JPH11507548A

JPH11507548A - ブタのリッターサイズ用ｄｎａマーカー

Info

Publication number: JPH11507548A
Application number: JP9502797A
Authority: JP
Inventors: ミレハム，アラン，ジョン; プラストウ，グラハム，ステュアート; サウスウッド，オルウェン，イレーネ
Original assignee: ダルジェティーパブリックリミテッドカンパニー
Priority date: 1995-06-12
Filing date: 1996-06-12
Publication date: 1999-07-06
Also published as: CZ401797A3; KR19990022827A; PL324028A1; EP0879296B1; ES2175095T3; AU6012096A; EP0879296A1; DE69620249T2; MX9710091A; WO1996041892A1; CA2224394A1; DE69620249D1; GB9511888D0; CN1191576A; DK0879296T3; RU2162895C2; NZ309858A; US6410227B1; ATE215129T1; PL184518B1

Abstract

(57)【要約】より多くの同腹子を産するとより考えられるブタおよび／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング方法が、ブタのゲノムＤＮＡのサンプル中に存在するＯＰＮ対立遺伝子の同定を基礎として、提供される。このような方法に使用されるキットもまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】ブタのリッターサイズ用ＤＮＡマーカー本発明は、大きなリッターサイズに関連するオステオポンチン(osteopontin) （ＯＰＮ）対立遺伝子の存在または不存在を決定するためのブタのスクリーニング方法、ブタのリッターサイズの推定における上記方法の使用およびこのような方法を行うためのキットに関するものである。動物のリッターサイズを増加させることが可能であると、肉の生産及び動物の繁殖率が向上できる。また、家畜の同等の生産高がより少ない親動物から得られるので、生産コストが減少できる。さらに、動物の飼育組織は、改良された遺伝子を有するものの子孫をより多くスクリーニングできる可能性により利益を享受することができる。しかしながら、リッターサイズは、従来、一方の性に限られ非遺伝的な因子の影響をかなり受ける（遺伝率、即ち、遺伝的な相違による表現型変異の比率の測定結果はブタのリッターサイズで約０．１である）ので、選択が非常に困難である。リッターサイズを増加させる方法の一つとしては、有用な遺伝子を有意により高いリッターサイズを有する品種由来の生産系に導入することである。しかしながら、量的遺伝学では、リッターサイズ等の複合特性(complex trait)はそれぞれがその特性に関して小さな効果を有する非常に多数の遺伝子によって制御されることが示唆される。この示唆が正しいとすると、複合特性(complex trait)の選択による遺伝的進歩は非常に遅いと考えられる。または、多くの遺伝子が複合特性に係わっているものの、これらのうち少数の遺伝子（主要遺伝子）がその特性に関して大きな効果を有するという考えもある。この考えが正しいとすると、関連のある主要遺伝子の有用な対立遺伝子の同定及び選択が可能であれば、このような特性の遺伝的進歩は迅速なものとなる。ゲノムマッピングの出現以降、量的特性とマップが使用できる動物のゲノムに等しく分布する分子マーカーとの関連を模索することによって、量的特性(quantitative trait)（量的特性遺伝子座(quantitative trait lo cus)、ＯＴＬ）に影響を及ぼす遺伝子を同定することが可能となった。重要なことには、選択を目的とした場合、このようなマーカーの表現型の遺伝率は１．０である。ブタのチャイニーズメイシャンという品種(Chinese Meishan breed)は、最も多産なヨーロッパの品種に比べて一同腹子当たり約４匹の子豚をさらに産することが知られている。この品種の多産性（リッターサイズ）に関する遺伝子は、一般的な西欧のブタの品種のリッターサイズを増加させることを目的としたプログラムにおいて非常に有用である。確かに、メイシャン(Meishan)のエストロゲンレセプター遺伝子（ＥＳＲ）に関連する遺伝マーカーは、リッターサイズに好ましい作用を及ぼすことが示され、これはＷＯ９２／１８６５１号に報告される。ヒツジのブールーラメリノという品種(Booroola Merino breed)は非常に多産である。３匹以上のリッターサイズが一般的である。この品種の非常に高い繁殖率は、単一の遺伝子、ＦＥＣＢの作用によるものであることが示された（評論として、ジーダブリューモントゴメリー(G W Montgomery)ら、エンドクリンレビューズ(Endocrine Reviews)、１３：３０９〜３２８（１９９２年）を参照）。