JPH11507209A

JPH11507209A - サイトメガロウイルスの潜伏転写産物およびプロモーター

Info

Publication number: JPH11507209A
Application number: JP8535836A
Authority: JP
Inventors: カズヒロ近藤; エス．ジュニアモカルスキ，エドワード
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 1995-05-23
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 1999-06-29
Also published as: CA2220415A1; US6194542B1; WO1996037211A1; AU5801796A; US5783383A; EP0835122A4; AU705890B2; EP0835122A1

Abstract

(57)【要約】この発明は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）潜伏転写産物、潜伏関連ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドに対する抗体に関する方法と組成物を提供するものである。これらポリペプチドは、ＣＭＶＤＮＡ配列でコードされ、かつ潜伏感染中に特異的に産生される。また、試料中のＣＭＶ、特に潜伏状態のＣＭＶを検出する方法も提供する。その方法には、ＲＴ−ＰＣＲベースの方法および免疫診断法が含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】サイトメガロウイルスの潜伏転写産物およびプロモーター発明の分野この発明は、ヒトメガロウイルスの潜伏転写産物とプロモーターを利用する診断方法および治療方法に関する。参考文献 Alford,C.A.および Britt,W.J.、The Human Herpesviruses（Roizman,B.他編）内、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在の Raven Press社、２２７〜２５５頁（１９９３年）。 Apperley,J.F.他、Experimental Hematology １７巻：３８〜４５頁（１９８９年）。 Ausubel，F.M.他、Current Protocols in Molecular Biology、米国ペンシルベニア州所在の John Wiley and Sons，Inc.社（１９８８年）。 Baines，P.他、Exp．Hematol.１５巻：８０９〜８１３頁（１９８７年）。 Beames 他、Biotechniques １１巻；３７８頁（１９９１年）。 Bevan，I.S.他、Br．J．Haematol.７８巻：９４〜９９頁（１９９１年）。 Bhaumik，D.他、J．Biol．Chem.２６９巻：１５８６１〜１５８６７頁（１９９４年）。 Boshart，M.他、Cell ４１巻：５２１〜５３０頁（１９８５年）。 Britt，W.J.他、J．Virol.６２巻：３３０９頁（１９８８年）。 Cha，T.A.他、J．Virol．７０巻：７８〜８３頁（１９９６年）。 Chee，M.S.他、Curr．Top Microbiol．Immunol.１５４巻：１２５〜１７０頁（１９９０年）。 Cherrington，J.M.および Mocarski，E.S.、J．Virol.６３巻：１４３５〜１５５０頁（１９８９年）。 Chirgwin，J.M.他、Biochemistry １８巻：５２９４〜５２９９頁（１９７９年）。 Chomczynski，P.および Sacchi，N.、Anal．Biochem.１６２巻：１５６〜１５９頁（１９８７年）。 Frangioni，J.V.および Neel，B.G.、Anal．Biochem.２１０巻：１７９〜１８７頁（１９９３年）。 Gonczol，E.他、Vaccine ８巻：１３０頁（１９９０年）。 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他の１９８５年の報告；Chee 他の１９９０年の報告）。発明の概要この発明は、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＤＮＡ配列によってコードされ、（ｉｉ）潜伏感染中に特異的に産生されるポリペプチドを精製したものを含む。そのようなポリペプチド（この明細書では、潜伏関連ポリペプチドまたはＣＭＶ潜伏転写産物（ＣＭＶ latent transcript）（ＣＬＴ）と称する）は、診断試験時の試薬および／またはワクチンの成分として有用である。全般的な実施態様において、これらのポリペプチドは、５’からＣＭＶＰＳＳ ie1/ie2 転写出発部位までのＣＭＶゲノム領域の約５００ｂｐ由来の配列でコードされたアミノ酸配列を含有している。上記のようなポリペプチドは、その転写出発部位が５’からＰＳＳＣＭＶ i e1/ie2 転写出発部位までのＣＭＶゲノムの約５００塩基対領域内に位置しているＲＮＡによりコードされ得るものである。一つの実施態様においては、上記転写出発部位は、ie1/ie2 エンハンサー領域、例えば、転写出発部位が配列番号：３６または配列番号：３７であるＲＮＡの中に含まれている。代表的な潜伏関連ポリペプチドとしては、配列番号：５９、配列番号：６１および配列番号：６３があるが、これらに限定される訳ではない。さらの別の実施態様においては、この発明のポリペプチドは、ＣＭＶ ie1/ie2 転写産物のコーディングストランドに対し相補的なストランド（すなわち、アンチセンスストランド）から転写されるＲＮＡによりコードされており、この場合ＲＮＡの位置は ie1/ie2 遺伝子のイントロン２および３とオーバラップしている。すなわち、配列番号：５７で表されるＤＮＡ配列は、このような１つのＲＮＡに対応する。アンチセンス転写産物によりコードされる代表的な潜伏関連ポリペプチドとしては、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：７１および配列番号：７３があるが、これらに限定される訳ではない。加えて、この発明のポリペプチドには、サイトメがウイルス潜伏転写産物由来の翻訳産物が含まれる。この発明には、この発明のポリペプチドを製造する方法、例えば、組換え製造方法または合成製造方法もまた含まれる。さらに、この発明には、潜伏関連ポリペプチドを選択された宿主内で発現することができるベクターが含まれる。潜伏関連ポリペプチドの代表的なコーデンィグ配列としては、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０および配列番号：７２があるが、これらに限定される訳ではない。そのうえ、この発明には、試料中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を検出する方法、特に潜伏ＣＭＶ感染を検出する方法が含まれる。そのような方法の一つでは、試料は、潜伏関連ポリペプチドに免疫反応性のある抗体を含有している。その試料をこの発明の潜伏関連ポリペプチドと接触させる。その抗体は、潜伏関連ポリペプチドに結合する。その結合が検出され、試料中にＣＭＶが存在していることを示し、より詳しく述べると、その試料に関連する潜伏ＣＭＶ感染があることを示す。原試料としては、例えば、ヒトの血清または血漿がある。抗体が抗原（すなわち、潜伏関連ポリペプチド）に結合していることの検出は、ＥＬＩＳＡ法によるのを初めとしていくつかの方法で行うことできる（例えば、抗原を固体支持体に固定し、結合した抗体の検出が、抗原／抗体複合体をデテクター抗体、例えば標識化抗ヒト抗体に暴露することによって行われる抗体捕獲検定法がある）。あるいは、単一または複数の抗原をゲル上にサイズ分画し、膜に移し、次にその膜を被検試料に暴露するウェスタンブロット分析法で検出することができる（例えば、実施例１５に記載のように）。結合した抗体の検出は、抗原／抗体複合体を、デテクター抗体、例えば標識化抗ヒト抗体に暴露することによって、実施することができる。この発明は、抗潜伏関連ポリペプチド抗体を用いて、試料中のＣＭＶを検出する方法をも含む。この方法では、潜伏関連ポリペプチドを含有する試料が抗体と接触させられ、その抗体は潜伏関連ポリペプチドに免疫反応性である。そこで、抗体が潜伏関連ポリペプチド抗原に結合したことが検出され、試料中にＣＭＶが存在していることを示す。抗体がポリペプチドに結合したことの検出は、ウエスタンブロット検定法や抗原捕獲検定法を含むいくつもの方法で実施できる。ウエスタンブロット分析法の場合、試料は、典型的には、ゲル上にサイズ分画され、膜に移され、そして抗体に暴露される。抗体が抗原に結合したことは、直接に（例えば、抗体を標識化することによって）または間接的に（例えば、第二抗体を用いて第一抗体の存在を検出することによって）検出できる。抗原捕獲検定法は、典型的には、抗体（選択された潜伏関連ポリペプチドに特異的に免疫反応性である）を固体の支持体に取り付け、そして該固体支持体に結合した抗原を検出することを含んでいる。検出は、例えば、選択された潜伏関連ポリペプチドに特異的に免疫反応性である第二の抗体、つまりリポーター抗体を使用して実施できる。あるいは、抗原の結合を、ポリペプチドリポーター複合体を利用する競合検定法を用いて検定することもでき、この場合、そのポリペプチドは、ポリペプチドリポーター複合体が抗体に結合するのと競合する。上述の諸測定法を用いて分析できる試料としては、骨髄、造血幹細胞、血液または血漿の試料などのヒト組織の試料がある。関係する面として、この発明には、潜伏関連ポリペプチドまたはＣＬＴがその標的に結合することに対して影響を与えることができる化合物を同定する方法が含まれる。潜伏関連ポリペプチドの標的がウイルスＤＮＡである場合、タレパク質−ＤＮＡ相互作用スクリーン（例えば、移動度シフト検定法）を利用できる。このような検定法を利用する法は、（ｉ）そのようなＣＬＴを、試験化合物の存在下および不在下で、その標的ウイルスＤＮＡ（ｔｖＤＮＡ）と接触させ、（ｉｉ）ＣＬＴとｔｖＤＮＡの間の結合の度合いに対する該試験化合物の効果を測定し、そして（ｉｉｉ）該試験化合物の存在下での結合の度合いがその不在下での結合の度合いと有意に異なっているならば（すなわち該化合物が結合を有意に破壊しているならば）その化合物が有効であると認定する方法である。有効であると認定された化合物は、さらに潜伏ＣＭＶ感染を治療するための性能について試験することができる。その代わりに、またはそれに加えて、これらの化合物は、別の抗ウイルス化合物を開発するためのリード化合物として使用することもできる。また、この発明には、この発明の潜伏関連ポリペプチドと特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（ならびに、その製剤、例えば、ＩＧＧ製剤）も含まれる。それらの抗体は、抗体ベースのワクチンにのみならず、診断選別検定法に有用である。別の面として、この発明には、ＲＮＡを含有する試料の潜伏サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を検出する方法が含まれる。この方法では、ｃＤＮＡを試料中のＲＮＡから特異的に発生させる（例えば、そのＲＮＡを精製するか、または試料中のＤＮＡを分解させる）。そのｃＤＮＡは、次いで二つのプライマーからなる一組のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応で増幅され、その場合、これらプライマーは、潜伏感染中に特異的に産生されるＲＮＡ（または、その一部分）をコードする選択されたＣＭＶ領域を定義する。選択されたＣＭＶ領域に対応して増幅産物が存在していることは、試料が潜伏ＣＭＶに感染していることを示す。このような一つの領域は、５’からＣＭＶＰＳＳ ie1/ie2 転写出発部位の間に位置するＣＭＶゲノム領域である（図１１）。それら方法の一実施態様では、前記プライマーセットのうち少なくとも一つのプライマーは、５’からＣＭＶＰＳＳ ie1/ie2 転写出発部位に位置するＣＭＶ配列から選択される。別の実施態様では、プライマーセットの少なくとも一つのプライマーは、ＣＭＶ ie1/ie2 転写産物のコーディングストランドに対して相補的であり、この場合、その増幅産物は、ie1/ie2 遺伝子のイントロン２および３にオーバラップしている。この発明のさらに他の面として、この発明には、哺乳類の細胞、特に造血幹細胞のトランスフェクションを行うのに有用な発現ベクターが含まれる。そのベクターとして、（ｉ）特に潜伏感染中（すなわち、増殖性感染に対して）、サイトメガロウイルスゲノムからのＲＮＡ転写産物の転写を促進するプロモーター、および（ｉｉ）前記プロモーターに非相同のコーディング配列、を含んでなる発現カセットが含まれる。このコーディング配列は、該プロモーターに機能可能に連結され、限定されないが、ポリペプチドおよびＲＮＡの産物（例えば、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム類）をはじめとする産物をコードすることができる。上記発現カセットは、サイトメガロウイルス自体の修飾形を含めて、哺乳類の細胞のトランスフェクションを行うのに有用ないくつものベクターの中に入れ込むことができる。一実施態様においては、これらプロモーターの配列には、そのＲＮＡ転写出発部位が、５’からＰＳＳＣＭＶ ie1/ie2 転写出発部位までの、ＣＭＶゲノムの約５００の塩基対からなる領域内に位置しているプロモーターが含まれている。他の実施態様においては、プロモーターには、配列番号：４２で表される配列が含まれている。さらに別の実施態様においては、プロモーターには、配列番号：４３で表される配列が含まれている。そのうえ、プロモーター配列には、そのＲＮＡがＣＭＶ ie1/ie2 転写産物のコーディングストランドに相補的なストランドから転写されるプロモーターが含まれており、その転写されたＲＮＡは、ie1/ie 2 遺伝子のイントロン２および３に対応するＣＭＶゲノムの領域とオーバラップしている。一実施態様では、そのようなプロモーターには、配列番号：４４で表される配列の一部分が含まれている。この発明の発現ベクターは、安定して形質転換される哺乳類細胞、特に造血幹細胞を産生する方法に使用できる。その方法では、この発明の発現ベクターは、これら細胞中にトランスフェクトされ、次いでその細胞を増殖させるかまたは維持する。また、この発明には、この発明のベクターを使用しての遺伝子療法への応用も含まれている。この発明の一実施態様は、標的細胞内の遺伝子的欠陥を治療する方法である。そのような欠陥としては、ウイルス感染または細胞遺伝子の不適当な発現（例えば、欠失および過剰発現）によって起こる症状がある。この方法では、発現ベクターは、上記のようにして製造される。その発現ベクターは、次いで標的細胞、例えばヒト造血幹細胞に導入される。それら標的細胞は、（ｉ）生きている動物内の細胞、または（ｉｉ）生体外で維持されて宿主動物中に再度導入される細胞でもよい。また、この発明の一部を形成するものとして、潜伏ＣＭＶ感染の治療および／または予防に用いるＣＭＶワクチンがある。一実施態様では、ワクチンは、ＣＭＶエピトープを含有する少なくとも１種の免疫原性ＣＬＴを含有している。他の実施態様では、それらワクチンは、加えて、増殖性感染中にのみ発現されるＣＭＶ抗原を含有してもよい。このような「完全な」ワクチンは、活発に複製しつつあるウイルスに対してのみ用いられるワクチンよりも有効である。代替的にまたは追加的に、これらワクチンは、この発明のＣＬＴが含有している抗原に対して特異的に免疫反応性である抗体（例えばり、ヒト化抗体など）を含有してもよい。