JPH11507501A

JPH11507501A - ヒトｇタンパク質レセプターｈｇｂｅｒ３２

Info

Publication number: JPH11507501A
Application number: JP9500357A
Authority: JP
Inventors: アール．ソペット，ダニエル; リ，イ; エイ．ローゼン，クレイグ; エム．ルーベン，スティーブン
Original assignee: ヒューマンジノームサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1995-06-05
Publication date: 1999-07-06
Also published as: EP0832125A4; AU2766395A; CA2221274A1; EP0832125A1; US5776729A; WO1996039434A1

Abstract

(57)【要約】ヒトＧタンパク質共役型レセプターポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするDNA(RNA)、ならびに組換え技術によりこのようなポリペプチドを産生するための手順を開示する。このようなポリペプチドを利用して、このようなポリペプチドに対するアンタゴニストおよびアゴニストを同定するための方法、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストを治療的に用いて、Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチドの過小発現および過剰発現のそれぞれに関する症状を処置するための方法もまた開示する。Ｇタンパク質共役型レセプター核酸配列中の変異を検出するための診断方法および可溶性形態のレセプターの改変されたレベルを検出するための診断方法もまた開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトＧタンパク質レセプターHGBER32 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、このようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用、ならびにこのようなポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に関する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、ヒトの７-膜貫通型レセプターである。この膜貫通レセプターは、Ｇタンパク質共役型レセプターである。より詳細には、この７-膜貫通型レセプターはＧタンパク質ケモカインレセプターとして推定的に同定され、時々本明細書中以下で「HGBER32」といわれる。本発明はまた、このようなポリペプチドの作用を阻害することに関する。多数の医学的に重要な生物学的プロセスが、Ｇタンパク質および/またはセカンドメッセンジャー（例えば、cAMP）を含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質により媒介されることは、十分に確立されている（Lefkowitz，Nature，351 :353-354(1991)）。本明細書中では、これらのタンパク質を、Ｇタンパク質を用いた経路に関与するタンパク質またはPPGタンパク質という。これらのタンパク質のいくつかの例としては、GPCレセプター（例えば、アドレナリン作用性薬剤およびドーパミンに対するGPCレセプター(Kobilka，B.K.ら，PNAS，84:46-50(19 87)；Kobilka，B.K.ら，Science，238:650-656(1987)；Bunzow，J.R.ら，Nature ，336:783-787(1988))）、Ｇタンパク質それ自体、エフェクタータンパク質（例えば、ホスホリパーゼＣ、アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ）、ならびにアクチュエータータンパク質（actuator protein）（例えば、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）(Simon，M.I.ら，Science, 252:8 02-8(1991))が挙げられる。例えば、シグナル伝達の１つの形態では、ホルモン結合の効果は、細胞内における酵素アデニル酸シクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化は、ヌクレオチドGTPの存在に依存し、そしてGTPはまた、ホルモン結合に影響を与える。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターをアデニル酸シクラーゼに連結させる。Ｇタンパク質は、ホルモンレセプターにより活性化されると、GTPを結合型GDPに変換することが示された。次いで、GTPを有する形態は、活性化されたアデニル酸シクラーゼに結合する。GTPのGDPへの加水分解は、Ｇタンパク質それ自体により触媒され、Ｇタンパク質を基底の不活性な形態に戻す。従って、Ｇタンパク質は、シグナルをレセプターからエフェクターに中継する中間物として、およびシグナルの持続時間を制御する時計としての２つの役割を果たす。Ｇタンパク質共役型レセプターの膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫通ドメインを有するものとして特徴づけられている。これらのドメインは、細胞外または細胞質ループにより結合された膜貫通αヘリックスを表すと考えられる。Ｇタンパク質共役型レセプターは、ホルモン、ウイルス、増殖因子、および神経レセプターのような広範囲の生物学的に活性なレセプターを含む。Ｇタンパク質共役型レセプターは、少なくとも８つの分岐した親水性ループを結合する、約20〜30アミノ酸のこれらの７つの保存された疎水性の範囲を含むものとして特徴づけられている。結合レセプターのＧタンパク質ファミリーとして、ドーパミンレセプターが挙げられる。これは、精神病的および神経学的障害を処置するために使用される神経弛緩性薬物に結合する。このファミリーのメンバーの他の例としては、カルシトニン、アドレナリン作用性、エンドセリン、cAMP 、アデノシン、ムスカリン様、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子-１レセプターおよびロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルスレセプターなどが挙げられる。大部分のＧタンパク質共役型レセプターは、機能的なタンパク質構造を安定化させると考えられるジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ループの各々に単一の保存されたシステイン残基を有する。７つの膜貫通領域はTM1、TM2、 TM3、TM4、TM5、TM6、およびTM7と命名されている。TM3（TM3とTM4との間の細胞内ループ）はまたシグナル伝達に関連付けられている。システイン残基のリン酸化および脂質化(パルミチル化またはファルネシル化) は、いくつかのＧタンパク質共役型レセプターのシグナル伝達に影響を与え得る。大部分のＧタンパク質共役型レセプターは、第３の細胞質ループおよび/ またはカルボキシ末端内に潜在的なリン酸化部位を含有する。いくつかのＧタンパク質共役型レセプター（例えば、β−アドレノレセプター）について、プロテインキナーゼＡおよび/または特異的なレセプターキナーゼによるリン酸化は、レセプター脱感作を媒介する。Ｇタンパク質共役型レセプターのリガンド結合部位は、いくつかのＧタンパク質共役型レセプター膜貫通ドメインにより形成される親水性受口(socket)を含有すると考えられ、この受口はＧタンパク質共役型レセプターの疎水性Ｇ残基により囲まれている。各Ｇタンパク質共役型レセプター膜貫通ヘリックスの疎水性側は内側に向いており、そして極性リガンド結合部位を形成すると仮定されている。TM3は、リガンド結合部位（例えば、TM3のアスパラギン酸残基を含む）を有するとして、いくつかのＧタンパク質共役型レセプターにおいて関連付けられている。さらに、TM5のセリン、TM6のアスパラギン、およびTM6のまたはTM7のフェニルアラニンまたはチロシンはまた、リガンド結合に関連する。さらに、細胞外親水性ドメインはまた、リガンド結合において役割を果たすことが示されている。Ｇタンパク質共役型レセプターは、ヘテロ三量体のＧタンパク質により種々の細胞内の酵素、イオンチャンネル、およびトランスポーターに細胞内で共役し得る（Johnsonら、Endoc.,Rev.,10:317-331(1989)を参照のこと）。異なるＧタンパク質のαサブユニットは、細胞内で種々の生物学的機能を調節するための特定のエフェクターを優先的に刺激する。Ｇタンパク質共役型レセプターの細胞質残基のリン酸化は、いくつかのＧタンパク質共役型レセプターのＧタンパク質共役の調節のための重要な機構として同定されている。Ｇタンパク質共役型レセプターは、哺乳動物宿主内の多数の部位において見出されている。本発明の１つの局面によれば、Ｇ新規のポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なフラグメントおよび誘導体が提供される。本発明のポリペプチドはヒト起源である。本発明の別の局面によれば、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供され、この核酸分子は、mRNA、DNA、cDNA、ゲノムDNA、ならびにそれらのアンチセンスアナログ、および生物学的に活性で、かつ診断または治療に有用なそれらのフラグメントを含む。本発明のさらなる局面によれば、前記ポリペプチドの発現およびその後の前記ポリペプチドの回収を促進する条件下で、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え原核生物宿主細胞および/または真核生物宿主細胞を培養する工程を包含する組換え技術によって、このようなポリペプチドを産生するためのプロセスが提供される。本発明のなおさらなる局面によれば、このようなポリペプチドに対する抗体が提供される。本発明の別の局面によれば、本発明のレセプターポリペプチドに結合して活性化するかまたは活性化を阻害する化合物、およびレセプターリガンドのスクリーニング方法が提供される。本発明のなお別の実施態様によれば、Ｇタンパク質共役型レセプターの過小発現に関する状態の処置のために、本発明のレセプターポリペプチドを刺激するためのこのような活性化合物を使用するプロセスが提供される。本発明の別の局面によれば、Ｇタンパク質共役型レセプターの過剰発現に関する状態を処置するために、このような阻害化合物を用いるプロセスが提供される。本発明のなお別の局面によれば、レセプターがＧタンパク質共役型レセプターのリガンドを結合し得るような、本発明のＧタンパク質共役型レセプターの少なくとも１つの膜貫通ドメインの、フラグメント、コンセンサスフラグメント、および／または保存されたアミノ酸置換を有する配列である、あるいはＧタンパク質共役型レセプターのリガンド結合を、量的にまたは質的に調節もし得る非天然、合成、単離、および／または組換えＧタンパク質共役型レセプターが提供される。本発明のなお別の局面によれば、合成または組換えＧタンパク質共役型レセプターポリペプチド、それらの保存的置換体および誘導体、抗体、抗イディオタイプ抗体、それらの予期される生物学的特性により、リガンドとの結合によるかまたはリガンド結合を調節することによってＧタンパク質共役型レセプター機能の潜在的なモジュレーターとして有用であり得る組成物および方法が提供され、これらは診断、治療、および/または研究応用に使用され得る。本発明のなお別の目的は、レセプタータイプおよびサブタイプとして、種々のＧタンパク質共役型レセプターまたはそれらのフラグメントを阻害または模倣するように設計された、合成、単離または組換えポリペプチドを提供することである。本発明のなおさらなる局面によれば、本発明の核酸配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含有する診断プローブも提供される。本発明のなお別の目的によれば、本発明の核酸配列中の変異に関連する疾患または疾患に対する罹患性を検出するための診断アッセイが提供される。