JPH11507435A - Analytical and therapeutic agents - Google Patents

Abstract

According to the present invention there is provided an agent and method of detecting 8-oxoquanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadenine, and 8-oxodeoxyadenosine.

Description

【発明の詳細な説明】 分析および治療用薬剤 本発明は、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソ アデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンを検出する方法に用いられる薬剤 に関し、特に、損傷を受けた(damaged)核酸の検出、該核酸の診断および該核酸 の検出法に用いられる薬剤に関する。 核酸塩基の損傷、特にＤＮＡの酸化的な塩基損傷は、トキシン（毒素）、癌発 生および神経変性障害などの多くの原因により起こり得る。このような損傷を検 出することは、医学的な診断、病理研究および職業上の健康管理など医学上の多 くの観点から重要である。 核酸塩基の損傷を検出するための現在の技術は、酸素遊離ラジカルによって引 き起こされるＤＮＡ塩基損傷を感受するマーカーである８−オキソグアニンを検 出することによる［Kasai，H．およびNishimura，S.，In：H．Sies，ed.「酸化 的ストレス：酸化剤および抗酸化剤（Oxidative Stress：Oxidants and Antioxi dants）London：Academic Press，1991：99-116；Ames，B．N.，1989，Free Rad ．Res．Commun.，7 : 121-128］が、８−オキソグアニンは形成する少なくとも2 0種類の生成物の唯一のものにすぎない。 ＤＮＡに対する酸化的損傷に対するマーカーとして８−オキソグアニンを使用 することにより、ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）を用いて電気化学的 に、ＤＮＡ分解物中のデオキシヌクレオシド（８−オキソデオキシグアノシン） として分析される（Floyd，R．A．他、1986，Free Rad．Res．Commun.，1 : 163 -172）。別の方法として、ガスクロマトグラフィー／マススペクトロメトリー（ ＧＣ−ＭＳ）法を用いて、８−オキソグアニンを遊離塩基として定量することも 行われている（Dizdaroglu，M．1994，Methods Enzymol.，234 ：3-16）が、こ の手法は高価で且つ技術的な要求が厳しい。これらの２つの手法が比較された（ Halliwell，B．およびDizdaroglu，M.，1992，Free Rad．Res．Commun，16：75- 87）が、得られた結果は一致していない。一般的に、ＧＣ−ＭＳ法によって測定 される８−オキソグアニンのレベルは高くなり、新鮮な分離細胞においては、Ｇ Ｃ−ＭＳによる値は２から11倍高くなっていることが報告されている。 ＤＮＡ中の８−オキソグアニンを測定するにはその他の多くの手段が提示され ている。³²Ｐを用いるポストラベル法は文献により確立されている（Lu，L．J． W．他、Chem．Phamaceut．Bull．39：1880-1882 Povey，A．C.他、In :ＤＮＡア ダクトを検出するポストラベル法（Postlabelling Methods for Detection of D NA Adducts）。 Lyon，105-114）。この方法は、非常に高感度の検出法を提供する可能性がある が、非常に時間がかかり面倒である。毛細管電気泳動法による８−オキソデオキ シグアノシンの測定（Guarnieri，C．他、1994，J．Chromatogr．B．656 ：209- 213）および８−オキソグアニンの測定（Poon，K．W．他、1995，Biochem．Soc ．Trans．23：443s ）も提示されている。現在までのところ、この方法は、ＵＶ 吸収測定が本質的に感度を欠いているために感度不足である。 本発明に従えば、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８− オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンを検出する方法に使用され る薬剤であって、ビオチンと特異的に結合し、且つ、８−オキソグアニン、８− オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデ ノシン（それぞれ８−ヒドロキシグアニン、８−ヒドロキシデオキシグアノシン 、８−ヒドロキシアデニンおよび８−ヒドロキシデオキシアデノシンとして知ら れているその最も一般的な互変異性体）の少なくとも１つに特異的に結合する分 子から成ることを特徴とする薬剤が提供される。 プリン塩基グアニンは、ビオチン分子と構造的な相関性を殆ど有しない。しか しながら、損傷を受けたＤＮＡに対するアビジンの詳細な結合特性は未だ不明で あるが、本発明が見出したところによれば、酸化的ＤＮＡ損傷の損傷生成物であ る８−オキソグアニンのケト型はビオチンにきわめて構造上類似しており、そし て、この酸化された塩基生成物に対してアビジン、ストレプトアビジンおよび抗 ビオチン抗体は有意の結合親和性を有するようである。 構造的な特徴を考慮すると、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシア デノシンンはイミダジリドン基を有しているのでアビジンはこれらの化合物と結 合することを強く示唆している。 「特異的に結合する」とは、薬剤が特定の（単一または複数の）エピトープに 対して特異的親和性を有することを意味する。アビジンは少なくともビオチン、 ８−オキソグアニンおよび８−オキソデオキシグアニンに特異的に結合するので 、これらの分子は同一または実質的に同じエピトープを有する。この特異性は、 ミモトープ（mimotope）にも特異的なポリペプチドのエピトープに特異的な抗体 （Geysen，H．M．他、1987，Journal of Immnological Methods， 102 ：259-27 4）に（構造）類似性である。但し、該ミモトープの配列が該ポリペプチドの配 列と相違していることはあり得る。 本発明の薬剤は、ビオチンに対してアビジンまたはストレプトアビジンと実質 的に同じ結合特異性を有し得るものである。さらに本発明の薬剤は、８−オキソ グアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オキ ソデオキシアデノシンの少なくとも１つに対して、アビジンまたはストレプトア ビジンと実質的に同 じ結合特異性を有し得るものである。 「同じ結合特異性」とは、薬剤（例えば、フラグメント、アナログ、抗体また は抗原結合性フラグメント）が、アビジンまたはストレプトアビジンと実質的に 同じ（単一または複数の）エピトープに対して特異的であることを意味する。 本発明の薬剤は、アビジンおよびストレプトアビジンから成る群の一つから選 ぶことができる。 本発明の薬剤は、アビジンまたはストレプトアビジンのフラグメントまたはア ナログから構成されてもよい。アビジンおよびストレプトアビジンの特性を調べ 変性して該分子の所望のフラグメント、例えば、該分子のうちビオチン結合性部 分のみから成るフラグメントを容易に得ることができる。アナログ（アビジンま たはストレプトアビジン分子自身のアナログまたは該分子のフラグメントのアナ ログ）を調製することもできる。例えば、ビオチン分子または損傷を受けたＤＮ Ａに対する結合特異性ないしは結合親和性が変化したようなアナログを調製して もよい。 「アビジンまたはストレプトアビジンのフラグメントまたはアナログ」とは、 アビジンまたはストレプトアビジン分子のフラグメントまたはアナログであって 、ビオチンに対して、および、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノ シン、８−オキソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの少なくとも１ つに対して特異的に結合するものを意味する。 本発明者は、驚くべきことに、アビジン、ストレプトマイシンおよび抗ビオチ ン抗体が、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソア デニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの検出、したがって、損傷を受けた 核酸、特に損傷を受けたＤＮＡの検出に使用し得ることを見出した。 アビジンは、卵白中にある天然に存在する因子であり、ビオチンビタミンに対 して顕著な親和性（Ka＝10¹⁵Ｍ^-1）を有し（Bayer，E．A．およびIchek，M.，19 90，Methods in Enzymol.，184 ：49-67）、そして、ストレプトマイセス・ア ビジニイ（Streptomyces avidinii）由来の細菌性アナログであるストレプトア ビジンも実質的に同じ結合親和性と特異性を有する。 ビオチン分子（Green，N．M.，1972，Adv．Protein Chem.，29：85-131）は疎 水性が大きく、そして、ウレイド基およびイミダジリドン環から成る。その分子 全体がアビジン結合部位と相互作用して、アビジンは２面対称を有する安定な四 量体を形成し、４ケのビオチン結合部位を含むように配置されて２つのクラスタ ーとなると考えられている。ビオチン分子の小フラグメントから成るアナログで ある広範囲の化合物がアビジンと結合し得るが、10mMのレベルでは類似の化合物 が有意に結合しないこと（Green，1972,上述の文献）から、ビオチンに対するア ビジンの結合性には比較的高い特異性が存するものと考えられる。 アビジンは、主として検出や増幅における二次的手段として研究および実用技 術の両方において汎用されている。イムノアッセイにおいてはビオチンを検出す るのに多用され、この場合には、一次抗体は直接ビオチンが結合されるか、また はビオチン化二次抗体を介して結合される。また、塩基のような標的分子をビオ チン化により化学的に修飾して可視化する場合にも使用されている。 アビジンは、ビオチン以外の生体分子を直接検出するのに現在のところ使用さ れてはいない。 本発明の試薬は、別の手段として、抗体またはその抗原結合性フラグメントか ら構成することもできる。 本発明における抗体とは、全抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、 一般的にはいずれの免疫グロブリンクラスに属するものであってもよい。すなわ ち、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡ抗体である。抗体またはそのフラグメ ントは、動物性のものであってもよく、例えば哺乳動物由来のものであり、例え ば、マウス、ラットまたはヒト由来のものである。本発明における抗体は天然の 抗体またはそのフラグメントであってもよいが、所望に応じて、組換え抗体、す なわち、組換えＤＮＡ技術を用いて製造された抗体または抗体フラグメントであ ってもよい。 使用し得る特別の抗体または抗体フラグメントとしては、（１）抗原結合性部 位の少なくとも一部が別異の抗体由来であるようなもの、例えば、１つの抗体の 超可変または相補性決定領域が第２の別の抗体の可変フレームワーク領域内に融 合（グラフト）されているような抗体（例えば、ヨーロッパ特許明細書第239400 号に記載されているようなもの）；（２）非Fv配列が他の別異の抗体由来の非Fv 配列によって置換されているような組換え抗体またはフラグメント（例えば、ヨ ーロッパ特許明細書第171469、173494および194276号に記載されているようなも の）；または（３）実質的に自然の免疫グロブリンの構造を保有する組換え抗体 またはフラグメントであるが、ヒンジ部が該自然免疫グロブリンに見出されるの とは異なる数のシステイン残基を有し、且つ、該組換え抗体またはフラグメント の表面ポケットの１つまたはそれ以上のシステイン残基が該自然免疫グロブリン に存在する他のアミノ酸残基に置換されているもの（例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ ／ＧＢ88／00730 およびＰＣＴ／ＧＢ88／00729 に記載されているようなもの） が含まれる。 本発明における抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ポリクローナル抗 体由来のものでもよく、または、モノクローナル抗体由来のものでもよい。該抗 体またはフラグメントは多数のエピトープに特異的なものでもよく、または、１ つのエピトープに特異的なものでもよい。 抗原結合性の抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ′）₂、Ｆａｂ′ もしくはＦａｂフラグメントのような、全抗体をタンパク質分解することによっ て得られ るフラグメント、またはＦｖフラグメントのような組換えＤＮＡ技術によって得 られるフラグメント（例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ８８／00747 に記載され ているようなもの）が挙げられる。 本発明に従う抗体は、周知の免疫学的手法を用い、アビジンまたはストレプト アビジンが特異的であるような（単数または複数の）エピトープ（またはそのミ モトープ）を抗原として使用して、ビオチンに対してアビジンまたはストレプト アビジンと実質的に同じ結合特異性を有するような抗体またはその抗原結合性フ ラグメントを生成することにより調製することができる。すなわち、例えば、エ ピトープまたはアジュバンに結合したエピトープまたはエピトープを有するペプ チドを適当な宿主に注入して、血清を集め、適当な精製および／または濃縮を行 う（例えば、アフィニティ媒体として固定化ストレス蛋白を用いるアフィニティ クロマトグラフィによる）ことにより所望のポリクローナル抗体を得ることがで きる。別の方法として、例えば、Kohler他による方法（1976，Eur．J．Immunol. ，6 ：511）を用いて細菌タンパク質を注入した宿主から脾臓細胞またはリンパ 球を回収して不死化させ、得られる細胞を分離するとモノクローナル抗体を産生 する単一の遺伝的細胞系を得ることができる。抗体フラグメントは、慣用的手法 、例えばペプシンまたはパパインを用いる酵素分解により製造することができる 。本発明に従う組換え抗体を製造することが所望される場合には、例えば、ヨー ロッパ特許明細書第171469、173494、194276および239400号に記載されているよ うな方法を用いて製造することができる。 本発明に従う抗体は、慣用的手法を用いて検出性ラベルで標識化されてもよく 、本発明はそのような標識化抗体または抗体複合体（コンジュゲート）を包含す るものである。 本発明における抗体の例として、シグマ(S1gma)社から供給されているモノク ローナル抗体ＢＮ−３４（Ｆ4024）がある。 実験によれば本発明の薬剤は損傷の受けた核酸塩基に特異的に結合することが できることが示されている（後述の「実験」の項参照）。 本発明の薬剤は損傷を受けた核酸塩基に結合し得る。本発明の薬剤は酸化的塩 基損傷核酸に結合し得る。 本発明の薬剤は損傷を受けたＤＮＡ塩基に結合し得る。本発明の薬剤は損傷を 受けたＲＮＡ塩基に結合し得る。 核酸塩基は、遊離の塩基の形態を成しているか、または、他の分子、例えば、 糖−リン酸骨格に結合されてＤＮＡまたはＲＮＡを形成しているものである。 酸化的に塩基が損傷を受けた核酸は、例えば、８−オキソグアニン、８−オキ ソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンまたは８−オキソデオキシアデノシ ンである。 本発明の薬剤は、一本鎖の核酸分子の損傷塩基に結合し得る。本発明の薬剤は 、二 本鎖の核酸分子の損傷塩基に結合し得る。 本発明の薬剤は損傷を受けた核のＤＮＡ塩基に結合し得る。本発明の薬剤は損 傷を受けたミトコンドリアＤＮＡに結合し得る。ミトコンドリアＤＮＡは限られ た修復能しか有しないことが示されており、核のＤＮＡよりもかなり酸化的損傷 を受け易い（Richter，C．他、1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，85：6465-6 467）。 本発明の薬剤は、損傷を受けた核酸塩基、特にＤＮＡまたはＲＮＡを検出する ための診断法に用いられることができる。そのような方法は標準的な試験法から 構成され、標的に対する薬剤の結合が検出され分析されることにより、損傷を受 けた核酸塩基の存否が判定される。例えば、薬剤（例えばアビジン）を固体の支 持体（担体）に結合させ、次に被験者由来のサンプルと接触させて、該サンプル からの損傷核酸塩基を効果的に精製する。適当な時間経過後、サンプルを取り除 き、支持体に結合した薬剤を調べて損傷核酸塩基の存在を知る。 このような試験法は、以下のような工程を含み得るものである： ａ）ＤＮＡまたはＲＮＡ含有サンプルと薬剤を反応させる工程； ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；および ｃ）サンプルと薬剤の結合反応の検出結果を、損傷ＤＮＡの存在および量と相 関させる工程。 さらに、本発明の薬剤は、混合物（例えば、反応混合物）から８−オキソグア ニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンまたは８−オキソデ オキシアデノシンを単に精製するのに用いることもできる。このような精製は、 例えば、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデ ニンまたは８−オキソデオキシアデノシンを製造するのに使用され得る。 本発明の薬剤は、ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法において使 用され得る。 本発明に従えば、さらに、核酸塩基損傷を検出する方法であって、 ａ）核酸塩基を含有するサンプルを、ビオチンに特異的に結合し且つ８−オキ ソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８−オ キソデオキシアデノシンの少なくとも１つに特異的に結合する分子を含む薬剤と 反応させる工程； ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合を検出する工程；および ｃ）サンプルと薬剤の結合反応の検出結果を、損傷核酸塩基の存在および量と 相関させる工程を含む方法が提供される。 前記分子は、酸化的塩基損傷核酸に結合し得るものである。該分子は損傷を受 けたＤＮＡ塩基に結合し得るものである。該分子は損傷を受けたＲＮＡ塩基に結 合し得るものである。 前記分子は、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合し得る。前記分子は、二 本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合し得る。 損傷核酸塩基は、損傷を受けた核のＤＮＡ塩基である場合がある。また、損傷 核酸塩基は、損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基である場合もある。 本発明の方法は、ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法となり得る 。 サンプルの試験を行うに際しては、ビオチンにより該サンプルが汚染されてい ないようにすることができる。 本発明に従う診断試験は医学的な診断、病理研究および職業上の健康管理など に適用することができ、さらに、体液やバイオプシー標本のスクリーニングに使 用できる。また、遺伝子毒性を有する可能性のある化合物について毒理学的スク リーニングを行うのに適用できる。 図面を参照する以下の説明から本発明がさらに明らかになるであろう。図面は 、損傷ＤＮＡを検出する１つの態様を例示のために示したにすぎない。各図の説 明は以下のとおりである。 図１は、ＵＶＡ処理した細胞に結合しているアビジンを示す。室温下に10分間 ＵＶＡを照射したＩＭＲ３２細胞の核にアビジン−FITCS（フルオレセインイソ チオシアネート）が結合した。細胞は照射直後に固定化し透過性化した。アビジ ン−FITCS により抗体の結合（図示していない）を可視化した。一次抗体の非存 在下に、照射細胞の核物質にアビジンが結合した（Ｂ）。対照には結合が認めら れなかった（Ａ）。 図２は、ビオチンおよび８−オキソグアニンの最適化構造を示す。デスクトッ プ分子モデル(Desktop Molecular Modelling)プログラムを用いて、グアニンの 最も一般的な互変異性体、８−ヒドロキシグアニンおよび８−オキソデオキシグ アノシンの６,８−ジケト互変異性体、ならびにビオチンの最適化構造を求めた ものである。 図３は、毛細管電気泳動法により測定したビオチンおよび８−オキソグアニン に対するアビジンの結合特性を示す。ビオチン（Ａ）または８−オキソグアニン （Ｂ）（いずれも濃度は100 μＭ）にアビジンを濃度を変化させながら添加し、 毛細管電気泳動法により非結合ビオチンまたは８−オキソグアニンの量（パーセ ント）を測定し、ビオチンまたは８−オキソグアニンに対するアビジンの結合比 を１：４と仮定した理論上の残存量に対してプロットしたものである。 図４は、酸化的変性を受けたＤＮＡに対するアビジンの特異性を示す。一本鎖 ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの双方をメチレンブルーで処理して、酸化的変性によ る塩基損傷を引き起こした。ELISA（酵素結合イムノソルベント分析）プレート （Ａ）（ｎ＝８）、または４％(w/v)のパラホルムアルデヒドを用いて固定化し たMultiScreen（ＲＴＭ）ろ過プレート（Ｂ）（ｎ＝８）に、メチレンブルーま たは非変性ＤＮＡ（100 μg/ml）を結合させ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ （ＨＲＰ）−複合化(conju gated)アビジンの結合レベルを分光光度計を用いて測定した。正常なＤＮＡに関 して、＊は95％レベルで有意であるもの、＊＊は99％レベルで有意なものを示す 。幾つかの競争物質について、パラホルムアルデヒドで固定化されメチレンブル ーで処理された二本鎖ＤＮＡへのアビジンの結合に対する阻害能を調べた（Ｃ） 。ｎ＝８（但し、８−オキソデオキシグアノシンおよび８−オキソグアニンにつ いてはｎ＝４）。 図５は、８−オキソデオキシグアノシンおよびその非変性デオキシヌクレオシ ドアナログに対するアビジンの結合特性を示す。８−オキソデオキシグアノシン およびデオキシグアノシンに対するFITCS-複合化アビジンの結合性（Ａ）を、固 定化細胞の基質に結合したいろいろな濃度の塩基への結合レベルによって評価し た。結合の最大値と最小値の違い（パーセント）としてデータを表している（Ａ ）。８−ＯＨｄＧ（８−オキソデオキシグアノシン）またはｄＧ（デオキシグア ノシン）のいずれかに対するアビジンの結合性の最大値と最小値との間には統計 学的な差は認められなかった。FITCS が複合した抗ビオチンモノクローナル抗体 の８−オキソデオキシグアノシンおよびデオキシグアノシンに対する結合性（Ｂ ）をアビジンの結合性と比較して、固定化細胞の基質に結合したいろいろな濃度 の塩基への結合レベルで示した。アビジン−FITCS に関して観測された結合性の 最大値（パーセント）としてデータを表している。数値はｎ＝８における平均値 ±平均値の標準偏差（ＳＥＭ）である。示しているデータは代表的な実験におけ るものである。 図６は、過酸化水素で処理したＩＭＲ細胞に対するアビジンの結合特性を示す 。ＨＢＳＳ（Hanks の緩衝塩溶液）に溶かした濃度の異なる過酸化水素溶液に１ 時間接触させた後、ＩＭＲ３２神経芽細胞腫培養物に新鮮な完全培地を添加し24 時間培養した後、FITCS-複合化アビジンを用いてアビジンの結合レベルを評価し た（Ａ）。