この発明には、また、上記ベクターの医薬組成物、例えば、医薬として許容される担体中に懸濁させた組成物も含まれる。この発明の以上のおよび他の目的および特徴は、以下に述べるこの発明の詳細な説明を、添付図面を参照しつつ読めば、一層十分に理解できるであろう。図面の簡単な説明図１は、ＧＭ−Ｐ培養物中のヒトＣＭＶＤＮＡの維持量を時間の関数として示すグラフを示す。図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、ＣＭＶＤＮＡが細胞と核中に保持されているのを示す、ＰＣＲ反応産物の臭化エチジウムで染色したゲルを示す。図３Ａおよび３Ｂは、感染してから４週間後の、ＧＭ−Ｐ中のヒトＣＭＶ β₂ _.7 遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ産物およびαとβ遺伝子の転写産物を電気泳動法（２．５％アガロースゲル）で分離した結果を示す。図３Ａは、臭化エチジウムで染色したバンドを示し、図３Ｂは、³²ＰｄＣＴＰで標識化したβ_2.7ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させて、オートラジオグラフィで実験した結果を示す。図４Ａおよび４Ｂは、ヒトＣＭＶＵＬ１１２／１１３遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ産物を電泳動法（２．５％アガロースゲル）で分離した結果を示す。図４Ａは、臭化エチジウムで染色したバンドを示し、図４Ｂは、³²ＰｄＣＴＰで標識化したＵＬ１１２／１１３ＤＮＡプローブとハイブリッドを形成させて、オートラジオグラフィで実験した結果を示す。図５Ａおよび５Ｂは、ＰＣＲ反応産物の臭化エチジウムで染色したゲルにおける、ie1 のエキソン２と３の間の発現（図５Ａ）および ie1 のエキソン３と４の間の発現（図５Ｂ）を示す。図６は、逆転写（ＲＴ）反応およびｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーの相対的位置を示す。図７は、この明細書に記載の実験に用いられたＰＣＲプライマー類の名称、配列および配列番号を示す。図８は、感染してから４週間後の潜伏感染ＧＭ−Ｐ内でのヒトＣＭＶの前初期（α）遺伝子の発現ならびにセンスおよびアンチセンスの ie1/ie2 領域の転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。図９は、潜伏転写産物の５’末端と３’末端を同定する、ＰＣＲ反応産物の臭化エチジウムで染色したゲルを示す。図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、１０Ｇ、１０Ｈ、１０Ｉ、１０Ｊおよび１０Ｋは、潜伏転写産物の構造と予測される読取り枠（ＯＲＦ）の概要を示す。図１１は、ヒトＣＭＶ ie1/ie2 の遺伝子座における、増殖性感染特異的（ＰＳＳ）プロモーターおよび潜伏感染特異的（ＬＳＳ１、ＬＳＳ２）プロモーターの相対的位置を示す。図１２は、潜伏感染を受けたＧＭ−Ｐから得たＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅物の臭化エチジウムで染色したゲルを示す。図１３は、潜伏転写産物のＲＮアーゼ保護分析のオートラジオグラフを示す。図１４Ａと１４Ｂは、潜伏転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析から得たセンスＣＭＶ潜伏転写産物（ＣＬＴ）の遺伝子発現および健康成人のドメーの骨髄における後初期（β）遺伝子の発現の臭化エチジウムで染色したゲル（図１４Ａ）とオートラジオグラフ（図１４Ｂ）を示す。図１５Ａと１５Ｂは、潜伏転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析から得たセンスＣＬＴ遺伝子発現および健康成人のドメーの骨髄における後初期（β）遺伝子の発現の臭化エチジウムで染色したゲル（図１５Ａ）とオートラジオグラフ（図１５Ｂ）を示す。図１６Ａと１６Ｂは、潜伏転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析から得たセンスＵＬ１１２／１１３遺伝子の発現および健康成人のドメーの骨髄における後初期（β）遺伝子の発現の臭化エチジウムで染色したゲル（図１６Ａ）とオートラジオグラフ（図１６Ｂ）を示す。図１７Ａは、センス１．５／１．６ｋｂ転写産物の新規な（潜伏転写産物）スプライス結合部に存在する配列を示す。図１７Ｂは、センス１．２／１．３ｋｂ転写産物の新規な（潜伏転写産物）スプライス部位に存在する配列を示す。図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、健康なＣＭＶ血清反応陽性の個体（図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃ）および血清反応陰性の対照個体（１８Ｄ）由来の血清でプローブした潜伏転写産物の融合タンパク質のイムノブロットを示す。図１９Ａと１９Ｂは、センス転写産物に対応するスプライスされたヌクレオチド配列を示し、ＰＳＳ，ＬＳＳ１，ＬＳＳ２をイタリック体で示し、そしてＯＲＦを下線付き開始「ＡＴＧ」コドンで標識をつけて示してある。図２０Ａと２０Ｂは、アンチセンス転写産物に対応するヌクレオチド配列を示し、ＯＲＦを下線付き開始「ＡＴＧ」コドンで標識をつけて示してある。図２１は、この発明の潜伏転写産物に関連するＣＭＶ領域の部分配列を示す。発明の詳細な説明Ｉ．定義二つの核酸要素または核酸フラグメントが２種の異なる遺伝子またはそれに替わって２種の異なる種に由来している場合、これら要素は「非相同」であるという。例えば、顆粒球、単球またはマクロファージの治療上有用なタンパク質をコードするヒト遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス由来のプロモーターに対し非相同である。「有意」という用語は、例えば、「有意に異なる」、「有意に阻害する」、「有意に刺激する」または「有意に効能を高める」というように用いる場合、比較される二つのグループ間の定量化しているパラメータに、標準の統計的検定法を用いて統計的に有意な差があることを意味する。例えば、タンパク質−ＤＮＡ結合検定法の結合度は標準法を用いて定量化することができるので、異なる条件下での結合度は統計的に有意な差があるかどうか比較することができる。「実質的に単離された」という用語は、典型的には、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは類縁化合物（例えば、特異的な抗体）が、非類縁成分または汚染成分（例えば、血清細胞類、タンパク質類および非特異的抗体類をから少なくとも部分的に精製されていることを意味する。対象の化合物または成分を単離または精製する方法と手順は、後述する（例えば、ＣＬＴポリペプチドの融合タンパク質と組換え産物のアフィニティー精製法）。抗体または抗体組成物（例えば、ポリクローナル抗体）は、それらが或ＣＬＴ抗原とは免疫反応性であるが、ＣＭＶの増殖性感染中に発現されるタンパク質または糖タンパク質（例えば、ｇｐＵＬ５５，ｇｐＵＬ７５など）の中に存在する抗原とは免疫反応性でない場合、そのＣＬＴに対して「選択的に免疫反応性」である。「エピトープ」は、抗原が結合する特異的抗体を決定する抗原性分子（抗原）の領域である。抗原又はエピトープは、それらがＣＭＶ感染の血清中に存在する抗体とは結合するが、ＣＭＶ感染していないかまたは感染したことがない個体由来の血清の大部分（約９０％を超える、好ましくは９５％を超える）に存在する抗体とは結合しない場合、ＣＭＶ陽性血清に対して「特異的に免疫反応性」である。「特異的に免疫反応性」の抗原またはエピトープは、ＣＬＴエピトープまたは抗原などの特異的ＣＭＶエピトープまたは抗原に対して生成するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とも免疫反応性である。抗体または抗体組成物（例えば、ポリクローナル抗体）は、それらがＣＭＶ抗原とは免疫反応性であるが、他のヘルプスウイルスの抗原とは免疫反応性でない場合り、そのＣＭＶと「特異的に免疫反応性」である。さらに、「特異的に免疫反応性の抗体」は、ＣＭＶ感染したりＣＭＶ暴露されたりしていない正常な血清中に典型的に存在する抗原に対しては免疫的反応性ではない。抗体または抗体組成物は、それらがＣＬＴとは免疫反応性であるが、他のヘルプスウイルスの抗原とは免疫反応性でない場合、そのＣＬＴに対して「特異的に免疫反応性」である。ＩＩ．発明の大略この発明を確証するために行ってこの明細書に詳述した実験は、骨髄はヒトＣＭＶウイルスが潜伏しかつ潜伏遺伝子が発現する自然部位であることを実証している。これらの実験では、培養時に増殖している間、ＣＤ１４⁺，ＣＤ１５⁺，ＣＤ３３⁺の表現型を維持し得るヒト胎児肝臓の細胞および骨髄造血細胞由来の一次顆粒球マクロファージ前駆細胞（ＧＭ−Ｐ）を培養したものを用いた。ＣＭＶに暴露した後、ウイルスＤＮＡは、４週間の培養期間中、後初期（β）遺伝子発現なしで、高比率のＧＭ−Ｐ中で存続した。感染は高度に制限されたが、ウイルスは、感染したＧＭ−Ｐと許容細胞との長期間に亘る共生培養によって再活性化された。上記実験の結果は、潜伏感染したＧＭ−Ｐの転写が制限されたことを示している。ie1/ie2 領域の転写産物は、３’−および５’−ＲＡＣＥマッピング（mapp ing）と関連して特異的なプライマーでＲＴ−ＰＣＲ分析を行って特性解析を実施した。両方のＤＮＡストランドから転写産物（許容細胞中に検出された転写産物に対するセンス転写産物とアンチセンス転写産物）が生じるのが検出された。２．１ｋｂのスプライシングされていないアンチセンス転写産物の特性解析をｃＤＮＡのクローン化とマッピングによって行った。アンチセンス転写産物の５’ 末端は、ie1 エキソン４の反対側のストランド上に位置し、３’（ポリアデニル化）末端は、エキソン１と２の間のイントロンの反対側のストランドに位置していた。センス転写産物は、増殖性感染中に使用される ie1/ie2 出発部位の上流へ２９２ｂｐ（塩基対）および３５４ｂｐの位置にある二つの新規な出発部位（「エンハンサー」と呼ばれる領域中）が起源であった。マッピングとｃＤＮＡクローン化によって、ie1 領域と ie2 領域によるいくつもの分化してスプライスされた産物が同定された。この情報を利用して、ドナーの血清反応状態について予め知識なしで、１３名のドナーから入手した骨髄試料中に潜伏転写産物が存在するかどうかを評価した。センス ie1/ie2 領域の転写産物は、ＲＴ−ＰＣＲによって７名の血清反応陽性のドナーのうち５名に検出されたが、６名の血清反応陰性のドナーには全く検出されなかった。アンチセンス転写産物は、これら個体のサブセット中に検出されたが、他の領域由来の転写産物には検出されなかった。これらの実験の結果は、骨髄が自然潜伏感染部位であり、そして ie1/ie2 領域がコードする新規な潜伏転写産物が潜伏感染の指標でありかつ潜伏感染中に機能することを示している。さらに、これらの結果は、ie1/ie2 領域が潜伏転写産物の発現を駆動できるプロモーターを含有していることを示している。このようなプロモーターは、以下に述べるように、ＧＭ−Ｐ前駆細胞由来の細胞を標的とすることが望まれる遺伝子療法への応用に有用であろう。この明細書が提供するガイダンス前には、潜伏感染を起こした組織におけるウイルス遺伝子発現の型または程度に関する明白な情報は全くなく、かつ骨髄が潜伏感染の部位であるかどうか明白ではなかった。換言すれば、ヒトにおけるＣＭＶ潜伏の部位および潜伏転写産物の検出については、分かっていなかった。この明細書に記載の実験結果は、特異的な一組の潜伏転写産物の存在の証拠を提供し、かつＣＭＶ潜伏時の骨髄造血前駆細胞の役割を裏付ける明白な証拠となっている。この発明で同定された転写産物（および関連プロモーター要素）は、主要ウイルス調節遺伝子の領域内にあり、同じ向き（ウイルスゲノムの「センス」方向）および反対の（「アンチセンス」）方向に発現される潜伏転写産物を含有している。プリンシプル（princi ple）ウイルス調節遺伝子の発現を誘導するＣＭＶプロモーターエンハンサー（「ＣＭＶエンハンサープロモーター」）は、上記領域内にあるが、ＧＭ−Ｐ内では活性ではない。増殖的複製中サイレントなプロモーターは、潜伏中は活性であり、センス転写産物の転写に関与している。これらのプロモーターは、複製中活性な十分に特性が解析されているＣＭＶプロモーターエンハンサーの上流２９２ｂｐと３５６ｂｐの位置にある。上記にまとめた結果は、ＣＭＶに関する診断法と治療法にも応用できることを意味している。診断法（例えば、発現された潜伏転写産物に対する抗体を利用するＲＴ−ＰＣＲまたは検定など）は、潜伏感染を起こした個体を検出し、およびＣＭＶが存在しているかどうかヒトの血液と組織産物を検定するのに利用できる（ＣＭＶ関連疾患が伝播する危険を減らすため）。治療法としては、遺伝子治療法があり、この場合、潜伏特異的遺伝子が長寿のまたは自己再生する細胞系統中に構造的に発現され、そしてその調節要素が外来遺伝子の発現に利用される。スプライスされた転写産物がコードするポリペプチドのみならず、この明細書に記載の潜伏転写産物は、血液または移植される組織におけるＣＭＶ感染の存在を検出するのに使用することもできる。また、その潜伏転写産物のポリペプチドは、ＣＭＶの感染に対して防御するワクチン製剤にも利用できる。潜伏転写産物のポリペプチドは、他のＣＭＶ抗原なしで、潜伏感染に対してのみ有効なワクチンを製造するのに利用できるか、または好ましくは、増殖性感染中に発現されるＣＭＶ抗原、例えば、ｇＢまたはｇＨの糖タンパク質中に含有されている抗原（ Plotkin の１９９４年の報告）と組み合わせて使用することができる。潜伏プロモーターは、遺伝子療法（例えば、造血細胞の遺伝子療法）に使用することができる。造血細胞への感染は静止性であるから、ＣＭＶは、潜伏プロモーターがコードする外来遺伝子を有するこれらの細胞にベクターとして使用することができる。ＩＩＩ．実験の概要この発明を裏付けるために実施した実験の結果は、ＣＭＶゲノムが、ウイルスの増殖性複製なしでＧＭ−Ｐ中に維持されていることを示唆している。ウイルスの増殖性複製を阻害することが知られている濃度（５または１０μＭ）のガンシクロビルの存在下で細胞を維持したところ、ＧＭ−Ｐ細胞の数が２週間かかって３〜１０倍に増加し、ウイルスゲノムのコピーが比例して増大した。感染培養物を末感染の対照と比較してところ、形態または細胞増殖の特徴に差は全く認められなかった。ＣＭＶの低継代株（low passage strain）Toledo は、ヒトボランティアの Towne 株より毒性が強いことが見出されているが（Plotkin 他の１９８９年の報告）、Towne 株の誘導体のＲＣ２５６に関する報告の結果と類似の結果を示した。追加の１９個の個体の胎児肝臓の試料および３個の胎児骨髄細胞の試料を、各ウイルス株を用いてこのシスチムで実験したところ、ここに記載の結果に一致した結果が得られた。この明細書が提供する教示前には、潜伏ＣＭＶのゲノムの性質または発現に関する情報は殆どなかった。単純ヘルペスウイルスなどのアルファヘルペスウイルス類の潜伏を特徴づけるニューロン部位、またはガンマヘルペスウイルスのエプスタインバールウイルスの潜伏にとって明らかに重要なＢリンパ球と異なり、ヒトＣＭＶの潜伏部位は捉え難かった。敏感なＰＣＲ法がウイルスゲノムと単核白血球との関連を再現可能に示したにも拘わらず（Taylor-Wiedeman 他の１９９１年の報告）、ウイルスを再活性化する操作可能なシステムがないので、潜伏感染の部位としてのこれらの細胞についてはなにも分かっていなかった。