物の残りの部分から分離され、ＥＰＯ公開第０２７３１１５号に対応する同時係属の米国特許出願第９２１９７９号（これらはいずれも所有者が同じであり、参考として本明細書に含める）に記載のような化学発光信号測定で記載されているものなどの既報の各種信号発生系を用いて検出することができる。さらに、本発明の方法を、固相が微粒子を有してなる自動および半自動系などの微粒子技術を利用する系で使用することができる。そのような系としては、それぞれＥＰ公開第０４２５６３３号および同第０４２４６３４号に対応する係属中の米国特許出願第４２５６５１号および同第４２５６４３号に記載のものなどがある。イムノアッセイにおける走査プローブ型顕微鏡測定（ＳＰＭ）の使用も、本発明の組換え蛋白またはこれらの組換え蛋白から生成するモノクローナル抗体を容易に利用できる技術である。走査プローブ型顕微鏡測定、特に原子力顕微鏡測定では、例えば本明細書に記載の新規なプラスミドによって産生される組換え蛋白またはその蛋白から産生されるモノクローナル抗体などの捕捉相を固相に付着させ、被験サンプルと固相の間の反応に十分な時間および条件下に被験サンプルを固相に接触させ、走査プローブ型顕微鏡を利用して固相表面に存在し得る抗原／抗体複合体を検出する。走査トンネル型顕微鏡を用いることで、多くの免疫アッセイ系で抗原／抗体複合体の検出に通常は使用しなければならない標識の必要性がなくなる。ヒト被験サンプル中の特異的分析物（例：ウィルスなどの感染因子）に対する抗体の存在を検出するアッセイ方式では、ヒト被験サンプルを、１以上の組換え蛋白（ポリペプチド）でコーティングした固相と接触・インキュベーションする。抗体が被験サンプルに存在する場合、それは抗原ポリペプチドと複合体を形成し、固相に付着する。複合体を形成した後、未結合の材料および試薬を固相の洗浄によって除去する。複合体を指示薬と反応させ、第２の複合体を形成するだけの時間および条件でインキュベーションする。被験サンプル中の組換えポリペプチドに対する抗体の存在を、発生した測定可能信号を検出することで明らかにする。カットオフ値より上の発生信号は、被験サンプルに存在する分析物に対する抗体を指示する。酵素などの多くの指示薬を用いた場合、存在する抗体の量は発生信号に比例する。被験サンプルの種類に応じて、被験サンプルを好適な緩衝剤で希釈したり、濃縮したり、または操作を加えずに(「ニート（neat）」で)固相と接触させたりすることができる。例えば、予め希釈しておいた血清もしくは血漿サンプルまたは尿などの濃縮検体を調べて、抗体の存在および／または存在する抗体の量を決めることができる。さらに別の実施態様では、サンドイッチアッセイが提供される。この方法は、１以上の本発明で提供される組換え抗原または本発明で提供される１以上の組換え抗原を含む組み合わせ物が結合した固相に被験サンプルを接触させて混合物を形成する。この混合物を、抗原／抗体複合体を形成させるだけの時間および条件でインキュベーションする。次にその複合体を、予め信号発生化合物に接合しておいた抗原を有する指示薬と接触させて第２の混合物を得る。この第２の混合物を、抗原／抗体／指示薬複合体を形成するだけの時間および条件でインキュベーションする。発生する測定可能信号を検出することで、抗原／抗体／指示薬複合体の存在を明らかにする。このアッセイでは、本発明で提供される組換え抗原などの検出対象抗体に特異的な第１の抗原を固相に固定化し、その抗体を有することが疑われる被験サンプルを固相に加え、標識が付着した本発明の組換え抗原などの第２の抗原を固相と接触させる。そうして、信号結合対構成員に特異的な２個の組換え抗原が、捕捉相および指示薬の一部として、一つのアッセイで用いられる。これらの抗原は、同一であっても、異なる（例：異種）取得源からのものであることもできる。その取得源としては、細菌および酵母などが考えられる。さらに、本発明で提供される一方の組換え抗原を捕捉試薬または指示薬の一部として用いて、このアッセイでの他方の抗原を合成ペプチドもしくはウィルス溶解物とするかまたは当業者には公知の他の抗原取得源から得ることができ、それも本発明の範囲に含まれる。さらに、ビオチンおよび抗ビオチン、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジンなどを使用して、そのようなアッセイでの発生信号を増強することができる。さらに、１以上の組換え蛋白をちょうど上述したアッセイ方式で使用して、調べている感染因子のウィルスゲノムの各種抗原性エピトープに対して本明細書に記載の方法で得た融合蛋白を利用することで、特異的感染因子に対する抗体の存在について調べることができる。