ＭＴＴ（３−(4,5)−ジメチル−チアゾール−２−イル−2,5 −ジフ ェニルテトラゾリウムブロミド）分析を用いて、細胞毒性を評価した。数値はｎ ＝８における平均値±平均値の標準偏差（ＳＥＭ）である。ANOVA（分散分析） 法およびScheffe 多重レンジ試験法を用いる対照を含む群から95％の信頼度で有 意に差があるものを＊で示す。示しているデータは代表的な実験におけるもので ある。 図７は、過酸化水素で処理したＩＭＲ３２細胞内でアビジンが結合した核の所 在位置を示す。過酸化水素（100μＭ）を含むＨＢＳＳ（Ａ）または含まないＨ ＢＳＳ（Ｂ）に１時間ＩＭＲ３２細胞を接触させた直後のアビジン位置を細胞の 顕微鏡写真(×200)に示すものである。アビジンの結合に対するビオチンの阻害 能（Ｃ）、８−オキソデオキシグアノシンの阻害能（Ｄ）およびグアニンの阻害 能（Ｅ）（濃度はいずれも100 μＭ）についても調べた。 図８は、ＵＶＡ照射したＩＭＲ３２細胞に対するアビジンの結合特性を示す。 分化したＩＭＲ細胞にＵＶＡを照射（最大0.2mJ cm^-2）し、照射直後または照射 から24時 間後のアビジン−FITCSの結合性を調べた（Ａ）。照射24時間後についてはアビ ジンの細胞結合性に対するα−トコフェロールを用いる予備培養の効果について 調べた（Ｂ）。ＭＴＴ分析により、照射24時間後の細胞の生存率を調べた（Ｃ） 。数値はｎ＝８における平均値±平均値の標準偏差（ＳＥＭ）である。ANOVA（ 分散分析）法およびScheffe 多重レンジ試験法を用いる対照を含む群から95％の 信頼度で有意に差があるものを＊で示す。示しているデータは代表的な実験にお けるものである。 図９は、運動神経ニューロン症(ＭＮＤ：motor neurone disease)患者由来の 運動皮質切片に対するアビジンの結合性を示すものである。運動皮質の凍結切片 （12μＭ）を固定化し、パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ（リン酸緩衝塩溶液）中 ２％w/v）、次に氷冷メタノールを用いて透過性化した。Ａ：65才男性の対照用 ；Ｂ：69才女性のＭＮＤ患者；Ｃ：75才女性のＭＮＤ患者；Ｄ：74才女性の対照 用。アビジン−FITCSはＭＮＤの皮質切片に直接結合することが認められた。 実験（実施例） 材料 ＩＭＲ３２神経芽細胞腫細胞（継代数66）は、ＥＣＡＣＣ（European Collect ion of Animal Cell Cultures）(在Porton Down，Salisbury)から入手した。 アビジン−FITCS 複合体は、シグマ(Sigma)社（Ａ2050）から、抗ビオチン−F ITCS 複合体ヒツジモノクローナル抗体（クローン番号BN-34）(Ｆ4024)として入 手したものである。 ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ複合体（コンジュゲー ト）はBiotrin 社(在Dubilin，Eire)から入手した。 ＵＶＡランプ(366nm)は、Knight Optical Technologies 社からOptical Radio meterとして入手したものである。 セントリコン(Centricon)ミクロ濃縮装置はアミコン（Amicon）社（在Stoneho use（英国））製である。 ＤＮＡ塩基：８−オキソデオキシグアノシンは、Udenfriendシステム（Kasai およびNishimura，1984，Mutation Research，12：2137-2145）に従って実験室 で合成し、エレクトロスプレー質量スペクトル法によりその純度を確認した。分子モデル デスクトップ(Desktop)分子モデル(Oxford University Press，1994)プログラ ムを利用して、酸化された塩基とビオチンの３次元モデルを作製した。該プログ ラムにより構造の最小化を行った。毛細管電気泳動法による結合分析 ８−オキソグアニン（シグマ社製）およびビオチン（シグマ社製）の両方に対 する アビジンの結合性を毛細管電気泳動法を用いて検討した（Poon他、1995、前述の 文献）。ベックマン(Bechman)社製Ｐ／ＡＣＥ2200（英国High Wycombe在）を用 い付属のSystem GOld（ＲＴＭ）ソフトウェアで制御しながら電気泳動を実施し た。分析は全て、全長57cmで内径75μｍの未処理溶融シリカ毛細管を用いて行っ た。ビオチンおよび８−オキソグアニンの分析は自由帯域毛細管電気泳動法によ って行った。８−オキソグアニン溶液（最終濃度100 μＭ）またはビオチン溶液 （最終濃度100 μＭ）にアビジンを添加して、84％から０％の間の理論上の結合 比が得られるようにした。得られた溶液をCentricon ミクロ濃縮装置に通し（ビ オチン溶液および８−オキソグアニン溶液のそれぞれに対して、C Con30 および C Con10 をそれぞれ適用）、濃縮物を４℃において2000rpmで20分間遠心分離に 供した。次いで、氷の上に配置した後、ＣＥにより分析した。電気泳動液として 、0.45μｍのフィルターに通した10mMのテトラホウ酸ナトリウム(ｐＨ9.3)を用 いた。正圧（0.5psi）でサンプルに25℃において５秒間負荷をかけた。操作時間 は30kVの電圧下に10分間とし、リンス時間は0.17分（約10.2 秒）とした。200nm における吸光度により検出を行い、既知の標準物質と比較した。ピーク高さか ら各化合物の濃度を推定した。酸化されたＤＮＡの調製 メチレンブルーでＤＮＡを処理することにより、残留するデオキシグアノシン が酸化されて８−オキソデオキシグアノシンとなる。氷の上に配置され上向きに したペトリ皿ふた内の0.5cm の水により白色光源（光源とＤＮＡの距離は３cm） から遮蔽されたペトリ皿に入れたメチレンブルー（最終濃度20μg/ml、0.1 Ｍの tris中、ｐＨ8.5）の存在下にＤＮＡ（0.5mg/mlの水溶液）をインキュベートし た。３時間照射を行い、その間に固形状の塩化ナトリウムを添加して最終濃度が １Ｍとなるようにし、エタノールでＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを取り出し脱イ オン水に溶解させた。該ＤＮＡを再沈殿させ、２回洗浄して残存するメチレンブ ルーを除去した。酵素を結合させたアビジンの結合性分析 アビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（アビジン−ＨＲＰ）（シグマ社 製）のメチレンブルー処理ＤＮＡに対する結合性を未処理ＤＮＡに対する結合性 と比較した。ＤＮＡをメチレンブルーで処理すると、８−オキソデオキシグアノ シンのような酸化された塩基生成物が得られる。ＤＮＡに対するアビジンの結合 特異性を明確にするため競争実験を実施した。損傷ＤＮＡおよび未損傷ＤＮＡは ＥＬＩＳＡプレートに結合する。当初の実験においては、ＰＢＳ（50μｌ／ウェ ル）中50μg/mlの濃度で、未損傷およびメチレンブルー処理した二本鎖および一 本鎖ＤＮＡをＥＬＩＳＡプレート（Nunc製、ImmunoプレートMaxisorp（ＲＴＭ） ）に結合させた。しかしながら、各種の処理後に残存するＤＮＡの量を定量する のは困難であるので、本実験においてはMillipore Multiscreen（ＲＴＭ）ろ過 プレートを用いた。かくして、96ウェルを備 えるMultiscreen-HVプレートのウェル（100μｌ／ウェル）に、未損傷およびメ チレンブルーで処理した二本鎖および一本鎖のＤＮＡ（水中100mg/ml）を添加し た。これらのプレートのウェルの基板は、0.45mMで疎水性のタンパク質結合性が 低いDurapore（ＲＴＭ）膜である。これらの実験においては、４％(w/v)のパラ ホルムアルデヒドのＰＢＳ(ｐＨ7.4)溶液（100μｌ／ウェル）を用いて室温下で ５分間ＤＮＡを固定化した。固定化後、真空マニホルドを用い水相をろ過除去し た。1.0 ％(w/v)ゼラチンのＰＢＳ溶液中で５分間ＤＮＡをインキュベートする ことにより非特異的結合部位をブロックした。次いで真空ろ過によりブロック溶 液を取り除き、ＰＢＳで３回ウェルを洗浄した。アビジン−ＨＲＰをウェルに添 加し（ＰＢＳ中500 倍稀釈、50μｌ／ウェル）、37℃において加湿器内で１時間 インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、50μｌ／ウェルのｏ−フェニレ ンジアミン（0.05Ｍのリン酸−クエン酸中0.5mg/ml、ｐＨ5.0 ；Ｈ ₂ Ｏ₂を置換す るため0.03％(w/v)の過ホウ酸ナトリウムを含有）を基質として、結合したペル オキシダーゼ標識化アビジンの検出を行った。室温下に20分間、２ＭのＨ₂ＳＯ₄ （25μｌ／ウェル）を用いて反応を停止させ、492nm における生成物の分光測を 行った。 競争実験として、アビジン−ＨＲＰを稀釈して(１：500)競争物質と考えられ る物質の溶液を作製し、ＤＮＡ調製液に直接添加した。競争物質は使用直前に直 接添加した。競争物質は使用直前にＰＢＳ中で調製し、ｐＨを7.4 に修正した。細胞培養 ＩＭＲ３２（継代数66）細胞系は、ＥＣＡＣＣ（英国Porton Down，Salisbury 在）から入手した。該細胞の維持は95％空気、５％ＣＯ₂から成る加湿雰囲気化 に37℃において行った。10％(v/v)のＨＩＦＣＳ（熱不活化ウシ胎児血清）およ び１％(v/v)の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含むα−最少必須培地内でＩＭＲ 細胞系を恒常的に維持した。いずれの場合でも抗生物質は用いなかった。 ストック培養物は対数増殖期に準集密的に維持した。15回以内で培養物を継代 させた後、凍結ストックに復帰させた。少量の新鮮培地内で振動させることによ りＩＭＲ細胞を分離してハーベストおよび継代接種に供した。 ゲージ19のニードルにより軽く粉砕することにより新鮮培地に細胞を再懸濁し た。ストックを維持するために、約２×１０⁶細胞／75cm²フラスコの割合で細胞 を再び接種した。 全ての実験の前に培養物は化学的に分化させた。蛍光定量法およびＭＴＴ（３ −(4,5)−ジメチル−チアゾール−２−イル−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブ ロミド）代謝測定によりＤＮＡ損傷を定量するために、96−ウェルのプレートで 細胞を培養した。５′−ブロモデオキシウリジン（１×10^-5M）を含む200 μｌ の培地（５％(v/v)のＨＩＦＣＳおよび１％(v/v)の非必須アミノ酸を含むα−Ｍ ＥＭ）を有するウェ ル当たり２×１０⁵ヶの細胞の割合で96−ウェルのプレートにＩＭＲ３２細胞を 接種し、時間を変えて分化を行わせた（Thomas，S．M．およびAnderton，B．H. ，1991，Toxic．In Vitro，5 ：173-180）。蛍光による細胞化学分析のためには 、５′−ブロモデオキシウリジン（１×10^-5Ｍ）を含む300 μｌの培地（５％(v /v)のＨＩＦＣＳおよび１％(v/v)の非必須アミノ酸を含むα−ＭＥＭ）を有する ウェル当たり２×10⁵ヶの細胞の割合で、８−チャンバーのプラスチック製LabTe k（ＲＴＭ）スライドに細胞を接種した。８−オキソデオキシグアニンの蛍光結合分析（ＦＢＡ） ＩＭＲ３２の培養物を前述したように96−ウェルプレートで増殖させ分化させ た。未処理の培養物を前述のように固定化し透過性化して基質とした。この基質 に８−オキソデオキシグアノシンが結合してＦＡＡｓが行われ得るようになる。 種々の濃度の正常塩基または酸化塩基をこれらのプレート状で１時間培養した（ 100 μｌ／ウェル）。 次いで該ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで３回洗浄した後、アビジン−複合化Ｆ ＩＴＣＳ（ＰＢＳ中で200 倍稀釈、１時間）またはFITCS-複合化抗ビオチンモノ クローナル抗体（ＰＢＳ中で80倍稀釈、１時間）を用いて結合した塩基を可視化 した。励起波長485nm および発光波長535nm とし、蛍光プレートリーダー（英国 Denly，Billingshurst）を用いて結合のレベルを定量した。過酸化水素処理 分化処理後、培地を注意深く吸引し、各ウェル（200 μｌ）に予め加温したHa nks緩衝液（ＨＢＳＳ）を添加した。この際、該緩衝液は、各種濃度の新たに調 製した過酸化水素を含むものと含まないものを用いた。過酸化水素を用いて１時 間培養物をインキュベートした後、ＨＢＳＳを新鮮な培地（５％(v/v)のＨＩＦ ＣＳおよび１％(v/v)の非必須アミノ酸を含むα−ＭＥＭ）と交換し、標準的な 培養条件下に24時間回復させた後、ＭＴＴ分析により細胞死を評価し、蛍光分析 によりアビジンの結合性を評価した。ＵＶＡ露光 分化細胞をＵＶＡ照射に供した。この照射は、脂質相抗酸化剤α−トコフェロ ールによる予備培養を行ったものと行わないものについて行った。各実験におい てラジオメーターによりＵＶＡ照射レベルをモニターした。照射24時間前に現存 の培地に、抗酸化剤を最終濃度が200 μＭとなるように添加した（原料は使用直 前にメタノール中で調製した）。対照用の培養物は等量のビヒクル（エタノール ）が添加されたものである。照射前に培地を取り除き細胞をＨＢＳＳで洗浄した 。室温下に上方から細胞に照射を行った。対照にも照射した。細胞の固定化は前 述したように行った。ＭＴＴ分析 ミトコンドリアのコハク酸デヒドロゲナーゼによるＭＴＴの還元（Mosmann．T .，1983，Immunol．Methods 65（1-2）：55-63）は標準的な比色法による細胞毒 性分析法である。各測定時点の１時間前に20μｌのＭＴＴ(ＰＢＳ中５mg/ml)を 各ウェルに添加し細胞培養物を37℃で１時間インキュベートした。培地を注意深 く吸引し、各ウェルに100 μｌのイソプロパノールを添加して生存細胞内に沈着 したホルマザン生成物を溶解させた。プレートを５分間攪拌した後走査式マルチ ウェル分光光度計で550nmにおける吸光度を読みとり、該ホルマザン生成物が完 全に溶解していることを確認した。アビジン結合性の蛍光測定 ＰＢＳで細胞を洗浄した後、2％(w/v)のパラホルムアルデヒド（ｐＨ7.4 のリ ン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中）を15分間添加することにより細胞を予め固定化し た。加温したＰＢＳ中で細胞を洗浄した。培養物を固定化し氷冷したメタノール で15分間透過性化し、ＰＢＳ中で再水和した後、10％(w/v)の正常ヤギ血清（Ｎ ＧＳ）を含有するＰＢＳを用いてブロッキングした。0.2％(w/v)ＮＧＳを含有す るＰＢＳを用いてブロッキング液を洗い去った。アビジン−複合化フルオレセイ ンイソチオシアネート（ＦＩＴＣＳ）（ＰＢＳ中200 倍稀釈、１時間）、または FITCS-複合化抗ビオチンモノクローナル抗体（ＰＢＳ中80倍稀釈、１時間）を用 いてＤＮＡ損傷を可視化することにより、蛍光顕微鏡観測または蛍光プレートリ ーダー(英国Denley，Billingshurst)による定量分析に供した。アビジン結合性の阻害 変性ＤＮＡおよびビオチンについて、過酸化水素処理した細胞に対するアビジ ンの結合性の阻害能を調べた。ビオチン、グアニンおよび８−オキソデオキシグ アノシンの100 μＭ溶液をＰＢＳ(ｐＨ7.4)を用いて使用直前に調製した。この ように競争物質と考えられるものにアビジン−ＦＩＴＣＳ（シグマ社製）を添加 し(１：100)、暗中で室温下に１時間予備的にインキュベートした。対照として 競争物質を含まないＰＢＳも同時に処理した。得られた溶液をミクロ遠心機で５ 分間（室温）10,000g で遠心分離し、上清を結合性実験に用いた。該溶液を用い て固定化細胞を暗中で室温下に１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳ中 で３回洗浄した後、Vectorshield（ＲＴＭ）（英国PeterboroughのVector Labor atories 製）（グリセロール系の抗漂白マウントである）を用いてスライドにカ バースリップを取り付けた。病理学的検討用組織片 発光している凍結組織片を室温下に15分かけて解凍した後、氷上で0.5 ％のグ ルタルアルデヒドを含む４％(w/v)のパラホルムアルデヒド(リン酸緩衝塩溶液（ ＰＢＳ）、ｐＨ7.4)を添加することにより固定化し、ＰＢＳおよび食塩で洗浄し た。得られたサンプルをアルコールで脱水した後、0.3 ％の過酸化水素を含むメ タノール中で15 分間インキュベートすることにより内生ペルオキシダーゼをブロックした。サン プルを再水和し、ＰＢＳ中で洗った。アビジン−複合化フルオロセインイソチア ネート(ＦＩＴＣＳ)（ＰＢＳ中200 倍稀釈）を１時間接触させることによりアビ ジンの結合を可視化した。組織片を充分に洗った後、Vectorshield（ＲＴＭ）（ 英国PeterboroughのVector Laboratories 製）（グリセロール系の抗漂白マウン トである）を用いて組織片にカバースリップを取り付けた後、顕微鏡観察を行っ た。統計学的解析 データの解析にはStatgraphics V.5.0プログラム（米国マサチューセッツ州Ｓ ＴＳＣInc.製）を用いた。解析の前に確率プロットによりデータの正規分布また は非母数分布を調べた。分散分析法（ＡＮＯＶＡ）および95％信頼度におけるSc heffe 多重レンジテスト法を用いて正規分布データへの影響を調べた。２つのサ ンプルの比較には95％信頼度におけるスチューデント式テストを採用した。結果 当初に見出されたことは、驚くべきことに、ＵＶＡで処理された細胞において 抗体が全く存在しない場合にアビジン−複合体がＤＮＡに結合したということで ある。ＵＶＡ処理された核にアビジン−ＦＩＴＣＳが結合することが見出された が（図１のＢ）、対照の照射細胞の核には結合は認められなかった。 酸化的に変性されたＤＮＡ塩基と天然のリガンドであるビオチンの構造的類似 性を検討した結果、非変性塩基グアニンとビオチンの間には殆ど類似性は存しな いが、８−オキソグアニンおよび８−オキソグアノシンの両者の6,8 −ジケト互 変異性体の最適化構造（Aida，M.およびNishimura，S.，1987，Mutation Resear ch，192 ：83-89）はビオチンと構造的類似性を有する（図２）。８−オキソグ アニンの6,8 −ジケト互変異性体および８−オキソデオキシグアノシンの6,8 − ジケト互変異性体はいずれも、ビオチンと共通するイミダジリドン基を有してい る。但し、デオキシリボース基は、８−オキソデオキシグアノシンのイミダジリ ドンのＮ³に結合している。ビオチンの２つの環は融合してシス体となっており 、また、吉草酸側鎖はイミダジリドン環に関してシスである（Green，N．M.，19 72，Adv．Protein Chem.，29：85-131 ）。８−オキソグアニンおよび８−オキ ソデオキシグアノシンのいずれも類似のアルキル基を有してはいないが、８−オ キソデオキシグアノシンの糖基は２つの環構造に対して類似の位置関係にあり、 また、リボース分子内の２つの酸素基は吉草酸のカルボキシル基の２つの酸素に 対して類似の位置関係にある（図２）。 アビジンに対するビオチンの結合度を示すために毛細管電気泳動法を用いて、 各種の濃度のアビジンでインキュベーションした後のビオチンの消失を観測した （図３）。結合比としてアビジン１ヶに対して４ヶのビオチン分子が結合すると 仮定した場合、非結合ビオチンの回収は予測される理論値に非常に近いものであ った。同様の手法を 適用して、８−オキソグアニンに対するアビジンの結合能を検討した。アビジン で予備的にインキュベートすると、８−オキソグアニンの検出レベルは、ビオチ ンで見られたように見かけ上１：４の比率で減少した（図３）。 メチレンブルーでＤＮＡを処理すると酸化的塩基損傷が得られ、特に８−オキ ソデオキシグアノシンが生成する。ＥＬＩＳＡ式の分析を適用して、メチレンブ ルーで損傷を受けたＤＮＡに対するアビジンの親和性を検討した。メチレンブル ー処理した一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に対するアビジンの結合レベ ルは、正常なＤＮＡに対して見られるよりも大きいものであった（図４のＡ）。 正常な一本鎖ＤＮＡおよびメチレンブルー処理された一本鎖ＤＮＡの両方に対す る結合のレベルは、二本鎖ＤＮＡに対するものよりもかなり大きいものであった 。パラホルムアルデヒド（４％(w/v)）を用いてＤＮＡを固定化すると二本鎖Ｄ ＮＡに対するアビジンの結合レベルは増大し、その結果、正常な一本鎖ＤＮＡお よび二本鎖ＤＮＡに対する結合レベルには有意な差が存在しなくなった（図４の Ｂ）。メチレンブルー処理されたＤＮＡに対するアビジンの結合性を正常ＤＮＡ に対する結合性と比較するときわめて有意な差が認められた。メチレンブルー処 理されたＤＮＡに対するアビジンの結合レベルは正常ＤＮＡに対するものよりも かなり大きいものであったが、非処理ＤＮＡに対しても結合は存在する。しかし ながら、市販のＤＮＡは多くの処理を受けており、また、ここで用いたような実 験の範囲内においてもＤＮＡは酸化的損傷から保護されていない。市販のウシ胸 腺中の８−オキソグアニンのレベルをＨＰＬＣで測定した（示さず）ところ、そ のレベルは0.4nmol/mgＤＮＡまたは3.2mol/10⁵mol グアニンであった。競争実験 によれば、８−オキソデオキシグアノシンと共にインキュベートすると、メチレ ンブルーで処理された二本鎖ＤＮＡに対するアビジンの結合阻害が大きくなった （図４のＣ）。グアニンおよびグアノシンにも結合阻害能があったが、アビジン の濃度(約10^-8Ｍ)に対して阻害剤の濃度は高い（約1000倍）ものであった。 ビオチンおよびモノクローナル抗体のアビジンに対する結合性を調べるために 、各種の濃度の８−オキソデオキシグアノシンまたはデオキシグアノシンを固定 化細胞質材料の基質に結合させた。アビジン結合は８−オキソデオキシグアノシ ンが10^-5Ｍのときに最大となり、その後は濃度（結合）はほぼ一定のレベルに維 持された（図５のＡ）。これとは対照的に、デオキシグアノシンに対する結合性 は濃度の上昇とともに増大し、デオキシグアノシンが10^-6Ｍで最大となった（図 ５のＢ）。これらの実験において０％値および100％値は統計学的には異ならな い。抗ビオチンモノクローナル抗体は、アビジンと同程度の特異性を有しないよ うであり、８−オキソデオキシグアノシンおよびデオキシグアノシンの両方に対 する結合性の最大値は10^-9Ｍのときであったが、損傷ＤＮＡを未損傷ＤＮＡと識 別することは可能であった（図５のＣおよびＤ）。同じ実験でデオキシヌクレオ シドの濃度を同じにした場合、抗体の結合レベル はアビジンの結合レベルよりかなり低いものであった。 ＩＢＲ培養物（24時間にわたって分化したもの）を過酸化水素に１時間接触さ せることにより、過酸化水素濃度に関してアビジン−ＦＩＴＣＳの結合性がかな り有意に増大する（ＡＮＯＶＡによるｐ＝0.0026）。過酸化水素10nMの場合（図 ６のＡ）、アビジンの結合レベルは、対照を含有する群よりも統計学的な相違が 見られた。対照の培養物に関して認められた蛍光の固有レベルは、顕微鏡分析で 認められるように、アビジン−ＦＩＴＣＳの固有の結合のレベルが低いことに因 るものであり、細胞質材料の自己蛍光に因るものである。結合のレベルは過酸化 水素が100nM のときに一定状態になった。これに対して、当初の接触から24時間 後の明白な細胞死は、過酸化水素の濃度が100 μＭ以上になったときにのみ認め られた（図６のＢ）。アビジン−ＦＩＴＣＳの結合は主として培養物の核に存在 し（図７のＢ）、一方、過酸化水素で処理されない細胞には核への結合は認めら れなかった（図７のＡ）。 アビジン−ＦＩＴＣＳ結合がビオチンによる予備インキュベーションによって 妨げられるか否かということを明らかにするために阻害性の検討を行い、結合が 特異的なものであり、ビオチン結合部位が関与していること、さらに、競争物質 として８−オキソデオキシグアノシンも関与していることを確認した（図７のＡ 〜Ｅ）。最初の例として、過酸化水素と接触させた細胞とのインキュベーション の前に、該アビジン複合体を各種の競争物質と予備的にインキュベートした。予 測したように、10μＭビオチンとの予備的インキュベーションにより過酸化処理 細胞への結合が妨げられた（図７のＣ）。８−オキソデオキシグアノシンも結合 を妨げたが（図７のＤ）、グアニンは結合を妨げなかった（全て100 μＭにおい て）（図７のＥ）。これらの事実は、核へのＤＮＡへの結合にビオチン結合部位 が関与していることを示唆している。