本発明のこれらおよび他の局面は、本明細書中の教示から当業者に明らかであるはずである。以下の図面は、本発明の実施態様の例示であり、そして請求の範囲により包囲されるような本発明の範囲を限定することを意味しない。図１は、本発明のHGBER32 Ｇタンパク質共役型レセプターのcDNA配列（配列番号１）および対応する推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。アミノ酸の標準１文字略語を使用する。図２は、HGBER332 Ｇタンパク質共役型レセプターの２次構造の特徴を示す。最初の７つの図はαヘリックス、βシート、ターン領域、またはコイル領域であるアミノ酸配列の領域を記載する。黒四角の範囲は示された領域に対応する領域である。第２連の図は細胞内、細胞質または膜貫通の範囲に曝されているアミノ酸配列の範囲を示す。親水性プロットは膜の脂質二重層である（従って疎水性である）タンパク質配列の領域および親水性である脂質二重層の外側の領域を示す。抗原性領域は脂質二重層膜の外側の領域であり、そして抗原が結合し得る範囲であるので、抗原性のインデックスは親水性プロットに対応する。表面確立プロットは抗原性インデックスおよび親水性プロットにさらに対応する。両親媒性プロットは極性および非極性であるタンパク質配列の領域を示す。第２連の図に対応する可撓性領域は、膜の外側が可撓性領域であり、そして膜貫通領域が非可撓性領域であることを意味する。図３は、アミノ酸６で始まる本発明のＧタンパク質共役型レセプター（HGBER3 2）と、アミノ酸40で始まるヒト単核球ケモアトラクタント(chemoattractant)タンパク質１レセプター（MCP-1b）（配列番号３）とのアミノ酸アラインメントを示す。線の符合は同一アミノ酸を示し（40.401％）、そして点の符合は類似アミノ酸を示す(64.470％)。図４はHGBER32の予想される膜貫通ドメインを示す。本発明の１つの局面によれば、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドをコードする、または1995年６月１付けのATCC受託番号第のような寄託されたクローンのcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。本発明のポリヌクレオチドは、ヒト胆嚢組織由来のcDNAライブラリーで発見された。これは構造的にＧタンパク質共役型レセプターファミリーに関連する。これは、355アミノ酸残基の成熟タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。このタンパク質は、ヒト単核球ケモアトラクタントタンパク質１レセプター(MCP-1b)に最約40％の同一性および約64％の類似性で最も高い程度の相同性を示す。本発明のポリヌクレオチドは、RNAの形態またはDNA（このDNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含む）の形態であり得る。DNAは二本鎖または一本鎖であり得、そして一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列と同一であり得るか、あるいはそのコード配列が、遺伝コードの重複または縮重の結果として、図１（配列番号１）のDNAまたは寄託したcDNAと同じ成熟ポリペプチドをコードする異なるコード配列であり得る。図１（配列番号２）の成熟ポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を含み得る：成熟ポリペプチドのコード配列のみ；成熟ポリペプチドのコード配列（および必要に応じてさらなるコード配列）および非コード配列（例えば、イントロンあるいは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および/または3'非コード配列）。従って、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄託したクローンのcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体をコードする本明細書中上記のポリヌクレオチドの改変体に関する。ポリヌクレオチドの改変体は、ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子改変体またはポリヌクレオチドの天然に存在しない改変体であり得る。従って、本発明は、図１（配列番号２）に示すものと同じ成熟ポリペプチド、または寄託したクローンのcDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドの改変体を含む。この改変体は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したクローンの cDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログをコードする。このようなヌクレオチド改変体は、欠失改変体、置換改変体、および付加または挿入改変体を含む。本明細書中上記で示したように、ポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）に示すコード配列または寄託したクローンのコード配列の天然に存在する対立遺伝子改変体であるコード配列を有し得る。当該分野で公知なように、対立遺伝子改変体は、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、または付加を有し得るポリヌクレオチド配列の別の形態であり、これはコードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない。ポリヌクレオチドはまた、本発明の全長ポリペプチドのTMおよび細胞内ドメインから切断されたポリペプチドの細胞外部分である本発明のレセプターポリペプチドの可溶性形態をコードし得る。本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有し得る。マーカー配列は、細菌宿主の場合には、マーカーに融合された成熟ポリペプチドの精製を提供する、pQE-9ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグであり得る。あるいは、例えばマーカー配列は、哺乳動物宿主（例えば、COS-7細胞）が使用される場合は、赤血球凝集素（HA）タグであり得る。HAタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープと一致する（Wilson，I.ら、Cell，37 :767(1984)）。本発明はさらに、配列間に少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、およびより好ましくは少なくとも95％の同一性が存在する場合、本明細書中上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、本明細書中上記のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で用いられる用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、配列間に少なくとも95％、そして好ましくは少なくとも97％の同一性が存在する場合のみに生じることを意味する。好ましい実施態様において、本明細書中上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）のcDNAまたは寄託したcDNAによりコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性のいずれかを保持する（すなわち、例えば、セカンドメッセンジャー応答を誘発することにより、膜結合レセプターポリペプチドとして機能しないポリペプチドを介するレセプターに対するリガンドの結合能力を保持することによる可溶性のレセプターポリペプチドとしての機能）ポリペプチドをコードする。あるいは、このポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズし、本明細書中上記したように、それに対して同一性を有し、そして活性を保持していない、少なくとも20塩基、好ましくは少なくとも30塩基、そしてより好ましくは少なくとも50塩基を有し得る。そのようなポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドのための、例えばこのポリヌクレオチドの回収のための、プローブ、または診断プローブ、またはPCRプライマーとして用いられ得る。本明細書中でいう寄託物（単数または複数）は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下に維持される。これらの寄託物は、当業者に対する便宜として提供されるにすぎず、そして米国特許法第112条の下で寄託が必要とされることを認めたわけではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配列、ならびにそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書中に参考として援用され、そして本明細書中の配列の任意の記載とのいかなる矛盾も抑えている。寄託物を製造し、使用し、または販売するためには実施許諾が必要とされ得、そしてそのような実施許諾はこれによって与えられるわけではない。本発明はさらに、図１（配列番号２）の推定のアミノ酸配列を有するか、または寄託したcDNAによりコードされるアミノ酸配列を有するＧタンパク質共役型レセプターポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体に関する。用語「フラグメント」、「誘導体」、および「アナログ」は、図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドをいう場合、このようなポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性（すなわち、Ｇタンパク質共役型レセプターとしての機能）を保持するか、あるいは、ポリペプチドがＧタンパク質共役型レセプター（例えば、このレセプターの可溶型）として機能しないとしても、リガンドまたはレセプターに結合する能力を保持するか、のいずれかであるポリペプチドを意味する。アナログは、プロタンパク質部分の切断により活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成し得るプロタンパク質を含む。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然のポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得、好ましくは組換えポリペプチドであり得る。図１（配列番号２）のポリペプチドまたは寄託したcDNAによりコードされるポリペプチドのフラグメント、誘導体、またはアナログは、(i)１つ以上のアミノ酸残基が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、そしてこのような置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによりコードされ得るアミノ酸残基であってもよく、またはそうでなくてもよいもの、あるいは(ii)１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含有するもの、あるいは(iii )成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させるような別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合されているもの、あるいは(iv)さらなるアミノ酸が、成熟ポリペプチドの精製のために使用される成熟ポリペプチドに融合されているもの、または(v)ポリペプチドのフラグメントが可溶（すなわち、膜に結合しないが、膜結合型レセプターに対するリガンドには結合する）であり得る。このようなフラグメント、誘導体およびアナログは、本明細書中の教示から、当業者の範囲内にあると考えられる。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好ましくは均質に精製される。