ヒトのＤＮＡマーカーを用いた遺伝地図(genetic mapping)により、ヒト形式( version)のＦＥＣＢはクロモソーム４(chromosome 4)上に位置（ジーダブリューモントゴメリー(G W Montgomery)ら、ネーチャージェネティックス(Nature Genetics)、４：４１０〜１１４（１９９３年））し、オステオポンチン（ＯＰＮ）としても既知の、分泌リンタンパク質−１(secreted phosphoprotein-1)（ＳＳＰ−１）、２ａｒ、骨のサイアロプロテイン−１(bone sialoprotein-1)、４４ｋＤａの骨のリンタンパク質及び腫瘍の分泌リンタンパク質をコード化する遺伝子と密接に関連することが示された。比較の地図（エッチエレグレン(H E llegren)ら、ゲノミックス(Genomics)、１７：５９９〜６０３（１９９３年）から、ヒトのクロモソーム４(chromosome 4)及びブタのクロモソーム８(chromosom e 8)は非常に類似する（シンテニックである(syntenic)）ことが示される。ブタのＳＰＰ−１遺伝子もまたクロモソーム８(chromosome 8)上に位置する。より近年、ウシのＦＥＣＢ連結マーカーが***速度の速いものについて選択された群における大きなリッターサイズ用のマーカーとして作用しないことが分かった（ブラットマン(Blattman)ら、ミッド−ウェストアニマルサイエンスミーティング(Mid-West Animal Science Meeting)、１８：４３（１９９５年））。しかしながら、我々は、驚くべきことに、ブタでは、ＯＰＮに関する特定のＤＮＡマーカーは、リッターサイズと関連があり、このため、より大きなリッターサイズを産するチャンスのより大きなブタを選択したり、より小さなリッターサイズを示す対立遺伝子を有するブタを除いて選択する(select against)ことに使用できることを発見した。本明細書において、「より大きなリッターサイズ(inc reased litter size）」とは、所定の集団の平均を超えるリッターサイズの有意な増加を意味する。興味深いことに、一方のヒツジ、ウシ及びヒトと他方のマウス及びブタとの間にはＯＰＮ付近のクロモソームシンテニーに明白なブレークポイントがあることが分かった（モントゴメリー(Montgomery)ら、ジェーレプロダクションアンドファーティリティー(J．Reproduction and Fertility)、追補(supplement) 、４９：１１３〜１２１（１９９５年））。これから、同腹子が多い動物（マウス及びブタ）と同腹子が少ない動物（ヒト、ヒツジ及びウシ）との間では、クロモソームの構造がこの領域で変化しており、これにより繁殖力に関する主要遺伝子の作用が修飾されることが示唆される。可能性のある説明としては以下が挙げられる：主要遺伝子の発現がより転写活性の高いあるいは転写不活性な領域に導入されることによって向上されるあるいは抑制されること；主要遺伝子が変更されたプロモーターエレメントの制御下に直接導入されること；ＯＰＮに関連する主要遺伝子の位置がＯＰＮがヒツジやウシに比べてブタにおける方がリッターサイズの潜在性を評価するのにより有効なマーカーとなるように変更される。したがって、第一の概念によると、本発明は、以下の段階からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング方法を提供するものである：（ｉ）ブタからゲノムＤＮＡのサンプルを得る；および（ｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、どのＯＰＮ対立遺伝子が存在するかを決定する。好ましくは、段階（ｉｉ）、即ち、ＯＰＮ対立遺伝子の決定は、ＯＰＮに直接的にあるいは間接的に連結する特定のＤＮＡマーカーを探索することによって行われる。遺伝マーカー及び特定の特性に応答可能な遺伝子との間の結合は、遺伝子組換によって破壊できる。したがって、マーカーと問題の遺伝子間の物理的な距離が近いほど、組換によりこれらを分離しにくいと考えられる。また、特定の特性と関連することが既に示された、別のＤＮＡマーカーの特殊な対立遺伝子と特定の遺伝子（例えば、本明細書に記載されるＯＰＮ遺伝子）に結合することが既知のＤＮＡマーカーの対立遺伝子との間の結合を確立することも可能である。したがって、現状では、ＯＰＮ遺伝子を採用して、他のクロモソーム８マーカーの特定の対立遺伝子の選択を介してＯＰＮ結合マーカーのある種の対立遺伝子について選択することによって、より多くの同腹子を産すると考えられるブタについて、または間接的には、より少ない同腹子を産すると考えられるブタを排除して、選択することが、少なくとも短期間で可能である。ブタのクロモソーム８上のＯＰＮに連結することが既知のこのようなマーカーの例としては、Ｓｗ６１、Ｓｗ１０８５、Ｓｗ１９４、Ｓｗ１６、Ｓｗ７９０及びＳＯ１７８が挙げられ、これらのマーカーはすべてミクロサテライト(microsatellite)である。本発明のさらなる実施態様によると、数多くのこのようなマーカーが使用される。例えば、マーカー対を用いて、主要遺伝子をブラケットし(bracket)、可能性のある組換効果を抑制する。