処理細胞に競争物質とアビジン−複合体を 同時に添加した競争実験も同様の結合阻害パターンを示した。 遊離ラジカル発生系により障害を受けている培養細胞中におけるＤＮＡに対す るアビジン−複合体の結合性は酸化が介在する現象に依存することを更に明らか にするため、抗酸化剤による該結合の妨害能を調べた。分化したＩＭＲ３２細胞 にＵＶＡ照射してＤＮＡ損傷を引き起こした。ＵＶＡ照射直後に該細胞にアビジ ンが結合することは明らかであり(ＡＮＯＶＡによるｐ＝0.008)、64mJ cm^-2およ びこれより強い照射を行った細胞に対する結合性は、対照含有群と統計学的異な っていた。24時間後の照射においては結合レベルはかなり大きく（ＡＮＯＶＡに よるｐ＝0.0005）、また、16mJ cm^-2しか照射しなかった細胞においてはその効 果は対照と有意に異なっていた(図８のＡ)。α−トコフェロール（200 μＭ）を 用いる予備インキュベーションは、短時間の照射ではアビジン結合性を減少させ たが、長時間照射後は結合性を減少させるのに効果的ではなかった。多重レンジ ＡＮＯＶＡ法によると、α−トコフェロール は検討した照射時間の全範囲にわたってアビジンの結合性を有意に減少させた( ｐ＝0.003)。照射後の培養物の生存率をＭＴＴで評価することにより、アビジン の結合が細胞の即死と関係していないことを明らかにした（図８のＣ）。生存率 に統計学的に有意な変化はなかった。ＭＴＴ代謝の上昇が認められなかったが、 これはα−トコフェロールによる予備インキュベーションで防止された。 神経変性障害で死亡した患者由来の死後の神経組織片に対するアビジン−ＦＩ ＴＣＳの結合性を年齢を合わせた対照と比較した（図９のＡ〜Ｄ）。該対照にも ある程度の結合は認められたが（ＡおよびＤ）、結合のレベルはＭＮＤ患者由来 のものの方がはるかに高かった。同様の方法を用いて他の身体組織の検討も容易 に行うことができる。ヒトの病理組織を用いることにより、この手法がインビト ロ系のみならず、組織にも適用できることが明らかである。考察 以上のようにアビジン、ストレプトアビジン、およびビオチン特異的抗体は損 傷を受けたＤＮＡに特異的に結合するが、従来の技術はこの点について教示して いない(例えば、Wood，G．S．およびWamke，R.，1981，J．Histochem．Cytochem .，29：1196-1204参照)。 純粋に化学的な系における結合性の検討により、非結合化合物の減少を調べる には最小限の予備的インキュベーションが必要であったことから、アビジンに対 する８−オキソグアニンの結合は極めて速いことが示唆された。結合比は、アビ ジンに対する理論比４：１に匹敵するものであり、各アビジン分子に４ヶの結合 部位が存在することと一致しており、また、アビジンの結合部位は８−オキソグ アニンの結合に関与していることを示唆している。 遊離ラジカルによって損傷を受けたＤＮＡに対するアビジンの結合性は、複合 体(コンジュゲート)にも検出の終点法にも依存しない。阻害実験は、さらに、Ｄ ＮＡに対するアビジンの結合が特異的であり、そして、ビオチンはアビジンの結 合を阻害することからアビジンのビオチン結合部位に依存することも示唆してい る。さらに、８−オキソデオキシグアノシンも結合をブロックし得るものであり 、したがって、このことは、該化合物もビオチン結合部位に結合することを示唆 している。グアニンおよびグアノシンもアビジンの結合を阻害するが、高濃度の 場合のみである。かくして、これらのデータは、当該結合がアビジンの結合部位 によって仲介されるものであることを強く示唆している。また、８−オキソデオ キシグアノシンの検出系としてアビジンの感度についても検討した。該基質に８ −オキソデオキシグアノシンが100 ％結合すると仮定すると、酸化されたＤＮＡ に対するアビジンの理論的（したがって控えめに見積もった）感度は、10⁴分子 の８−オキソデオキシグアノシンを検出し得ることを示唆している。 アビジンにより認識されるＤＮＡの構造は、α−トコフェロールで予めインキ ュベートされたＵＶＡ照射細胞に対するアビジンの結合が減少することから、酸 化性の遊離ラジカル機構により生じるものと考えられる。細胞に対するアビジン の結合性は、ＵＶＡ照射または過酸化水素を用いるインキュベーション［これら はいずれも酸化的ＤＮＡ損傷（８−オキソデオキシグアノシンの生成を含む）を 起こすための確立された手段である］が介在する障害作用に依存して上昇する。 他の細胞系（他の神経芽腫細胞腫および３Ｔ３繊維芽細胞を含む）を用いて、遊 離ラジカルが関与した損傷細胞に対するアビジンの結合性についても検討した。 アビジン−複合体は、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソグアニンお よびビオチンに対して類似の親和性を有するようである。アビジンを用いて、イ ンビトロの培養実験由来の固定化細胞材料および固定化病理学的組織片の両方に おけるＤＮＡに対する損傷を明らかにした。この手法は、広範囲の用途に適用し 得る。ＤＮＡは現在広く研究されているが、採用されている方法は高価で且つ時 間のかかるものである。８−オキソデオキシグアノシンは、広範な酸化的ＤＮＡ 損傷生成物の１つに過ぎないが(Dizdaroglu，M.，1994．Methods Enzymol.，234 ：3-16)、酸化的ＤＮＡ損傷のバイオマーカーとして許容されることが示唆され た。病理学的標本における８−オキソデオキシグアノシンを直接同定することが でき、同定の前に抽出や精製を必須条件としないことは魅力的で満足できるバイ オマーカーとなる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                             Analytical and therapeutic agents   The present invention relates to 8-oxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxo Drug used in a method for detecting adenine and 8-oxodeoxyadenosine In particular, the detection of damaged nucleic acids, the diagnosis of the nucleic acids and the nucleic acids The present invention relates to a drug used in a method for detecting a substance.   Damage to nucleobases, especially oxidative base damage to DNA, can lead to toxins, cancer It can occur from a number of causes, such as live and neurodegenerative disorders. Detect such damage It can be used for medical diagnosis, pathological research, and occupational health care. This is important from the perspective of   Current techniques for detecting nucleobase damage are triggered by oxygen free radicals. 8-oxoguanine, a marker sensitive to DNA base damage caused by [Kasai, H. And Nishimura, S., In: H. Sies, ed. “Oxidation Oxidative Stress: Oxidants and Antioxi dants) London: Academic Press, 1991: 99-116; N., 1989, Free Rad . Res. Commun.,7: 121-128], but 8-oxoguanine forms at least two It is only one of zero products.   Use of 8-oxoguanine as a marker for oxidative damage to DNA By using HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) First, the deoxynucleoside (8-oxodeoxyguanosine) in the DNA digest (Floyd, RA, et al., 1986, Free Rad. Res. Commun.,1: 163 -172). Alternatively, gas chromatography / mass spectrometry ( GC-MS) can be used to quantify 8-oxoguanine as a free base. (Dizdaroglu, M. 1994, Methods Enzymol.,234: 3-16) Is expensive and technically demanding. These two approaches were compared ( Halliwell, B .; And Dizdaroglu, M., 1992, Free Rad. Res. Commun,16: 75- 87), but the results obtained are inconsistent. Generally measured by GC-MS method The level of 8-oxoguanine produced is high, and in freshly isolated cells, G Values by C-MS are reported to be 2 to 11 times higher.   Many other means have been proposed for measuring 8-oxoguanine in DNA. ing.³²The post-label method using P has been established in the literature (Lu, LJ. W. Et al., Chem. Phamaceut. Bull. 39: 1880-1882 Povey, A. C. et al., In: DNA Postlabelling Methods for Detection of D NA Adducts). Lyon, 105-114). This method may provide a very sensitive detection method But it is very time-consuming and troublesome. 8-oxodeoxy by capillary electrophoresis Measurement of ciguanosine (Guarnieri, C. et al., 1994, J. Chromatogr.656: 209- 213) and 8-oxoguanine (Poon, KW et al., 1995, Biochem. Soc). . Trans.twenty three： 443s) Is also presented. To date, this method has Insufficient sensitivity because absorption measurements are inherently insensitive.   According to the invention, 8-oxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoguanine, Used in a method for detecting oxoadenine and 8-oxodeoxyadenosine A drug that specifically binds to biotin and contains 8-oxoguanine and 8-oxoguanine. Oxodeoxyguanosine, 8-oxoadenine and 8-oxodeoxyadene Nosin (8-hydroxyguanine and 8-hydroxydeoxyguanosine, respectively) , Known as 8-hydroxyadenine and 8-hydroxydeoxyadenosine That specifically bind to at least one of its most common tautomers An agent is provided, wherein the agent is comprised of a child.   The purine base guanine has little structural correlation with the biotin molecule. Only However, the detailed binding properties of avidin to damaged DNA are still unknown. However, the present inventors have found that it is a damage product of oxidative DNA damage. The 8-oxoguanine keto form is very similar in structure to biotin, and Avidin, streptavidin and anti- Biotin antibodies appear to have significant binding affinity.   Considering structural features, 8-oxoadenine and 8-oxodeoxya Avidin binds to these compounds because denocin has an imidaziridone group. Strongly suggests a match.   "Specifically binds" means that the agent binds to a specific (single or multiple) epitope Has a specific affinity for it. Avidin is at least biotin, Specifically binds to 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanine , These molecules have the same or substantially the same epitope. This specificity Antibodies specific for epitopes of polypeptides that are also specific for mimotope (Geysen, HM, et al., 1987, Journal of Immnological Methods,102: 259-27 4) (Structure) similarity. However, the sequence of the mimotope corresponds to the sequence of the polypeptide. It can be different from a column.   The drug of the present invention is substantially equivalent to biotin with avidin or streptavidin. Can have the same binding specificity. Further, the drug of the present invention is 8-oxo. Guanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadenine and 8-oxo Avidin or streptoa for at least one of sodeoxyadenosine Substantially the same as Vidin It can have the same binding specificity.   “Same binding specificity” refers to an agent (eg, a fragment, analog, antibody or antibody). Is an antigen-binding fragment) that is substantially identical to avidin or streptavidin Mean specific for the same (single or multiple) epitopes.   The agent of the present invention is selected from one of the group consisting of avidin and streptavidin. I can do it.   The agent of the present invention may be a fragment or avidin or streptavidin. It may be composed of a nalog. Characterize avidin and streptavidin Denature to produce a desired fragment of the molecule, eg, a biotin binding portion of the molecule. It is easy to obtain a fragment consisting of only the minutes. Analog (avidin or Or an analog of the streptavidin molecule itself or an analog of a fragment of the molecule. Log) can also be prepared. For example, biotin molecules or damaged DN An analog having a changed binding specificity or binding affinity for A is prepared. Is also good.   "Avidin or streptavidin fragments or analogs" A fragment or analog of an avidin or streptavidin molecule, , Biotin, and 8-oxoguanine, 8-oxodeoxyguano At least one of syn, 8-oxoadenine and 8-oxodeoxyadenosine One that specifically binds to   The present inventors have surprisingly found that avidin, streptomycin and anti-biotin Antibodies are 8-oxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoa Detection of denine and 8-oxodeoxyadenosine and therefore damaged It has been found that it can be used for the detection of nucleic acids, especially damaged DNA.   Avidin is a naturally occurring factor found in egg whites, Remarkable affinity (Ka = 10^FifteenM^-1(Bayer, EA and Ichek, M., 19). 90, Methods in Enzymol.,184 : 49-67) and Streptomyces a Business (Streptomyces avidinii) -Derived bacterial analog streptoa Vidin also has substantially the same binding affinity and specificity.   Biotin molecule (Green, NM, 1972, Adv. Protein Chem.,29: 85-131) is sparse Aqueous is large and consists of a ureido group and an imidaziridone ring. The molecule Avidin interacts entirely with the avidin binding site, and avidin is a stable Two clusters arranged to contain the four biotin binding sites It is thought to be. An analog consisting of small fragments of the biotin molecule A wide range of compounds can bind to avidin, but similar compounds at the 10 mM level Does not bind significantly (Green, 1972, supra), suggesting that It is considered that the binding of vidin has relatively high specificity.   Avidin is primarily used as a secondary tool in detection and amplification in research and practical applications. It is widely used in both techniques. Detect biotin in immunoassays In this case, the primary antibody is directly conjugated with biotin, Is bound via a biotinylated secondary antibody. In addition, target molecules such as bases It is also used for visualization by chemical modification by tinification.   Avidin is currently used to directly detect biomolecules other than biotin. Not.   The reagents of the present invention may alternatively comprise an antibody or an antigen-binding fragment thereof. Can also be configured.   The antibody in the present invention is a whole antibody or an antigen-binding fragment thereof, Generally, it may belong to any immunoglobulin class. Sand That is, for example, an IgM, IgG or IgA antibody. Antibody or its fragment The animal may be of animal origin, for example, of mammalian origin, e.g. For example, it is of mouse, rat or human origin. Antibodies in the present invention are naturally occurring It may be an antibody or a fragment thereof, but if desired, a recombinant antibody, That is, antibodies or antibody fragments produced using recombinant DNA technology. You may.   