本明細書で提供する実験の結果は、ヒト骨髄由来のＧＭ−Ｐ内でＣＭＶが存続し、かつＣＭＶが実験で再活性化することを実証している。このウイルスとＧＭ −Ｐの相互作用は、ウイルス遺伝子の発現が制限されていることと、ie1 転写産物が非定形でスプライシングされていないことが特徴である。ここに教示されていることに従えば、今や健康なキャリヤー内において直接これら転写産物の発現を評価することができる。許容細胞との長期間にわたる共生培養の後、ウイルスを回復できることは、ＧＭ−Ｐ内でのＣＭＶの複製が共生培養中に起こる増殖または分化によって決まることを示し、このことは、ＣＭＶ複製が細胞型と細胞の分化状態に依存しているという従来の研究結果（Taylor-Wiedeman 他の１９９４年の報告、Ibanez 他の１９９１年の報告、Lathey および Spectorの１９９１年の報告、Reiser 他の１９８６年の報告、Apperley 他の１９８９年の報告、Simmons 他の１９９０年の報告、Sing および Ruscetti の１９９０年の報告）と一致している。この明細書に記載されているシステムによって、ＣＭＶと一次骨髄単球細胞（ primary myelomonocytic cell）、これは健康なキャリヤー中の潜伏ＣＭＶの潜在的貯蔵所（potential reservoir）を構成している（Taylor-Wiedeman 他の１９９１年の報告）が、との相互作用を研究することができる。今や、潜伏感染の樹立、維持および再活性化におけるウイルスと宿主細胞の機能を研究することができる。さらに、この明細書に記載のシステムによって、潜伏感染時の非定形 ie1 転写産物を直接、研究することができる。興味深いことに、ＣＭＶ遺伝子の発現は、培養中に生成する大きな付着細胞内においても、非付着性のＧＭ−Ｐ内内においても、ともに著しく制限された。これら培養物中にＣＭＶが存在していても、これら培養物中の細胞の増殖または分化に対して検出可能な影響はなかった。また、この明細書は、ＣＭＶの低継代および高継代の実験株が、ＧＭ−Ｐの潜伏感染に対して生物学的ポテンシャルを保持していることを明確に教示している。これらの細胞内でのウイルスの潜伏は、ウイルスＤＮＡと細胞の安定な会合と関連があり、そしてガンシクロビル耐性がウイルスＤＮＡ内に細胞数と平行として増大した。この発明を裏付けるために実施した実験の結果は、潜伏感染したＧＭ−Ｐ中ウイルスゲノムを維持する機構が増殖性複製中に利用される機構とは異なっていることを示唆している。非定形 ie1 領域の転写産物が検出されることは、その産物が潜伏感染とゲノムの維持に或役割を果たしていることを示唆している。ＣＭＶとＧＭ−Ｐの生体内での相互作用によって、正常で健康な血清反応陽性の個体の末梢血液由来の単核細胞中にウイルスＤＮＡが検出されること（Taylor -Wiedeman 他の１９９１年の報告、Stanier 他の１９９２年の報告、Bevan 他の１９９１年の報告）および易感染性の個体の単球および顆粒球中に感染性ウイルスが存在していることを説明できる。この発明で開示されるまで、正常で健康な血清反応陽性の個体内でのウイルス遺伝子の発現の評価は限られたものであったし、かつ相互に相容れない結論になっていた。インシトウ（in situ）のハイブリッド形成法によるＣＭＶα（前初期）遺伝子の転写産物の検出（Schrier 他の１９８５年の報告）は、進行中の発現を示唆したが、ごく最近の分析では、ＣＭＶ遺伝子の発現は細胞が分化した後にしか検出できないことを示唆している（Taylor-Wiedeman 他の１９９４年の報告）。この発明を裏付けるために実施した実験によって、培養されたＧＭ−Ｐ中に発現された潜伏関連ポリペプチドをコードする二つの新規のクラスのＣＭＶ潜伏転写産物（ＣＬＴ）の特性解析を行った。また、これらの転写産物は、ＰＣＲを用いて、健康なＣＭＶ血清反応陽性成人の骨髄中に検出された（実施例１３）。さらに、潜伏関連ポリペプチド類と免疫反応性の抗体は、イムノブロット分析法を用いて、健康なＣＭＶ血清反応陽性の個体に由来の血清中に検出された（実施例１５）。配列分析を行った結果、ＰＳＳすなわち増殖性感染中に利用される転写開始部位（図１０Ａ〜１０Ｋ）で始まる転写産物には存在しない４０個を超えるコドンの新規な読取り枠（ＯＲＦ）が潜伏転写産物に存在することが明らかになった（図１０Ａ〜１０Ｋ）。相異なる二つの短いＯＲＦ（４５個のアミノ酸（配列番号：５９）をコードする配列番号：５８と、４２個のアミノ酸（配列番号：６１）をコードする配列番号：６０）は、ＬＳＳ１またはＬＳＳ２で始まるセンス転写産物上の５’付近（5'-proximal）であり、そしてＵＬ１２６（Chee 他の１９９０年の報告）のアミノ末端の５９個のコドンに対応する１個の長いＯＲＦ（９４個のアミノ酸（配列番号：６３）をコードする配列番号：６２）が上記短い方のＯＲＦの下流に配置されている。この９４個のコドンのＯＲＦ（配列番号：６２）は、増殖性感染に関連するタンパク質とは異なるＯＲＦ中のエキソン１／２の境界および２／３の境界とクロスしている。上記の新規なＯＲＦの存在は、増殖性感染中に ie1 と ie2 の遺伝子がコードする十分に特性分析された４９１個と５７９個のａａのタンパク質を含み、下流のＯＲＦの発現をダウンレギュレート（減数調節）すると考えられる（Stenberg 他の１９８４年、１９８５年、１９８９年の報告、Stinski 他の１９８３年の報告、Stinski の１９７８年の報告）。この予測と一致して、４９１ａａＩＥ１または５７９ａａＩＥ２のタンパク質の発現は、ＣＨ１６０すなわちエキソン２中のエピトープに対して特異的なネズミモノクローナル抗体による免疫蛍光分析法では検出されなかった（Plachter 他の１９９３年の報告）。５個のＯＲＦがアンチセンス転写産物中に同定された。これらのＯＲＦは、この明細書では、（ｉ）５９個のアミノ酸（配列番号：６５）をコードする配列番号：６４、１５４個のアミノ酸（配列番号：６７）をコードする配列番号：６６、４４個のアミノ酸（配列番号：６９）をコードする配列番号：６８、１５２個のアミノ酸（配列番号：７１）をコードする配列番号：７０、および５０個のアミノ酸（配列番号：７３）をコードする配列番号：７２で表される。１５２個のコドンのＯＲＦ（配列番号：６９）は、ＵＬ１２４（Chee 他の１９９０年の報告）に相当していた。これらの新規なＯＲＦがコードするポリペプチドは、配列データベースに現在寄託されている他の予測タンパク質（predicted proteins）との類似性を殆ど示さなかった。この明細書で詳細に述べる実験結果によって、潜伏ＣＭＶゲノムが骨髄（ＢＭ）由来の造血細胞中に所在していることと、潜伏が新規な転写産物の発現と関連していることが確認された。これらのデータは、さらに、潜伏転写産物、特に血清反応陽性のＢＭドナーの７０％以上に容易に検出されるセンス転写産物が、潜伏中に重要な役割を演じていることを示唆している。ＣＬＴが同定されると、ＣＭＶの潜伏と再活性化を詳細に評価することができ、かつこれらのプロセスに必要なウイルスと宿主細胞の機能の特性解析を行うことができる。ＣＭＶとＧＭ−Ｐの相互作用は非細胞破壊性なので、この明細書に記載の潜伏特異的プロモーターは、非相同遺伝子の発現を制御するために遺伝子療法に利用できる。また、これらの実験結果は、特定のＣＬＴ、例えばＯＲＦ９４のタンパク質（配列番号：６３）に対する抗体が、高比率の個体に由来の血清中に存在していることを示し（実施例１５）、このことは、ＣＬＴおよびＣＬＴのコードするタンパク質が自然感染の個体内で発現されていることを強く裏付けている。以上にまとめた実験の大部分は、ＲＣ２５６すなわち Towne ウイルス株の誘導体を用いて実施した。Toledo すなわちウイルスの完全補体を保有する低継代株（Cha 他の１９９６年の報告）に感染した後、類似のパターンのＣＬＴ発現が観察された。特定の機構に縛られたくないが、上記タンパク質がコードされているＣＬＴが、潜伏感染中の樹立、維持または再活性化で役割を演じている。ＣＬＴは、ＧＭ −Ｐ内で発現されるが、これらの細胞の増殖または細胞面の表現型は変化しない。ＣＭＶゲノムは、ＥＢＶ（Kieff の１９９５年の報告）が潜伏感染したＢリンパ球に類似の***中の細胞（dividing cells）の中に維持されているようである。ＣＬＴがコードするＣＭＶタンパク質により実行される機能の一つは、ＥＢＶゲノムの維持においてＥＢＮＡ−１が演ずる役割に類似している。ＣＭＶとＧＭ −Ｐの相互作用は非増殖的なので、潜伏中にコードされるウイルスの機能は、調節の役割を演じ、α遺伝子の発現を抑制する。ＩＶ．用途／有用性Ａ．組換えポリペプチドの製造ＣＭＶ潜伏関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、すなわちＣＬＴは、適切な組換え発現ベクター中にクローン化され、次いで選択された宿主細胞、例えば大腸菌内で潜伏関連ポリペプチドを発現するのに使用される。このようなベクターは、典型的に、選択された宿主細胞と相容性である制御配列、例えばプロモーター領域、エンハンサー要素などを含有する配列を有している。これらの制御配列は、挿入配列（すなわち、潜伏関連ポリペプチドをコードする配列）が選択された宿主内で発現できるように、その挿入配列に機能可能に連結されている。代表的なコーディング配列としては、限定されないが、以下のポリペプチド、すなわち、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１および配列番号：７３をコードする配列がある。代表的なＤＮＡ配列としては、限定されないが、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０および配列番号：７２がある。潜伏関連ポリペプチドの組換え製造を行うのに用いる発現ベクターの一例は、プラスミドｐＧＥＸ（Smith 他の１９８５年と１９８８年の報告）およびその誘導体（例えば、米国ニュージャージー州ピスカタウエイ所在の Pharmacia Biote ch 社から入手できるｐＧＥＸシリーズ）である。これらのベクターは、グルタチオン−Ｓ-トランスフェラーゼでフレーム内に融合されたクローン化された挿入片のポリペプチド配列を発現する。組換えｐＧＥＸプラスミドは、大腸菌の適当な菌株に形質転換することができ、次いでＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を添加することによって、融合タンパク質の産生を誘導することができる。次に、可溶化組換え融合タンパク質を、標準の方法に従ってグルタチオンアガロースアフィニティークロマトグラフィーを用いて（Ausubel 他の１９８８年の報告）、誘導培養物（induced cultures）の細胞溶解物から精製することができる。あるいは、λｇｔ１１中に潜伏関連ポリペプチド配列をクローン化することによって製造されるようなβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を単離するのに、アフィニティークロマトグラフィーを利用することもできる。その融合タンパク質は、抗βガラクトシダーゼ抗体表面に結合させた固体支持体上に、細胞融解物を通過させることによって単離される。潜伏関連ポリペプチドをコードするＤＮＡは、いく種もの市販ベクター中にクローン化して、適当な宿主系中に組換潜伏関連ポリペプチドを生成させることができる。これらの系としては、いくつもの細菌発現ベクターがあり、例えば、λ ｇｔ１１（米国ウイスコンシン州マディソン所在の Promega 社）、ｐＧＥＸ（S mith 他の１９８５年と１９８８年の報告）およびｐＢＳ（米国カリフォルニア州ラホーヤ所在の Stratagene 社）のベクター類、酵母発現システム、例えば、 Pichia 発現キット（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在の Invitrogen 社から入手）、バキュロウイルス発現システム（Reilly 他の１９９２年の報告、B eames 他の１９９１年の報告、米国カリフォルニア州パロアルト所在の Clontec h 社）、および哺乳動物細胞の発現システム（米国カリフォルニア州パロアルト所在の Clontech 社、および米国メリーランド州ガイサーズブルグ所在の Gibco-BRL 社）がある。いくつもの特徴を発現ベクター中に組込むことができる。例えば、培地の中への発現された配列の分泌を促進するリーダー配列を組み込むことができる。組換え法で製造したポリペプチドは、典型的には、溶解された細胞または培地から単離される。上記のようにして製造された単離組換えポリペプチドは、示差沈澱法（differ ential precipitation）、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電収束法、ゲル電気泳動法およびアフィニティークロマトグラフィー法を含む標準のタンパク質精製法で精製することができる。また、タンパク質製剤は、例えば、濾過法で濃縮することができる（米国マサチューセッツ州ダンバーズ所在の Amicon 社）。組換え法に加えて、潜伏関連のタンパク質またはポリペプチドは、当該技術分野の当業者にとって公知の方法を用いて化学的に合成することができる。この発明の潜伏関連ポリペプチドは、ワクチンや診断用（例えば、以下に説明するような）を含むいくつもの用途に使用することができる。Ｂ．診断法およびキットこの発明の潜伏関連ポリペプチドは、潜伏ＣＭＶ感染があることを検出する診断剤として使用するのに有利である。このような潜伏感染を診断できることはいくつもの理由のため重要である。例えば成人人口の約８０％が増殖性ウイルス感染中に産生されるＣＭＶタンパク質に対する血清反応抗体を持っている（すなわち、成人人口の８０％が血清反応陽性である）ことが知られている。健康な個体の場合、典型的に、ＣＭＶに感染しても症状を示さない。これと対照的に、免疫不全の個体、例えば老人とＡＩＤＳにかかっている個体および乳児は、ＣＭＶ感染すると重篤な合併症を起こしやすい。したがって、移植組織と輸注製品（例えば、血液）は、典型的に、免疫不全の個体に対して不適な組織試料を同定するため、抗ＣＭＶ抗体の有無によって選別される。組織ドナーに抗ＣＭＶ抗体が存在していても、提供される組織中にウイルスが存在していることを必ずしても示していないことは知られている。事実、ＣＭＶ陽性の個体由来の血液の約５〜１２％だけがそのウイルスを実際に含有しているといわれている。したがって、移植組織（例えば、骨髄）または輸注製品（例えば、血液、血漿など）からＣＭＶが感染する危険を、現在可能な方法よりも、より高度に予測する試験法が必要とされている。この発明の方法は、上記のような試験に利用することができる。潜伏ＣＭＶ転写産物、潜伏関連ポリペプチドおよび／またはそのようなポリペプチドに対する抗体の存在により、再活性化する確率の増大したウイルスの存在を検知することが、意図されている。したがって、移植組織は、ＣＭＶについて示差選択（diff erential screen）に付してもよい。例えば、血清の試料は、最初に、公知の方法を用いて、抗ＣＭＶ抗体の存在の有無について試験する。試験の結果が陽性であった試料は、次に、この発明の方法を用いて二次の選択を行って、潜伏ＣＭＶ転写産物、ポリペプチドまたはそれら潜伏関連ポリペプチドに対する抗体の有無について試験する。潜伏関連ＣＭＶ転写産物の存在についての試験結果が陽性の試料は、ＣＭＶウイルスを伝播する可能性が高いと見なして、相応に処理し治療する。潜伏関連ＣＭＶ転写産物、すなわちＣＬＴを検出または診断する一つの方法は、以下の諸実施例で詳細に述べるＲＴ−ＰＣＲ法である。