そこで、特異的ウィルス抗原性領域内のエピトープおよびウィルスゲノムからの他の抗原性領域からのエピトープを有する組換えポリペプチドを用いて、１個のエピトープからのポリペプチドを用いる場合より感度および恐らくは特異性の高いアッセイを行うことが好ましいと考えられる。そのようなアッセイは、確認アッセイとして利用することができる。この特定のアッセイ方式では、既知量の被験サンプルを、組換え蛋白／抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で１以上の組換え蛋白でコーティングした既知量の１以上の固体担体と接触させる。その複合体を、反応が起こるだけの時間および好適な条件で既知量の適切な指示薬を接触させ、発生する信号を負の被験サンプルと比較して、被験サンプル中の分析物に対する抗体の存在を測定する。さらに、微粒子などのある種の固相を用いた場合、アッセイで利用される各組換え蛋白を別の微粒子に付着させ、各種コーティング微粒子（これは各アッセイについて至適化することができる）を組み合わせることでこれら微粒子の混合物を得ることができると考えられる。上記のアッセイ方式の別法としては、同一または異なる固相に付着した異なる分析物の本明細書に記載のプラスミドによって産生される組換え蛋白を組み込むことで、いずれかの分析物に対する抗体の存在を検出する方法（例：同一もしくは異なる固相にＨＩＶ−２の一定の抗原領域に特異的な組換え蛋白をコーティングしたＨＩＶ−１の一定の抗原領域に特異的な組換え蛋白による、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のいずれか（または両方）の存在検出）などがある。さらに別のアッセイ方式では、抗原性エピトープを有する本明細書に記載のプラスミドから産生される組換え蛋白が、中和アッセイなどの競争的アッセイで有用である。中和アッセイを行うには、ウィルスなどの感染因子の抗原性領域のエピトープを代表する組換えポリペプチドを可溶化し、サンプル希釈液と混合して、最終濃度０．５〜５０．０μｇ／ｍＬの最終濃度とする。希釈または未希釈の既知量の被験サンプル（好ましくは１０μＬ）を反応ウェルに加え、次に組換えポリペプチドを含むサンプル希釈液４００μＬを加える。所望に応じて、混合物を約１５分間〜２時間予めインキュベーションすることができる。次に、本明細書に記載の組換え蛋白でコーティングした固相を反応ウェルに加え、約４０℃で１時間インキュベーションする。洗浄後、既知量の指示薬、例えばペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧの接合体希釈液溶液２００μＬを加え、４０℃で１時間インキュベーションする。洗浄後、上述のような酵素接合体を用いる場合、ＯＰＤ基質などの酵素基質を加え、室温で３０分間インキュベーションする。１Ｎ硫酸などの停止剤を反応ウェルに加えることで、反応を停止する。吸光度を波長４９２ｎｍで読み取る。特異的ポリペプチドに対する抗体を有する被験サンプルが発生する信号は、溶液中のその抗体に対するペプチドの競争的結合のために低いものとなる。同じ希釈度で、組換えポリペプチド存在下でのサンプルの吸光度値と組換えポリペプチド不在下で定量したサンプルの吸光度値とを比較することで、競争的結合のパーセントを計算することができる。そうして、組換え蛋白存在下のサンプルと組換え蛋白不在下のサンプルとの間で生じる信号の差を測定し、それを用いて抗体の有無を明らかにする。他の中和アッセイも考えられる。それには、被験サンプル中に存在し得る抗原分析物の量を検出するための競争的アッセイなどがある。そのアッセイは、信号発生化合物を付着させた既知量の分析物（この場合、本発明の組換え抗原）および抗分析物抗体が付着した固相と被験サンプルとを接触させる段階を有するものである。こうして得られた混合物を、固相／分析物複合体または固相／組換え抗原複合体のいずれかを形成するだけの時間および条件でインキュベーションする。信号の誘発を、当業界で公知の手段によって行う。特異的ポリペプチドに対する抗体を有する被験サンプルが発する信号は、溶液中の抗原に対する固相上の抗体の競争的結合によって低下する。同じ希釈度で、組換えポリペプチド存在下のサンプルの吸光度値を組換えポリペプチド不在下に定量したサンプルの吸光度値と比較することで、競争的結合のパーセントを計算することができる。そうして、組換え蛋白存在下のサンプルと組換え蛋白不在下のサンプルとの間での発生信号の差を測定し、それを用いて、抗体の有無を明らかにする。