Specific antibodies or antibody fragments that can be used include (1) antigen-binding portion Such that at least a portion of the positions are derived from different antibodies, eg, one antibody A hypervariable or complementarity determining region is fused within the variable framework region of a second separate antibody. Antibodies (eg, European Patent Specification 239400) (2) the non-Fv sequence is derived from another different antibody; A recombinant antibody or fragment (eg, As described in European Patent Specification Nos. 171469, 173494 and 194276. Or; (3) a recombinant antibody having substantially the structure of a natural immunoglobulin Or a fragment, wherein the hinge region is found in the innate immunoglobulin. The recombinant antibody or fragment has a different number of cysteine residues than One or more cysteine residues in the surface pocket of the innate immunoglobulin (For example, in PCT application PCT) / GB88 / 00730 and PCT / GB88 / 00729) Is included.   The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is a polyclonal antibody. It may be derived from the body or from a monoclonal antibody. The anti The body or fragment may be specific for multiple epitopes, or It may be specific for one epitope.   Examples of antigen-binding antibody fragments include F (ab ')_Two, Fab ' Alternatively, proteolysis of whole antibodies, such as Fab fragments, Obtained Or recombinant DNA techniques such as Fv fragments. Fragments described in, for example, PCT application PCT / GB88 / 00747. That you have).   Antibodies according to the present invention can be prepared using known immunological techniques, The epitope (s) (or its epitopes) for which avidin is specific Avidin or streptose against biotin using An antibody or an antigen-binding antibody thereof having substantially the same binding specificity as avidin; It can be prepared by producing a fragment. That is, for example, Epitope or epitope-bearing peptide bound to pitope or adjuvant The peptide is injected into a suitable host, the serum collected, and subjected to appropriate purification and / or concentration. (Eg, affinity using immobilized stress protein as the affinity medium) Chromatography) to obtain the desired polyclonal antibody. Wear. Alternatively, for example, the method of Kohler et al. (1976, Eur. J. Immunol. ,6: 511) from a host injected with bacterial proteins using spleen cells or lymph Collect and immortalize spheres and isolate the resulting cells to produce monoclonal antibodies A single genetic cell line can be obtained. Antibody fragments can be prepared using conventional techniques. , For example, by enzymatic degradation using pepsin or papain . If it is desired to produce a recombinant antibody according to the invention, for example, No. 171469, 173494, 194276 and 239400. It can be manufactured using such a method.   Antibodies according to the present invention may be labeled with a detectable label using conventional techniques. The invention encompasses such labeled antibodies or antibody conjugates. Things.   As an example of the antibody in the present invention, a monoclonal antibody supplied from Sigma (S1gma) There is a lonal antibody BN-34 (F4024).   Experiments have shown that the agents of the present invention can specifically bind to damaged nucleobases. This is shown to be possible (see the "Experiment" section below).   The agents of the present invention may bind damaged nucleobases. The agent of the present invention is an oxidizing salt It can bind to base damaged nucleic acids.   The agents of the present invention can bind to damaged DNA bases. The agent of the present invention Capable of binding to the received RNA base.   The nucleobase may be in the form of a free base or other molecules, for example, It is linked to a sugar-phosphate skeleton to form DNA or RNA.   Nucleic acids with oxidatively damaged bases include, for example, 8-oxoguanine, 8-oxo Sodeoxyguanosine, 8-oxoadenine or 8-oxodeoxyadenosine It is.   The agents of the present invention can bind to damaged bases on single-stranded nucleic acid molecules. The drug of the present invention ,two It can bind to damaged bases of a single-stranded nucleic acid molecule.   The agents of the present invention can bind to damaged nuclear DNA bases. The drug of the present invention It can bind to damaged mitochondrial DNA. Mitochondrial DNA is limited Has much better oxidative damage than nuclear DNA (Richter, C. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,85： 6465-6 467).   The agents of the invention detect damaged nucleobases, especially DNA or RNA Can be used for diagnostics. Such methods are based on standard test methods Damage by detecting and analyzing the binding of the drug to its target. The presence or absence of the digit nucleobase is determined. For example, a drug (eg, avidin) may be Bound to a carrier and then contacted with a sample from the subject, Effectively purifies damaged nucleobases from After a suitable time, remove the sample The presence of the damaged nucleobase is then determined by examining the drug bound to the support.   Such a test method may include the following steps:   a) reacting a drug with a sample containing DNA or RNA;   b) detecting a binding reaction between the sample and the agent; and   c) The detection result of the binding reaction between the sample and the drug is compared with the presence and amount of the damaged DNA. Related process.   In addition, the agents of the present invention can be used to prepare 8-oxoguar from a mixture (eg, a reaction mixture). Nin, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadenine or 8-oxode Oxyadenosine can also be used to simply purify. Such purification For example, 8-oxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadene It can be used to produce nin or 8-oxodeoxyadenosine.   The agents of the present invention may be used in methods of treating or diagnosing the human or animal body. Can be used.   According to the present invention, there is further provided a method for detecting nucleobase damage,   a) A sample containing nucleobases is specifically bound to biotin and Soguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadenine and 8-oxo An agent comprising a molecule that specifically binds to at least one of xodeoxyadenosine; Reacting;   b) detecting binding between the sample and the agent; and   c) The detection result of the binding reaction between the sample and the drug is determined based on the presence and amount of the damaged nucleobase. A method is provided that includes the step of correlating.   The molecule is capable of binding to oxidative base damaged nucleic acids. The molecule is damaged It is capable of binding to a single-stranded DNA base. The molecule binds to damaged RNA bases. It is possible to match.   The molecule can bind to a damaged nucleobase of a single-stranded nucleic acid molecule. The molecule is two It can bind to damaged nucleobases of a single-stranded nucleic acid molecule.   Damaged nucleobases can be damaged nuclear DNA bases. Also damage The nucleobase may be a damaged mitochondrial DNA base.   The method of the present invention can be a method of treating or diagnosing the human or animal body .   When testing samples, make sure they are not contaminated with biotin. Can not be.   Diagnostic tests according to the invention include medical diagnostics, pathological research and occupational health care And can be used to screen body fluids and biopsy specimens. Can be used. Toxicological screening for compounds that may have genotoxicity Applicable for leaning.   The present invention will become more apparent from the following description with reference to the drawings. The drawing is One embodiment for detecting damaged DNA is provided by way of example only. Theory of each figure The details are as follows.   FIG. 1 shows avidin binding to UVA-treated cells. 10 minutes at room temperature Avidin-FITCS (fluorescein isoform) was added to the nuclei of IMR32 cells irradiated with UVA. Thiocyanate). Cells were fixed and permeabilized immediately after irradiation. Avige Antibody binding (not shown) was visualized by 1-FITCS. Absence of primary antibody In the presence, avidin bound to the nuclear material of the irradiated cells (B). Control shows binding Not (A).   FIG. 2 shows the optimized structures of biotin and 8-oxoguanine. Desk top Guanine using the Desktop Molecular Modeling program. The most common tautomers, 8-hydroxyguanine and 8-oxodeoxyg Optimized structures of 6,8-diketo tautomers of anosine and biotin were determined. Things.   FIG. 3 shows biotin and 8-oxoguanine measured by capillary electrophoresis. 2 shows the binding properties of avidin to Avidin. Biotin (A) or 8-oxoguanine (B) avidin was added to the mixture (all at a concentration of 100 μM) while changing the concentration, The amount of unbound biotin or 8-oxoguanine (percentage) was determined by capillary electrophoresis. ) And the binding ratio of avidin to biotin or 8-oxoguanine Is plotted against the theoretical residual amount assuming 1: 4.   FIG. 4 shows the specificity of avidin for oxidatively denatured DNA. Single strand Both DNA and double-stranded DNA are treated with methylene blue and subjected to oxidative denaturation. Caused base damage. ELISA (enzyme-linked immunosorbent analysis) plates (A) Immobilization using (n = 8) or 4% (w / v) paraformaldehyde Methylene blue was added to the MultiScreen (RTM) filtration plate (B) (n = 8). Or non-denatured DNA (100 μg / ml) and bind to horseradish peroxidase. (HRP)-conjugation (conju gated) The binding level of avidin was measured using a spectrophotometer. Normal DNA * Indicates that it is significant at the 95% level, and ** indicates that it is significant at the 99% level . For some competitors, methylene chloride immobilized in paraformaldehyde (C) was examined for its ability to inhibit the binding of avidin to double-stranded DNA treated with . n = 8 (however, for 8-oxodeoxyguanosine and 8-oxoguanine) N = 4).   FIG. 5 shows 8-oxodeoxyguanosine and its non-denatured deoxynucleoside. Figure 4 shows the binding properties of avidin to the analogs. 8-oxodeoxyguanosine The binding (A) of FITCS-conjugated avidin to deoxyguanosine and Assessed by the level of binding to various concentrations of base bound to the substrate of the formatted cells Was. The data is expressed as the difference (percent) between the maximum value and the minimum value of the bond (A ). 