このようなマーカーの組み合わせの例としては、ＳＯ１７８及びＳｗ６１、さらにはＳＯ１７８及びＳｗ７９０が挙げられる。上記効果はブタ（及びマウス）およびヒツジ（及びヒトやウシ）の遺伝子の順番の相違に関連するので、これから、最も有用な第二のマーカーはブタのクロモソーム８の非相同（非シンテニー(non-syntenic)）領域にあることが示唆される。この領域をブラケットする(bracket)ことが既知のマーカーの適当な組み合わせの例としては、ＯＰＮ及びＳＯ１７８がある。しかしながら、当業者は、他の有用なマーカーが定常的に同定されることも分かっているであろう。ＯＰＮと結合する(associate)特定の遺伝マーカーはミクロサテライト(micros atellite)である。これらは、約５０，０００塩基（１ハプロイドゲノム当たり約６０，０００ミクロサテライト(microsatellite)）毎にゲノム付近で実質的に任意に生じる、４、３または、より一般的には２個のヌクレオチドの単純な配列の繰り返しである。複製中のＤＮＡポリメラーゼのステュターリング(stutterin g)及び組換中の不等交差により繰り返し単位が失われたりまたは増えると考えられる。このことは、ミクロサテライトが一般的に多形性であり、様々な繰り返し長対立遺伝子(repeat length allele)を有することを意味する。可能性のある繰り返し単位長対立遺伝子(repeat unit length allele)を生じる（ＣＡ）_n、例えば、（ＣＡ）₂、（ＣＡ）₉、（ＣＡ）₁₀、（ＣＡ）₁₁及び（ＣＡ）₁₂が、所定の遺伝子と結合するミクロサテライトの例である。標準的なＰＣＲ技術と組み合わせて、所定の遺伝子と結合するミクロサテライトに隣接する(flanking)領域と（例えば、ストリンジェントな条件下で）ハイブリッド形成できることができるプライマーを用いることにより、様々な長さのＰＣＲ産物が得られるが、その長さはミクロサテライトの特定の繰り返し単位長対立遺伝子(repeat unit length allele)に依存する。リッターサイズとＯＰＮ遺伝子と結合するミクロサテライトを用いた上記ＰＣＲ産物との関連を分析することにより、増加した、及び減少したリッターサイズに関連するマーカー長対立遺伝子がブタで決定できた。このようなミクロサテライトのフランキング領域とハイブリッド形成する適当なプライマー対としては、以下の配列を有するものが挙げられる：ＧＣＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡ；またはＣＣＡＡＴＣＣＴＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣ；およびＧＴＧＴＣＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣ；またはＣＡＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＣ。特に、１３２及び１３６と称される、上記ミクロサテライトマーカーの繰り返し単位長対立遺伝子(repeat unit length allele)は、ブタの大きなリッターサイズに関連することが分かった。さらに、１１２と称される、繰り返し単位長対立遺伝子は、ブタの小さなリッターサイズに関連することが分かった。事実、大きなリッターサイズに関連する対立遺伝子は、主として、ヨーロッパの親ストック由来である。これは、上述したように、メイシャン(Meishan)はランドレース(Landrace)またはデュロック(Duroc)に比べて１同腹子当たり４匹の子豚をさらに有するので、予想に反しており、有用なマーカーは元がメイシャン (Meishan)の親ストックから受け継がれる遺伝子に関連すると予想された。第二の概念によると、本発明は、以下の段階からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング方法を提供するものである：（ｉ）ブタからゲノムＤＮＡのサンプルを得る；（ｉｉ）（ｉ）のゲノムＤＮＡを一またはそれ以上の適当なプライマーとハイブリッド形成させる；（ｉｉｉ）（ｉｉ）のハイブリッド形成した核酸を用いて一またはそれ以上のＰＣＲサイクルを行う；および（ｉｖ）（ｉｉｉ）で得られたＰＣＲ産物の長さを分析する。好ましくは、本発明の方法は、キットの形態で示される試薬及び指示を用いて実施される。したがって、第三の概念によると、本発明は、ブタのゲノムＤＮＡのサンプルにおいてＯＰＮ対立遺伝子を同定できる一以上の試薬または材料からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング用キットを提供するものである。本発明の好ましいキットは、ＯＰＮ遺伝子に連結されるＤＮＡマーカー、例えば、ミクロサテライトマーカー、と結合する対立遺伝子を同定できる試薬または材料からなる。このようなキットは、最も好ましくは、一以上のＤＮＡプライマー、さらに必要であれば標準的なＰＣＲ試薬からなる。