別のアッセイ方式では、免疫ドットブロットアッセイ系で組換え蛋白を使用することができる。免疫ドットブロットアッセイ系は、ニトロセルロース固体支持体上に列状に配置した１群の精製組換えポリペプチドを使用する。準備の整った固体支持体をサンプルと接触させて、組換え蛋白（他の特異的結合構成員）に対する特異的抗体（特異的結合構成員）を捕捉して、特異的結合構成員対を形成する。捕捉された抗体を、指示薬との反応によって検出する。好ましくは、１９８８年８月２日出願の米国特許出願第０７／２２７４０８号に記載の装置中の反射率光学系アッセンブリーを用いて接合体特異的反応を定量する。関連する米国特許出願第０７／２２７５８６号および同第０７／２２７５９０号（いずれも１９８８年８月２日に出願）にはさらに、イムノドットアッセイを実施する上で有用な具体的な方法および装置が記載されており、米国特許第５０７５０７７号（１９８８年８月２日出願の米国特許出願第０７／２２７２７２号）にもそのような記載がある。すなわち、ニトロセルロース基材の試験カートリッジを複数の抗原性ポリペプチドで処理する。各ポリペプチドは、試験カートリッジにある特異的反応領域に含まれている。ニトロセルロース上に全ての抗原性ポリペプチドを配置した後、ニトロセルロース上の過剰な結合部位をブロックする。次に、試験カートリッジを被験サンプルと接触させて、被験サンプルが該当する抗体を有する場合は各反応領域の各抗原ポリペプチドが反応するようにする。反応後、試験カートリッジを洗浄し、抗原−抗体反応を好適な公知の試薬を用いて確認する。本明細書に挙げた特許および特許出願に記載の方法に従って、全プロセスを自動化することが可能である。イムノドットブロットアッセイを行うための方法および装置に関係するこれら出願の明細書は、参考として本明細書に含める。本明細書に記載のプラスミドから製造される融合蛋白を、以下に記載するような第１および第２の固体支持体を用いるアッセイで使用して、被験サンプル中の分析物の特異的抗原に対する抗体を検出することができ、それも本発明の範囲に含まれる。このアッセイ方式では、第１の小分け被験サンプルを、組換え蛋白／分析物抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で分析物に特異的な組換え蛋白でコーティングされた第１の固体支持体と接触させる。次に、複合体を、組換え抗原に特異的な指示薬と接触させる。指示薬を検出して、被験サンプル中の組換え蛋白に対する抗体の有無を明らかにする。この後に、第２の小分け被験サンプルを第２の抗体に特異的な組換え蛋白でコーティングされた第２の固体支持体と、組換え蛋白／第２の抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件で接触させることで、同じ分析物の異なる抗原決定因子の有無を明らかにする。複合体を、その複合体の抗体に特異的な第２の指示薬と接触させる。信号を検出して、被験サンプル中の抗体の有無を明らかにする。その場合、いずれかの分析物組換え蛋白または両方に対する抗体が存在すると、被験サンプル中の抗分析物の存在が示される。固体支持体を同時に調べ得ることも考えられる。ハプテンの使用は当業界では公知である。本発明のプラスミドによって産生される融合蛋白を用いるアッセイでハプテンを使用して、アッセイの性能を高めることが可能であることも考えられる。以下の実施例によって本発明の思想および範囲を説明するが、これらは限定を加えるものではない。実施例実施例１Ｅ２抗原構築以下の手順に従って２段階で、分泌可能なＨＣＶＥ２抗原のコード配列を挿入することで、プラスミド５７７を構築した。第１に、Ｓｐｅ１およびＸｂａ１で消化した二重鎖合成ヌクレオチドを、突出末端連結によって、構築しておいた発現ベクターのＸｂａ１クローニング部位に挿入した。このオリゴヌクレオチドは、ウサギ免疫グロブリンγ鎖ペプチド由来の配列およびクローニングのための制限部位を形成するために入れた他の配列を有していた。次にそれを、プロモータ要素およびＲＮＡ転写開始部位の下流に挿入した。このＤＮＡセグメントは、哺乳動物細胞から分泌されるべき下流遺伝子配列に対するＸｂａ１部位で同一位相で（in frame）融合するアミノ酸配列をコードしていた。このプラスミド５７７の構造を図１に示してある。哺乳動物分泌シグナルペプチダーゼ開裂部位を直線化した概念的翻訳を図４に示してある。第２に、ＨＣＶプラスミド鋳型由来の配列を有するＰＣＲ産物を、ウサギ重鎖シグナル配列の下流にＸｂａ１断片として挿入した。