ＲＴ−ＰＣＲ法は、それが典型的に再現性が高くかつ多くの情報を提供する結果をもたらす点で、ＤＮＡＰＣＲ法よりも有利である。というのは、細胞が典型的にはＤＮＡの各コピー転写産物を多数含有していることも、その理由である。さらに、転写産物が存在することが転写活性の指標になり、これは、ＤＮＡの（潜伏的に静止性の）セグメントを検出するのよりも、より多くの情報を提供する。他の診断法としては、この発明には、血清が少なくとも一つの潜伏関連ポリペプチドに対する抗体を含有している場合に、抗体捕獲検定法が含まれる。この実施態様では、実験試料（例えば、血清または血漿）を、表面に結合した潜伏関連ポリペプチド（この発明の方法で得られる。例えば、配列番号：６３または配列番号：６７）を有する固相試薬と反応させる。抗潜伏関連ポリペプチド抗体を該試薬に結合させ、次いで末結合の血清成分を洗浄によって除いた後、該試薬をリポーター標識化ヒト抗体と反応させて、該固体支持体に結合した抗潜伏関連ポリペプチド抗体の量に比例して、リポーターを該試薬に結合させる。その試薬を再び洗浄して、未結合の標識化抗体を除去して、試薬と結合したリポーターの量を測定する。典型的には、リポーターは、適切な蛍光測定法用または比色測定法用の基質の存在下で該固相をインキュベートすることによって検出される酵素である。上記検定法における固体表面試薬は、固体支持体の材料、例えば、ポリマービーズ、ディップスティック（dip sticks）、９６ウェルプレートまたはフィルター材料に、タンパク質物質を付着させる公知の方法で調製される。これらの付着方法としては、一般に、タンパク質の支持体への非特異的吸着、または典型的には、固体支持体上の化学的反応性基、例えば活性化されたカルボキシル基、ヒドロキシル基またはアルデヒド基への遊離アミン基によるタンパク質の共有結合がある。均一系検定法として知られている第二の診断法では、固体支持体に結合する抗体は、反応媒体中である種の変化を起こし、その変化は該媒体中で直接検出することができる。今まで提案されている公知の一般的な形態の均一検定法としては、（ａ）スピン標識化リポーター、これは抗原に結合する抗体がリポートされる移動度の変化（スピンスプリットのピーク（spin splitting peak）の幅が広くなる）によって検出される方法、（ｂ）蛍光リポーター、これは結合が蛍光効率の変化で検出される方法、（ｃ）酵素リポーター、これは抗体の結合が酵素／基質の相互作用をもたらす方法、および（ｄ）リポソームに結合させたリポーター、これは結合によってリポソームが分解して、被包されていたリポーターが放出される方法がある。これらの方法は、均一系検出法の試薬を製造する従来の方法に従って、この発明のタンパク質抗原に適用される。上記の各検定法では、被検個体由来の血清をタンパク質の抗原と反応させて、結合する抗体が存在するかどうか該抗原について試験される。その試験は、第一の方法のように、標識化抗ヒト抗体を被検抗体に結合させ、次いで固体支持体に結合したリポーターの量を測定して行われ、または第二の方法のように、均一系検定法の試薬に結合する抗原の作用を観察して行う。また、この発明の一部として、上記検定法を実施するための検定システムまたはキットである。この発明のキットには、一般に、表面に潜伏関連ポリペプチド抗原、これは、例えば、組換え法で製造される、が結合されている支持体が含まれる。一面において、この発明には、この発明の潜伏関連ポリペプチドに対して特異的な抗体が含まれる。潜伏関連ポリペプチドまたはその免疫原性部分は、抗血清または抗体の製剤を生成させる際の抗原として使用することができる。典型的には、抗体を製造するには、宿主動物、例えばウサギを、精製抗原または融合タンパク質の抗原で免疫化する。その宿主の血清または血漿を適当な時間間隔をおいて収集し、その血清を、前記抗原に対して特異的な抗体が存在しているかどうか試験する。実施例は１４には、Ｓｊ２６融合タンパク質およびβガラクトシダーゼ融合タンパク質中の潜伏関連ポリペプチドに対して特異的なウサギ血清抗体の製造が記載されている。これらの技術は、この発明の他の潜伏関連抗原にも等しく適用することができる。免疫化動物のγグロブリン画分またはＩｇＧ抗体は、例えば、飽和硫酸アンモニウムまたはＤＥＡＥ Sephadex、またはポリクローナル抗体を製造するための当該技術分野の当業者にとって公知の他の方法を用いることによって得ることができる。あるいは、精製された潜伏関連抗原または融合抗原タンパク質がモノクローナル抗体を製造するのに使用できる。ここで、免疫化動物から脾臓またはリンパ球を取り出して、不死化させるか、または当該技術分野の当該業者にとって公知の方法（例えば、Harlow 他の１９８８年の報告）でハイブリドーマを製造するのに用いる。不死化された細胞が分泌する抗体を、例えば、ウエスタンブロット分析法を用いて、選別し、所望の特異性を有する抗体を分泌するクローンを確定する。第三の診断法では、抗潜伏関連ポリペプチド抗体が用いられる。試料中に潜伏関連ポリペプチドが存在していることは、例えば、抗原捕獲検定法を用いて検出することができ、この検定法では、候補試料中に存在している潜伏関連ポリペプチド抗原を、潜伏関連ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体と反応させる。この実施態様では、抗体を固体基板に結合させ、次いで試料に暴露する。このような試料としては、限定されないが、骨髄試料、組織試料、血液試料、およびこれらのホモジネートがある。次いで、潜伏関連ポリペプチド抗原の抗体／基板への結合が、第二の標識化抗潜伏関連ポリペプチド抗体を結合させることによって検出される。この発明のこの面において用いる抗体は、上記のように、この発明のペプチドを利用して製造することができる。この発明のこの面の実施において特に有用なのは、同じ潜伏関連ポリペプチドに対して生成される２種以上のモノクローナル抗体である。あるいは、ポリクローナル抗体の製剤を潜伏関連ポリペプチド抗原を捕獲するのに利用することもでき、抗原の存在を標識化モノクローナル抗体を用いて検出することもできる。あるいは、抗原競合検定法を用いて、特異的抗原と抗体の結合を検出することができる。簡単に云うと、抗潜伏関連ポリペプチド抗体分子が単離される（例えば、ウサギ抗潜伏関連ポリペプチドポリクローナル抗体血清由来のモノクローナル抗体またはＩＧＧ）。マイクロウエルを前記抗体でコートし、次いでその抗体でコートされたウエルを実験試料とともにインキュベートする。培養を行った後、ポリペプチド-リポーター複合体を各ウエルに加える。ポリペプチド-リポーター複合体は、リポーター部分を含有し、このリポーター部分としては、例えば、ウエルに結合させて抗体を生成させるために使用される潜伏関連ポリペプチドに接合された西洋ワサビペルオキンダーゼなどがある。ウエルを洗浄した後、結合したポリペプチドリポーター複合体の存在を、比色分析法の基質を添加することによって検出する。実験試料中に潜伏関連ポリペプチドが存在していることは、ポリペプチドリポーター複合体の結合がうまく阻害されるので、色が薄くなることによって確認さえる。潜伏関連ポリペプチドの試料中の濃度は、変化する既知量の潜伏関連ポリペプチドと一定量のポリペプチドリポーター複合体を用いて、この検定法用に作成した標準の線形阻害曲線に照らして求めた。同じく、この発明の一部を形成するものは、上記の診断法を実施するための検定システムまたはキットである。Ｃ．潜伏を誘発する化合物に対するスクリーンＬＳＳ１とＬＳＳ２のプロモーター領域は、それぞれ転写開始部位（＋１）のすぐ上流の配列（すなわち、配列番号：４２と配列番号：４３）を含んでいる。これらのプロモーター領域は、さらに、欠失分析（deletion analysis）で、転写のレベルを制御する追加の配列を同定することによって、特性分析を行うことができる。そして、所望のプロモーター領域を含有する配列は、いくつもの用途に使用できる。例えば、ＬＳＳ１および／またはＬＳＳ２のプロモーターの配列は、これらプロモーターを上方調節（upregulate）するのに有効な化合物を同定するためのスクリーンに用いることができる。上記のように、潜伏ＯＲＦ（latent ORF）が存在すると、下流のＯＲＦの発現を下方調節（down-regulate）すると考えられる。特定の機構に拘束されたくないが、このような下方調節は、活性ウイルスの潜伏を誘発するのに有効であると考えられる。したがって、潜伏ＣＭＶプロモーター、例えばＬＳＳ１とＬＳＳ２のプロモーターを上方調節する化合物は、活性ＨＣＭＶを阻害する抗ウイルス化合物として有効である。このような化合物を同定するのに有効なスクリーンは、次のとおりである。選択されたＣＭＶ潜伏プロモーターをリポーターの遺伝子構造体、例えばＣＡＴ構造中にクローン化し、その構造体は、そのプロモーターを許容する宿主細胞（例えば、ＧＭ−Ｐ細胞）中にトランスフェクトされる。これらの細胞を試験化合物と接触させて、リポーター遺伝子の発現について検定する。リポーター発現のレベルを上方調節する化合物は、ＣＭＶ潜伏転写を促進するのに有効であると認定される。Ｄ．遺伝子治療法におけるＣＭＶ潜伏プロモーターこの発明のＣＭＶ潜伏プロモーターは、遺伝子治療法の用途、特に顆粒球マクロファージ前駆細胞（granulocyte-macrophage progenitors）を標的とする用途に用いることができる。これらの細胞は、細胞の自己再生集団を含有し、ＣＤ３４⁺とＣＤ３３⁺の細胞型がある（ＣＤ３４⁺は、骨髄由来の造血細胞に対する公知の最初期の系統マーカー（earliest lineage marker）である）。上記の潜伏プロモーターは、初期段階の顆粒球マクロファージ系統での発現に対し特異的なようである。これらのプロモーターは、血液細胞に遺伝子を送達する（身体遺伝子治療法）のに適した発現ベクター中に組み込まれる。上記のプロモーター（ＬＳＳ１とＬＳＳ２からの発現を駆動するセンス転写産物プロモーターおよび／またはアンチセンス転写産物プロモーター）は、各種のベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、サイトメガロウイルス由来のベクター）に挿入され、これらのベクターに、顆粒球マクロファージ前駆細胞中に非相同遺伝子を発現する性能を付与する。ついで、これらのベクターを用いて、非相同遺伝子を、顆粒球マクロファージ前駆細胞中に送り込んで、顆粒球マクロファージ前駆細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球およびマクロファージを含む）由来の細胞を冒す疾患を治療することができる。顆粒球マクロファージ前駆細胞由来の細胞は、典型的には、循環血液の細胞であるから、この発明のキメラベクター（非相同遺伝子に機能可能に連結されたＣＭＶ潜伏プロモーターを含有する）は、血液が運ぶポリペプチド治療薬によって治療しやすい疾患（例えば、ゴーチエ病（Gautier's disease）を治療するのに有用な分泌タンパク質を発現させるのに使用できる。顆粒球マクロファージ前駆裁縫のような幹細胞は、分化循環細胞を着実に供給できるので、この種の遺伝子治療に顕著な有利性を提供する。Ｅ．潜伏ＣＭＶの感染に対する治療法この発明の方法および組成物は、個体をＣＭＶに対して免疫化して、潜伏CMV に感染するのを予防するのにもまた利用することができる。この発明のこの面によれば、潜伏関連ポリペプチド、このようなポリペプチド中に存在する抗原および／またはこのような抗原と特異的免疫反応性の抗体は、ワクチン組成物に使用して、これを予防接種された個体を潜伏ＣＭＶの感染から防護する。これらの免疫原性ポリペプチド、抗原および／または抗体は、増殖性感染中に発現されるポリペプチドまたは抗原がない場合に、潜伏感染に対し選択的に防護するワクチンを製造するのに使用でき、または、好ましくは、増殖性感染中に発現されるポリペプチドおよび／または抗原と組み合わせて使用することもできる。後者の手法によれば、増殖性ＣＭＶ感染に対し防護する（現在入手可能であるかまたは臨床実験中のＣＭＶワクチンの特徴である）のみならず、潜伏ＣＭＶ感染に対しても防護する一層「完全な」ワクチンが得られる。そのような完全なワクチンは、潜伏関連が見られる個体に投与すると、増殖性感染中にのみ発現されるウイルス抗原の認識に依存しているワクチンよりも、迅速に感染個体からウイルスを除去することができる。この発明の潜伏関連ポリペプチドと抗原を組み合わせて用いることができる、増殖感染中に発現される抗原の例としては、ＣＭＶの表面コート糖タンパク質類、例えば、ｇｐＵＬ５５（ｇＡ１−Ａ７（Lenore の１９８７年の報告）、ｇｐ１３０とｇｐ５５（Rasmussen 他の１９８５年の報告）、およびｇＢ（Britt 他の１９８８年の報告、Gonczol 他の１９９０年の報告、Pachl 他の１９９４年の報告）とも呼ばれる）、およびｇｐＵＬ７５（ｇＨ（Spaete 他の１９９１年の報告）とも呼ばれる）がある。免疫原性ペプチドを活性成分として含有するワクチンは、典型的には、液剤または懸濁剤のような注射剤として製造される。さらに、その免疫原性ポリペプチドは、注射する前に再構成して水性形態にするのに適した固体または凍結乾燥状態で製造することができる。免疫原性ポリペプチドは、また、乳化させたりリポソーム中に被包してもよい。これらポリペプチドは、これらと相溶性の、医薬として許容される賦形剤と混合することが多い。このような賦形剤としては、限定されないが、生理的食塩水、水、糖類（例えば、デキストロースとソルビトール）、グリセリン、アルコール類（例えば、エタノール［ＥｔＯＨ］）、および当該技術分野で公知の他の賦形剤およびその混合物がある。さらに、ワクチン製剤は、少量の他の添加剤、例えば、湿潤剤、乳化剤（例えば、界面活性剤）およびｐＨ緩衝剤を含有していてもよい。加えて、ワクチン製剤の効力を強化するいくつかのアジュバントを利用できる。そのようなアジュバントの例は、限定されないが、Ｎ-アセチル-ムラニル-Ｌ-トレオニル−Ｄ-イソグルタミンおよびＮ-アセチル-ノル-ムラニル-Ｌ-アラニル-Ｄ-イソグルタミンを含む類縁化合物の群、および水酸化アルミニウムである。この発明のワクチンに用いられる免疫原性ポリペプチドは、組み換え法によるかまたは合成法によるものでもよく、通常、中性または塩の形態でワクチンに配合される。医薬として許容される有機および無機の塩は、当該技術分野で公知である。この発明のワクチンは、典型的には、皮下もしくは筋肉内の注射によって非経口投与される。他の可能な調剤としては、経口配合剤と坐剤配合剤である。経口配合剤は、通常、添加剤（例えば、医薬グレードの糖類、サッカリン、セルロースなど）を使用し、普通は、１０〜９８％の範囲内の免疫原性ポリペプチドを含有している。経口組成物の形態は、丸剤、カプセル剤、錠剤、液剤、懸濁剤、粉末薬等の形態であり、徐放性または長期間放出性にするよう配合できる。坐剤の配合には、伝統的な結合剤と担体を用い、そして典型的には、０．１％〜１０％の免疫原性ポリペプチドを含有している。上記の情報にかんがみ、増殖性感染中に発現されるＣＭＶ抗原のみならず、潜伏中に発現されるＣＭＶ抗原に対する多価ワクチンを製造することができる。このようなワクチンは、配合法に適合した投与法、および予防もしくは治療を行うのに薬理学的に有効な量で投与される。投与される免疫原の量は、治療される患者、治療される患者の免疫系の防護免疫応答を起こす能力、および所望の防護レベルによって決まる。個体は、伝統的なワクチン法に加えて、「養子」免疫療法（Greenberg 他の１９９１年の報告）を用いることによって、潜伏ＣＭＶ感染の作用に対して防護される。この方法では、「教育された」免疫担当細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞：ＣＬＴ）を宿主に移入して、所望の免疫応答を仲介させる。