最後に、当業者によれば、本明細書中に記載される方法及びキットはより多くの同腹子を産するとより考えられるブタ（またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタ）を決定するための他の既に報告されたブタのスクリーニング方法及びキットと組み合わせて使用できることは認識される。このような他の方法及びキットの例としては、ＷＯ９２／１８６５１号に記載されるものがある。言うまでもなく、双方の方法を用いてブタのＤＮＡをスクリーニングするために使用される組み合わされたキットを製造することも可能である。ＷＯ−Ａ−９２１８６５１号及びＵＳＳＮ０８／３１２３１２号には、ＥＳＲ遺伝子との連結を基礎としたどのブタがより多くの同腹子を産するとより考えられるかを決定する方法が開示される。したがって、当業者は、本発明のスクリーニング方法を、先に開示されたＥＳＲスクリーニング方法と組み合わせて使用することにより、このような決定方法を目的としたより強力な道具を提供することができることを認識するであろう。したがって、さらなる概念によると、本発明は、以下の段階からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング方法を提供するものである：（ｉ）ブタからゲノムＤＮＡのサンプルを得る；（ｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、どのＯＰＮ対立遺伝子が存在するかを決定する；および（ｉｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、どのブタのリッターサイズに関連する少なくとも一の他の遺伝子の対立遺伝子が存在するかを決定する。本発明の上記概念の一つの好ましい実施態様によると、上記少なくとも一の他の遺伝子としては、ＷＯ−Ａ−９２１８６５１号及びＵＳＳＮ０８／３１２３１２号に記載される、ＥＳＲ遺伝子がある。最後の概念によると、本発明は、ブタのゲノムＤＮＡのサンプルにおいてＯＰＮ対立遺伝子を同定できる一以上の試薬または材料、およびブタのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるブタのリッターサイズに関連する少なくとも一の他の遺伝子の対立遺伝子を同定できる一以上の試薬または材料からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング用キットを提供するものである。本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて(mutatis mutan dis)、各他の概念に適用できる。本発明を下記実施例を参照しながら説明するが、本発明は下記実施例に何等制限されるものではない。実施例１ＤＮＡの調製ＤＮＡは、細胞核を含む組織であればいずれの源、例えば、白血球、毛嚢、耳のノッチ(ear notch)及び筋肉、から調製されてもよい。本明細書に概説される工程は、血球調製物に関連するものである；他の組織に関しては、Ｋ緩衝液(K b uffer)に材料を直接懸濁した後血液工程(blood procedure)の同様の段階により加工することによって、同様に加工される。本明細書に概説される方法により、ＰＣＲ増幅に適する未精製ＤＮＡを含む細胞ライゼートが得られる。しかしながら、いずれの精製または未精製のＤＮＡを調製する方法もまた同様にして有効である。血液は、凝固を防止するために５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中に集められなければならない。５０μｌの血液を小さなミクロ遠心管(microcentrifuge t ube)（０．５ｍｌエッペンドルフまたはその等価物）中に入れた。４５０μｌのＴＥ緩衝液を加え、赤血球（ヘム群はＰＣＲを阻害する）を分解し(lyse)、２秒間ボルテックスにより混合した。次に、そのままの白血球及び残りの赤血球をミクロ遠心器(microcentrifuge)で１３，０００ｇで１２秒間遠心した。低圧の真空ポンプシステムを用いて緩やかに吸引することにより、上清を除去した。次に、４５０μｌのＴＥ緩衝液をさらに加え、残りの赤血球を分解し、白血球を前記と同様にして遠心によって収集した。ペレットが赤みが残っている際には、このプロセスをペレットを白くなるまで繰り返した。ペレット化した白血球から上清を残らず除去した後、１００μｌのプロテイナーゼＫ含有Ｋ緩衝液を添加し、この混合物を５５℃で２時間インキュベートした。次に、この混合物を８分間９５〜１００℃に加熱し、ＤＮＡライゼートを必要となるまで、−２０℃で貯蔵した。試薬ＴＥ緩衝液：１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．０）１ｍＭＥＤＴＡＫ緩衝液：５０ｍＭＫＣｌ１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．３）２．５ｍＭＭｇＣｌ₂ ０．５％ツィーン２０(Tween 20) ライゼートを使用する前に、１．０ｍｌのＫ緩衝液当たり、１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（ベーリンガーマイハイム(Boehringer Marmheim) ）を添加した。