本発明のポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）ならびに少なくとも70％の類似性（好ましくは少なくとも70％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そしてより好ましくは少なくとも90％の類似性（より好ましくは少なくとも90％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有し、そしてなおより好ましくは少なくとも95％の類似性（なおより好ましくは少なくとも95％の同一性）を配列番号２のポリペプチドに対して有するポリペプチドを含み、そしてまた一般に少なくとも30％のアミノ酸およびより好ましくは少なくとも50アミノ酸を含むこのようなポリペプチドの部分を有するこのようなポリペプチドの部分を含む。当該分野で公知なように、２つのポリペプチド間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。本発明のポリペプチドのフラグメントまたは部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用され得る。用語「単離された」は、物質がその本来の環境（例えば、天然に存在する場合は、天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物の中に存在する天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然の系において共存する物質の幾らかまたは全てから分離されている同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてそのようなベクターまたは組成物はその天然の環境の一部ではないため、なお単離され得る。用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するDNAのセグメントを意味する；これは、コード領域の前および後（リーダーおよびトレイラー）の領域ならびに個々のコードセグメント（エクソン）の間の介在配列（イントロン）を含む。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子操作される宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。宿主細胞は、本発明のベクター（これは、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得る）を用いて遺伝子操作される（形質導入されるか、または形質転換されるか、またはトランスフェクトされる）。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であり得る。操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化するか、形質転換体を選択するか、またはＧタンパク質共役型レセプター遺伝子を増幅するために適切に改変した従来の栄養培地中において培養され得る。培養条件（例えば、温度、pHなど）は、発現のために選択される宿主細胞に以前使用された条件であり、そして当業者には明らかである。本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するために用いられ得る。従って、例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体DNA配列、非染色体DNA配列、および合成DNA配列を包含する。このようなベクターは、例えば、SV40の誘導体；細菌性プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター、ウイルスDNA（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病）である。しかし、宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、他の任意のベクターも使用され得る。適切なDNA配列は、種々の手順によりベクターに挿入され得る。一般に、DNA配列は、当該分野で公知の手順により適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順および他の手順は、当業者の範囲内であると考えられる。発現ベクター中のDNA配列は、適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結され、mRNAの合成を指示する。このようなプロモーターの代表的な例としては、以下が挙げられ得る：LTRまたはSV40プロモーター、E.coli lacまたはt rp 、λファージP_Lプロモーター、および原核生物細胞または真核生物細胞あるいはそのウイルス内で遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含有する。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含有し得る。さらに、発現ベクターは、好ましくは、形質転換された宿主細胞の選択のための表現型特性（例えば、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、あるいは例えばE.coliにおけるテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）を提供する１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有する。本明細書中上記のような適切なDNA配列ならびに適切なプロモーター配列または制御配列を含有するベクターは、適切な宿主を形質転換して宿主にタンパク質を発現させるために用いられ得る。適切な宿主の代表的な例としては、以下が挙げられ得る：細菌細胞（例えば、E.coli 、Streptomyces、Salmonella typhimurium）；真菌細胞（例えば酵母）；昆虫細胞（例えば、Drosophila S2およびSpodoptera Sf9）；動物細胞（例えば、CHO、COSまたはBowes黒色腫）；アデノウイルス；植物細胞など。適切な宿主の選択は、本明細書中の教示から当業者の範囲内であると考えられる。さらに詳細には、本発明はまた、上記で広範に記載した１つ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、ベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）を包含し、このベクターの中に、本発明の配列が正方向または逆方向に挿入されている。この実施態様の好ましい局面において、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーターを包含する）を含む。非常に多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者には公知であり、そして購入可能である。以下のベクターが例として提供される。細菌性：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pblues cript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；pTRC99a、pKK 223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)。真核性：pWLNEO、pSV2CAT、pOG4 4、pXT1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。しかし、他の任意のプラスミドまたはベクターも、それらが宿主において複製可能で、かつ存続可能である限り、使用され得る。プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択され得る。２つの適切なベクターは、PKK232-8およびpCM7である。特によく知られた細菌性プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_Lおよびtrpを包含する。真核生物プロモーターは、CMV即時型、HSVチミジンキナーゼ、初期SV40および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネインＩを包含する。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。さらなる実施態様では、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞）または下等真核生物細胞（例えば、酵母細胞）であり得るか、あるいは宿主細胞は原核生物細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション、またはエレクトロポレーションにより達成され得る(Davis,L.，Dibner,M.，Battey,I.，B asic Methods in Molecular Biology,(1986))。宿主細胞中の構築物を用いて、従来の方法で組換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生し得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、従来のペプチド合成機により合成的に産生され得る。本発明のポリペプチドのフラグメントは、ペプチド合成により、対応する全長ポリペプチドを産生するために使用され得る。従って、このフラグメントは、全長ポリペプチドを産生するための中間体として使用され得る。本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、本発明の全長ポリペプチドを合成するために、同様の方法で用いられ得る。成熟タンパク質は、哺乳動物細胞、酵母、細菌、または他の細胞中で適切なプロモーターの制御下で発現され得る。無細胞翻訳系もまた、本発明のDNA構築物に由来するRNAを使用して、このようなタンパク質を産生するために用いられ得る。原核生物宿主および真核生物宿主で使用される適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ，第２版，Cold Spring Harbor,N.Y.，（1989）（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。本発明のポリペプチドをコードするDNAの高等真核生物による転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増大される。エンハンサーはDNAのシス作用エレメントであり、通常は約10〜約300bpであり、これはプロモーターに作用してその転写を増大させる。例として、複製起点のbp100〜270の後期側の SV40エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー（例えば、E.coliのアンピシリン耐性遺伝子およびS.cerevisi ae のTRP1遺伝子）、ならびに下流の構造配列の転写を指示する高発現遺伝子由来のプロモーターを含有する。このようなプロモーターは、中でも解糖酵素（例えば、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)）、α因子、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などをコードするオペロンに由来し得る。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終止配列と適切な相内で組立てられる。必要に応じて、異種配列は、所望の特徴（例えば、発現された組換え産物の安定化または簡略化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。細菌の使用に有用な発現ベクターは、機能的なプロモーターと作動可能な読み取り相で、適切な翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルと共に所望のタンパク質をコードする構造DNA配列を挿入することにより構築される。ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー、およびベクターの維持を確実にし、かつ所望される場合は宿主内での増幅を提供するための複製起点を含有する。形質転換のために適切な原核生物宿主は、E.coli、Bacillus subtilis、Salmonella typhimur ium 、ならびにPseudomonas属、Streptomyces属、およびStaphylococcus属内の種々の種を包含するが、他の種もまた選択対象として用いられ得る。代表的な、しかし限定しない例として、細菌の使用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含む市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌性の複製起点を含有し得る。このような市販のベクターは、例えば、pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Upp sala，Sweden)およびGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)を含む。これらのpBR322「骨格」部分は、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組み合わされる。適切な宿主株の形質転換および適切な細胞密度までの宿主株の増殖に続いて、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により誘導され、そして細胞はさらなる期間培養される。細胞は、代表的には遠心分離により収集され、物理的手段または化学的手段により破砕され、そして得られた粗抽出物はさらなる精製のために保持される。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用を包含する任意の便利な方法により破砕され得る。このような方法は当業者に周知である。種々の哺乳動物細胞の培養系もまた、組換えタンパク質を発現するために用いられ得る。哺乳動物発現系の例には、Gluzman，Cell，23: 175(1981)に記載されるサル腎臓線維芽細胞のCOS-7株、および適合性のベクターを発現し得る他の細胞株（例えば、C127、3T3、CHO、HeLa、およびBHK細胞株）が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終結配列、および５'フランキング非転写配列をまた含有する。SV40スプライス部位、およびポリアデニル化部位に由来するDNA配列は、必要な非転写遺伝的エレメントを提供するために使用され得る。本発明のＧタンパク質共役型レセプターポリペプチドは、以下を含む方法により組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー。必要に応じて、タンパク質の再折りたたみ（refo lding）工程が、成熟タンパク質の配置を完全にするために使用され得る。最終的に、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が、最終的な精製工程に用いられ得る。本発明のポリペプチドは、天然の精製された産物、または化学合成手順の産物であり得るか、あるいは原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、培養物中の細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞）から組換え技術により産生され得る。組換え産生手順に用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化されないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。全長Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子のフラグメントは、全長遺伝子を単離し、そしてこの遺伝子に対して高い配列類似性または類似した生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するために、cDNAライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、少なくとも20塩基、好ましくは30塩基、および最も好ましくは50塩基以上を有するを有する。プローブはまた、全長の転写物に対応するcDNAクローンおよびゲノムクローン、または調節およびプロモーター領域、エキソン、ならびにイントロンを含む完全Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子を含有するクローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの例として、既知のDNA配列を使用し、オリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、Ｇタンパク質共役型レセプター遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子の配列と配列相補性を有する標識されたオリゴヌクレオチドは、ヒトcDNA、ゲノムDNA、またはmRNAのライブラリーをスクリーニングするために使用され、ライブラリーのどのメンバーがプローブとハイブリダイズするかを決定する。本発明のＧタンパク質共役型レセプターは、本発明のレセプターポリペプチドを活性化する化合物（アゴニスト）または活性化を阻害する化合物（アンタゴニスト）のスクリーニングのためのプロセスにおいて使用され得る。一般的に、このようなスクリーニング手順は、その表面で本発明レセプターポリペプチドを発現する適切な細胞を提供することを含む。このような細胞は、哺乳動物、酵母、Drosophila、またはE．coli由来の細胞を含む。特に、本発明のレセプターをコードするポリヌクレオチドは、細胞をトランスフェクトし、それにより、Ｇタンパク質共役型レセプターを発現させるのに用いられる。次いで発現させたレセプターを、試験化合物と接触させ、結合、機能的応答の刺激または阻害を観察する。１つのこのようなスクリーニング手順は、本発明のＧタンパク質共役型レセプターを発現するためにトランスフェクトされるメラニン保有細胞の使用を含む。このようなスクリーニング技術は、PCT WO 92/01810（1992年２月６日公開）に記載されている。従って、例えば、このようなアッセイは、レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物の両方と、レセプターをコードするメラニン保有細胞とを接触させることにより、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物をスクリーニングするために使用され得る。リガンドにより生じるシグナルの阻害は、化合物がこのレセプターの潜在的なアンタゴニストであること、すなわち、レセプターの活性化を阻害することを示す。このスクリーニングは、このような細胞とスクリーニングされるべき化合物とを接触させ、そしてそのような化合物がシグナルを生じる、すなわち、このような化合物がレセプターを活性化するか否かを決定することにより、レセプターを活性化する化合物を決定するために用いられ得る。他のスクリーニング技術は、例えば、Science、第246巻、181〜296頁（1989年 10月）に記載されるように、レセプターの活性化により引き起こされる細胞外の pH変化を測定する系における、Ｇタンパク質共役型レセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトCHO細胞）の使用を含む。例えば、化合物が、本発明のレセプターポリペプチドを発現する細胞と接触され得、そしてセカンドメッセンジャー応答（例えば、シグナル伝達またはpH変化）が、潜在的化合物がレセプターを活性化するかまたは阻害するかのを決定するために測定され得る。別のこのようなスクリーニング技術は、Ｇタンパク質共役型レセプターをコードするRNAをXenopus卵母細胞に導入し、一時的にレセプターを発現させることを含む。次いでそのレセプター卵母細胞を、レセプターリガンドおよびスクリーニングされるべき化合物と接触し得、続いてレセプターの活性化を阻害すると考えられる化合物をスクリーニングする場合、カルシウムシグナルの阻害または活性化を検出し得る。別のスクリーニング技術は、そのレセプターがホスホリパーゼＣまたはＤと共役しているＧタンパク質共役型レセプターの発現を包含する。このような細胞の代表例としては、内皮細胞、平滑筋細胞、胎児腎細胞などが挙げられ得る。スクリーニングは、本明細書中上記のように、レセプターの活性化、またはホスホリパーゼの２次シグナルに由来するレセプターの活性化の阻害の検出により達成され得る。別の方法は、細胞表面にレセプターを有する細胞への標識リガンドの結合の阻害を決定することによる、本発明のアンタゴニストのレセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物のスクリーニングを包含する。このような方法は、細胞がその表面にレセプターを発現するようにＧタンパク質共役型レセプターをコードするDNAで真核細胞をトランスフェクトする工程、および標識形態の公知のリガンドの存在下で細胞と化合物とを接触させる工程を包含する。リガンドは、例えば、放射能により標識され得る。レセプターに結合する標識リガンドの量は、例えば、レセプターの放射能の測定により測定される。レセプターに結合する標識リガンドの減少により決定されるように化合物がレセプターに結合する場合、標識リガンドのレセプターへの結合は阻害される。Ｇタンパク質共役型レセプターは哺乳動物宿主内に偏在し、そして多くの病状を包含する、多くの生物学的機能を担う。従って、一方でＧタンパク質共役型レセプターを刺激し、他方でＧタンパク質共役型レセプターの機能を阻害し得る化合物および薬物を見出すことが望ましい。例えば、Ｇタンパク質共役型レセプターを活性化する化合物は、喘息、パーキンソン病、急性心疾患、低血圧、尿閉、骨粗鬆症の処置のような、治療目的のために使用され得る。一般に、Ｇタンパク質共役型レセプターの活性化を阻害する化合物は、例えば、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大、および精神病性ならびに神経学的疾患（精神***病、躁病性興奮、うつ病、せん妄、痴呆または重篤な精神遅滞、ハンチントン病あるいはジル・ド・ラ・ツレット(G illes dila Tourett's)症候群のようなジスキネジー）の処置のための、種々の治療目的のために使用され得る。Ｇタンパク質共役型レセプターを阻害する化合物はまた、内因性の食欲不振を逆転させることおよび病的飢餓の制御に有用となっている。抗体は、本発明のＧタンパク質共役型レセプターまたはある場合はオリゴペプチドをアンタゴナイズし得る。これは、Ｇタンパク質共役型レセプターに結合するが、セカンドメッセンジャーの応答を誘発せず、従ってＧタンパク質共役型レセプターの活性化を妨げる。抗体は、一般に抗体の抗原結合部位と会合する独特の決定基を認識する抗イディオタイプ抗体を含む。潜在的なアンタゴニスト化合物はまた、Ｇタンパク質共役型レセプターのリガンドに密接に関連するタンパク質、すなわち、リガンドのフラグメントを含む。それは、生物学的機能を欠失しており、そしてＧタンパク質共役型レセプターに結合する際にいかなる応答も誘発しない。アンチセンス技術の使用を介して調製されたアンチセンス構築物は、３重らせん形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAを介して遺伝子発現を制御するために用いられ得る。これらの両方法はポリヌクレオチドのDNAまたはRNAへの結合に基づく。例えば、ポリヌクレオチド配列の５’コード部分（本発明の成熟ポリペプチドをコードする）は、約10〜40塩基対の長さのアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計するために用いられる。