防護を要する個体またはＨＬＡ適合同胞ドナーから単離された線維芽細胞を培養して増殖させ、ＣＭＶに感染させる。次いで、その感染した線維芽細胞を用いてＣＴＬを刺激し、その刺激されたＣＴＬを元の個体に移植する（Greenberg 他の１９９１年の報告）。この方法は、増殖性ＣＭＶ感染の重傷度を軽減することに成功したことが実証されている（Walter 他の１９９５年の報告）。潜伏感染が見られるＧＭ−Ｐは、同様に、ＣＴＬを半ビボ（ex vivo）で刺激するのに用い、次いで、その刺激された細胞は冒された個体中に移植されて、潜伏ＣＭＶに対する防護を行うことが意図されている。Ｆ．潜伏中に有効な抗ウイルス化合物の選別この発明は、他の面では、潜伏ＣＭＶタンパク質の機能に対する抗ウイルス性の可能性のある化合物の選別に関する。これらの機能を阻害する化合物は、ウイルス自体が潜伏状態を維持する性能に対する逆作用を有していると考えられる。したがって、このような化合物は、潜伏ＣＭＶ感染を治療するのに使用できる。いくつもある選別法の中からいずれでも利用することができる。例えば、この発明の潜伏関連ポリペプチドの機能、特にＯＲＦ９４（配列番号：６２）がコードするポリペプチド（配列番号：６３）の機能は、ウイルスＤＮＡとの相互作用であると考えられる。したがって、例えば配列番号：６３で表される配列を有するポリペプチドを組み合わせてウイルスＤＮＡを使う移動度シフト検定法を用いる選別は、上記抗ウイルス化合物を確認するのに使用できる。移動度シフト検定法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ausubel 他の１９８８年の報告の１２章を参照）。タンパク質ＤＮＡの相互作用は、標識化ＤＮＡフラグメントの非変性ゲル中での移動度を低下させる、選別されたタンパク質の性能を監視することによって、上記の検定法で検出される。潜伏関連ポリペプチド（例えば、配列番号：６３）とＣＭＶＤＮＡの間の相互作用を破壊するのに有効な抗ウイルス化合物を同定するために、試験化合物の存在下および試験化合物の不存在化で、タンパク質・ＤＮＡ相互作用検定法（例えば、移動度シフト検定法）を実施する。上記検定法において、タンパク質・ＤＮＡの相互作用を有意に混乱させるならば、その化合物は有効であると認定される。これら有効な化合物は、タンパク質とそのＤＮＡ標的の間の結合を有意に増加または減少させることができる。好ましくは、有効な化合物はそのような結合を完全に阻止するのがよい。下記の実施例はこの発明を説明するものであるが、決してこの発明を限定するものではない。材料および方法特に断らない限り、制限酵素とＤＮＡ修飾酵素は、New England Biolabs 社（米国マサチューセッツ州ビバリー所在）または Boehringer Mannhe im 社（米国インディアナ州インディアナポリス所在）から入手したものである。他の化学薬剤は、Sigma 社（米国ミズリー州セントルイス所在）または Unite d States Biochemical 社（米国オハイオ州クリーブランド所在）から購入した。Ａ．細胞とウイルスの培養５％仔ウシ血清（ＦＢＳ）、５６３７膀胱癌細胞（米国メリーランド州ロックビル所在の American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）line ＨＴＢ９）由来の５％調整培地、１００単位／ｍｌのペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充した、Iscove の改良ダルベッコ培地（米国ニューヨーク州グランドアイランド所在の GIBCO/BRL 社）中で（Baines 他の１９８７年の報告）、ヒト胎児肝細胞（１２〜１８周で流産した胎児）を培養した。非付着細胞を集め、一週間に３回移し変え（tansfer）、培養物にＧＭ−Ｐ（ＣＤ３３⁺ 細胞）を増大させ、ストロマ細胞および一層分化した骨髄単球系統の付着細胞を減少させた。ヒト***線維芽（ＨＦ）細胞を、１０％の「ＮＵＳＥＲＵＭ」（米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在の Collaborative Research 社）を補充したダルベッコの改良イーグル培地（GIBCO/BRL 社）内で増殖させた。ヒトＣＭＶ株 Towne のｌａｃＺ誘導体、ＲＣ２５６（Spaete と Mocarski の１９８７年の報告）および低継代分離株の Toledo（Plotkin 他の１９８９年の報告）を、ＨＦ細胞上で増殖させた（Spaete と Mocarskiの１９８５年の報告）。Ｂ．ウイルスの感染性の検出ウイルスを１０⁵のＧＭ−Ｐから放出させるために、凍結／融解（Ｆ／Ｔ）のサイクル（−８０℃／３７℃）を３回行った。プラーク検定法をＨＦ細胞に行ったが、接種時に、遠心濃縮（centrifugal enhancement）を行った（Woods 他の１９８７年の報告）。共生培養でウイルスを回復させるため、被感染ＧＭ−ＰをＨＦ細胞培養物中に導入した。Ｃ．ネストＤＮＡのＰＣＲ（nested DNA PCR）および細胞の希釈（cell dilut ion）細胞または核を計数し、希釈して、試験管当たり平均数を１００、３０、１０、３および１にして、次にＤＮＡを、すでに報告されているようにして抽出した（Kondo 他の１９９１年の報告）。核は、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．９）、５ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのＤＴＴおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の中で、氷上で融解した細胞から調製し、そして位相差顕微鏡によって監視した。最初のＰＣＲ増幅は、Perkin-Elmer Therm ocycler（９４℃で１分間、６２℃で１分間および７２℃で２分間）を３０サイクル使用して、すでに報告されている（Porter-Jordan 他の１９９０年の報告）ようにして、ie1 のプライマーであるＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）およびＩＥＰ２ＡＩＩ（配列番号：15）を使って、行った。ネストプライマーＩＥＰ３Ｂ（配列番号：１９）とＩＥＰ３Ａ（配列番号：１８）（９４℃で１分間、５２℃で１分間および７２℃で２分間）を３０サイクル使用して、最初の反応液１μｌを次の反応の鋳型として用いた。その反応液は、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、１μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ（米国カリフォルニア州フォスター所在の Perkin-Elmer 社）を含有していた。増幅を行った後、各反応液の１０％を、２．５％アガロースゲル上で電気泳動させることによって分離し、そのゲルを臭化エチジウムで染色した（Higchi の１９８９年の報告）。使用したプライマーの配列は、図７に示し、かつ配列表に挙げある。上記のプライマー対および他のプライマー対で得られたスプライスされていないＰＣＲ産物とスプライスされたＰＣＲ産物の両者の大きさの期待値（ｂｐ）を以下の表１にまとめた。Ｄ．定量的競合ＰＣＲ８×１０⁴個の細胞または核を、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．４５％のＮＰ−４０、０．４５％のＴｗｅｅｎ−２０および１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有する溶液６０μｌ中に懸濁させ、次いで６５℃で１６時間インキュベートし、続いて９８℃ で１０分間インキュベートして、プロテイナーゼＫを失活させた（Higchi の１９８９年の報告）。各試料を６等分して、競合鋳型として、変性ヒトＣＭＶ ie １ｃＤＮＡの３×１０³〜１×１０⁶個のコピーの存在下で分析した（図６参照）。なお、上記ｃＤＮＡは、エキソン２、３および４からタンパク質のコーディング配列を表す１５４９個のｂｐのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩフラグメントを有する構造体のｐＯＮ２３４７から得た。プライマーのＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）とＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）を用いて、ＰＣＲ増殖を同条件下で３０サイクル行い、ネストＰＣＲ分析法に報告されているようにして、アガロースゲル電気泳動法で分析した。Ｅ．逆転写ＰＣＲ感染ＧＭ−Ｐ、およびＣＭＶ感染ＨＦ細胞と未感染ＧＭ−Ｐ細胞の対照混合物から標準法でＲＮＡを抽出した（Chomczynski と Sacchi の１９８７年の報告）。１０³以下のＧＭ−Ｐの試料全てについて、ＲＮＡの抽出を行う前にＲＮアーゼを含有していない酵母ｔＲＮＡ（Sigma 社）２μｇを添加した。１００単位の「ＲＮＡＳＩＮ」（Promega 社）の存在下で、ＲＮＡを、５単位のＲＮアーゼを含有しないＲＱ１ＤＮアーゼ（米国ウイスコンシン州マディソン所在の Promeg a 社）で、３７℃で１時間処理し、次にランダム６量体のプライマー１μｇおよび「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」マウス白血病ウイルス逆転写酵素（GIBCO／BRL 社）または熱安定性ｒＴｔｈポリメラーゼ（Perkin E lmer 社）を、メーカーのプロトコルを利用しながら使用して、ｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡ試料を、次に、以下に説明し図６に示す条件とプライマーを用いて、ＰＣＲに付した。β_2.7遺伝子転写産物の場合、これはスプライスされていないが、プライマーの２．７Ａ（配列番号：４）および２．７Ｂ（配列番号：５）と、９４℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で１分間のサイクルパラメーターを使用して、４５サイクルのＰＣＲを実施した。スプライスされたＵＬ１１２／１１３転写産物の場合、非対称のネスト増幅（ asymmetric nested amplification）を、最初にプライマーの１１２Ａ（配列番号：１）と１１３Ｂ（配列番号：２）を用いて３０サイクル実施し（２２８ｂｐの予想産物）、次にプライマーの１１３Ｄ（配列番号：３）と１１２Ａ（配列番号：１）を用いて３０サイクル実施した（１５０ｂｐの予想産物）。なお、これらの増幅は、９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で２分間のサイクルパラメーターを使用して、行った。 ie１転写産物については、プライマーのＩＥＰ２ＡＩＩ（配列番号：１５）およびＩＥＰ３Ｄ（配列番号：２１）（エキソン２〜３、図５Ａ）、またはプライマーのＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）およびＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）（エキソン３〜４、図５Ｂ）を用い、かつ（９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で２分間）または（９４℃で１分間、６２℃で１分間および７２℃ で２分間）のパラメーターを用いて、３０サイクルのＰＣＲを実施した。利用した他のサイクルパラメーターは、（Ａサイクルパラメータ）９４℃で１分間、６５℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクル；（Ｂサイクルパラメーター）９４℃で１分間、６２℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクル；（Ｃサイクルパラメーター）９４℃で１分間、５５℃で２分間および７２℃で３分間を４０サイクル；（Ｄサイクルパラメーター）９４℃で１５秒間、６０℃で１分間および７２℃で３分間を３０サイクル；（Ｅサイクルパラメーター）９４℃で１分間、５８℃で１分間および７２℃で２分間を３０サイクルであった。ＰＣＲ反応液は、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌｐＨ８．５、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、使用した各プライマー１μＭ、２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ（Boehringer Mannheim 社）を含有していた。いくつかの反応に、Gene Amp ＸＬＰＣＲキット（Perkin Elmer 社）と、メーカー指定の条件を用いた。試料を２．５％アガロースゲル上に電気泳動させた後、臭化エチジウムを用いて可視化した。β_2.7とＵＬ１１２／１１３転写産物を分析する場合、分離したフラグメントを変性させ、「HYBRIDON-N⁺」膜（米国イリノイ州アーリントンハイツ所在の Amersham 社）に写し、³²ＰｄＣＴＰで標識化した（ランダムプライムを行った、Amersham 社）ＤＮＡプローブ、またはγ³²Ｐ−ＡＴＰ（Amersham 社）で末端を標識化したオリゴヌクレオチドのプローブとハイブリッドを形成させ、次に Kodak X-OMAT フィルム（米国ニューヨーク州ロチェスター）を用いてオートラジオグラフィーに付した。Ｆ．５’−ＲＡＣＥのＰＣＲｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ；Ohara 他の１９８９年の報告）を実施して、選択された転写産物の末端を同定した。感染してから４週間後には、１０⁴〜１０⁵のＧＭ−Ｐから単離したＲＮＡ（図１参照）を、メーカーのプロトコルに従って、１０ｐｍｏｌのプライマーＩＥＰ２Ｅ（配列番号：１７）の存在下で「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」を用いて４５℃で２時間逆転写させる（アンチセンス転写産物の場合）か、または１０ｐｍｏｌのプライマーＩＥＰ３Ｄ（配列番号：２１）の存在下でγＴｔｈ逆転写酵素（Perkin-Elmer 社）を用いて、７０℃で１時間逆転写させた（センス転写産物の場合）。ＲＮアーゼＨで消化した後、ｃＤＮＡを「ＱＵＩＣＫＳＰＩＮ」Ｇ−５０「ＳＥＰＨＡＤＥＸ」カラム（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在の Pha rmacia Biotech 社）で単離し、次に精製ｃＤＮＡの１０μｌに、２５０μＭのｄＡＴＰの存在下で、２０単位の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（GIBCO／BRL 社）を用い、容積２０μｌの中で３７℃で１０分間、３’−テイル処理を行った。この試料５μｌを、５０ｐｍｏｌの適当なプライマー（センスＲＮＡの場合はＩＥＰ３Ｄ−配列番号：２１を用い、アンチセンスＲＮＡの場合はＩＥＰ３Ｅ−配列番号：２２を使用）およびアンカープライマー（ＲＬ−１；配列番号：３５）を全容量１００μｌで使用して、ＰＣＲに付した。Ｔａｑポリメラーゼを用い、最初、Ｃサイクルパラメーターを使用して、４０サイクルのＰＣＲを行った。