ＰＣＲ反応液を、以下のようにして薄膜０．２５ｍｌ容管(thin walled 0.25 ml tub e) （パーキンエルマー(Perkin Elmer)）中に作製した：１．５μｌ１０×緩衝液；１．５μｌ１５ｍＭＭｇＣｌ；１．５μｌ２ｍＭｄＮＴＰ（ファルマシア(Pharmacia)）；０．５μｌ５ｍＭの各プライマー（ゲノシス(Genosys)）；９μｌ滅菌脱イオン水；０．１μｌ（０．５単位）アンプリタック(AmpliTaq)ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー(Perkin Elmer)）；１μｌＤＮＡライゼート。次に、反応管をパーキンエルマー９６００熱循環器(Perkin Elmer 9600 thermal cycler)に置き、ＰＣＲを下記レジメに従って行った：９４℃で４分間；９４℃で３０秒間、５８℃で１分間、および７２℃で１分間を３０サイクル；７２℃で４分間；必要になるまで４℃。試薬１０×ＰＣＲ緩衝液：１００ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．３（２５℃）、５００ｍＭＫＣｌ順方向プライマー(forward primer)：ＧＣＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡまたはＣＣＡＡＴＣＣＴＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣ逆方向プライマー(reverse primer)：ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣまたはＣＡＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＣプライマーの一方が蛍光マーカーで標識される際には、得られる産物は、ジーンスキャン(Genescan)及びゲノタイパーソフトウェアー(Genotyper software) を用いたアプライドバイオシステムズ３７３ＤＮＡシークエンサー(App lied Biosystems 373 DNA Sequencer)等の自動ＤＮＡ配列決定器(automated DNA sequencer)で分析できる。実施例２ポリアクリルアミドゲル電気泳動５μｌのＰＣＲ産物を２μｌのローディングバッファー(loading buffer)と混合し、１×ＴＢＥ緩衝液中で非変性ポリアクリルアミドスラブゲル上で１００Ｖで４時間分離させた。次に、ゲルを５０ｎｇ／ｍｌのエチジウムブロミド溶液中で３０分間染色し、ＰＣＲ産物を可視化し、紫外線透視器(UV light transillum inator)で撮影した。次に、ＰＣＲ産物の塩基対としての大きさを、同様のゲルで流した既知の分子量マーカーと比較して、相対的な移動度から測定した。ＰＣＲ産物の大きさの測定結果はミクロサテライト対立遺伝子の長さに反映する。また、ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ中の蛍光で標識されたプライマーを使用することによって、アプライドバイオシステムズＤＮＡシークエンサー(Applied B iosystems DNA Sequencer)で分析した。結果ＯＰＮ対立遺伝子の頻度様々なブタの集団におけるＯＰＮ対立遺伝子の頻度を表１に示す。 L93 ランドレース(Landrace)×メイシャン(Meishan)の交配によってできる集団由来の動物 L94 デュロック(Duroc)×メイシャン(Meishan)の交配によってできる集団由来の動物統計学的分析Ｌ９３及びＬ９４由来のメス動物について、可能であれば様々なパリティで、リッターサイズを評価（全出産数（ＴＮＢ）及び生存出産数（ＮＢＡ）の双方）し、これらのデータを同じ動物セットのＯＰＮミクロサテライト遺伝子型と比較した。リッターサイズとＯＰＮ遺伝子型との統計学的な関連を、最小自乗法を用いて調べ、一般的な直線モデル(general linear model)に合わせた。リッターサイズに関する最小自乗平均(Least Squares Mean)（ＬＳＭ）を各ＯＰＮ遺伝子型で評価した。ＬＳＭは、リッターサイズに影響を及ぼすモデルにおける他の効果を調節した平均値である。個々のＯＰＮ対立遺伝子の効果を、特定の対立遺伝子の０、１または２コピーを有するかどうかによって動物をグループに分けた対立遺伝子の置換モデル(all elesubstitution model）を用いてさらに分類した。リッターサイズに関するＬＳＭを各群で調べた。Ｌ９３に関する結果を表２に示す。上記データから、対立遺伝子１１２はリッターサイズにおける負の効果に関連すると考えられ、対立遺伝子１３２（ＮＢＡ）及び１３６（ＴＮＢ）では正の傾向が見られることが分かる。表１に示されるデータから、対立遺伝子１１２及び１３６はランドレース(Landrace)由来であると考えられるが、対立遺伝子１３２はランドレース(Landrace)またはメイシャン(Meishan)の祖先由来であったことが示唆される。