8-OHdG (8-oxodeoxyguanosine) or dG (deoxyguanosine) (Nosin) between the maximum and minimum avidin binding No biological difference was observed. FITCS conjugated anti-biotin monoclonal antibody Binding to 8-oxodeoxyguanosine and deoxyguanosine (B ) Is compared to the binding of avidin at various concentrations bound to the substrate of the immobilized cells. Is shown at the level of binding to the base. Avidin-FITCS Observed Binding Properties Data is expressed as the maximum value (percent). The numerical value is the average value at n = 8 ± The standard deviation of the mean (SEM). Data shown are for a typical experiment Things.   FIG. 6 shows the binding properties of avidin to IMR cells treated with hydrogen peroxide. . 1% solution of hydrogen peroxide in different concentrations dissolved in HBSS (Hanks' buffered salt solution) After a period of contact, fresh complete medium was added to the IMR32 neuroblastoma culture for 24 hours. After incubation for hours, avidin binding levels were assessed using FITCS-conjugated avidin. (A). MTT (3- (4,5) -dimethyl-thiazol-2-yl-2,5-diif Enyltetrazolium bromide) assay was used to assess cytotoxicity. Number is n = Mean value ± standard deviation of mean value (SEM) at = 8. ANOVA (Analysis of Variance) Method and a 95% confidence level from the group containing the control using the Scheffe multi-range test method. Those with a difference are indicated by *. The data shown is from a representative experiment is there.   FIG. 7 shows the location of avidin-bound nuclei in IMR32 cells treated with hydrogen peroxide. Indicates your location. HBSS (A) with or without hydrogen peroxide (100 μM) The avidin position immediately after contacting the IMR32 cells with BSS (B) for 1 hour was This is shown in a micrograph (× 200). Inhibition of biotin on avidin binding Ability (C), ability to inhibit 8-oxodeoxyguanosine (D) and inhibition of guanine Noh (E) (all concentrations were 100 μM) was also examined.   FIG. 8 shows the binding properties of avidin to UVA-irradiated IMR32 cells. Irradiate the differentiated IMR cells with UVA (maximum 0.2 mJ cm^-2) And immediately or after irradiation From 24:00 The avidin-FITCS binding after a short time was examined (A). 24 hours after irradiation Effect of preculture with α-tocopherol on cell binding of gin (B). Cell viability 24 hours after irradiation was examined by MTT analysis (C). . The numerical values are the average value at n = 8 ± standard deviation of the average value (SEM). ANOVA ( Analysis of variance) and 95% of the group containing controls using the Scheffe Those with a significant difference in reliability are indicated by *. The data shown is for a typical experiment. It is   FIG. 9 shows the results from a motor neurone disease (MND) patient. FIG. 4 shows the binding of avidin to motor cortical slices. Frozen sections of motor cortex (12 μM) immobilized in paraformaldehyde (PBS (phosphate buffered saline)) 2% w / v) and then permeabilized with ice-cold methanol. A: For 65-year-old male control B: 69-year-old female MND patient; C: 75-year-old female MND patient; D: 74-year-old female control for. Avidin-FITCS was found to bind directly to cortical sections of MND.                               Experiment (Example) material   IMR32 neuroblastoma cells (passage 66) were obtained from ECACC (European Collect ion of Animal Cell Cultures (Porton Down, Salisbury).   Avidin-FITCS conjugate was obtained from Sigma (A2050) using anti-biotin-F Entered as ITCS-conjugated sheep monoclonal antibody (clone number BN-34) (F4024) It was a hand.   Streptavidin-horseradish peroxidase complex (conjugation G) was obtained from Biotrin (Dubilin, Eire).   UVA lamp (366nm) is available from Knight Optical Technologies It was obtained as a meter.   Centricon microconcentrators are available from Amicon (Stoneho use (UK)).   DNA base: 8-oxodeoxyguanosine is obtained from the Udenfriend system (Kasai And Nishimura, 1984, Mutation Research,12: Laboratory according to 2137-2145) And its purity was confirmed by electrospray mass spectrometry.Molecular model   Desktop molecular model (Oxford University Press, 1994) Using the system, a three-dimensional model of the oxidized base and biotin was created. The blog Ram was used to minimize the structure.Binding analysis by capillary electrophoresis   Compatible with both 8-oxoguanine (Sigma) and biotin (Sigma) Do Avidin binding was examined using capillary electrophoresis (Poon et al., 1995, supra). Literature). For use with P / ACE2200 from Bechman (High Wycombe, UK) Perform electrophoresis while controlling with the included System GOld (RTM) software. Was. All analyzes were performed using untreated fused silica capillaries with a total length of 57 cm and an inner diameter of 75 μm. Was. Biotin and 8-oxoguanine were analyzed by free band capillary electrophoresis. I went. 8-oxoguanine solution (final concentration 100 μM) or biotin solution (Final concentration 100 μM) plus avidin to give a theoretical binding between 84% and 0% Ratio was obtained. Pass the resulting solution through a Centricon microconcentrator (bi For each of the otine solution and the 8-oxoguanine solution, C Con30 and C Con10) and centrifuge the concentrate at 2000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. Provided. They were then placed on ice and analyzed by CE. As electrophoresis liquid Using 10 mM sodium tetraborate (pH 9.3) passed through a 0.45 μm filter Was. The sample was loaded at 25 ° C. for 5 seconds at positive pressure (0.5 psi). Operation time For 10 minutes under a voltage of 30 kV, and a rinsing time of 0.17 minutes (about 10.2 seconds). 200nm  The detection was carried out by the absorbance at, and compared with a known standard substance. Peak height From these, the concentration of each compound was estimated.Preparation of oxidized DNA   Treatment of DNA with methylene blue results in residual deoxyguanosine. Is oxidized to 8-oxodeoxyguanosine. Placed on ice and facing upwards 0.5cm of water in the lid of the Petri dish that has been cleaned (white light source and DNA is 3cm) Methylene blue (final concentration 20 μg / ml, 0.1 M) in a Petri dish shielded from Incubate DNA (0.5 mg / ml in water) in the presence of tris, pH 8.5) Was. Irradiate for 3 hours, during which time add solid sodium chloride to a final concentration The mixture was adjusted to 1M, and the DNA was precipitated with ethanol. Remove DNA and remove Dissolved in water. The DNA is reprecipitated, washed twice and the remaining methylene Lou was removed.Binding analysis of avidin with enzyme   Avidin-horseradish peroxidase (avidin-HRP) (Sigma) Of methylene blue treated DNA to untreated DNA And compared. When the DNA was treated with methylene blue, 8-oxodeoxyguano was obtained. An oxidized base product such as syn is obtained. Avidin binding to DNA Competition experiments were performed to clarify the specificity. Damaged and undamaged DNA Binding to ELISA plate. In the initial experiment, PBS (50 μl / well) was used. Undamaged and methylene blue treated duplexes and 50 μg / ml The single-stranded DNA is transferred to an ELISA plate (Nunc, Immunoplate Maxisorp (RTM)). ). However, the amount of DNA remaining after various treatments is quantified In this experiment, Millipore Multiscreen (RTM) filtration Plates were used. Thus, 96 wells are available The wells (100 μl / well) of the new Multiscreen-HV plate Double- and single-stranded DNA (100 mg / ml in water) treated with Tylene Blue was added. Was. Substrates in the wells of these plates have hydrophobic protein binding at 0.45 mM. Low Durapore (RTM) membrane. In these experiments, a 4% (w / v) param Formaldehyde in PBS (pH 7.4) solution (100 µl / well) at room temperature The DNA was immobilized for 5 minutes. After immobilization, the aqueous phase was removed by filtration using a vacuum manifold. Was. Incubate DNA for 5 minutes in 1.0% (w / v) gelatin in PBS This blocked non-specific binding sites. Then, block dissolve by vacuum filtration. The solution was removed, and the wells were washed three times with PBS. Avidin-HRP added to wells (500-fold dilution in PBS, 50 μl / well) for 1 hour in a humidifier at 37 ° C. Incubated. After three washes with PBS, 50 μl / well o-phenylene Diamine (0.5 mg / ml in 0.05 M phosphoric acid-citric acid, pH 5.0; H _Two O_TwoReplace Containing 0.03% (w / v) of sodium perborate Oxidase-labeled avidin was detected. 2M H for 20 minutes at room temperature_TwoSO_Four (25 μl / well) and stop the reaction and measure the product spectroscopy at 492 nm. went.   As a competition experiment, avidin-HRP was diluted (1: 500) and considered to be a competitor. Was prepared and added directly to the DNA preparation. Competitive substances immediately before use It was added directly. Competitors were prepared in PBS immediately before use and the pH was corrected to 7.4.Cell culture   The IMR32 (passage 66) cell line is an ECACC (Porton Down, Salisbury, UK) )). The cells are maintained in 95% air, 5% CO_TwoHumidification atmosphere consisting of At 37 ° C. 10% (v / v) HIFCS (heat-inactivated fetal bovine serum) and IMR in α-minimal essential medium containing 1% (v / v) non-essential amino acids (NEAA) The cell line was constantly maintained. No antibiotics were used in any case.   Stock cultures were maintained semi-confluent during the log phase. Passage the culture within 15 times After that, it was returned to the frozen stock. By shaking in a small amount of fresh medium IMR cells were isolated and subjected to harvest and passage.   Resuspend cells in fresh medium by gently grinding with a gauge 19 needle. Was. About 2 × 10 to maintain stock⁶Cell / 75cm^TwoCells in flask proportion Was inoculated again.   Cultures were chemically differentiated before all experiments. Fluorometric assay and MTT (3 -(4,5) -dimethyl-thiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium Lomido) 96-well plates to quantify DNA damage by metabolic measurements Cells were cultured. 5'-bromodeoxyuridine (1 × 10^-Five200 μl containing M) Medium (α-M containing 5% (v / v) HIFCS and 1% (v / v) non-essential amino acids EM) 2 × 10 per le^FiveIMR32 cells in a 96-well plate at a rate of The cells were inoculated and allowed to differentiate at different times (Thomas, SM and Anderton, BH. , 1991, Toxic. In Vitro,Five: 173-180). For cytochemical analysis by fluorescence 5,5'-bromodeoxyuridine (1 × 10^-FiveM) containing 300 μl of medium (5% (v / v) with HIFCS and 1% (v / v) α-MEM with non-essential amino acids) 2 × 10 per well^FivePer cell, 8-chamber plastic LabTe k (RTM) slides were inoculated with cells.Fluorescence binding assay (FBA) for 8-oxodeoxyguanine   Cultures of IMR32 were grown and differentiated in 96-well plates as described above. Was. Untreated cultures were immobilized and permeabilized as described above to provide substrates. This substrate Is bound to 8-oxodeoxyguanosine to allow FAAs to be performed. Various concentrations of normal or oxidized bases were incubated on these plates for 1 hour ( 100 μl / well).   