「上側の」ＰＣＲプライマー配列にＸｂａ１部位がコードされており、その直後に、ヒトプロウロキナーゼのアミノ末端配列であるアミノ酸配列セリン −アスパラギン−グルタミン酸−ロイシン（「ＳＮＥＬ」）をコードする１２ヌクレオチドの配列がある。アミノ酸配列ＳＮＥＬは、シグナルプロテアーゼプロセシング、有効な分泌および培養液中での最終産生物の安定性を高めるためのものであった。図２では、このセグメントに下線が施してある。この１２ヌクレオチドの配列の直後で、プライマーにはＨＣＶのａａ３８８で始まるアミノ酸をコードする鋳型配列に対して相補的なヌクレオチドを持たせた。「下側の」ＰＣＲプライマーには、ＨＣＶの６６４で終止するアミノ酸をコードする鋳型配列に対して相同性の配列、二重終止コドン、クローニングのためのＸｂａ１部位を持たせた。Ｅ２抗原をこの位置で切断して、分泌を促進した。図２では、Ｘｂａ１部位は太字で表してあり、終止コドンには下線を施してある。この挿入領域の完全配列を図２および配列番号１４に示してある。図１には、このコード領域をグラフ表示してある。図１について説明すると、プラスミド５７７には、図１のプラスミドの最上部から反時計回りに以下のＤＮＡセグメントがある。すなわち、（ａ）細菌のβ−ラクタマーゼおよびＤＮＡ複製起点を有する、ｐＢＲ３２２の２．３Ｋｂ断片、（ｂ）ＨＳＶ−１チミジンキナーゼプロモータおよびポリ−Ａ付加シグナルの制御下にネオマイシン耐性遺伝子を発現させる１．８Ｋｂのカセット、（ｃ）ＳＶ−４０プロモータおよびポリ−Ａ付加シグナルの制御下にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を発現させる１．９Ｋｂのカセット、（ｄ）サルウィルス４０Ｔ−ａｇプロモータおよび転写エンハンサ、Ｂ型肝炎表面抗原エンハンサＩ、ならびにポリ−Ａ付加シグナルを提供する単純疱疹ウィルス−１ゲノムの断片の制御下にＣ型肝炎ウィルス由来の改変遺伝子を発現させる３．５Ｋｂカセット、（ｅ）このプラスミドの無機能の残りの０．７Ｋｂ断片であるサルウィルス４０ゲノム後期領域である。これらのデータを上記の表１にまとめてある。このベクターのセグメントは全て、分子生物学の当業者には公知の標準的方法によってアッセンブリーしたものである。実施例２Ａ．ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のトランスフェクション以下に記載のように、カチオン性リポソームが仲介する方法（Felgner,P.L. e t al., Proc.Natl.Acad.Sci., 84, 7413-7417(1987)）を用いて、プラスミド５７７を、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞（ｄｘｂ−１１１）(Uriacio,et al., Proc.Nat. Acad.Sci. , 77, 4451-4466(1980)；この細胞は、受託番号ＣＲＬ９０９６下に入手できる(American Type Culture Collection[A.T.C.C.],12301 Parklawn Dri ve, Rockville, MD 20852))にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間前に、１０％ウシ胎仔血清、Ｌ−グルタミン（１μＭ）を補充し、フラスコ当たり細胞数５〜８×１０⁵の密度で２５ｃｍ²フラスコに接種したばかりのハムのＦ−１２培地で、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞を培養した。プラスミドＤＮＡ１５μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ培地１．５ｍＬに加え、リポフェクチン試薬（Lipofectin Reagent；Gibco-BRL, Grand Island N.Y.）１００μＬを、ＯｐｔｉＭＥＭ−Ｉ培地に加えた。その２つの溶液を混合し、室温で２０分間インキュベーションした。細胞から培地を除去し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ−リポフェクチン−ＤＮＡ溶液で置換して、組織培養での細胞へのＤＮＡのリポソーム仲介トランスフェクションに供した。細胞を３７℃で３時間インキュベーションした後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ−リポフェクチン−ＤＮＡ溶液を培地で置換して、さらに２４時間経過させた後、選択を行った。Ｂ．