しかしながら、対立遺伝子１３２はメイシャン(Meishan)に比べて２倍以上ランドレース(Landrace)で共通しているので、Ｌ９３における対立遺伝子１３２のかなりの部分はランドレース(Landrace)由来であると考えられる。これらの対立遺伝子がリッターサイズのプレディクター(predictor)として作用する能力があるかを調べるために、Ｌ９４からのデータをさらに分析した。対立遺伝子１３２はこの系統では見付からなかった（恐らくこの対立遺伝子はデュロック(Duroc)では見付からない）。対立遺伝子１３２及び１３６のデーターを合わせたものを表３に示す。これらのデータから、対立遺伝子１３２のみがＴＮＢ及びＮＢＡ双方に関してリッターサイズに有意な正の効果を有したことが示される。対立遺伝子１３６はＴＮＢではかなり有意性が認められるが、この効果は少数の１３６／１３６動物（３）がかなり高い観察結果を出したことによると考えられる。ＯＰＮ対立遺伝子１３２及び高いリッターサイズとの間の関連は、ブタの２種の異なる系統（Ｌ９３及びＬ９４）で示された。これから、リッターサイズに影響を及ぼすＱＴＬはブタのＯＰＮ遺伝子と密接に関連することが示される。しかしながら、ブタの他の科、系統または品種において、異なるＯＰＮ対立遺伝子がリッターサイズの増加に関連があることは可能である。Ｌ９３及びＬ９４に関する及びさらに系統Ｌ０７（大きな白色系統）に関する再分析結果を、他のモデルを用いて下記表４に示す。これは、各ＯＰＮ対立遺伝子を可変とし、各対立遺伝子に対して０、１または２（即ち、各対立遺伝子の０、１または２コピー）を有する各動物をコードする(coding)ことを伴う。群れ(herd)−季節−種付け(service)のタイプ及びパリティは固定された効果とした。種雄は任意な効果とした。ＥＳＲ及びＯＰＮは、共可変(covariable)と適合させた。一系統毎のすべてのデータは全くの同胞あるいは半分同胞の家系に関するものであった。１０未満のリッターの第二の遺伝子型を有するＯＰＮ対立遺伝子は、分析から除外した。分析した特性は全出産数（ＴＮＢ）及び生存出産数（ＮＢＡ）であった。上記したような固定された、任意の及びＥＳＲ効果の３モデルを、各系統について行った。１．ＯＰＮを持たないモデル２．すべてのＯＰＮ対立遺伝子を含むモデル３．ＯＰＮ対立遺伝子を個々に含むモデル -2対数尤度(-2log liklihood)を各モデルについて得た。モデルの有意性を、モデル１の尤度(liklihood)からモデル２または３の尤度(liklihood)を引くことにより算出し、結果をカイ自乗分布で比較した。２モデル間の差を自由度（ｄｆ）として使用した。モデル２に関する１系統当たりの有意性及びモデル３の有意な対立遺伝子のレベルを下記表に示す。上記データから以下の結論が引き出せる：１．ＯＰＮでは、Ｌ７０（Ｐ＜０．１０）；Ｌ９３（ＴＮＢ：Ｐ＜０．１０；ＮＢＡ：Ｐ＜０．０５）；及びＬ９４（ＴＮＢ：Ｐ＜０．１０；ＮＢＡ：Ｐ＜０．０５）について、リッターサイズ（ＥＳＲを含む後）の変動量は有意性があった。２．ＯＰＮ対立遺伝子１３２は、Ｌ９３及びＬ９４においてリッターサイズにおいて有意なポジティブな効果を示した。３．他の対立遺伝子ＯＰＮ１２２（Ｌ０７）、ＯＰＮ１１２及びＯＰＮ１５４（Ｌ９３）、さらにはＯＰＮ１２４（Ｌ９４）は、有意なネガティブな効果を示した。実施例３さらなる系統Ｌ０３（他の大きな白色系統(large white based line)）由来のゲノムＤＮＡサンプルを得、分析した。結果は下記表５に示す。１，０１０同腹子の記録を有する４１６匹の動物を分析した。様々な異なるモデルを実験した。すべてのモデルは、農場の分娩月(farm-mont hfarrowed）、パリティ及び種雄の効果を含んだ。ＥＳＲは、すべての分析において共可変(co-variable)として適合させた。分析した特性は全出産数（ＴＮＢ）及び生存出産数（ＮＢＡ）であった。使用したモデルは下記のとおりである：１．全出産数＝分娩月(farrow-month)＋雄種＋ＥＳＲ＋ＯＰＮ対立遺伝子２．ＴＮＢまたはＮＢＡ＝分娩月＋雄種＋ＥＳＲ＋ＯＰＮ１１２＋ＯＰＮ１２２等上記データから、ＯＰＮ１２４は各対立遺伝子のコピーに対して０．７のＴＮＢで有意な（Ｐ＜０．０１）ポジティブな効果を示すことが示される。さらに、ＯＰＮ１４２は、Ｌ０３においてリッターサイズについてネガティブな効果を有する傾向を示し、これと同様の効果がＬ９３において認められた。上述したように、他の遺伝子、ＥＳＲ、は、ブタのリッターサイズに影響を及ぼすことが示され、また、リッターサイズに関連する他の遺伝子もまた将来同定されると考えられる。我々は、ＯＰＮ及びＥＳＲという２種の異なる遺伝子の特定の有用な対立遺伝子の組み合わせがリッターサイズにさらに影響を及ぼすか否かを調べた。上記可能性を試験するために、我々は、リッターサイズとＥＳＲ及びＯＰＮの対立遺伝子の様々な組み合わせとの関連を模索した。結果は下記表４及び５に示すが、これから、ＯＰＮの真に有用な対立遺伝子はＥＳＲの有用な対立遺伝子とポジティブに組み合わすことにより、ＯＰＮ及びＥＳＲ単独の有用な対立遺伝子を使用する際に得られるよりも優れたリッターサイズの特長が得られることが示される。