最初の反応に続いて、「ＧＥＮＥＡＭＰＸＬ」ＰＣＲキット（米国カリフォルニア州フォスター所在の Perkin−Elmer 社）を用い、４０ｐｍｏｌのネストＰＣＲプライマー（センスＲＮＡの場合にはＩＥＰ２Ｄ−配列番号：１６またはＩＥＰ１Ｄ−配列番号：７、そして、アンチセンスＲＮＡの場合にはＩＥＰ３Ｇ−配列番号：２３）とともにプライマーＮ１（配列番号：３３）を使用して、Ｄサイクルパラメーターを使って３０サイクルのＰＣＲを行って１μｌのＰＣＲ産物を増幅した。Ｇ．３’−ＲＡＣＥのＰＣＲ感染してから４週間後の１０⁴〜１０⁵個のＧＭ−Ｐから単離したＲＮＡを、メーカー（Gibco/BRL）が推奨するプロトコルに従って、５０ｐｍｏｌのアンカープライマー（ＲＬ−１；配列番号：３５）の存在下で、「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」を用い、全容量２０μｌで、４５℃で２時間逆転写に付した。この試料５μｌを、４０ｐｍｏｌのＣＭＶ配列特異的プライマー（センスＲＮＡの場合はＩＥＰ２ＡＩＩ−配列番号：１５、そしてアンチセンスＲＮＡの場合はＩＥＰ３Ｄ−配列番号：２１）およびプライマーＮ２（配列番号：３４）を全容積１００μｌで用い、ＰＣＲを行って増幅した。「ＧＥＮＥＡＭＰＸＬ」ＰＣＲキットを用いて、ＰＣＲを２５サイクル行った。そのＰＣＲ産物１μｌを、４０ｐｍｏｌのネストＰＣＲプライマー（センスＲＮＡの場合はＩＥＰ３Ｃ−配列番号：２０、アンチセンスＲＮＡの場合はＩＥＰ２Ｄ−配列番号：１６を使用）とともにプライマーＮ１（配列番号：３３）を用いて、Ｄサイクルパラメーターを使って、２５サイクルのＰＣＲで増幅した。実施例１骨髄単球細胞の培養ＣＭＶとＧＭ−Ｐの直接相互作用を研究できる培養物を樹立するため、胎児骨髄または肝臓の細胞を、骨髄単球細胞培養条件（Baines 他の１９８７年の報告）下で、培養した。これらの培養条件は、ＣＭＶを許容するストロマ細胞（Reis er 他の１９８６年の報告）に依存することなく、骨髄単球系譜細胞の増殖を支えた。これら懸濁培養物中の非付着細胞集団は、ＣＤ１４、ＣＤ１５およびＣＤ３３の細胞表面マーカーを発現し、このことは「FACSCAN」および Becton Dicke nson 社（米国カリフォオルニア州サンノゼ所在）から入手したマウスモノクローナル抗体を使用して多パラメーター・フロー・サイトメトリーによって判定されたが、骨髄単球の形態を示した。胎児骨髄および胎児肝臓それぞれを用いて開始した培養物は、約４週間増殖し続ける類似の非付着細胞集団を増殖させることができた。非付着細胞を１週間に３回移し変え、最初にストロマ細胞を枯渇させ、後に、これら培養物内で分化した大きな付着細胞を除いた。メチルセルロースコロニー形成検定法（Kyoizumi 他の１９９２年の報告）を用いて、独立した６個の胎児試料の顆粒球マクロファージのコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）を評価した。これらの試料は、１×１０³〜５×１０³のＣＦＵ−ＧＭ／１０⁶出発胎児肝細胞であった。図１は、ヒトＣＭＶＤＮＡのＧＭ−Ｐ培養物中での維持を示す。異なる起源由来の肝細胞６試料（各試料２個ずつの複製培養物）を培養物に入れた（１培養物あたり全細胞数１０⁶個、１〜５×１０³のＣＦＵ−ＧＭを含有）。接種の直後、１細胞あたりＲＣ２５６のプラーク形成単位（ＰＦＵ／細胞）は３であったが、続いて、感染後（ＰＩ）３、７、１４、２１および２８日目に、５×１０⁴〜４×１０⁵の細胞由来のＤＮＡを用い、定量競合ＰＣＲで、ＣＭＶＤＮＡコピー数を測定した（例えば、８×１０⁴の細胞の分析結果を図２Ｃに示す）。１培養物あたりのＧＭ −Ｐ数は、直接計数によって測定し、ＤＮＡ陽性感染細胞数は、細胞希釈ＰＣＲ法で測定した（表２ならびに図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃ）。図１中の記号は次のとおりである。□：出発細胞数、■：ＣＦＵ−ＧＭ数、●：感染細胞数、○：全細胞数、△：ＤＮＡコピー数。ＣＦＵ−ＧＭは、出発細胞集団中のＣＤ３４⁺細胞の数と相関関係があった（これらの細胞は、ＣＤ１４⁺、ＣＤ１５⁺、ＣＤ３３⁺のＧＭ−Ｐ集団の前駆体のようである）。このデータは、これらの培養を開始するのに使用された細胞の５０％超がＣＤ３３⁺であり、そして小部分がＣＤ３４⁺であってＣＦＵ−ＧＭを形成できることを示した。実施例２細胞培養物のＣＭＶ感染ＣＭＶに感染させるため、１０名の個体のＣＭＶ陰性起源由来の１０⁶の胎児肝細胞の試料を２個ずつまたは３個ずつ培地中に入れた。３日後、非付着細胞を集め、計数し、次いで、感染多重度（ＭＯＩ）３でＣＭＶ（ＲＣ２５６）に曝露した。ＲＣ２５６、すなわち強力なＣＭＶβ（後初期）プロモーター（β_2.7）の制御下にあるｌａｃＺ遺伝子を保有する Towne 株の誘導体を用いた。というのは、このウイルスは、豊富なレベルのβガラクトシダーゼ（β-Gal）を発現し、このβ−Galが細胞および組織の中でのウィルスの複製の簡便でかつ敏感な指標を提供したからである（Spaete と Mocarski の１９８５年の報告、Mocarski 他の１９９３年の報告）。感染細胞を洗浄してウイルスを除き、培地に入れた。１週間ずつ間隔をおいて、独立の各胎児試料で作成した二つずつまたは三つずつの培養物から、１０⁵個のＧＭ−Ｐを取り出した。ウイルスの感染は、非付着細胞または付着細胞の増殖または形態に有意な影響を与えなっかた。実施例３ β-Gal の発現の検出ＲＣ２５６に感染させたＧＭ−Ｐの試料１０個を、感染してから３週間後または４週間後に収穫した。凍結／融解（Ｆ／Ｔ）を行って放出させた遊離ウイルスを、ＨＦ細胞上でプラーク検出を行った。１０⁵のＧＭ−ＰをＨＦ細胞とともに１２日間、共生培養を行い、感染中心（ＩＣ）の検出を行った。先に報告されている（Baines 他の１９８７年の報告）ように、５-ブロモ-３-クロロ-インドリル-β-Ｄ-ガラクトピラノシド（Ｘ-gal）を用いて、１０⁵の細胞の重層（overla y）によって、β-Gal を検出した。一週間ごとに、試料を、感染ウイルスの有無、およびウイルスβ（後初期）遺伝子の発現の指標としてのβ-Gal の発現の有無について分析した（表２）。凍結／融解細胞溶解物のプラーク検定法も、無傷の細胞の感染中心の検定法も、いずれもＧＭ−Ｐ集団の中にウイルスが複製している証拠は見つけられなかった。このことは、先に挙げた諸報告（Reiser 他の１９８６年の報告、Apperley 他の１９８９年の報告、Simmons 他の１９９０年の報告、Sing と Ruscetti の１９９０年の報告）と符合している。さらに、これらの細胞はＸ-gal で染色されなっかた。全体として見て、これらの知見は、最初に入れた感染性ウイルスの残留（residual input infectious virus）も、ウイルスの複製も、これらの培養物中には検出できなかったことを示している。実施例４ＣＭＶのＰＣＲ検出ＲＣ２５６に感染させたＧＭ−Ｐ細胞の試料１０個を、感染してから３週間後または４週間後に収穫した。凍結／融解（Ｆ／Ｔ）を行い遊離ウイルスを放出させ、ＨＦ細胞上でプラーク検定を行った。１０⁵のＧＭ−ＰをＨＦ細胞とともに、１２日間共生培養を行い感染中心（ＩＣ）の検出を行った。指定数の細胞から単離されたＤＮＡを抽出し、次いで ie1 領域のプライマーを用いてネストＰＣＲ検定法に付した。ＧＭ−Ｐの１０個の個々の試料中の高比率の細胞（試料によって１０〜１００％）が、ie1 領域のための一塊（ネスト状の一組、anested set）のプライマーを用いて細胞希釈ＰＣＲ分析法によって、ＣＭＶＤＮＡに対して陽性であることが見出された。図１に、上記１０個の培養物のうちの６個についてＣＭＶとＧＭ−Ｐの相互作用をまとめて示す。ＤＮＡコピー数は、感染直後と感染後３、７、１４、２１および２８日の試料について定量競合ＰＣＲ法を用いて算出した。また、累積細胞数を、細胞の直接計数によって求め、そしてゲノム陽性であった細胞の百分率を、細胞希釈後ネストＤＮＡＰＣＲ（nested DNA PCR）法によって推定した。ＧＭ−Ｐが増殖するにつれて、細胞数は１培養物あたり１０⁷〜１０⁸細胞まで蓄積され、ウイルスＤＮＡが細胞数と平行して蓄積された。上記の同じ６個の培養物から単離した細胞と核を希釈分析法で比較した結果、ウイルスＤＮＡは、主として細胞の核分画（nuclear fraction）と関連していることが見出された。ウイルスＤＮＡが３個以上の細胞または核を含有する試料中に検出された例を、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。図２Ａと２Ｂは、細胞と核の中にＣＭＶＤＮＡが保持されていることを示している。細胞（図２Ａ）と核（図２Ｂ）は、ＤＮＡを調製する前に、計数し希釈して、図中の各レーンの上に示したように、１試験管あたりの平均個数を１００、３０、１０、３および１個とした（Kondo 他の１９９１年の報告）。ie1 特異的プライマーを用いて、最初にＩＥ４ＢＩＩとＩＥＰ２ＡＩＩ（配列番号：１５）を使って３０サイクル、次いでＩＥＰ３Ｂ（配列番号：１９）とＩＥＰ３Ａ（配列番号：１８）を使って３０サイクルで、塊ＰＣＲ（nested PCR）で生成した１６７ｂｐ産物の位置が、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルのレーンと並べて示されている。ＭＷＭ：１００ｂｐのラダー（ladder）（Gibco/BRL 社）。図２Ｃは、ＣＭＶＤＮＡのコピー数を測定する代表的な実験の結果を示す。８×１０⁴の細胞から単離されたＤＮＡ（左半分）または８×１０⁴の核から単離されたＤＮＡ（右半分）を、コンペチターとして、３×１０³〜１×１０⁶のコピーの変性ヒトＣＭＶ ie1 ｃＤＮＡの存在下で、プライマーとしてＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）およびＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）を用いて定量ＰＣＲに付した。コピー数は、各レーンの頂部に示してある。ヒトＣＭＶＤＮＡからの３８７ｂｐの産物と、競合鋳型からの２１７ｂｐの産物の位置が、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルのレーンと並べて示されている。得られた結果は、約３×１０⁴のＣＭＶゲノムがこれらの試料中に存在する事を示しており、このことは約２０ゲノム／ゲノム陽性細胞に相当する。全試料についてのこの分析結果は、ＣＭＶＤＮＡが、独立して樹立された培養物中のＧＭ−Ｐの１０〜１００％の中に存在していることを実証した（上記の表２）。ie 1 ｃＤＮＡクローンをコンペチターとして用いる定量競合ＰＣＲ法（Higchi の１９８９年の報告）を使って、ゲノム陽性細胞あたり１０〜１００コピーのウイルスゲノムのコピー数、すなわち核ＤＮＡの分析結果と一致する数（例えば、図２Ｃ）を推定した。上記結果は、ＣＭＶＤＮＡが、他のヘルペスウイルスによる潜状感染に特徴的なゲノムコピー数で、ＧＭ−Ｐ細胞と定量的に会合していたことを示している。実施例５長期間の共生培養ＧＭ−Ｐは、それがすでに１か月間も骨髄単球培養物中にあったにもかかわらず、１２日間に亘るＨＦ細胞との共生培養中で増殖し続けたので、実験を行って、ウイルスが長期間の供生培養後に回復できるかどうかを調べた。感染ＧＭ−Ｐについて、ＨＦ細胞単層との長期間の共生培養の後でウイルスを生成できるかどうかを調べた。ＲＣ２５６に感染させた骨髄細胞の１０個の個々の試料を、感染後４週間で収穫し計数した。各試料由来の約３００個の感染細胞を、予めＨＦ細胞を播種した９６ウエルの培養皿の４８個の各ウエルに移植した。１２個のウエル（全て同じ試料由来の細胞が入っている）を、共生培養の開始後５、１２、１６および２１日に、Ｘ-gal で染色した。正の対照として、そして、これらの条件下で増殖感染を受けた細胞からＣＭＶが急速に広がるのを示すため、１ウエルあたり１〜５個の感染細胞を含有する３００個のＨＦ細胞を、未感染のＨＦ細胞と共生培養した。これらの培養物は、さらに３週間維持された。ウイルスの回復（プラークの生成）を、共生培養ご５、１２、１６および２１日に評価して、結果を下記の表３にまとめた。上記ＧＭ−Ｐは、１２日間を通じてウイルス陰性のままであったが、２１日までに８０％の試料がウイルスを生成した。比較のために、増殖感染を受けた少数のＨＦ細胞を平行して培養したところ、５日以内にプラークを生成し、そして一つの無細胞感染性ウイルス（one cell-free infectious virus）を入れたところ、７日以内にプラークを生成した。したがって、ＧＭ−Ｐと会合したウイルスは、かなり遅れた機序で回復され、これは、少量の感染性ウイルスの持続というよりも、潜伏からの再活動化に一致する。再活動化は、３００個のＧＭ−Ｐを播種して試験した１０個の試料のすべてに起こったので、これは、潜伏感染を受けたＧＭ−Ｐからの感染性ウイルスが再現性ある回復をすることを示している。播種されたＧＭ−Ｐが３００個より少ないと、比例して再活動化を示すウエルの数が減少した。このことは、培養物中のゲノム陽性細胞の全てがこれらの条件下でウイルスを生成できる訳ではないことを示唆している。類似の結果が、ＣＭＶの低継代 Toledo 株で得られた。実施例６ＲＴ−ＰＣＲによるウイルスのα遺伝子とβ遺伝子の発現の検出上記の１０個のＧＭ−Ｐ培養物（感染後４週間）を、材料および方法の項で詳細に述べたように、直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって、ウイルスのα遺伝子とβ遺伝子が発現しているかどうかを分析した。ＰＣＲ反応の産物を２．５％アガロースゲル上に分散させて臭化エチジウムで染色した。β_2.7とＵＬ１１２／１１３の転写産物を分析するため、分離したフラグメント（画分）をブロットし、次いで材料および方法の項で述べたように、³²ＰｄＣＴＰで標識化した特異的ＤＮＡプローブでプローブした。図３Ａ（臭化エチジウムで染色したゲル）および図３Ｂ（ブッロトオートラジオグラフ）は、５種の異なるＲＮＡの試料（図３Ａ：レーン２〜６、図３Ｂ：レーン８〜１２）について行ったＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示し、各試料は１０⁵ の細胞由来の試料であり、豊富に発現されるβ_2.7遺伝子からのスプライスされていない転写産物を検出できるＰＣＲプライマーを用いている（Greenaway と W ilkinson の１９８７年の報告）。図４Ａと４Ｂは、上記のように実施したＲＴ −ＰＣＲ分析の結果を示すが、ＵＬ１１２−１１３遺伝子由来のスプライスされた転写産物のファミリーを増幅するよう設計されたプライマーを使用している（ Staprans と Spector の１９８６年の報告）。使用された条件が、１０⁵個の未感染ＧＭ−Ｐ中に混合された単一の感染ＨＦ細胞（感染してから８h後）中の転写産物を検出するのに十分に敏感であっても、β_2.7の転写産物もＵＬ１１２−１１３の転写産物も検出されなかった（図３Ａと４Ａのレーン１、図３Ｂと４Ｂのレーン７）。ラベルＭをつけたレーンは、１００ｂｐラダーのサイズマーカー（GIBCO/BRL 社）である。材料および方法の項で詳細に述べたプライマーを用いて行ったα遺伝子の ie1 ＰＴ−ＰＣＲ転写産物の分析結果を、図５Ａと５Ｂに示す。図５Ａと５Ｂに示す実験では、１０³個の感染ＧＭ−Ｐの３種の異なる試料（＃１、＃２、および＃３）由来のＲＮＡを使用した。各試料について、次の三つの分析を行った。（ｉ）逆転写酵素を反応（ＲＴＰＣＲ）に加えた分析、（ｉｉ）対照として、逆転写酵素を反応（ＰＣＲ）から除外した分析、および（ｉｉｉ）ＲＮＡを、ＲＴ −ＰＣＲを行う前に、３７℃で１時間、２０ｎｇのＲＮアーゼＡ（Sigma 社）で処理した分析（ＲＮアーゼＰＣＲ）である。