選択および増幅トランスフェクションから１日後に、細胞を１：３継代培養し、ｄｈｆｒ／Ｇ４１８選択培地（以下、「Ｆ−１２マイナス培地Ｇ」と称する）とともにインキュベーションした。選択培地は、Ｌ−グルタミンを含みヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含まないハムのＦ−１２（JRH Biosciences,Lenexa,Kansas, USA）および３００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Gibco-BRL）であった。Ｆ−１２マイナス培地Ｇでトランスフェクションした細胞を４〜５日間インキュベーションしたら、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ringold, et al., J.Mol.App l.Genet. , 1:165-174）およびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（Sou thern,P.J. and Berg, P.J., Mol.Appl.Gent., 1:327-341(1981)）の存在を示すコロニーが現れた。約２週間後、ＤＨＦＲ／Ｇ４１８細胞が十分に増殖して、Ｆ −１２マイナス培地Ｇでの継代および連続維持が可能となった。メトトレキセートによるＤＨＦＲ⁺、Ｇ４１８⁺細胞の段階的選択（シムケらによる総説がある（Schimke, R., Cell 37,705-713(1984)）によって、トランスフェクションしたＵＫ−ＨＣＶ−Ｅ２遺伝子の増幅を行った。１５０ｎＭでメトトレキセート（ＭＴＸ）を含むＦ−１２マイナス培地とともに、耐性コロニーが現れるまでの約２時間にわたって、細胞をインキュベーションした。適切な選択培地で、ＭＴＸ耐性細胞を継代および維持した。５μＭＭＴＸを用いた選択によってさらに増幅を行い、細胞を適切な選択培地で連続的に維持した。Ｃ．細胞系の維持および保存各種の選択または増幅法を受けた培地に入った細胞に、１週間に３回、適切な培地を再供給した。細胞を適切な培地で７５ｃｍ²フラスコに１：４継代し、標準法を用いて５％ＣＯ₂で３７℃にてインキュベーションした。２〜４×１０⁶個の細胞をＤＭＳＯ（Sigma Chem.Co., St Louis, Missouri, USA）を５％含む適切な培地１．８ｍＬに再懸濁させ、−８０℃で２４時間低温保存し、次に−１３５℃で永久的に保存して、冷凍保存した。Ｄ．抗原製造ハムのＦ１２特製マイナス培地で、ちょうど集密となった単層上を、５％ＣＯ₂ で、３７℃にて１２〜２４時間覆った。次に、成長培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（カルシウムおよびマグネシウム含有；Gibco-BRL から入手）で３回洗浄して、存在する可能性のある残りの培地／血清を除去した。次に細胞を、ＶＡＳ特製培地（１−グルタミンとＨＥＰＥＳを含み、フェノールレッドを含まないＶＡＳ特製製剤；JRH Bioscience から入手、製品番号５２−０８６７８Ｐ）とともに、５％ＣＯ₂で、３７℃にて１時間インキュベーションした。次に、最終洗浄としてＶＡＳを廃棄した。次に、Ｔ２５ｃｍ²フラスコ当たり５ｍＬでの製造用に細胞をＶＡＳで覆った（それより大きいフラスコまたはローラーボトルではそれに比例して規模を合わせる）。回収物１については、インキュベーション３〜４日後に培地を除去し、冷凍して、回収物２および３の精製まで待った。単層をＶＡＳで覆い、さらに２回の３〜４日後回収を行った。培地については毎日観察を行って、細胞の状態を調べた。Ｅ．清澄化および濃縮回収物を１５００×ｇで３０分間清澄化した。上清を、アミコン（Amicon）ＹＭ１０膜を取り付けたアミコン攪拌型セル（Amicon, Amicon, Beverly, MA から入手）で５０倍に濃縮した。実施例３ＣＨＯ−Ｅ２の精製イオン交換およびレクチンクロマトグラフィーによって、細胞上清から、シアル酸を含むＣＨＯ−Ｅ２糖蛋白を９０％を超える純度まで精製した。２つの異なる蛋白を含まない培地からの別個の１０ロット全てを精製し、それによって、この手順の再現性および多用途性が明らかになった。Ｒ−２５０クマシー・銀染色によって純度を評価した。エンド−Ｆ消化によって、理論分子量が３０Ｋｄａｌであることを検証した。ローラーボトルで増殖させた細胞からの上清を遠心して、細胞破片を除去し、アミコンＹＭ１０膜を用いて５０倍（５０ｍＬ）まで濃縮した。５０倍濃縮液を０．２μｍフィルターで最終濾過し、次にＳ−セファロース溶離緩衝液（０．