括弧で括ってあるリッターサイズ効果はOPN 132またはESR B=+0.39 の効果を呈する以外はリッターサイズ効果は完全に加算性である (OPN 132 = +0.49；ESR B = +0.34)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年６月３日【補正内容】請求の範囲１．以下の段階からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスタリーニング方法：（ｉ）ブタからゲノムＤＮＡのサンプルを得る；および（ｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、どのオステオポンチン（ＯＰＮ）対立遺伝子が存在するかを決定する。２．段階（ｉｉ）におけるＯＰＮ対立遺伝子の決定がＯＰＮに直接的にあるいは間接的に連結する少なくとも一のＤＮＡマーカーと結合する少なくとも一の対立遺伝子の存在を決定することからなる、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該ＤＮＡマーカーがミクロサテライトである、請求の範囲第２項に記載の方法。４．該ＤＮＡマーカーがＳｗ１０８５、Ｓｗ１９４、Ｓｗ１６、Ｓｗ７９０、Ｓｏ１７８またはＳｗ６１である、請求の範囲第３項に記載の方法。５．ミクロサテライトと結合する領域とハイブリッド形成することが可能な一以上のプライマーをゲノムＤＮＡのサンプルに添加した後、一以上のＰＣＲサイクルを行い、プライマー伸張産物を得る、請求の範囲第４項に記載の方法。６．ゲノムＤＮＡのサンプル中に存在するＯＰＮの一の対立遺伝子または複数の対立遺伝子が１６．以下の段階からなる、ブタのＯＰＮ遺伝子と結合するＤＮＡマーカーに関するどの対立遺伝子がより多くのリッターサイズと関連するかを決定する方法：（ｉ）一以上のブタからゲノムＤＮＡを得る；（ｉｉ）どの対立遺伝子がＯＰＮ遺伝子と結合する特定のＤＮＡマーカーについて存在するかを決定する；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の結果をより多くのリッターサイズを産することが既知の一以上のブタで同様に行われた測定結果と比較する。１７．以下の段階からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング方法：（ｉ）ブタからゲノムＤＮＡのサンプルを得る；（ｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、どのＯＰＮ対立遺伝子が存在するかを決定する；および（ｉｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、ブタのリッターサイズに関連する少なくとも一の他の遺伝子のどの対立遺伝子が存在するかを決定する。１８．該少なくとも一の他の遺伝子がエストロゲンレセプター（ＥＳＲ）遺伝子である、請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．請求の範囲第２から７項のいずれかに記載の一以上の態様によって修飾される請求の範囲第１７項または第１８項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者プラストウ，グラハム，ステュアートイギリス国，ケンブリッジシャイアシービー７５エッチユー，ソハム，ミルコーナー６ (72)発明者サウスウッド，オルウェン，イレーネイギリス国，オックスフォードシャイアオーエックス12 ７イーイー，ウァンテージ，チャールトンハイツ，エルムロード 29

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の段階からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング方法：（ｉ）ブタからゲノムＤＮＡのサンプルを得る；および（ｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、どのＯＰＮ対立遺伝子が存在するかを決定する。２．段階（ｉｉ）におけるＯＰＮ対立遺伝子の決定がＯＰＮに直接的にあるいは間接的に連結する少なくとも一のＤＮＡマーカーと結合する少なくとも一の対立遺伝子の存在を決定することからなる、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該ＤＮＡマーカーがミクロサテライトである、請求の範囲第２項に記載の方法。４．該ＤＮＡマーカーがＳｗ１０８５、Ｓｗ１９４、Ｓｗ１６、Ｓｗ７９０、Ｓｏ１７８またはＳｗ６１である、請求の範囲第３項に記載の方法。５．ミクロサテライトと結合する領域とハイブリッド形成することが可能な一以上のプライマーをゲノムＤＮＡのサンプルに添加した後、一以上のＰＣＲサイクルを行い、プライマー伸張産物を得る、請求の範囲第４項に記載の方法。６．ゲノムＤＮＡのサンプル中に存在するＯＰＮの一の対立遺伝子または複数の対立遺伝子がプライマー伸張産物の長さを参照することにより決定される、請求の範囲第５項に記載の方法。７．