DNAオリゴヌクレオチドは転写に関する遺伝子の領域に相補的であり（３重らせん、Leeら、Nucl.Acids Res.,6:3073(1979 )；Cooneyら、science、241:456(1988)；およびDervanら、Science、251:1360(1 991)を参照のこと）、それによりＧタンパク質共役型レセプターの転写および産生を妨げるように設計される。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリダイズし、そしてＧタンパク質共役型レセプターへのmRNA分子の翻訳をブロックする(アンチセンス、Okano、J.Neurochem.、56:560(1991)；遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとしてのオリゴデオキシヌクレオチド、CR C Press、Boca Raton、FL(1988))。上記のオリゴヌクレオチドはまた細胞へ送達され得、その結果アンチセンスRNAまたはDNAはＧタンパク質共役型レセプターの産生を阻害するためにインビボで発現され得る。Ｇタンパク質共役型レセプターに結合する低分子は、Ｇタンパク質共役型レセプターをリガンドに接近しにくくし、その結果正常な生物学的活性が妨げられる。例えば、小ペプチドまたはペプチド様分子もまた、本発明のレセプターポリペプチドの活性化を阻害するために用いられ得る。Ｇタンパク質共役型レセプターの可溶性形態（例えば、レセプターのフラグメント）は、本発明のポリペプチドに対するリガンドに結合することによりおよびリガンドが膜結合型Ｇタンパク質共役型レセプターと相互作用することを妨げることによってレセプターの活性化を阻害するために用いられ得る。本発明はさらに、過度のＧタンパク質共役型レセプター活性に関連する異常な状態を処置するための方法を提供する。この方法は、Ｇタンパク質共役型レセプターへのリガンドの結合をブロックすることまたは第２のシグナルを阻害することにより活性化を阻害するために有効量な量で、薬学的に受容可能なキャリアとともに上記のようなインヒビター化合物を被検体に投与する工程、およびそれによって異常な状態を緩和する工程を包含する。本発明はまたＧタンパク質共役型レセプター活性の過小発現に関連する異常な状態を処置するための方法を提供する。この方法は、本発明のレセプターポリペプチドを活性化する化合物の治療的有効量を、上記のように薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて被検体に投与して、それによって異常な状態を緩和する工程を包含する。可溶性形態のＧタンパク質共役型レセプター、およびこのようなレセプターを活性化するまたは阻害する化合物は、適切な薬学的キャリアと組み合わせて用いられ得る。このような組成物は、治療的有効量のポリペプチドまたは化合物、および薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。このようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。処方は、投与の態様に合わせるべきである。本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。このような容器（単数または複数）に関して、薬剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する政府機関により規定された形式の製品表示をし得、この製品表示は、ヒトへの投与についての製造、使用、または販売における機関による認可を表す。さらに、薬学的組成物は、他の治療化合物と併用して用いられ得る。薬学的組成物は、例えば、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路による簡便な様式で投与され得る。薬学的組成物は、特定の適応症の処置および／または予防に有効な量で投与される。一般に、薬学的組成物は少なくとも約10μg/kg体重の量で投与され、そして多くの場合、それらは１日に約８mg/kg体重を超えない量で投与される。多くの場合、投薬量は、１日に約10μg /kg体重〜約１mg/kg体重であり、投与経路、症状などが考慮される。Ｇタンパク質共役型レセプターポリペプチド、および化合物をまた活性化または阻害する化合物は、本発明に従って、インビボでのこのようなポリペプチドの発現により用いられ得る。これはしばしば「遺伝子治療」と呼ばれる。従って、例えば、患者由来の細胞は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(DNAまたはRNA)を用いてエキソビボで操作され得、次いで、操作された細胞はこのポリペプチドで処置されるべき患者に提供される。このような方法は当該分野で周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子の使用により、当該分野で公知の手順によって操作され得る。同様に、細胞は、インビボでのポリペプチドの発現のために、例えば、当該分野で公知の手順によりインビボで操作され得る。当該分野で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞は、インビボで細胞を操作するため、およびインビボでのポリペプチドの発現のために患者に投与され得る。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかなはずである。例えば、細胞を操作するための発現ビヒクルは、レトロウイルス以外のもの（例えば、アデノウイルス）であり得る。これは、適切な送達ビヒクルと組み合わせた後、インビボで細胞を操作するために使用され得る。本明細書中上記のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施態様において、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。ベクターは、１つ以上のプロモーターを含む。使用され得る適切なプロモーターとしては、Millerら、Biotechniques、第７巻、第９号、980-990(1989)に記載のレトロウイルスLTR；SV40プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス(CM V)プロモーター、または他の任意のプロモーター（例えば、真核生物細胞プロモーター（ヒストン、pol III、およびβ-アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない）のような細胞性プロモーター）が挙げられるが、これらに限定されない。使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ(TK)プロモーター、およびB19パルボウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書中に含まれる教示から当業者に明らかである。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用され得る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター）；または異種プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター）；RSウイルス(RSV)プロモーター；誘導性プロモーター（例えば、MMTプロモーター、メタロチオネインプロモーター）；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ApoAIプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター）；レトロウイルスLTR （本明細書中上記の改変レトロウイルスLTRを含む）；βアクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然のプロモーターであり得る。レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株に形質導入し、プロデューサー細胞株を形成するために使用される。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例としては、Miller、Human Gene Therapy、第１巻、5-14 頁(1990)（その全体が参考として本明細書中に援用される）に記載のような、PE 501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+E -86、GP+envAm12、およびDAN細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、当該分野で公知の任意の手段によりパッケージング細胞を形質導入し得る。このような手段としては、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびCaPO₄沈澱が挙げられるが、これらに限定されない。１つの代替として、レトロウイルスプラスミドベクターは、リポソームにカプセル化され得るか、または脂質に結合され得、次いで宿主に投与され得る。プロデューサー細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、真核生物細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核生物細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（単数または複数）を発現する。形質導入され得る真核生物細胞としては、胎芽幹細胞、胎芽癌腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明はまた、本発明のＧタンパク質共役型レセプターに結合し得ることが既知でないリガンドが、このようなレセプターに結合し得るかどうかを決定するための方法を提供する。この方法は、Ｇタンパク質共役型レセプターへのリガンドの結合を許容する条件下で、Ｇタンパク質共役型レセプターを発現する哺乳動物細胞をリガンドと接触する工程、レセプターに結合するリガンドの存在を検出する工程、およびそれによってリガンドがＧタンパク質共役型レセプターに結合するかどうかを決定する工程を包含する。本発明はさらに、細胞の表面上のヒトＧタンパク質共役型レセプターと特異的に相互作用し、そしてこれに結合する薬物を同定するために、薬物をスクリーニングする方法を提供する。これはＧタンパク質共役型レセプターをコードする単離されたDNA分子を含有する哺乳動物細胞と複数の薬物とを接触させる工程、哺乳動物細胞に結合するこれらの薬物を決定する工程、そしてそれによって本発明のヒトＧタンパク質共役型レセプターと特異的に相互作用し、そしてそれに結合する薬物を同定する工程を包含する。次いで、このような薬物は、本発明のレセプターを活性化するかまたは活性化を阻害するかのいずれかのために治療的に使用され得る。本発明はまた、Ｇタンパク質共役型レセプターをコードするmRNAの存在を検出することにより、細胞の表面におけるＧタンパク質共役型レセプターの発現を検出する方法を提供する。この方法は、細胞から全mRNAを得る工程、およびこのように得られたmRNAを、ヒトＧタンパク質共役型レセプターをコードする核酸分子の配列内に含まれる配列と特異的にハイブリダイズし得る本発明の核酸プローブと、ハイブリダイズする条件下で接触させる工程、プローブにハイブリダイズしたmRNAの存在を検出する工程、およびそれによって細胞によるＧタンパク質共役型レセプターの発現を検出する工程を包含する。本発明はまた、本発明のレセプターポリペプチドをコードする核酸配列中の変異の存在に関連する疾患または疾患に対する感受性を検出するための診断アッセイの一部としてのＧタンパク質共役型レセプター遺伝子の使用に関する。例として、このような疾患は、細胞の形質転換（例えば、腫瘍およびガン）に関する。ヒトＧタンパク質共役型レセプター遺伝子中に変異を有する個体は、種々の技術によりDNAレベルで検出され得る。診断のための核酸は、患者の細胞（例えば、血液、尿、唾液、組織生検、および剖検物質）より得られ得る。ゲノムDNAは、検出のために直接使用され得るか、または分析前にPCRを用いることにより酵素的に増幅され得る（Saikiら、Nature、324:163-166(1986)）。RNAまたはcDNA もまた、同じ目的のために使用され得る。