The ELISA plate was then washed three times with PBS, followed by avidin-conjugated F ITCS (200-fold dilution in PBS, 1 hour) or FITCS-conjugated anti-biotin mono Visualize bound base using clonal antibody (80-fold dilution in PBS, 1 hour) did. Excitation wavelength 485nm and emission wavelength 535nm, fluorescent plate reader (UK) Denly, Billingshurst) was used to quantify the level of binding.Hydrogen peroxide treatment   After the differentiation treatment, the medium was carefully aspirated, and the pre-warmed Ha nks buffer (HBSS) was added. At this time, the buffer is newly prepared at various concentrations. Those containing and not containing hydrogen peroxide were used. 1 hour with hydrogen peroxide After incubating the interculture, HBSS was replaced with fresh medium (5% (v / v) HIF (Α-MEM containing CS and 1% (v / v) non-essential amino acids) After 24 hours recovery under culture conditions, cell death was assessed by MTT analysis and fluorescence analysis Was used to evaluate the binding of avidin.UVA exposure   Differentiated cells were subjected to UVA irradiation. This irradiation is performed by the lipid phase antioxidant α-tocophero. And those without preculture. In each experiment The UVA irradiation level was monitored with a radiometer. Exist 24 hours before irradiation Antioxidant was added to the medium at a final concentration of 200 μM. Previously prepared in methanol). Control cultures consist of an equal volume of vehicle (ethanol ) Is added. The medium was removed before irradiation and the cells were washed with HBSS . The cells were irradiated from above at room temperature. Controls were also irradiated. Before immobilization of cells Performed as described.MTT analysis   Reduction of MTT by mitochondrial succinate dehydrogenase (Mosmann. T ., 1983, Immunol. Methods65(1-2): 55-63) is a standard colorimetric cytotoxin Sex analysis method. One hour before each measurement, 20 μl of MTT (5 mg / ml in PBS) The cell culture was added to each well and incubated at 37 ° C for 1 hour. Careful media Aspirate and add 100 μl of isopropanol to each well to deposit in living cells The formazan product was dissolved. After stirring the plate for 5 minutes, Read the absorbance at 550 nm with a well spectrophotometer and confirm that the formazan product is complete. It was confirmed that it was completely dissolved.Avidin binding fluorescence measurement   After washing the cells with PBS, 2% (w / v) paraformaldehyde (pH 7.4 The cells were pre-fixed by the addition of acid buffered saline (PBS) for 15 minutes. Was. Cells were washed in warm PBS. Immobilized culture and ice-cooled methanol For 15 minutes and rehydrated in PBS before 10% (w / v) normal goat serum (N Blocking was carried out using PBS containing GS). Contains 0.2% (w / v) NGS The blocking solution was washed off with PBS. Avidin-complexed fluorescein Isothiocyanate (FITCS) (200-fold dilution in PBS, 1 hour), or Using FITCS-conjugated anti-biotin monoclonal antibody (80-fold dilution in PBS, 1 hour) Visualization of DNA damage by fluorescence microscopy or fluorescent plate (Billingshurst, Denley, UK).Inhibition of avidin binding   Avidin for cells treated with hydrogen peroxide for denatured DNA and biotin Was examined for its ability to inhibit binding. Biotin, guanine and 8-oxodeoxyg A 100 μM solution of anosine was prepared using PBS (pH 7.4) immediately before use. this Avidin-FITCS (manufactured by Sigma) is added to those considered to be competitors (1: 100) and pre-incubated for 1 hour at room temperature in the dark. As a control PBS without competitor was also treated. The resulting solution is microcentrifuged for 5 The mixture was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes (room temperature), and the supernatant was used for binding experiments. Using the solution The fixed cells were incubated for 1 hour at room temperature in the dark. Slides in PBS After washing three times with Vectorshield (RTM) (Vector Labor, Peterborough, UK) atories) (made of glycerol-based anti-bleaching mount). A bur slip was attached.Tissue pieces for pathological examination   Thaw the luminescent frozen tissue debris for 15 minutes at room temperature, then add 0.5% 4% (w / v) paraformaldehyde containing rutaraldehyde (phosphate buffered saline ( (PBS), pH 7.4) and washed with PBS and saline. Was. After dehydrating the obtained sample with alcohol, a sample containing 0.3% hydrogen peroxide 15 in Tanol Endogenous peroxidase was blocked by incubating for minutes. Sun The pull was rehydrated and washed in PBS. Avidin-conjugated fluorescein isothia Contact with FITCS (200-fold diluted in PBS) for 1 hour Gin binding was visualized. After thoroughly washing the tissue pieces, Vectorshield (RTM) ( Manufactured by Vector Laboratories of Peterborough, UK) (glycerol anti-bleaching mount After attaching a coverslip to the tissue piece using Was.Statistical analysis   Statgraphics V.5.0 program (S.M., USA) for data analysis TSC Inc.) was used. Before analysis, a probability plot is used to determine the normal distribution or Examined the non-parameter distribution. Analysis of variance (ANOVA) and Sc at 95% confidence The influence on the normal distribution data was examined using the heffe multiple range test method. Two sa Student tests with 95% confidence were used for sample comparison.result   What was initially found is, surprisingly, that in cells treated with UVA The avidin-complex bound to DNA when no antibody was present is there. Avidin-FITCS was found to bind to UVA-treated nuclei However (FIG. 1B), no binding was observed in the nuclei of the control irradiated cells.   Structural analogy between oxidatively modified DNA bases and the natural ligand biotin As a result of examination of the similarity, there is almost no similarity between the undenatured base guanine and biotin. However, the 6,8-diketo mutual of both 8-oxoguanine and 8-oxoguanosine. Optimized structure of mutants (Aida, M. and Nishimura, S., 1987, Mutation Resear ch,192: 83-89) has structural similarity to biotin (Figure 2). 8-oxog The 6,8-diketo tautomer of anine and the 6,8-diketo tautomer of 8-oxodeoxyguanosine All diketo tautomers have an imidaziridone group in common with biotin. You. However, the deoxyribose group is the imidaziri of 8-oxodeoxyguanosine. Don's N^ThreeIs bound to. The two rings of biotin are fused to form cis And the valeric acid side chain is cis with respect to the imidaziridone ring (Green, NM, 19 72, Adv. Protein Chem.,29: 85-131). 8-oxoguanine and 8-oxo None of the sodeoxyguanosines have a similar alkyl group, but the 8- The sugar group of xodeoxyguanosine has a similar positional relationship to the two ring structures, Also, the two oxygen groups in the ribose molecule are replaced with the two oxygens of the carboxyl group of valeric acid. They have a similar positional relationship to each other (FIG. 2).   Using capillary electrophoresis to show the degree of biotin binding to avidin, Biotin disappearance observed after incubation with various concentrations of avidin (FIG. 3). When the binding ratio of four biotin molecules to one avidin is Assuming unbound biotin recovery is very close to the expected theoretical value Was. A similar approach In addition, the ability of avidin to bind to 8-oxoguanine was examined. Avidin After pre-incubation with, the level of detection of 8-oxoguanine is As shown in FIG. 3, the apparent decrease was at a ratio of 1: 4 (FIG. 3).   Treatment of DNA with methylene blue results in oxidative base damage, especially in 8-oxo Sodeoxyguanosine is produced. Applying the ELISA-type analysis, The affinity of avidin for DNA damaged by roux was examined. Methylene bull -Binding level of avidin to both treated single- and double-stranded DNA Was larger than that seen for normal DNA (FIG. 4A). For both normal single-stranded DNA and methylene blue-treated single-stranded DNA Levels of binding were significantly greater than for double-stranded DNA. . Immobilization of DNA with paraformaldehyde (4% (w / v)) results in double-stranded D The level of binding of avidin to NA is increased, resulting in normal single-stranded DNA and And there was no significant difference in the level of binding to double-stranded DNA (FIG. 4). B). Avidin binding to methylene blue treated DNA A very significant difference was observed when compared to the binding to Methylene blue The binding level of avidin to treated DNA is higher than that to normal DNA. Although large, binding is also present for untreated DNA. However However, commercially available DNA has undergone a number of treatments, and DNA is not protected from oxidative damage even within the limits of the experiment. Commercial bovine breast The level of 8-oxoguanine in the gland was measured by HPLC (not shown) and was determined. Level is 0.4 nmol / mg DNA or 3.2 mol / 10^Fivemol guanine. Competition experiment According to that, when incubated with 8-oxodeoxyguanosine, Inhibition of avidin binding to double-stranded DNA treated with immunoglobulin increased (C in FIG. 4). Guanine and guanosine also had the ability to inhibit binding, but avidin Concentration (about 10^-8The concentration of the inhibitor was higher (about 1000-fold) than that of M).   To investigate the binding of biotin and monoclonal antibodies to avidin Immobilizes various concentrations of 8-oxodeoxyguanosine or deoxyguanosine Bound to a substrate of activated cytoplasmic material. Avidin bond is 8-oxodeoxyguanosine 10^-FiveThe maximum is reached at M, after which the concentration (binding) is maintained at a nearly constant level. (A in FIG. 5). In contrast, binding to deoxyguanosine Increases with increasing concentrations, with 10^-6The maximum was at M (Fig. 5B). The 0% and 100% values in these experiments were statistically different. No. Anti-biotin monoclonal antibodies do not have the same specificity as avidin. For both 8-oxodeoxyguanosine and deoxyguanosine. Maximum connectivity is 10^-9M, but the damaged DNA was identified as undamaged DNA. It was possible to distinguish (C and D in FIG. 5). Deoxynucleose in the same experiment Antibody binding level for the same SID concentration Was significantly lower than the binding level of avidin.   IBR cultures (differentiated over 24 hours) were exposed to hydrogen peroxide for 1 hour. Avidin-FITCS binding with respect to hydrogen peroxide concentration. (P = 0.0026 by ANOVA). In the case of 10 nM hydrogen peroxide (Figure 6A), the binding level of avidin is statistically different from the group containing the control Was seen. The intrinsic level of fluorescence observed for control cultures was As can be seen, due to the low level of intrinsic binding of avidin-FITCS, And is due to autofluorescence of the cytoplasmic material. The level of binding is peroxidation The state became constant when hydrogen was 100 nM. 24 hours from initial contact Subsequent apparent cell death was observed only when the concentration of hydrogen peroxide was greater than 100 μM. (FIG. 6B). Avidin-FITCS binding is mainly in the nucleus of the culture On the other hand, cells not treated with hydrogen peroxide showed no nuclear binding (FIG. 7B). (A in FIG. 7).   