０２Ｍリン酸ナトリウム、塩なし、ｐＨ６．５）に対して十分に透析を行った（１２〜１４Ｋｄａｌカットオフ）。イオン交換クロマトグラフィーは２本のカラムで行った（Ｓ−セファロースおよびＤＥＡＥ−セファロース）。両方のカラムを直列で流し、望ましくない蛋白はカラムに結合させ、所望の蛋白が溶出液に含まれていた。カラムのそれぞれの溶離緩衝液に２ＭＮａＣｌを加えた液でイオン交換カラムを洗浄して、望ましくない蛋白を除去した。濃縮・透析上清を最初に、流速５ｍＬ／分で平衡Ｓ−セファロースカラム（ベッド容量２００ｍＬ）に負荷した。未結合溶出液を回収し、濃縮して（ＹＭ１０）最初の容量とし、ＤＥＡＥ−セファロース溶離緩衝液（０．０２Ｍトリス緩衝液／０．１ＭＮａＣｌを含む、ｐＨ８．５）で十分に透析を行った。この緩衝液の導電率が約１２ｍＳであることが認められた。透析後、材料を流速５ｍＬ／分でＤＥＡＥ−セファロースカラム２００ｍｌに負荷した。未結合の溶出液を回収し、濃縮して（ＹＭ１０）最初の容量とし、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、０．１３ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．０）で十分に透析を行った。この緩衝液は、レクチンＷＧＡ−セファロース６ＭＢ溶離緩衝液と称した。サンプルをＷＧＡ溶離緩衝液に加え、それを０．５ｍＬ／分で１０．０ｍＬのＷＧＡ−セファロース６ＭＢカラムに負荷し、溶出液を回収・循環した。十分に洗浄（カラム容量の１０倍）を行った後、カラムの溶離方向を逆転させ、溶離緩衝液に１０ｍＭＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオースを加えた液を用いて精製ＣＨＯ−Ｅ２抗原を溶出させた。精製抗原をＰＢＳに対して透析し、−７０℃で保存した。実施例４クローン化細胞懸濁液スクリーニングのためのＣＨＯ−Ｅ２抗原アッセイＡ．ＣＨＯ−Ｅ２抗原ビーズクローン化細胞懸濁液または対照懸濁液（ＨＣＶ挿入物を持たない発現ベクターでトランスフェクションしたＣＨＯ細胞）２０μＬを、１／４インチのビーズを入れることができる微量定量ウェルに入れた。調べるウェル数に０．２および１．０５を掛けて、コーティングに必要な希釈液のｍＬ数を得た。使用した希釈液は、ＳＭＰ希釈液（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL から入手可能）であった、上記で得られた試薬２００μＬを、上清の入った各ウェルに加え、封止し、ウェルを有するトレーを予め４０℃に加熱しておいたインキュベータに入れた。ダイナミックモードとしたダイナミック・インキュベータ（Dynamic Incubator）中でトレーを２０秒間振盪して、サンプルを混合した。その後、トレーを静止状態で４０℃にて１時間インキュベーションした。次に、Ｅ２ペプチドビーズを加え、カバーを施し、静止モードで４０℃にて１時間インキュベーションした。そのインキュベーション後、トレーを洗浄し、ウェル当たり接合体２００μＬを加えた（Abbott Laboratories, Abbott Park, ILから入手可能なＨＣＶ２．０接合体希釈液にγ−特異的Ｇ抗ヒトＨＲＰＯを１００ｎｇ／ｍＬで含むもの、リスト番号４Ａ１４Ｃ）。この混合物を静止モードで４０℃にて３０分間インキュベーションした。このインキュベーション後、ビーズを洗浄し、ＥＩＡ管ボックスに移し入れた。次に、ＯＰＤ基質３００μＬ（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL から入手可能）を各ウェルに加え、得られた混合物を４０℃で３０分間インキュベーションした。ウェル当たり１ＮＨ₂ＳＯ₄１．０ｍＬを加えることで反応を停止した。各ウェルについて、アボット・クオンタム（Abbott Quantum；登録商標）装置での４９２（Ａ₄₉₂）の吸光度を読み取り、アッセイの妥当性を以下のようにして求めた。陰性対照の平均Ａ₄₉₂＝１．０００±０．１０；陽性対照の平均Ａ₄₉₂＝０．０２５±０．１０。これらの計算を行ってから、被験サンプルの低下パーセントを次のように計算した。す実施例５Ｅ２抗原を利用するアッセイ以上の実施例で記載の方法に従って得られた精製ＨＣＶＥ２抗原を、当業界で公知の方法に従って、濃度１．０〜２．０μｇ／ｍＬでポリスチレンビーズにコーティングした。コーティング法で使用する成分を調節して、抗体アッセイ試験に至適な感度および特異性が得られるようにした。