例として、Ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質をコードする核酸に相補的なPCRプライマーが、Ｇタンパク質共役型レセプター変異を同定および解析するために使用され得る。例えば、欠失および挿入は、正常な遺伝子型との比較における増幅された産物のサイズの変化により検出され得る。点変異は、放射性標識されたＧタンパク質共役型レセプター RNA、あるいは、放射性標識されたＧタンパク質共役型レセプターアンチセンスD NA配列に、増幅されたDNAをハイブリダイズさせることにより同定され得る。完全にマッチした配列は、RNaseA消化または融解温度の差により、ミスマッチした二重鎖と区別され得る。対照遺伝子と変異を有する遺伝子との間の配列の相違は、直接DNA配列決定法によって明らかにされ得る。さらに、クローン化されたDNAセグメントは、特定のDNAセグメントを検出するためのプローブとして用いられ得る。本方法の感度は、PCRと組み合わされた場合、非常に増強される。例えば、配列決定プライマーは、二本鎖PCR産物、または改変されたPCRによって作製された一本鎖テンプレート分子とともに使用される。配列決定は、放射性標識ヌクレオチドを用いる従来の手順または蛍光タグを用いる自動配列決定手順によって実施される。 DNA配列の差異に基づいた遺伝子試験は、変性剤を含むかまたは含まないゲルにおけるDNAフラグメントの電気泳動的移動度における変化の検出により達成され得る。小さな配列欠失および挿入は、高分解能ゲル電気泳動によって視覚化され得る。異なる配列のDNAフラグメントは、変性ホルムアミド勾配ゲルにおいて区別され得る。ここで異なるDNAフラグメントの移動度は、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従ってゲル内の異なる位置に遅延される（例えば、 Myersら、Science，230:1242(1985)を参照のこと）。特定の位置での配列の変化はまた、ヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、RNas e保護およびS1保護または化学的切断法（例えば、cottonら、PNAS、USA、85:439 7-4401(1985)））により明らかにされ得る。従って、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase保護、化学的切断、直接的なDNA配列決定、または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型(RFLP)）およびゲノムDNAのサザンブロッティングのような方法によって達成され得る。より慣習的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加えて、変異はまたインサイチュ分析により検出され得る。本発明はまた、種々の組織における本発明のレセプターポリペプチドの可溶形態の変化したレベルを検出するための診断アッセイに関する。宿主に由来するサンプル中の可溶レセプターポリペプチドのレベルを検出するために使用されるアッセイは、当業者に周知であり、そしてラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、および好ましくはELISAアッセイを含む。 ELISAアッセイは、レセプターポリペプチドの抗原に特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する工程を最初に含む。さらに、このモノクローナル抗体に対するレポーター抗体が調製される。放射能、蛍光、またはこの実施例において西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のような検出可能な試薬がレポーター抗体に付着される。ここでサンプルは、宿主から取り出され、そして固体支持体（例えば、サンプル中のタンパク質に結合するポリスチレンディッシュ）上でインキュベートされる。次いで、ディッシュ上の任意の遊離のタンパク質結合部位は、非特異的タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とインキュベートすることにより被覆される。次いで、モノクローナル抗体は、ディッシュ内でインキュベートされ、この間、モノクローナル抗体は、ポリスチレンディッシュに付着した任意の本発明のレセプターポリペプチドに付着する。全ての結合しなかったモノクローナル抗体は、緩衝液により洗い流される。ここで西洋ワサビペルオキシダーゼに連結されたレポーター抗体はディッシュ内に入れられ、これによりレセプタータンパク質に結合した任意のモノクローナル抗体へレポーター抗体が結合する。次いで、付着しなかったレポーター抗体は洗い流される。次いで、ペルオキシダーゼ基質は、ディッシュに添加され、そして所定の期間における発色量が、標準曲線と比較した場合の所定容量の患者サンプルに存在するレセプタータンパク質の測定値である。本発明の配列はまた、染色体の同定に有益である。この配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的化し、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、染色 ***置の標識化に利用可能な実際の配列データ（反復多型）に基づいた染色体標識化試薬はほとんどない。本発明のDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子を相関させることにおいて重要な第１工程である。簡潔に述べれば、配列は、cDNAからPCRプライマー（好ましくは15〜25bp）を調製することにより染色体にマップされ得る。３'非翻訳領域のコンピューター解析が、ゲノムDNA内で１より多いエキソンにまたがらない、従って増幅プロセスを複雑化するプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。プライマーに対応するヒト遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じる。体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための迅速な手順である。同じオリゴヌクレオチドプライマーを本発明と共に使用して、類似の様式で特定の染色体由来のフラグメントのパネルまたは大きなゲノムクローンのプールを用いて、部分的局在性の決定(sublocalization)が達成され得る。染色体にマッピングするために同様に使用され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識化フロー選別した (flow-sorted)染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる前選択を包含する。 cDNAクローンの中期染色体スプレッドへの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、１工程で正確な染色***置を提供するために使用され得る。この技術は、50または60塩基という短いcDNAを用いて使用され得る。この技術の総説については、Vermaら，Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques， Pergamon Press，New York(1988)を参照のこと。一旦配列が正確な染色***置にマッピングされると、配列の染色体上での物理的な位置を遺伝子地図のデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、 V．McKusick，Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)において見出される。次いで、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝）により同定される。次に、罹患個体と非罹患個体との間のcDNA配列またはゲノム配列における差異を決定する必要がある。変異がいくつかまたは全ての罹患個体に観察されるが、いずれの正常な個体には観察されない場合、この変異は疾患の原因因子であるようである。物理的マッピング技術および遺伝子マッピング技術の現在の解像度では、疾患に関連する染色体領域に正確に位置決めされたcDNAは、50と500との間の潜在的原因遺伝子の１つであり得る。（これは、１メガベースのマッピング解像度、および20kbあたり１遺伝子と仮定する）。このポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、またはそれらのアナログ、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を産生させるための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ抗体、単鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにFabフラグメント、またはFab発現ライブラリーの産物を包含する。当該分野で公知の種々の手順が、このような抗体およびフラグメントの産生のために使用され得る。本発明の配列に対応するポリペプチドに対して生成される抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射により、または動物へのポリペプチドの投与により得られることができる。この動物は、好ましくはヒトではない。次いで、このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合する。このようにして、このポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列でさえも、天然のポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用され得る。次いで、このような抗体は、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するために使用され得る。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養により産生される抗体を提供する任意の技術が使用され得る。例としては、ハイブリドーマ技術(Kohle rおよびMilstein，1975，Nature，256: 495-497)、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら，1983，Immunology Today 4: 72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術(Coleら，1985，Mono clonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.,77-96頁)が挙げられる。単鎖抗体を産生するために記載された技術（米国特許第4,946,778号)を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する単鎖抗体を生成するために適合させ得る。また、トランスジェニックマウスが、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対するヒト化抗体を発現するために使用され得る。本発明を以下の実施例を参照にしてさらに記載する；しかし、本発明はこのような実施例に限定されないことが理解されるべきである。すべての部分または量は、他に明記しない限り重量基準である。以下の実施例の理解を容易にするために、頻繁に現れる特定の方法および／または用語が記載される。「プラスミド」は、小文字のｐの前および／またはそれに続く大文字および／または数字を示すことにより明示される。本明細書中の出発プラスミドは、市販されており、制限無く公的に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築され得る。さらに、記載されるプラスミドと等価のプラスミドが当該分野において公知であり、そして当業者には明らかである。 DNAの「消化」は、DNA中の特定の配列でのみ作用する制限酵素でそのDNAを触媒反応的に切断することをいう。本明細書中で使用される種々の制限酵素は、市販されており、そしてそれらの反応条件、補因子、および他の必要条件は当業者に公知のものが使用された。