Avidin-FITCS binding is induced by pre-incubation with biotin Investigation of inhibitory activity was performed to clarify whether or not the Specific, involving a biotin binding site, and As a result, it was confirmed that 8-oxodeoxyguanosine was also involved (A in FIG. 7). ~ E). As a first example, incubation with cells contacted with hydrogen peroxide Prior to, the avidin complex was pre-incubated with various competitors. Forecast As measured, pre-oxidation by preincubation with 10 μM biotin Binding to cells was prevented (FIG. 7C). Also binds 8-oxodeoxyguanosine Guanine did not interfere with binding (all at 100 μM). (E in FIG. 7). These facts suggest that the binding of DNA to the nucleus Is involved. Competitor and avidin-complex in treated cells Competition experiments added at the same time showed a similar binding inhibition pattern.   DNA in cultured cells damaged by free radical generating systems Further reveals that the binding properties of avidin-complexes depend on oxidation-mediated phenomena In order to achieve this, the ability of the antioxidant to block the binding was examined. Differentiated IMR32 cells UVA irradiation caused DNA damage. Avid treatment of the cells immediately after UVA irradiation Is apparently bound (p = 0.008 by ANOVA), 64 mJ cm^-2And Binding to cells irradiated more strongly than this was statistically different from the control group. I was At 24 hours post-irradiation, the binding level is quite large (ANOVA P = 0.0005), and 16mJ cm^-2In cells that have only been irradiated The result was significantly different from the control (FIG. 8A). α-tocopherol (200 μM) The pre-incubation used reduces avidin binding with short exposures. However, after long irradiation, it was not effective in reducing the binding. Multiple ranges According to the ANOVA method, α-tocopherol Significantly reduced avidin binding over the entire range of irradiation times studied ( p = 0.003). Avidin was evaluated by assessing the viability of cultures after irradiation by MTT. Was not associated with the immediate death of the cells (FIG. 8C). Survival rate Did not have a statistically significant change. Although no increase in MTT metabolism was observed, This was prevented by pre-incubation with α-tocopherol.   Avidin-FI on postmortem neural explants from patients who have died of neurodegenerative disorders TCS binding was compared to age-matched controls (FIGS. 9A-D). The control Although some binding was observed (A and D), the level of binding was from MND patients Was much higher. Easy examination of other body tissues using similar methods Can be done. By using human pathological tissue, this method can be used It is clear that the present invention can be applied to not only the system but also the organization.Consideration   As described above, avidin, streptavidin, and biotin-specific antibodies Although it specifically binds to damaged DNA, the prior art teaches in this regard. No (eg, Wood, GS and Wamke, R., 1981, J. Histochem. Cytochem .,29: 1196-1204).   Examining the reduction of unbound compounds by examining connectivity in purely chemical systems Required minimal preliminary incubation, It was suggested that the binding of 8-oxoguanine was extremely fast. The binding ratio is 4: 1 binding to each avidin molecule, equivalent to a theoretical ratio of 4: 1 to gin Site, and the binding site for avidin was 8-oxog It suggests that it is involved in the binding of anin.   The binding of avidin to DNA damaged by free radicals is complex. Neither the body (conjugate) nor the endpoint method of detection. Inhibition experiments further indicate that D Avidin binding to NA is specific, and biotin binds avidin. Inhibition also suggests that it depends on the biotin binding site of avidin You. In addition, 8-oxodeoxyguanosine can also block binding. Thus, this suggests that the compound also binds to the biotin binding site doing. Guanine and guanosine also inhibit avidin binding, but at high concentrations. Only if. Thus, these data indicate that the binding is avidin binding site Strongly suggests that it is mediated by Also, 8-oxodeo The sensitivity of avidin as a detection system for xyguanosine was also examined. 8 Assuming that oxodeoxyguanosine is 100% bound, oxidized DNA The theoretical (and therefore conservatively estimated) sensitivity of avidin to^Fourmolecule Of 8-oxodeoxyguanosine can be detected.   The structure of the DNA recognized by avidin is pre-inked with α-tocopherol. The reduced binding of avidin to UVA-irradiated cells It is thought to be caused by a labile free radical mechanism. Avidin on cells Binding was determined by UVA irradiation or incubation with hydrogen peroxide [these All show oxidative DNA damage (including the production of 8-oxodeoxyguanosine) Is an established means of raising], which rises depending on the intervening distress effects. Using other cell lines, including other neuroblastoma and 3T3 fibroblasts, The binding of avidin to injured cells involving free radicals was also examined.   The avidin-conjugate comprises 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoguanine and And seems to have a similar affinity for biotin. Using avidin, For both immobilized cell material and immobilized pathological tissue debris from in vitro culture experiments Damage to the DNA in the cells. This method is applicable to a wide range of applications. obtain. Although DNA is currently widely studied, the methods employed are expensive and sometimes It takes time. 8-Oxodeoxyguanosine has a wide range of oxidative DNA Although only one of the damage products, (Dizdaroglu, M., 1994. Methods Enzymol.,234 : 3-16), suggesting that it is acceptable as a biomarker of oxidative DNA damage. Was. Direct identification of 8-oxodeoxyguanosine in pathological specimens It is attractive and satisfactory to not require extraction or purification before identification. Become a marker.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年４月９日 【補正内容】 請求の範囲 １．８−オキソグアニン、８−オキソグアノシン、８−オキソアデニンおよび ８−オキソデオキシグアノシンを検出する方法において、ビオチンに特異的に結 合する分子を含むことを特徴とする薬剤の使用。 ２．該分子がビオチンに対してアビジンまたはストレプトアビジンと実質的に 同じ結合特異性を有することを特徴とする請求項１に従う薬剤の使用。 ３．該分子が、アビジンおよびストレプトアビジンから成る群の任意の１つか ら選ばれることを特徴とする請求項１に従う薬剤の使用。 ４．アビジンまたはストレプトアビジンのフラグメントまたはアナログを含む ことを特徴とする請求項１または２に従う薬剤の使用。 ５．該分子が抗体またはその抗原結合性フラグメントから成ることを特徴とす る請求項１または２に従う薬剤の使用。 ６．モノクローナル抗体から成ることを特徴とする請求項５に従う薬剤の使用 。 ７．モノクローナル抗体が、シグマ(Sigma)社から供給されるＢＮ−３４（Ｆ4 024）であることを特徴とする請求項６に従う薬剤の使用。 ８．前記分子が、損傷を受けた核酸塩基に結合することを特徴とする請求項１ 〜請求項７のいずれかに従う薬剤の使用。 ９．前記分子が、酸化的に塩基が損傷を受けた核酸に結合することを特徴とす る請求項８に従う薬剤の使用。 10．前記分子が、前記損傷ＤＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項８ま たは９のいずれに従う薬剤の使用。 11．前記分子が、前記損傷ＲＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項８〜 請求項10のいずれかに従う薬剤の使用。 12．前記分子が、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とす る請求項８〜請求項11のいずれかに従う薬剤の使用。 13．前記分子が、二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とす る請求項８〜請求項12のいずれかに従う薬剤の使用。 14．請求項８〜請求項13のいずれかに従う損傷核酸塩基を検出する方法に使用 され、該損傷核酸塩基が損傷を受けた核のＤＮＡ塩基であることを特徴とする薬 剤の使用。 15．請求項８〜請求項14のいずれかに従う損傷核酸塩基を検出する方法に使用 され、該損傷核酸塩基が損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基であることを 特徴とする薬剤の使用。 16．損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断テスト法に使用されるこ とを 特徴とする請求項10〜請求項15のいずかに従う薬剤の使用。 17．損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断テスト法に使用される薬 剤の使用であって、 ａ）該薬剤をＤＮＡまたはＲＮＡ含有サンプルと反応させる工程； ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；および ｃ）該サンプル−薬剤結合反応の検出結果を、損傷を受けたＤＮＡまたはＲ ＮＡの存在および量と相関させる工程を含むことを特徴とする請求項16に従う薬 剤の使用。 18．８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニ ンまたは８−オキソデオキシアデノシンを精製する方法に使用されることを特徴 とする請求項１〜請求項17のいずれかに従う薬剤の使用。 19．ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法に使用されることを特徴 とする請求項１〜請求項18のいずれかに従う薬剤の使用。 20．核酸塩基の損傷を検出する方法であって、 ａ）核酸塩基を含有するサンプルを、ビオチンに特異的に結合し且つ８−オ キソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８− オキソデオキシアデノシンの少なくとも１つに特異的に結合する分子を含む薬剤 と反応させる工程； ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；および ｃ）該サンプル−薬剤結合反応の検出結果を、損傷を受けた核酸塩基の存在 および量と相関させる工程を含むことを特徴とする方法。 21．前記分子が酸化的に損傷を受けた核酸塩基と結合することを特徴とする請 求項20に従う検出方法。 22．前記分子が、前記損傷を受けたＤＮＡ塩基に結合することを特徴とする請 求項20または21に従う検出方法。 23．前記分子が、前記損傷を受けたＲＮＡ塩基に結合することを特徴とする請 求項20〜請求項22のいずれかに従う検出方法。 24．前記分子が、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とす る請求項20〜請求項23のいずれかに従う検出方法。 25．前記分子が二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする 請求項20〜請求項24のいずれかに従う検出方法。 26．損傷核酸塩基が、損傷を受けた核のＤＮＡ塩基であることを特徴とする請 求項20〜請求項25のいずれかに従う検出方法。 27．損傷核酸塩基が、損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基であることを 特徴とする請求項20〜請求項26のいずれかに従う検出方法。 28．ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法であることを特徴とする 請求 項20〜請求項27のいずれかに従う検出方法。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] April 9, 1997 [Correction contents]                                 The scope of the claims   1.8-oxoguanine, 8-oxoguanosine, 8-oxoadenine and In a method for detecting 8-oxodeoxyguanosine, the method specifically binds to biotin. Use of a medicament characterized in that it contains a molecule that matches.   2. The molecule is substantially identical to avidin or streptavidin for biotin. Use of an agent according to claim 1, having the same binding specificity.   3. The molecule is any one of the group consisting of avidin and streptavidin Use of a medicament according to claim 1, characterized in that it is selected from the group consisting of:   4. Contains fragments or analogs of avidin or streptavidin Use of a medicament according to claim 1 or 2, characterized in that:   5. Characterized in that the molecule comprises an antibody or an antigen-binding fragment thereof. Use of a medicament according to claim 1 or 2.   6. Use of a medicament according to claim 5, consisting of a monoclonal antibody. .   7. A monoclonal antibody was obtained from BN-34 (F4 024) Use of a medicament according to claim 6, characterized in that:   8. 2. The molecule of claim 1, wherein the molecule binds to a damaged nucleobase. Use of a medicament according to any of claims 7 to 7.   9. The molecule binds oxidatively base-damaged nucleic acid. Use of a medicament according to claim 8.   Ten. 9. The method of claim 8, wherein the molecule binds to the damaged DNA base. Or use of an agent according to any of 9.   11． 9. The method of claim 8, wherein the molecule binds to the damaged RNA base. Use of a medicament according to any of the preceding claims.   12． The molecule binds to a damaged nucleobase of a single-stranded nucleic acid molecule. Use of a medicament according to any of claims 8 to 11.   