志願供血者群からの検体を調べることで、Ｅ２抗体アッセイの特異性を評価した。上記のアッセイプロトコール（上記の実施例を参照）に従って、信号発生化合物として西洋ワサビ・ペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ヒトＩｇＧを用いる酵素イムノアッセイで、検体はいずれも１：４１希釈で使用した。米国の複数の施設から慢性および急性の非Ａ非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）検体を得た。ＨＣＶ抗原に対して血清変換した対象者から連続的に採血した検体を商業的血漿販売者から入手した。ＨＣＶＲＮＡ陽性である保管サンプル（Ｎ＝４９５）を、患者または供血者との関係は不明で米国の大きいウィルス学参考検査室から入手した。ＲＮＡ抽出法およびＰＣＲ増幅法は既報である（D.Gretch et al., J.Clin.Micro.. 30:2145-2149(1992)）。別のＨＣＶＲＮＡ陽性検体を、日本（Ｃ＝５９）およびオランダ（Ｎ＝３３）から集めた。ＡＬＴ値が１００ＩＵ／Ｌより高いＨＣＶ感染の危険性のある供血者からの検体（Ｎ＝３０４）をニューヨーク血液センターから得た。ＨＣＶ核抗原およびＨＣＶＮＳ３抗原についてのアボットＭＡＴＲＩＸ（登録商標）１．０ＨＣＶアッセイで反応性が曖昧なサンプル（それぞれ、Ｎ＝１３９およびＮ＝１４９）を、アボットウィルス学参考検査室（Abbott Virology Reference Labo ratory, North Chicago, IL）から入手した。市販の抗ＨＣＶ２．０陽性供血者および患者。市販の抗ＨＣＶ混合力価測定群（ＰＨＶ２０３）を入手した(Bosto n Biomedica, Inc.(BBI),West Bridgewater, MA から)。ＨＣＶ２．０反応性血漿サンプルを入手し(North American Biologicals, Inc.(NABI)から)、２つのＨＣＶ２.０ＥＩＡ(Abbott Laboratories,Abbott Park, IL および Ortho Diagnostics, Inc., Raritan, NJ)で同じ反応性を示すサンプルのみをさらに分析した。すでに慢性ＮＡＮＢＨと診断されている患者１５９名をアボットＨＣＶ２．０試験およびＥ２ＥＩＡを用いて調べた。患者１５９名中計１４７名（９２．５％）がＨＣＶ２．０で陽性であり、患者１５９名中１４１名（８８．５％）もＥ２に対する抗体を持っていた。全体的に、ＨＣＶ２．０アッセイおよびＥ２アッセイの間で９６．２％の一致があった。ＨＣＶ核抗体およびＥ２抗体の間の高い相関性（９４％）も、この群では認められた。同様の高い一致が、急性ＮＡＮＢＨ患者でのＨＣＶ２．０アッセイとＥ２アッセイの間でも認められた。これら１１３の検体中９９の検体（８７．６％）が一致した結果を与え（５１が陽性で４８が陰性）、１０検体が専らＨＣＶ２．０とのみ反応し、４検体がＥ２抗体アッセイのみで陽性であった。ＨＣＶ２．０およびＥ２ＥＩＡについての急性患者での全体的反応率は、それぞれ５４％および４９％であった。複数ＨＣＶ抗原に対して血清転換した５名の個々の血漿供血者からの連続採取検体も、ＨＣＶＥ２蛋白と反応することが明らかになった。患者５名中３名において、血清転換時に検出可能な最初の抗体はＥ２抗体であった。抗Ｅ２は最終的に患者５名全員に認められた。計５８７名のＨＣＶＲＮＡ陽性検体について、アボットＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶ２．０アッセイを用いて、Ｅ２に対する抗体と他の個々のＨＣＶ抗体を調べた。これらＲＮＡ陽性検体５８７中５７１が、Ｅ２に対する抗体を有することが明らかになり、それには日本で採血した５９検体中の５６検体（９４．９％）もあった。いずれのＥ２陽性サンプルにも、アボットＭＡＴＲＩＸ（登録商標）によって検出された他のＨＣＶ抗原が含まれていたが、この群では、Ｅ２抗体より高い頻度で生じた抗体はなかった。ＡＬＴ値が１００ＩＵ／Ｌを超える供血者群では、４８名（１５．８％）がＥ２抗体陽性であった。これら４８名の供血者中４６名（９５．８％）は、アボットＨＣＶ２．０ＥＩＡでも反応性であり、アボットＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶ２．０アッセイで反応性であることが確認された。アボットＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶ１．