分析目的のためには、典型的には１μgのプラスミドまたはDNAフラグメントが、約２単位の酵素と共に約20μlの緩衝溶液中で使用される。プラスミド構築のためのDNAフラグメントを単離する目的のためには、代表的には５〜50μgのDNAが、20〜250単位の酵素を用いてより大きな容量中で消化される。特定の制限酵素のための適切な緩衝液および基質量は、製造者により特定される。37℃で約１時間のインキュベーション時間が通常使用されるが、これは供給者の説明書に従って変わり得る。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望のフラグメントを単離する。切断フラグメントのサイズ分離は、Goeddel,D.ら，Nucleic Acids Res.,８: 4 057(1980)により記載された８％ポリアクリルアミドゲルを使用して行われる。「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、これらは化学的に合成され得る。このような合成オリゴヌクレオチドは、５'リン酸を有さず、従ってキナーゼの存在下でATPと共にリン酸を添加しなければ、別のオリゴヌクレオチドと連結しない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントに連結する。「連結」は、２つの二本鎖核酸フラグメントの間でリン酸ジエステル結合を形成するプロセスをいう(Maniatis,Tら、前出、146頁)。他に提供しなければ、連結は公知の緩衝液および条件を使用して、ほぼ等モル量の連結されるべきDNAフラグメント0.5μgあたり10単位のT4 DNAリガーゼ（「リガーゼ」）を用いて達成され得る。他に記載しない限り、Graham,F.およびVan der Eb，A.，Virology，52:456-45 7(1973)の方法に記載されるように、形質転換を実施した。実施例１ COS7 細胞中での組換えHGBER32の発現プラスミド、HGBER32HAの発現を、ベクターpcDNA3（Invitrogen）から誘導する。ベクターpcDNA3は以下を含有する：１）SV40複製起点、２）アンピシリン耐性遺伝子、３）E．coli複製起点、４）ポリリンカー領域、SV40イントロン、およびポリアデニル化部位が続くCMVプロモーター。HGBER32前駆体全体およびその３'末端にインフレームで融合されたHAタグをコードするDNAフラグメントを、ベクターのポリリンカー領域にクローン化した。それゆえ、組換えタンパク質発現はCMVプロモーター下に支配される。HAタグは、先に記載された（Wilsonら、Cel l 37：67、1984）ようなインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する。標的タンパク質へのHAタグの融合により、HAエピトープを認識する抗体を用いる組換えタンパク質の容易な検出が可能になる。プラスミド構築ストラテジーを以下に記載する： HGBER32をコードするDNA配列（ATCC受託番号第号）を、以下の２つのプライマーを用いてゲノムλクローンにPCRにより構築した：５'プライマー（５'- ACCAGGATCCGCTGCCTTGATGGATTAT）（配列番号４）は、BAMHI部位、それに続く開始コドンから始まるHGBER32コード配列の９ヌクレオチドを含む；３'プライマー（配列番号５）、５'-CTGCTTCTAGAATGCCATTCAAGAAAATGTTは、XbaI部位、翻訳停止コドン、およびHGBER32コード配列の10ヌクレオチド（停止コドンは含まない）に相補的な配列を含む。それゆえ、PCR産物は、BAMHI部位、翻訳停止コドンおよびXbaI部位が続くHGBER32コード配列を含む。PCR増幅DNAフラグメントおよびベクター（pcDNAI/Amp）を、BAMHIおよびXbaI制限酵素を用いて消化し、そして連結した。連結混合物を、E．coli SURE株（Stratagene Cloning Systems，1109 9 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037より入手可能）に形質転換し、形質転換培養物をアンピシリン培地プレートに播種し、そして耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを形質転換体から単離し、そして正しいフラグメントの存在を制限酵素分析で調べた。組換えHGBER32レセプターの発現のために、C OS7細胞をDEAE-DEXTRAN法（Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Man ual,第２版、Cold Spring Laboratory Press，1989）により発現ベクターでトランスフェクトした。HGBER32 HAタンパク質の発現を、放射性標識および免疫沈降法により検出した（HarlowおよびLane，Antibodies: A Laboratory Manual，Col d Spring Harbor Laboratory Press，(1988)）。細胞を、トランスフェクションの２日後、³⁵S-システインで８時間標識した。次いで培養培地を回収し、そして細胞を界面活性剤(RIPA緩衝液(150mM NaCl、１％ NP-40、0.1％ SDS、１％ NP-4 0、0.5％ DOC、50mM Tris(pH7.5))で溶解した(Wilsonら、同上 37:767（1984)）。細胞溶解物および培養培地の両方を、HA特異的モノクローナル抗体を用いて沈降させた。沈降したタンパク質を15％ SDS-PAGEゲルにおいて分析した。実施例２バキュロウイルス発現系を用いるHGBER32のクローニングおよび発現全長HGBER32タンパク質をコードするDNA配列（ATCC受託番号第号）を、この遺伝子の５'配列および３'配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅した： TCAGTG（配列番号６）を有し、そしてBAMHI制限酵素部位（太字）と、それに続く真核生物細胞における翻訳の開始に効率的なシグナルに類似する18つのヌクレオチド（Kozak、J．Mol．Biol．196，947-950，1987）、およびすぐ後ろにこのH GBER32遺伝子の最初の25ヌクレオチド（翻訳の開始コドン「ATG」に下線を付する）を含有む。有し、そして制限エンドヌクレアーゼXbaIの切断部位およびこのHGBER32遺伝子の３'非翻訳配列に相補的な４ヌクレオチドを含む。増幅した配列を、市販のキット（「Geneclean」 BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.）を用いて、１％アガロースゲルから単離した。次いで、このフラグメントをエンドヌクレアーゼBAMHIおよびXbaIで消化し、次いで実施例１に記載のように精製した。このフラグメントを、F2と称する。ベクターpA2（PUL941ベクターの改変体、下記）を、バキュロウイルス発現系を用いるHGBER32タンパク質の発現のために用いる（総説について、SummersおよびSmith,1987，A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cel l Culture Procedures，Texas Agricultural Experimental Station Bulletin N o．1555，1987を参照のこと）。この発現ベクターは、Autographa californica 核多角体病ウイルス（AcMNPV）の強力なポリヘドリンプロモーター、それに続く制限エンドヌクレアーゼBAMHIおよびXbaIの認識部位を含む。シミアンウイルス（SV）40のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスを容易に選択するために、E．coli由来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと、それに続くポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルと同方向に挿入する。ポリヘドリン配列を、コトランスフェクトした野生型ウイルスDNAの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列に両端で隣接させる。多くの他のバキュロウイルスベクターが、pA2の代わりに用いられ得る。例えば、pRG1、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である（LuckowおよびSummer s．Virology，170:31-39）。プラスミドを制限酵素BAMHIおよびXbaIで消化し、次いで当該分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスファターゼを用いて脱リン酸化した。次いで、DNAを、実施例１に記載のように、１％アガロースゲルから単離した。このベクターDNAをV 2と称する。フラグメントF2および脱リン酸化したプラスミドV2を、T4 DNAリガーゼを用いて連結した。次いで、E．coli HB101細胞を形質転換し、HGBER32遺伝子を有するプラスミド（pBac-HGBER32）を含む細菌を同定した。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認した。５μgのプラスミドpBac-HGPCRを、リポフェクション法（Felgnerら Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，84:7413-7417(1987)）を用いて、1.0μgの市販の線状化したバキュロウイルス（「BaculoGold^TM baculovirus DNA」，Pharmingen，San Dieg o，CA.）とともにコトランスフェクトした。 1μgのBaculoGold^TMウイルスDNAおよび５μgのプラスミドpBac-HGBER32を、50 μlの無血清Grace培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）を含むマイクロタイタープレートの無菌ウェル中で混合した。その後、10μlのリポフェクチンおよび90μlのGrace培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートした。次いで、そのトランスフェクション混合物を、血清を含まないGr ace培地１mlを含有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞（ATCC CRL 171l）に滴下して加えた。プレートを、新たに加えられた溶液を混合するために、前後に振動させた。次いでプレートを、27℃で５時間インキュベートした。５時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10％ウシ胎児血清を補充した１mlのGrace昆虫培地を添加した。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で４日間培養を続けた。４日後、上清を回収し、そしてSummersおよびSmith（前出）による記載と同様にプラークアッセイを行った。改変法として、青く染色されたプラークの容易な単離を可能にする、「Blue Gal」（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）を有するアガロースゲルを用いた。（「プラークアッセイ」の詳細な記述はまた、 Life Technologies Inc.、Gaithersburgが配布する昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学の使用者ガイド（９〜10頁）においても見い出され得る）。連続希釈の４日後、ウイルスを細胞に加え、そして青く染色されたプラークをエッペンドルフピペットのチップで拾った。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、200μlのGrace培地を含むエッペンドルフチューブ中で再懸濁した。寒天を、短時間の遠心分離により除去し、そして組換えバキュロウイルスを含む上清を、35mmディッシュに播種されたSf9細胞に感染させるために用いた。