13. The molecule binds to a damaged nucleobase of a double-stranded nucleic acid molecule. Use of an agent according to any one of claims 8 to 12.   14. Use for the method for detecting a damaged nucleobase according to any one of claims 8 to 13. Wherein the damaged nucleobase is a damaged nuclear DNA base. Use of agents.   15． Use for the method for detecting a damaged nucleobase according to any one of claims 8 to 14. And that the damaged nucleobase is a damaged mitochondrial DNA base. Use of characteristic drugs.   16． Used in diagnostic tests to detect damaged DNA or RNA And Use of a medicament according to any of claims 10 to 15, characterized in that:   17． Drugs used in diagnostic tests to detect damaged DNA or RNA Use of an agent,     a) reacting the drug with a sample containing DNA or RNA;     b) detecting a binding reaction between the sample and the agent; and     c) The detection result of the sample-drug binding reaction is determined by using the damaged DNA or R 17. A drug according to claim 16, comprising the step of correlating with the presence and amount of NA. Use of agents.   18.8-oxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadeni Or a method for purifying 8-oxodeoxyadenosine. Use of an agent according to any of claims 1 to 17.   19. Characterized for use in methods of treating or diagnosing the human or animal body Use of an agent according to any of claims 1 to 18.   20. A method for detecting damage to a nucleobase, comprising:     a) A sample containing nucleobases is specifically bound to biotin and Xoxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadenine and 8-oxoadenine Agent comprising a molecule that specifically binds to at least one of oxodeoxyadenosine Reacting with     b) detecting a binding reaction between the sample and the agent; and     c) The detection result of the sample-drug binding reaction is determined by the presence of a damaged nucleobase. And correlating with the amount.   twenty one. Wherein the molecule binds to an oxidatively damaged nucleobase. A detection method according to claim 20.   twenty two. Wherein the molecule binds to the damaged DNA base. A detection method according to claim 20 or 21.   twenty three. Wherein the molecule binds to the damaged RNA base. A detection method according to any one of claims 20 to 22.   twenty four. The molecule binds to a damaged nucleobase of a single-stranded nucleic acid molecule. A detection method according to any one of claims 20 to 23.   twenty five. Wherein the molecule binds to a damaged nucleobase of a double-stranded nucleic acid molecule. A detection method according to any one of claims 20 to 24.   26. The damaged nucleobase is a damaged nuclear DNA base. A detection method according to any one of claims 20 to 25.   27. That the damaged nucleobase is a damaged mitochondrial DNA base The detection method according to any one of claims 20 to 26, characterized in that:   28. It is a method of treating or diagnosing the human or animal body Claim 28. A detection method according to any one of claims 20 to 27.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ， ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI G01N 33/566 G01N 33/577 B 33/577 A61K 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK) , ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN , TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), UA (AZ, BY, KG, KZ, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB , BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, L R, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR , TT, UA, UG, US, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．８−オキソグアニン、８−オキソグアノシン、８−オキソアデニンおよび ８−オキソデオキシグアノシンを検出する方法に使用され、ビオチンに特異的に 結合し、且つ、８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキ ソアデニンおよび８−オキソデオキシアデノシンの少なくとも１に特異的に結合 する分子を含むことを特徴とする薬剤。 ２．該分子がビオチンに対してアビジンまたはストレプトアビジンと同じ結合 特異性を有することを特徴とする請求項１に従う薬剤。 ３．該分子が、アビジンおよびストレプトアビジンから成る群の任意の１つか ら選ばれることを特徴とする請求項１に従う薬剤。 ４．アビジンまたはストレプトアビジンのフラグメントまたはアナログを含む ことを特徴とする請求項１または２に従う薬剤。 ５．該分子が抗体またはその抗原結合性フラグメントから成ることを特徴とす る請求項１または２に従う薬剤。 ６．モノクローナル抗体から成ることを特徴とする請求項５に従う薬剤。 ７．モノクローナル抗体が、シグマ(Sigma)社から供給されるＢＮ−３４（Ｆ4 024）であることを特徴とする請求項６に従う薬剤。 ８．前記分子が、損傷を受けた核酸塩基に結合することを特徴とする請求項１ 〜請求項７のいずれかに従う薬剤。 ９．前記分子が、酸化的に塩基が損傷を受けた核酸に結合することを特徴とす る請求項８に従う薬剤。 10．前記分子が、前記損傷ＤＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項８ま たは９のいずれに従う薬剤。 11．前記分子が、前記損傷ＲＮＡ塩基に結合することを特徴とする請求項８〜 請求項10のいずれかに従う薬剤。 12．前記分子が、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とす る請求項８〜請求項11のいずれかに従う薬剤。 13．前記分子が、二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とす る請求項８〜請求項12のいずれかに従う薬剤。 14．請求項８〜請求項13のいずれかに従う損傷核酸塩基を検出する方法に使用 される薬剤であって、該損傷核酸塩基が損傷を受けた核のＤＮＡ塩基であること を特徴とする薬剤。 15．請求項８〜請求項14のいずれかに従う損傷核酸塩基を検出する方法に使用 される薬剤であって、該損傷核酸塩基が損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩 基である ことを特徴とする薬剤。 16．損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断テスト法に使用されるこ とを特徴とする請求項10〜請求項15のいずかに従う薬剤。 17．損傷を受けたＤＮＡまたはＲＮＡを検出する診断テスト法に使用される薬 剤であって、 ａ）該薬剤をＤＮＡまたはＲＮＡ含有サンプルと反応させる工程； ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；および ｃ）該サンプル−薬剤結合反応の検出結果を、損傷を受けたＤＮＡまたはＲ ＮＡの存在および量と相関させる工程を含むことを特徴とする請求項16に従う薬 剤。 18．８−オキソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニ ンまたは８−オキソデオキシアデノシンを精製する方法に使用されることを特徴 とする請求項１〜請求項17のいずれかに従う薬剤。 19．ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法に使用されることを特徴 とする請求項１〜請求項18のいずれかに従う薬剤。 20．核酸塩基の損傷を検出する方法であって、 ａ）核酸塩基を含有するサンプルを、ビオチンに特異的に結合し且つ８−オ キソグアニン、８−オキソデオキシグアノシン、８−オキソアデニンおよび８− オキソデオキシアデノシンの少なくとも１つに特異的に結合する分子を含む薬剤 と反応させる工程； ｂ）該サンプルと該薬剤との間の結合反応を検出する工程；および ｃ）該サンプル−薬剤結合反応の検出結果を、損傷を受けた核酸塩基の存在 および量と相関させる工程を含むことを特徴とする方法。 21．前記分子が酸化的に損傷を受けた核酸塩基と結合することを特徴とする請 求項20に従う検出方法。 22．前記分子が、前記損傷を受けたＤＮＡ塩基に結合することを特徴とする請 求項20または21に従う検出方法。 23．前記分子が、前記損傷を受けたＲＮＡ塩基に結合することを特徴とする請 求項20〜請求項22のいずれかに従う検出方法。 24．前記分子が、一本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とす る請求項20〜請求項23のいずれかに従う検出方法。 25．前記分子が二本鎖の核酸分子の損傷核酸塩基に結合することを特徴とする 請求項20〜請求項24のいずれかに従う検出方法。 26．損傷核酸塩基が、損傷を受けた核のＤＮＡ塩基であることを特徴とする請 求項20〜請求項25のいずれかに従う検出方法。 27．損傷核酸塩基が、損傷を受けたミトコンドリアのＤＮＡ塩基であることを 特徴 とする請求項20〜請求項26のいずれかに従う検出方法。 28．ヒトまたは動物の身体を治療または診断する方法であることを特徴とする 請求項20〜請求項27のいずれかに従う検出方法。[Claims]   1.8-oxoguanine, 8-oxoguanosine, 8-oxoadenine and Used in a method for detecting 8-oxodeoxyguanosine and specifically for biotin Binds and binds to 8-oxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxo Specific binding to at least one of soadenine and 8-oxodeoxyadenosine A medicament characterized in that it contains a molecule that acts.   2. The molecule binds biotin the same as avidin or streptavidin The agent according to claim 1, having specificity.   3. The molecule is any one of the group consisting of avidin and streptavidin The medicament according to claim 1, which is selected from the group consisting of:   4. Contains fragments or analogs of avidin or streptavidin A medicament according to claim 1 or 2, characterized in that:   5. Characterized in that the molecule comprises an antibody or an antigen-binding fragment thereof. 3. A medicament according to claim 1 or claim 2.   6. The agent according to claim 5, comprising a monoclonal antibody.   7. A monoclonal antibody was obtained from BN-34 (F4 024). The medicament according to claim 6, which is 024).   8. 2. The molecule of claim 1, wherein the molecule binds to a damaged nucleobase. An agent according to any one of claims 7 to 7.   9. The molecule binds oxidatively base-damaged nucleic acid. A medicament according to claim 8 wherein   Ten. 9. The method of claim 8, wherein the molecule binds to the damaged DNA base. Or a drug according to any of 9.   11． 9. The method of claim 8, wherein the molecule binds to the damaged RNA base. A medicament according to any of claims 10 to 14.   12． The molecule binds to a damaged nucleobase of a single-stranded nucleic acid molecule. A drug according to any one of claims 8 to 11.   13. The molecule binds to a damaged nucleobase of a double-stranded nucleic acid molecule. 13. A medicament according to any one of claims 8 to 12.   14. Use for the method for detecting a damaged nucleobase according to any one of claims 8 to 13. The damaged nucleobase is a damaged nuclear DNA base. A drug characterized by the following.   15． Use for the method for detecting a damaged nucleobase according to any one of claims 8 to 14. A damaged mitochondrial DNA salt wherein the damaged nucleobase is damaged. Is the base A drug characterized by the fact that:   16． Used in diagnostic tests to detect damaged DNA or RNA A drug according to any one of claims 10 to 15, characterized in that:   17． Drugs used in diagnostic tests to detect damaged DNA or RNA Agent     a) reacting the drug with a sample containing DNA or RNA;     b) detecting a binding reaction between the sample and the agent; and     c) The detection result of the sample-drug binding reaction is determined by using the damaged DNA or R 17. A drug according to claim 16, comprising the step of correlating with the presence and amount of NA. Agent.   18.8-oxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadeni Or a method for purifying 8-oxodeoxyadenosine. 18. The drug according to any one of claims 1 to 17, wherein   19. Characterized for use in methods of treating or diagnosing the human or animal body The agent according to any one of claims 1 to 18, wherein   20. A method for detecting damage to a nucleobase, comprising:     a) A sample containing nucleobases is specifically bound to biotin and Xoxoguanine, 8-oxodeoxyguanosine, 8-oxoadenine and 8-oxoadenine Agent comprising a molecule that specifically binds to at least one of oxodeoxyadenosine Reacting with     b) detecting a binding reaction between the sample and the agent; and     c) The detection result of the sample-drug binding reaction is determined by the presence of a damaged nucleobase. And correlating with the amount.   twenty one. Wherein the molecule binds to an oxidatively damaged nucleobase. A detection method according to claim 20.   twenty two. Wherein the molecule binds to the damaged DNA base. A detection method according to claim 20 or 21.   twenty three. Wherein the molecule binds to the damaged RNA base. A detection method according to any one of claims 20 to 22.   twenty four. The molecule binds to a damaged nucleobase of a single-stranded nucleic acid molecule. A detection method according to any one of claims 20 to 23.   twenty five. Wherein the molecule binds to a damaged nucleobase of a double-stranded nucleic acid molecule. A detection method according to any one of claims 20 to 24.   26. The damaged nucleobase is a damaged nuclear DNA base. A detection method according to any one of claims 20 to 25.   27. That the damaged nucleobase is a damaged mitochondrial DNA base Feature The detection method according to any one of claims 20 to 26.   28. It is a method of treating or diagnosing the human or animal body A detection method according to any one of claims 20 to 27.