ＲＮＡの全試料は、ＲＮアーゼなしのＲＱ１ＤＮアーゼで処理した。１０³個の感染ＧＭ−Ｐの試料由来のＣＭＶＤＮＡのＰＣＲも比較のためレーン１に示す。対照には、１０³個の末感染ＧＭ−Ｐ細胞と混合（４ｈ）された１０個の感染ＨＦ細胞から抽出されたＲＮＡ（図５Ａと５ＢＮレーン１１）、または１０³ 個の末感染ＧＭ−Ｐ細胞と混合（４ｈ）された１０個の感染ＮＩＮ３Ｔ３細胞から抽出されたＲＮＡ（図５Ａと５Ｂ、レーン１２）が含まれていた。図５Ａのデータは、エキソン２〜３を増幅するプライマーを用いて得た。そして、図５Ｂのデータは、エキソン３〜４を増幅するプライマーを用いて得た（材料および方法の項）。１５１ｂｐのスプライスされた産物と２６３ｂｐのスプライスされていない産物の位置が、図５Ａに矢印で示され、一方、２１７ｂｐのスプライスされた産物と３８７ｂｐのスプライスされていない産物が図５Ｂに矢印で示されている。ここで使用した３０サイクルのＰＣＲ条件は、半定量的であったので、バンドの強度でＲＮＡのレベルが推定される。レーンＭは、１００ラダーのサイズマーカー（GIBC O/BRL 社）を示す。豊富なα遺伝子 ie1 からの転写は、１０³個のような少ない細胞由来のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで評価した場合でも、６個の感染ＧＭ−Ｐ培養物すべてに容易に検出された（図５Ａと５Ｂに、２つの異なる ie1 領域について、三つの例が示してある）。末感染ＧＭ−Ｐ由来のＲＮＡを用いた分析結果は、一様に陰性であった。予想外であったが、観察された信号は、主として感染ＧＭ−Ｐ中のスプライスされていないＲＮＡから発せられており、増殖感染されたＨＦや不発感染されたマウスＮ１Ｈ３Ｔ３線維芽細胞に典型的なスプライスされたＲＮＡからが主ではなかった。圧倒的多数の ie1 ＲＮＡがスプライスされないまま、６個の独立した被検ＧＭ−Ｐ培養物の全ての中に残っていて、１０³個の細胞由来のＲＮＡ中にＲＴ−ＰＣＲによって容易に検出された。スプライスされていないＲＮＡが、ie1 遺伝子のエキソン２と３の間（図５Ａ）またはエキソン３と４の間（図５Ｂ）に存在していることが実証された。半定量的なＰＣＲ条件を用いて、ＲＮＡの各試料が増幅前にｃＤＮＡのコピーを少なくとも１０³個含有していることが推定された。内部オリゴヌクレオチドプローブでＰＣＲ反応産物をプローブすることによる推定では、これらの転写産物の７０％〜９９％がスプライスされないままであった。スプライスされていない転写産物がこのように相対的に非常に多いことは異状であり、これは、潜伏中の ie1 遺伝子の発現が、増殖性感染中に起こる発現と異なっていることを示している（Mocarski の１９９３年の報告）。細胞希釈シリーズから単離したＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで分析して得た結果は、２〜５％ものＣＭＶゲノム陽性細胞がスプライスされていない ie1 転写産物を含有していたことを示唆している。モノクローナル抗体を利用した実験では、これらの細胞中に７２ｋＤａの ie1 遺伝子産物が存在していることを検出できなかったが、これは、適当にスプライスされた転写産物が相対的に欠如していることと合致している。さらなる分析により、このスプライスされていないＲＮＡの約１０％がポリアデニル化されていることが分かった。実施例７潜伏感染ＧＭ−Ｐ由来のＣＭＶｃＤＮＡのストランド特異的増幅 ie1/ie2 領域の転写産物を、ストリンジェント条件下（７０℃）でストランド特異的プライマーで逆転写させ、潜伏感染ＧＭ−Ｐ由来のｃＤＮＡを増幅するためＰＣＲに使用した。これらの分析に使用した諸プライマーの相対的位置を図６に示す。これらプライマーの配列を図７に示し、配列表に示してある。プライマーのＩＥＰ２ＡＩＩ（配列番号：１５）とＩＥＰ３Ｄ（配列番号：２１）またはＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）とＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）で、それぞれＡサイクルパラメーターまたはＢサイクルパラメーターを使って、３０サイクルのＰＣＲを使用した（材料および方法の項の「逆転写ＰＣＲ」）。反応液には、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１．２５単位のＴａｑポリメラーゼ（Boehringer Mannheim 社）を含有していた。オリゴヌクレオチドのＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）とＩＥＰ２ＡＩＩ（配列番号：１５）を用いて、センス転写産物とアンチセンス転写産物それぞれからのｃＤＮＡの合成を開始した。上記のプライマーＩＥＰ２ＡＩＩ（配列番号：１５）とＩＥＰ３Ｄ（配列番号：２１）（ie1 エキソン２と３）またはＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）とＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）（ie1 エキソン３と４）を用いてＰＣＲを行った後、産物をアガロースゲル電気泳動法で分割した。結果を図８に示すが、これは ie1 のエキソン２と３の間（レーン１〜５）および ie1 のエキソン３と４の間（レーン６〜１０）の発現についての試験である。ＲＮＡは、単一ステップの酸性グアニジウム-チオシアネート-フェノール- クロロホルムによる抽出法（Chomczynski と Sacchi の１９８７年の報告）によって、１０⁴個（レーン１〜３と６〜８）の潜伏感染ＧＭ−Ｐから抽出して調製し、１０個の増殖性感染（感染後４時間）ヒト線維芽（ＨＦ）細胞（レーン５と１０）から抽出したＲＮＡと比較した。各試料に対して、RNAを抽出する前に、２μｇのＲＮアーゼなしの酵母ｔＲＮＡ（Sigma 社）を添加した。全てのＲＮＡ試料を、逆転写を行う前に、１００単位の「ＲＮＡＳＩＮ」（Promega 社）の存在下で５単位のＲＮアーゼなしのＲＱ１ＤＮアーゼ（Promega 社）で３７℃で１時間処理した。レーン１、５、６および１０の試料の場合、メーカーが推奨するプロトルコに従って、ランダム６量体のプライマー（GIBCO/BRL 社）と「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」逆転写酵素（GIBCO/BRL 社）を使用して合成した。レーン２、３、７および８の試料については、５単位の耐熱性ｒＴｔｈ逆転写酵素（Perkin-Elmer 社）をプライマーＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）とともに使用して、センスストランド（レーン２と７）をコピーし、そしてプライマー１ＥＰ２ＡＩＩ（配列番号：１５）とともに使用して、アンチセンスストランド（レーン３と８）をコピーした。メーカーのプロトコルに従って７０℃で３０分間インキュベートした後、試料を、上記に詳述したようにして、ＰＣＲに付した。ウイルスＤＮＡの約１０⁵個のコピー（レーン４と９）を同じＰＣＲ条件に付して、比較のために使用した。２．５％アガロースゲルを使って電気泳動によって分離し、次いで臭化エチジウムで染色した。レーンの近くの矢印は、予想される１５１ｂｐのスプライスされたエキソン２ −３の産物と２６３ｂｐのスプライスされていないエキソン２−３の産物（レーン１〜５）、および２１７ｂｐのスプライスされたエキソン３−４の産物と３８７ｂｐのスプライスされていないエキソン３−４の産物（レーン６〜１０）の位置を示す。サイズマカー（Ｍ）は、ＨａｅＩＩＩで消化したφＸ１７４ＤＮＡである。上記に詳述した分析は、スプライスされたＲＮＡがセンス方向に転写されていき（図８のレーン２と７）、一方スプライスされていないＲＮＡはアンチセンス方向（図８のレーン３と８）に転写されて、ウイルス複製中に通常産生される転写産物を生成した（Stenberg 他の１９８４年と１９８５年の報告）。図２Ｃに示した結果と同様に、ランダムにプライムされた（random-primed）ＧＭ−ＰＲＮＡは、両タイプのＰＣＲ産物（レーン１と６）を生成したが、これは増殖感染を受けたヒト***線維芽（ＨＦ）細胞に検出されるスプライスされたパターン（図８のレーン５と１０）とは異なっている。これら結果は、ie1 領域由来のセンス転写産物もアンチセンス転写産物も、ＧＭ−Ｐ中に検出され、アンチセンス転写産物の方が優勢であることを示している。実施例８潜伏転写産物の構造 -- ３’および５’ＲＡＣＥＰＣＲ潜伏転写産物の構造を分析するため、５’-および３’-ＲＡＣＥ手続（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅手続）（Ohara 他の１９８９年の報告）を利用して、ＧＭ−Ｐ内に発現された転写産物の末端の地図作製をした。ＲＡＣＥ-ＰＣＲの実験は、前記の材料および方法の項で説明したようにして実施した。Ａ．潜伏転写産物の単離ＲＡＣＥ-ＰＣＲの実験の結果を図９に示す。センスＲＮＡ（レーン１、２および５）およびアンチセンスＲＮＡ（レーン３と４）由来のＲＡＣＥ産物が示されている。すなわち、レーン１はＮ１（配列番号：３３）とＴＥＰ２Ｄ（配列番号：１６）を用いて５’ＲＡＣＥ法で増幅したもの、レーン２はり１（配列番号：３３）とＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）を用いて３’ＲＡＣＥ法で増幅したもの、レーン３はＮ１（配列番号：３３）とＩＥＰ３Ｇ（配列番号：２３）を用いて５’ＲＡＣＥ法で増幅したもの、レーン４はＮ１（配列番号：３３）とＩＥＰ２Ｄ（配列番号：１６）を用い，３’-ＲＡＣＥ法で増幅したもの、レーン５はＮ１（配列番号：３３）とＩＥＰ１Ｄ（配列番号：７）を用いて５’ＲＡＣＥ法で増幅したものである。これらのＰＣＲ産物は、アガロースゲル（レーン１〜４に対しては１．２％、レーン５に対しては２．５％）電気泳動法で分離した。１ｋｂのラダー（GIBCO/BRL 社）およびＨａｅＩＩＩで消化したφＸ１７４ＤＮＡをサイズマカーとして使用し、そのうちのいくつかの位置は、各一組のレーンの左側にｂｐの番号を記入して示した。ＰＣＲを行った結果、センス転写産物の５’末端二つが、ＩＥＰ２Ｄ（配列番号：１６）プライマーのアニーリング部位の上流約６００ｂｐの位置に配置されており（図９のレーン１）、そしてプライマーＩＥＰ１Ｄ（配列番号：７）を用いての高分解能分析法（higher resolution analysis）により、これら二つの５ ’末端が約５０ｂｐ離れて位置していた（図９のレーン５）。大きさが１．０ｋｂｐ未満から約１．７ｋｂｐまでの範囲内のいくつものＰＣＲ産物が、プライマーのＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）とＮ１（配列番号：３３）を用いて、３’ＲＡＣＥに続いてＰＣＲを行うことによって、センス転写産物から生成され（図９のレーン２）、このことは、これらの転写産物の本体は相当に不均質であることを示唆している。類似の方法（上述のと）を用いて、アンチセンス転写産物の５’末端は、ＩＥＰ３Ｇ（配列番号：２３）のアニーリング部位の約１．１ｋｂｐ上流に位置特定され、そしてアンチセンス転写産物の３’末端は、ＩＥＰ２Ｄ（配列番号：１６）プライマーのアニーリング部位の約０．７ｋｂｐ下流に位置特定された。これら転写産物の５’末端の配列は、下記のようにして、Ｔ−Ａベクターの中へクローニングした後、決定した。Ｂ．潜伏転写産物のクローニングセンス転写産物の５’末端を同定するため、５’ＲＡＣＥの産物を、プライマーのＩＥＰ２Ｄ（配列番号：１６）とＮ１（配列番号：３３）を用いてＰＣＲに付し、その産物をｐＧＥＭ-Ｔベクターの中へクローン化した。ie1/ie2 プロモーター-エンハンサーのプローブを用いて、コロニー-ブロットハイブリッド形成を行わせ、増殖性感染中に利用された出発部位の上流に５’末端を有するクローンを単離した。配列決定は、「ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ」version ２．０（Amersham 社）と fmole DNA Sequencing System（Promega 社）を用いて行った。エキソン１／エキソン２のスプライスもまた、これらのクローン中に保持されていた。ＬＳＳ１の位置を正確に定めるため、５’ＲＡＣＥの産物を、プライマーとしてＩＥＰ１Ｄ（配列番号：７）とＲＬ−１（配列番号：３５）を用いて、かつＴａｑポリメラーゼを使用してＣサイクルパラメーターで４０サイクル行うＰＣＲに付し（材料および方法の項の「逆転写ＰＣＲ」）、次いでそのＰＣＲ産物１μｌを、４０ pmole のネストプライマーＩＥＰ１Ｄ（配列番号：７）とＮ１（配列番号：３３）を用い、かつ「ＧＥＮＥＡＭＰＸＬ」ＰＣＲキットを使用し、Ｄサイクルパラメーターで３０サイクル増幅を行った。三つの異なるドナー細胞の製剤から七つの独立したクローンを単離した。二つのクローン（ｐＯＮ２２１８とｐＯＮ２２１９）がその５’末端に同じ配列（配列番号：４８）を示し、ｐＯＮ２２２０がＰＳＳに対して−３５６の位置（ＬＳＳ１）に一つの追加のノンテンプレートＧ（nontemlate G）（配列番号：４９）を示した。三つのクローン（ｐＯＮ２２２２、ｐＯＮ２２２３、ｐＯＮ２２２４）は、ＰＳＳに対し −２９２の位置（ＬＳＳ２）でその５’末端に同じ配列（配列番号：５０）を示した。センス転写産物の３’末端を同定するため、３’ＲＡＣＥの産物をＮ１（配列番号：３３）とＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）のプライマーを用いて増幅し、そして四つのクローン（一つはエキソン４を示すクローンであり、三つはエキソン５由来の異なる大きさのクローンである）の配列を決定して、増殖性感染転写産物と同じポリアデニル化部位を利用していることが見出された（Stenberg 他の１９８４年、１９８５年および１９８９年の報告）。アンチセンス転写産物の５’末端を同定するため、５’ ＲＡＣＥ産物を、Ｎ１（配列番号：３３）とＩＥＰ４Ｃ（配列番号：２６）またはＩＥＰ３Ｇ（配列番号：２３）とによって増幅し、次いで産物をクローン化した。ｐＯＮ２３４７由来の ie1/ie2 を含有するα³²ＰｄＣＴＰランダムプライム標識化（random primed labeled）ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩフラグメントにハイブリッド形成している四つのクローンを、単離して配列決定した。これらクローンのうち二つ（ｐＯＮ２２２７とｐＯＮ２２２８）は、同じ末端（配列番号：５１）を示し、そして二つのクローン（ｐＯＮ２２２５とｐＯＮ２２２６）は、それより短かった（配列番号：５２と配列番号：５３でそれぞれ表される）。アンチセンス転写産物の３’未満を同定するため、３’ＲＡＣＥ産物を増幅し、そしてＩＥＰ２ＡＩＩ（配列番号：１５）とハイブリッドを形成させた４つのクローン（ｐＯＮ２２２９、ｐＯＮ２２３０、ｐＯＮ２２３１、ｐＯＮ２２３２）は、同じ３’配列（配列番号：５４）を示した。Ｃ．潜伏転写産物の配列分析センス産物およびアンチセンス産物由来の多数の５’ＲＡＣＥクローンをヌクレチド配列分析に付した。独立して単離された三つの最も長いセンスｃＤＮＡは、全て、潜伏出発部位１（ＬＳＳ１）が配列番号：３６であると同定され、ここに、その配列の第一ヌクレオチドのすぐ５’側の⁺¹は、受入れ番号Ｘ１７４０３で GenBank から入手できる、ＡＤ１６９ゲノム配列上のｎｔ１７３，２５９に相当している。