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いで４℃で保存した。 Sf9細胞を、10％熱不活化FBSを補充したGrace培地中で増殖させた。細胞を、感染多重度（MOI）２で、組換えバキュロウイルスV-HGBER32で感染させた。６時間後、培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900 II培地（Life Technologies Inc.，Gaithersburg）に置き換えた。42時間後、５μCiの³⁵ Ｓ-メチオニンおよび５μCiの³⁵Ｓシステイン（Amersham）を添加した。細胞をさらに16時間インキュベートし、その後細胞を遠心分離により収集し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化した。実施例３ヒト組織におけるHGBER32の発現パターンノーザンブロット分析を、ヒト組織におけるHGBER32の発現レベルを調べるために行う。全細胞RNAサンプルを、RNAzol^TMBシステム（Biotecx Laboratories， Inc．6023 South Loop East，Houston，TX 77033）を用いて単離した。それぞれの特定したヒト組織から単離した約10μgの全RNAを、１％アガロースゲルで分離し、そしてナイロンフィルター上にブロットした。（Sambrookら、前出）。標識反応を、Stratagene Prime-Itキットに従って50ngのDNAフラグメントを用いて行う。標識したDNAを、Select-G-50カラムを用いて精製する（5 Prime-3 Prime，I nc．5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 80303）。次いで、フィルターを、1,000 ,000cpm/mlで放射能標識した全長HGBER32遺伝子と、0.5M NaPO₄（pH7.4）および７％ SDS中で65℃にて一晩ハイブリダイズさせる。室温にて２回、そして60℃にて２回、0.5×SSC、0.1％SDSを用いて洗浄した後、次いでフィルターを増感スクリーンを用いて−70℃にて一晩感光させる。HGBER32に対するメッセンジャーRNA は、小脳組織において豊富である。実施例４遺伝子治療を介しての発現線維芽細胞を、皮膚生検により被験体から得る。得られた組織を、組織培養培地中に置き、そして小片に分ける。組織の小塊（small chunk）を、組織培養フラスコの湿潤表面に置き、およそ10片をそれぞれのフラスコ中に置く。フラスコの上下を逆さにし、密閉し、そして室温にて一晩置く。室温にて24時間後、フラスコを逆さにし、そして組織の塊をフラスコの底に固着したままにし、そして新鮮な培地（例えば、10％FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するH amのF12培地）を添加する。次いで、これを37℃にておよそ１週間インキュベートする。この時点で、新鮮な培地を添加し、その後数日毎に取り替える。さらに２週間培養後、線維芽細胞の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、そしてより大きなフラスコにスケールを合わせた。モロニーマウス肉腫ウイルスの長末端反復に隣接するpMV-7（Kirschmeier，P. T.ら，DNA，7: 219-25(1988)）を、EcoRIおよびHindIIIで消化し、その後仔ウシ腸ホスファターゼを用いて処理する。線状ベクターをアガロースゲルで分画し、そしてガラスビーズを用いて精製する。本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、それぞれ５'末端配列および３'末端配列に対応するPCRプライマーを用いて増幅する。５'プライマーはEcoRI部位を含み、そして３'プライマーはさらにHindIII部位を含む。T4 DNAリガーゼの存在下で、等量のモロニーマウス肉腫ウイルスの線状骨格ならびにEcoRIおよびHin dIIIフラグメントを一緒に加える。得られた混合物を、２つのフラグメントの連結に適切な条件下で維持する。連結混合物を用いて細菌HB101を形質転換し、次いでこれを、ベクターが適切に挿入された目的の遺伝子を有することを確認する目的のために、カナマイシンを含有する寒天上にプレーティングする。アンホトロピックなpA317またはGP+am12パッケージング細胞を、10％仔ウシ血清（CS）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを有するDulbecco改変Eagle 培地（DMEM）中でコンフルエントな密度になるまで組織培養物中で増殖させる。次いで、遺伝子を含むMSVベクターを培地に添加し、そしてパッケージング細胞をベクターを用いて形質導入する。この時、パッケージング細胞は、遺伝子を含有する感染性のウイルス粒子を産生する（この時、パッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる）。新鮮な培地を、形質導入したプロデューサー細胞に添加し、その後、培地を、コンフルエントなプロデューサー細胞の10cmプレートから収集する。感染性のウイルス粒子を含有する使用済みの培地を、ミリポアフィルターを通して濾過して、剥離したプロデューサー細胞を除去し、次いでこの培地を用いて線維芽細胞を感染させる。培地を、サブコンフルエントな線維芽細胞のプレートから除去し、そして迅速にプロデューサー細胞からの培地と置き換える。この培地を除去し、そして新鮮な培地で置き換える。ウイルスの力価が高い場合、実質的に全ての線維芽細胞が感染し、そして選択は必要ない。力価が非常に低い場合、選択マーカー（例えば、neoまたはhis）を有するレトロウイルスベクターを使用することが必要である。次いで、操作された線維芽細胞を、単独で、またはcytodex3マイクロキャリアービーズ上でコンフルエントになるまで増殖させた後のいずれかで宿主に注入する。この時、線維芽細胞は、タンパク質産物を産生する。本発明の多数の改変および変更が、上記の教示を参照して可能であり、従って、添付する請求の範囲の範囲内で、本発明は特記した以外の方法で実施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＪＡ６１Ｋ 48/00 ＡＢＳＡＢＳＡＢＶＡＢＶＡＣＤＡＣＤＡＣＶＡＣＶＣ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 16/28 16/28 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＮ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者リ，イアメリカ合衆国メリーランド 20878, ガイザースバーグ，ホワードランディングドライブ 16125 (72)発明者ローゼン，クレイグエイ. アメリカ合衆国メリーランド 20878, ガイザースバーグ，ローリングヒルロード 22400 (72)発明者ルーベン，スティーブンエム. アメリカ合衆国メリーランド 20832, オルニー，ヘリテイジヒルズドライブ 18528

Claims

【特許請求の範囲】１．以下からなる群から選択されるメンバーを含む単離されたポリヌクレオチド： (a) 図１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (b) ATCC受託番号に含まれるDNAにより発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； (c) (a)または(b)のポリヌクレオチドにハイブリダイズし得、そして(a)または(b)のポリヌクレオチドと少なくとも70％同一であるポリヌクレオチド；および (d) (a)、(b)、または(c)のポリヌクレオチドのポリヌクレオチドフラグメント。２．図１に記載のポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがATCC受託番号に含まれるDNAによりコードされる成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。４．請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。５．請求項４に記載のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。６．ポリペプチドを産生するためのプロセスであって：請求項５に記載の宿主細胞から前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現する工程を包含する、プロセス。７．請求項４に記載のベクターで細胞を遺伝子操作する工程を包含する、ポリペプチドを発現し得る細胞を産生するためのプロセス。８．以下からなる群から選択されるポリペプチド： (i) 図１の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびにそのフラグメント、アナログ、および誘導体；および (ii) ATCC受託番号のcDNAによりコードされるポリペプチド、ならびに該ポリペプチドのフラグメント、アナログ、および誘導体。９．前記ポリペプチドが図１の推定アミノ酸配列を有する、請求項８に記載のポリペプチド。１０．請求項８に記載のポリペプチドに対する抗体。１１．請求項８に記載のポリペプチドを活性化する化合物。１２．請求項８に記載のポリペプチドの活性化を阻害する化合物。１３．レセプターを活性化する必要性を有する患者の処置方法であって：請求項１１に記載の化合物の治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。１４．レセプターを阻害する必要性を有する患者の処置方法であって：請求項１２に記載の化合物の治療的有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。１５．前記化合物がポリペプチドであり、そして該化合物の治療的有効量が、患者にアゴニストをコードするDNAを提供し、そしてインビボで該アゴニストを発現させることにより投与される、請求項１３に記載の方法。１６．前記化合物がポリペプチドであり、そして該化合物の治療的有効量が、患者にアンタゴニストをコードするDNAを提供し、そしてインビボで該アンタゴニストを発現することにより投与される、請求項１４に記載の方法。１７．請求項８に記載のポリペプチドに結合し、そして該ポリペプチドを活性化する化合物を同定するための方法であって：細胞表面上で請求項８に記載のポリペプチドを発現する細胞と化合物とを接触させる工程であって、該ポリペプチドは、該化合物の該ポリペプチドへの該結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と会合され、該摂食が該化合物の該ポリペプチドへの結合を許容するのに十分な条件下である、工程；および該第２の成分により産生されるシグナルを検出することによりポリペプチドの結合し得る化合物を同定する工程、を包含する、方法。１８．請求項８に記載のポリペプチドに結合し、そして該ポリペプチドの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって：細胞表面上で請求項８に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞と、レセプターポリペプチドに結合することが公知の分析的に検出可能なリガンドおよび化合物とを接触させる工程であって、該ポリペプチドは、該ポリペプチドへの結合を許容する条件下で、該化合物の該ポリペプチドへの該結合に応答して検出可能なシグナルを提供し得る第２の成分と会合される、工程；および該リガンドと該ポリペプチドとの相互作用から生成されるシグナルが存在しないことを検出することにより、該リガンドが該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程、を包含する、方法。１９．患者において請求項８に記載のポリペプチドの過小発現に関する疾患または疾患に対する感受性を診断するためのプロセスであって：該ポリペプチドをコードする核酸配列中の変異、または患者に由来するサンプル中の該ポリペプチドの量を決定する工程を包含する、プロセス。