０アッセイによって、専らＨＣＶコアまたはＨＣＶＮＳ３に対する抗体を有するという検出結果を与えた検体について、Ｅ２抗体を調べた。１３９のコア反応性検体中５９（４２．４％）がＥ２抗体を有することが認められ、ＮＳ３反応性の場合は１４９中２３（１５．４％）であった。血清学的マーカーに関して特性がわかっている検体群をＢＢＩから入手し、アボットＨＣＶ３．０ＥＩＡ試験およびＥ２抗体試験によって評価した。その群には、ＢＢＩによって、ＨＣＶ２．０ＥＩＡ（アボットおよびオーソ（Ortho））、ＨＣＶ３．０ＥＩＡ（オーソ）、アボットＭＡＴＲＩＸ（登録商標）ＨＣＶ１．０およびＲＩＢＡＨＣＶ２．０のデータが提供された。ＨＣＶ２．０ＥＩＡ陽性（アボットおよびオーソの両方のアッセイによって）の２３検体中１８検体（７８．３％）が抗Ｅ２陽性でもあった。ＨＣＶ陰性群の２検体がＥ２抗体陰性であった。ＨＣＶ２．０で同じ陽性の２３検体中６検体（全体の２６．１％）がオーソＨＣＶ３．０ＥＩＡでは陰性の評点であったが、アボットＨＣＶ３．０ＥＩＡではやはり反応性であった。これら６検体中の３検体（５０％）が、複数のＨＣＶ蛋白に対する抗体を有することが明らかになり、そのうちの２検体はＥ２に対する抗体を持っていた。これら２検体は、ＲＩＢＡアッセイおよびアボットＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アッセイの両方でＨＣＶコアに対して反応性であった。従って、プラスミド５７７からのＥ２組換え抗原は、それを用いるアッセイで機能することができた。以上記載の本発明の具体的実施態様についての他の変更および変形は当業者には明らかであろう。従って本発明は、添付の請求の範囲に従って限定されるべきものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スハー，トーマス・エスアメリカ合衆国、イリノイ・60046、リンデンハースト、ベツク・ロード・842 (72)発明者レスニーウスキイ，リチヤード・アールアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、ケノシヤ、ワンハンドレツドテンス・アベニユー・8706

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）固相に付着した分析物に特異的な１以上の蛋白を、蛋白／抗体複合体が生じるのに適する時間および条件で被験サンプルと接触させ、（ｂ）信号発生化合物と、分析物に対する特異的結合構成員とを含む指示薬を、反応が起こる時間および十分な時間で前記複合体と接触させ、ここで発生信号が被験サンプル中の抗分析物抗体の存在の指標である、被験サンプル中の抗分析物抗体を検出するためのアッセイにおいて、改良が、プラスミド５７７で産生された融合蛋白を捕捉試薬として固相に付着させることからなるアッセイ。２．分析物が抗ＨＣＶ抗体、抗ＨＩＶ−１抗体、抗ＨＩＶ−２抗体、抗ＨＴＬＶ−Ｉ抗体および抗ＨＴＬＶ−ＩＩ抗体から成る群から選択される請求項１に記載のアッセイ。３．（ａ）第１の小分け被験サンプルと第２の小分け被験サンプルを得て、（ｂ）前記第１の小分けサンプルを、固体支持体に付着した抗分析物抗体に特異的な蛋白と接触させ、（ｃ）前記第２の小分けサンプルを前記抗分析物に特異的な未付着の蛋白と接触させ、次に前記結合蛋白と接触させる、流体被験サンプル中の蛋白と免疫学的に反応性の抗分析物抗体の存在を検出する競合アッセイにおいて、改良が、段階（ｂ）で固相に付着した前記抗分析物抗体に特異的なＣＫＳ融合蛋白および、段階（ｃ）で前記抗分析物抗体に特異的なプラスミド５７７で産生される未付着融合蛋白からなる競合アッセイ。４．段階（ｂ）で約１５〜２時間のインキュベーシヨンを行ってから、段階（ｃ）を行う請求項３に記載の競合アッセイ。５．段階（ｂ）と段階（ｃ）を同時に行う請求項２に記載の競合アッセイ。６．被験サンプル中の抗分析物抗体の存在検出に使用する試験キットであって、前記抗分析物抗体に特異的な１以上の蛋白の入った容器を含む試験キットにおいて、改良が、前記抗分析物抗体に特異的なプラスミド５７７で産生される融合蛋白の入った容器からなる試験キット。７．前記融合蛋白がＨＣＶ融合蛋白である請求項６に記載の試験キット。８．前記融合蛋白が固相に付着している請求項６に記載の試験キット。９．プラスミド５７７で産生される融合蛋白を含む診断試薬。１０．プラスミド５７７。１１．医薬的に許容される賦形剤中に薬理学的に有効な用量の免疫原性ポリペプチドもしくはその断片を含む感染治療用ワクチンであって、改良が、プラスミド５７７で産生されるポリペプチドからなるワクチン。