一以上の下記プライマーを使用する、請求の範囲第５項または第６項に記載の方法：ＧＣＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡ；ＣＣＡＡＴＣＣＴＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣ；ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣ；またはＣＡＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＣ。８．以下の段階からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング方法：（ｉ）ブタからゲノムＤＮＡのサンプルを得る；（ｉｉ）（ｉ）のゲノムＤＮＡを一またはそれ以上の適当なプライマーとハイブリッド形成させる；（ｉｉｉ）（ｉｉ）のハイブリッド形成した核酸を用いて一回またはそれ以上のＰＣＲサイクルを行う；および（ｉｖ）（ｉｉｉ）で得られたＰＣＲ産物の長さを分析する。９．請求の範囲第２から４項の一以上の態様によって修飾される請求の範囲第８項に記載の方法。１０．一以上の下記プライマーを使用する、請求の範囲第９項に記載の方法：ＧＣＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡ；ＣＣＡＡＴＣＣＴＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣ；ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣ；またはＣＡＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＣ。１１．ブタのゲノムＤＮＡのサンプルにおいてＯＰＮ対立遺伝子を同定できる一以上の試薬または材料からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング用キット。１２．ＯＰＮ遺伝子に連結されるＤＮＡマーカーと結合する対立遺伝子を同定できる試薬または材料からなる、請求の範囲第１１項に記載のキット。１３．該ＤＮＡマーカーがミクロサテライトであり、該キットがミクロサテライトと結合するゲノムＤＮＡの領域にハイブリッド形成できる一以上のＤＮＡプライマーからなる、請求の範囲第１２項に記載のキット。１４．一以上の下記プライマーを含ませる、請求の範囲第１３項に記載のキット：ＧＣＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴＡＡ；ＣＣＡＡＴＣＣＴＡＴＴＣＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣ；ＧＴＧＴＣＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＧＣ；またはＣＡＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＴＣＣＣＡＣ。１５．標準的なＰＣＲ試薬を含む、請求の範囲第１３項または第１４項に記載のキット。１６．以下の段階からなる、ブタのＯＰＮ遺伝子と結合するＤＮＡマーカーに関するどの対立遺伝子がより多くのリッターサイズと関連するかを決定する方法：（ｉ）一以上のブタからゲノムＤＮＡを得る；（ｉｉ）どの対立遺伝子がＯＰＮ遺伝子と結合する特定のＤＮＡマーカーについて存在するかを決定する；（ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の結果をより多くのリッターサイズを産することが既知の一以上のブタで同様に行われた測定結果と比較する。１７．以下の段階からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング方法：（ｉ）ブタからゲノムＤＮＡのサンプルを得る；（ｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、どのＯＰＮ対立遺伝子が存在するかを決定する；および（ｉｉｉ）（ｉ）で得られたゲノムＤＮＡを分析して、ブタのリッターサイズに関連する少なくとも一の他の遺伝子のどの対立遺伝子が存在するかを決定する。１８．該少なくとも一の他の遺伝子がＥＳＲである、請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．請求の範囲第２から７項のいずれかに記載の一以上の態様によって修飾される請求の範囲第１７項または第１８項に記載の方法。２０．ブタのゲノムＤＮＡのサンプルにおいてＯＰＮ対立遺伝子を同定できる一以上の試薬または材料、およびブタのゲノムＤＮＡのサンプルにおけるブタのリッターサイズに関連する少なくとも一の他の遺伝子の対立遺伝子を同定できる一以上の試薬または材料からなる、より多くの同腹子を産するとより考えられるブタ、および／またはより同腹子を産するとはあまり考えられないブタを決定するためのブタのスクリーニング用キット。２１．該少なくとも一の他の遺伝子がＥＳＲである、請求の範囲第２０項に記載のキット。２２．請求の範囲第１２から１５項のいずれかに記載の一以上の態様によって修飾される請求の範囲第２０項または第２１項に記載のキット。