他のクローンは、潜伏出発部位２（ＬＳＳ２）が配列番号：３７であると同定され、ここに、その配列の第一ヌクレオチドのすぐ５ ’側の⁺¹部分は、ＡＤ１６９上のｎｔ１７３，１９５に相当している。これらの５’末端は、増殖性感染出発部位（ＰＳＳ配列番号：５５、図１０Ａ、１０Ｃ、１１）の上流の、それぞれ３５６ｂｐおよび２９２ｂｐの位置に位置していた。３’ＲＡＣＥｃＤＮＡ構造体の配列を決定したことに基づいて、これら転写産物の３’末端は増殖性感染中に用いられるのと同じポリアデニル化部位に地図作製された（Stenberg 他の１９８４年と１９８５年の報告）。潜伏中における構造上の主な違いは、センス転写産物上には長いエキソン１が存在していることであった（図１０Ｃ〜１０Ｊ）。単離されたクローンは、いずれもＰＳＳで開始しなかった。アンチセンス転写産物の５’末端は、四つの最も長い独立のｃＤＮＡクローンを分析した結果、より一層不均一であり、そのうち二つは同じ配列（配列番号：３８）を有し、ここに、その配列の第一ヌクレオチドのすぐ５’側の⁺¹の部分は、ＡＤ１６９上のｎｔ１７１，２５６に相当し、他の二つはわずかに短かった（配列番号：３９と配列番号：４０）。アンチセンスｃＤＮＡの３’末端は、均一であり（配列番号：４１）、その３’近くのＴ（3’proxi mal T）は、ＡＤ１６９上のｎｔ１７３，３３１に相当している。実施例９潜伏転写産物の構造 -- 「ＧＥＮＥＡＭＰＸＬ」ＰＣＲ５’末端の配列に基づいて、転写産物の５’末端に対して特異的なプライマー（センス転写産物の場合は、ＬＥＰ１Ｅ配列番号：８またはＩＥＰ１Ｋ配列番号：１１、そしてアンチセンス転写産物の場合は、ＩＥＰ４Ｊ配列番号：２８）を、３’ＲＡＣＥアンカープライマーＲＬ−１（配列番号：３５）および「ＧＥＮＥＡＭＰＸＬ」増幅手続と組み合わせて用いて、潜伏転写産物の構造分析を完了した。１０⁶個の感染ＧＭ−Ｐ（感染後４週間、図１参照）からＲＮＡを単離し、次いで２０μｌの反応液中でプライマーＲＬ−１（配列番号：３５）と「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」ＲＴを用いてｃＤＮＡを合成し、その反応液から５μｌを別の２０μｌの反応液に入れて４０ pmoles のプライマーＩＥＰ１Ｅ（配列番号：８）とＮ２（配列番号：３４）（ＬＳＳ１の場合）、またはＩＥＰ１Ｋ（配列番号：１１）とＮ２（配列番号：３４）（ＬＳＳ２の場合）および「ＧＥＮＥＡＭＰＸＬ」を用い、Ｂサイクルパラメーターで増幅した（材料および方法の項参照）。この反応液１μｌを、同じ条件下で、プライマーのＩＥＰ１Ｇ（配列番号：９）とＮ１（配列番号：３３）を用いて、さらに２５サイクルのＰＣＲに付した。増幅された産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega Corp.社）の中へクローン化し、クローンは、³²Ｐで標識化したｐＯＮ２３４７、ＩＥＰ４ＡＰ（配列番号：２４）およびＩＥＰ５ＡＰ（配列番号：２９）のプローブとハイブリッド形成させることによって同定した。候補のクローンを、プライマーの組（セット）、すなわち、ＩＥＰ１ＭとＩＥＰ２Ｄ、ＩＥＰ２ＡＩＩとＩＥＰ３Ｄ、ＩＥＰ３ＣとＩＥＰ４ＢＩＩ、ＩＥＰ３ＣとＩＥＰ５Ｂ、ＩＥＰ４ＡＰとＩＥＰ４Ｈ、ＩＥＰ５ＡＰとＩＥＰ５Ｄ、およびＩＥＰ５ＡＰとＩＥＰ５Ｈを用いてのＰＣＲによって、さらに分析した。二つの異なるタイプのクローン（ｐＯＮ２２３５とｐＯＮ２２３６）が、２．１ｋｂおよび２．０ｋｂの ie1 領域のｃＤＮＡを表した（図１０Ｃと１０Ｄ）。それぞれ、２．４、２．３、１．６、１．５、１．３および１．２ｋｂの ie2 の種を表す六つの異なるタイプのクローン（ｐＯＮ２２３７〜ｐＯＮ２２４２）を配列分析によって特性解析を行い、それぞれ、図１０Ｅ〜１０Ｋに図解する構造を得た。これらのｃＤＮＡクローンを、エキソン特異的プライマーを用いるＰＣＲ分析および配列分析によって評価した。ＲＮＡのスプライシングとポリアデニル化のパターンは、大部分、増殖性感染中に利用されるパターンと類似していた。しかし、潜伏中は一つの追加のスプライスドナーとアクセプターが利用され、増殖性感染中には観察されない二つのスプライスされたエキソン５誘導体が生成した（図１０Ｇと１０Ｈ）。したがって、センス転写産物の発現は、ie1/ie2 エンハンサー領域内に位置する潜伏特異的プロモーターによって決まるようであり（Bosh art 他の１９８５年の報告、Thomsen 他の１９８４年の報告）、そしてこれの転写産物は、増殖感染中よりも一層複雑な分化スプライシングを受けた（Stenberg 他の１９８９年の報告）。ＬＳＳ１（配列番号：４２）とＬＳＳ２（配列番号：４３）は、それぞれ、推定ＴＡＴＡ要素の３４ｂｐ下流と３５ｂｐ下流に位置していた。アンチセンス転写産物は、スプライスされていなかったが、ie1 エキソン４を構成する領域内で開始され、そしてセンス転写産物の第一イントロンを構成する領域内で終結された（図１０Ｋ）。アンチセンス転写産物は、コンセンサスＴＡＴＡ要素を欠いていたが、アンチセンス転写産物の上流の領域は、ヒトのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子に見られるものと類似の潜在的イニシエーター配列（配列番号：４４）を有していた（Bhaumik 他の１９９４年の報告、Sorsher 他の１９９４年の報告）。センス転写産物およびアンチセンス転写産物のｃＤＮＡコピーをクローン化するのに使用される３’ＲＡＣＥ手続は、ポリアデノシンのテイル（尾部）の存在に依存している。スプライスされていない転写産物の大部分は、この修飾を欠いている（前記参照）が、ここでの分析の結果は、アンチセンス転写産物が、ポリアデニル化されていようといまいと、類似の内部構造を有していることを示唆した。潜伏感染出発部位から始まる転写産物は、５’ＲＡＣＥ法を用いてもＲＴ− ＰＣＲで特異的なプライマーを用いても、増殖性感染を受けたＨＦ細胞中には検出されなかった。実施例１０諸潜伏転写産物の構造の比較図１０Ａ〜１０Ｋは、潜伏転写産物の構造と予想読取り枠（predicted open r eading frame）（ＯＲＦ）の分析結果をまとめたものを図解している。図１０Ａと１０Ｂは、増殖性感染中に発現された ie1/ie2 領域由来の優勢なα転写産物の構造を示す（Stenberg 他の１９８４年、１９８５年、１９８９年の報告）。i e1 転写産物は、エキソン１、２、３および４で構成されているが、４９１個のアミノ酸（ａａ）のタンパク質をコードしている（白ボックス）。そして、このタンパク質は、８５個のアミノ末端アミノ酸（ａａ）を、エキソン１、２、３および５で構成されかつ５７９個のａａのタンパク質をコードしている優勢な ie2 転写産物およびより高度にスプライスされた転写産物からコードされている４２５個のアミノ酸（ａａ）からなる劣勢な ie2 タンパク質と、共有している。図１０Ｃ〜１０Ｋは、ｃＤＮＡクローンの配列分析によって決定された優勢なセンスＣＬＴおよびアンチセンスＣＬＴを示す。拡大部分（図１０Ｃ）は、増殖性感染転写出発部位（ＰＳＳ配列番号：４５、Stenberg 他の１９８４年と１９８５年の報告、Boshart 他の１９８５年の報告、Thomsen 他の１９８４年の報告）と、ＬＳＳ１およびＬＳＳ２を図解する。センスＣＬＴにとって新規な別のエキソン５スプライス領域の部位は、次のとおりであった。すなわち、1.6/1.5 kb: ⁵'CCACGCGTCCTTTCAG/GTGATTATT... TCGTCTTCCTCCTGCAG/TTCGGCTTC...AAGATT GACGAG/ GTGAGCCGCA...TTTCCCAAACAG/ GTCATGGTGCG³'（配列番号：４６）、1.3/ 1.2kb: CCACGCGTCCTTTCAAG/GTGATTATT...TTCCCAAACAG/GTCATGGTGCG（配列番号：４７）である。太い黒矢印は、転写産物を示し、ＧＭ−Ｐ中に検出されるエキソン１の５’延長部は、ハッチングをしたボックスで示し、そして白ボックスは、 Towne 株およびＡＤ１６９中に保有されているＯＲＦを示す。図１１は、ＬＳＳ１、ＬＳＳ２およびＰＳＳ転写出発部位の配列を、お互いの関係、および ie1/ie2 遺伝子座の地図との関係で示す。モジュレーター、ＮＦ１およびエンハンサーの各領域を示してある。実施例１１転写産物の構造のＰＣＲによる確認センス転写産物およびアンチセンス転写産物の構造を、５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ同定された転写産物およびエキソンの５’末端と３’末端に近いプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。代表的な結果を図１２に示す。図１２は、潜伏感染ＧＭ−Ｐから得たＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅した結果を示す。レーン１〜６に示す反応に使用した標的ｃＤＮＡは、感染してから４週間後の１０⁴個のＧＭ−Ｐから単離したＲＮＡから、ランダム六量体のプライマーと「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」（Gibco/BRL 社）を用いて製造した。レーン７に示す反応に使用した標的ｃＤＮＡは、感染してから４週間後の１０⁵のＧＭ−Ｐから単離したＲＮＡから、オリゴｄＴと「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」を使用して製造した。全てのｃＤＮＡ試料は、次いで、「ＧＥＮＥＡＭＰＸＬ」ＰＣＲキットを用い、Ｂサイクルパラメーターで４０サイクルのＰＣＲで増幅し（材料および方法の項）、同じ方法で増幅したウイルスＤＮＡの１０⁵のコピー（レーン８）と比較した。以下のプライマーの４０ｐｍｏｌをＰＣＲに使用した。すなわち、レーン１：ＩＥＰ１Ｅ（配列番号：８）とＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）、レーン２：ＩＥＰ１Ｅ（配列番号：８）とＩＥＰ５Ｂ（配列番号：３０）、レーン３：ＩＥＰ１Ｋ（配列番号：１１）とＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）、レーン４：ＩＥＰ１Ｋ（配列番号：１１）とＩＥＰ５Ｂ（配列番号：３０）、レーン５：ＩＥＰ４ＡＰ（配列番号：２４）とＩＥＰ４Ｈ（配列番号：２７）、レーン６：ＩＥＰ５ＡＰ（配列番号：２９）とＩＥＰ５Ｄ（配列番号：３１）、レーン７と８：ＩＥＰ１Ｑ（配列番号：１３）とＩＥＰ４Ｊ（配列番号：２８）である。ｃＤＮＡ分析の結果と一致して、ＬＳＳ１からエキソン４またはエキソン５までの領域およびエキソン４内の領域をカバーするセンス転写産物は、均一であった（図１２のレーン１〜５）。プライマーのＩＥＰ５ＡＰ（配列番号：２９）とＩＥＰ５Ｄ（配列番号：３１）の間の三つの予想されたＰＣＲ産物（１３００、５５０および２５０ｂｐ）によって、交互にスプライスされた形態のエキソン５（図１２のレーン６）が確認され、そして最も高度にスプライスされた形態のエキソン５が優勢であることが示唆された。アンチセンス転写産物は、均一でかつスプライスされていないことが確認された（図１２のレーン７と８）。実施例１２ＲＮアーゼ保護検定法センス転写産物とアンチセンス転写産物に転写出発部位が利用されていることを、ＲＮアーゼ保護分析法で確認した。ＲＮアーゼを保護するのに用いるプローブは、ヒトＣＭＶ（ＲＣ２５６）ＤＮＡ（Spaete と Mocarski の１９８７年の報告）から、ＩＥＰ１Ｈ（配列番号：１０）とＩＥＰ１Ｓ（配列番号：１４）またはＩＥＰ４Ｈ（配列番号：２７）とＩＥＰ４Ｃ（配列番号：２６）を用いて増幅したＰＣＲフラグメントを、ＴＡ- クローン化キット（Promega 社）を用いてｐＧＥＭ−Ｔベクター中にクローン化して調製し、それぞれｐＯＮ２２３３とｐＯＮ２２３４を得た。³²Ｐ標識化ＲＮＡ（ｐＯＮ２２３３からのセンス転写産物分析用の５７２ｎｔのプローブ１またはｐＯＮ２２３４からのアンチセンス転写産物分析用の６０３ｎｔのプローブ）を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと³²Ｐ−ＵＴＰ（Amersham 社）を用いて「ＭＡＸＩＳＣＲＩＰＴ」生体外転写キット（米国テキサス州オースチン所在の Ambion 社）を使用し製造した。ＲＮアーゼ保護検定法を、１０⁵ｃｐｍの生体外で合成したＲＮＡプローブ（上記）を使い、推奨されたプロトコルに従って、「ＲＰＡＩＩ」ＲＮアーゼ保護検定法キット（Ambion 社）を利用して行った。８Ｍ尿素／５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った（Sambrook 他の１９８９年の報告）後、放射能標識化した種を、Kodak ＸＡＲフィルム上で２日間露光するオートラジオグラフィーで検出した。試験結果を図１３に示す。ＲＮＡを、上記のようにして、１０⁶の感染ＧＭ− Ｐ（レーン２と５）または１０³の感染ＨＦ細胞（レーン３）から抽出した。レーンＭは５’末端標識化φＸ１７４ＤＮＡＨａｅＩＩＩで消化したもの、レーン１はプローブ１単独、レーン２は感染ＧＭ−Ｐ（感染４週間後）由来のＲＮＡをプローブ１とハイブリッドを形成させ次いでＲＮアーゼで消化したもの、レーン３は感染ＨＦ（感染２時間後）由来のＲＮＡをプローブ１とハイブリッドを形成させ次いでＲＮアーゼで消化したもの、レーン４はプローブ２単独、レーン５は感染ＧＭ−Ｐ由来のＲＮＡをプローブ２とハイブリッドを形成させ次いでＲＮアーゼで消化したものである。センス転写産物（プローブ１、５７２ｎｔ）の５’末端を検出するように設計された反応液中で、４７０ｎｔと４２０ｎｔの保護された種を観察した（図１３のレーン２）。なお、長い方の（ＬＳＳ１）転写産物が優勢であった。プローブ２（６０３ｎｔ）を用いたアンチセンス転写産物のＲＮアーゼ検定では、２２０ｎｔの種を保護しており（図１３のレーン５）、これは、先に詳細に述べた５’ ＲＡＣＥ地図作製実験と一致している。予想どおりに、１２０ｎｔの保護された種は、増殖性感染を受けた細胞由来のＲＮＡを用いて検出された（図１３のレーン３）。ＰＳＳから出発する転写産物は、潜伏感染ＧＭ−Ｐ中には検出されず、また、ＬＳＳ１やＬＳＳ２から出発する転写産物は、増殖性感染を受けたＨＦ細胞中に観察されなかった。これらのデータから、センス転写産物上の転写出発部位としてＬＳＳ１とＬＳＳ２を用いることと、アンチセンス転写産物が存在することは、潜伏に特異的なことのようである。実施例１３健康なドナーの骨髄中のＣＬＴの検出スタンフォード大学病院（米国カリフォルニア州スタンフォード所在）の健康な成人ドナー由来の骨髄（ＢＭ）を、ＣＬＴの存在の有無について試験した。センスＣＬＴとアンチセンスＣＬＴの発現を、ネストプライマーセット（nested p rimer sets）を用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅法で、１５名の成人ＢＭドナーにおいて試験した。なお、これらドナーのＣＭＶの血清反応状態は、転写産物を分析した時点では未知であった。３ｍｌのＢＭから造血細胞を「ＬＹＭＰＨＯＰＲＥＰ」（Gibco/BRL 社）による密度沈降法で単離し（約３×１０⁷個の細胞）、続いてグアニジンイソチオシアネートで溶解してＣｓＣｌクッションを通して沈降させてＲＮＡを単離し（Ch irgwin 他の１９７９年の報告）、そして懸濁させた後、先に述べたようにＲＮアーゼを含有しないＲＱ１ＤＮアーゼで処理した。ＲＮＡを、「ＲＮＥＡＳＹ」全ＲＮＡキット（米国カリフォルニア州チャッツワース所在の Qiagen 社）上で、メーカーのプロトコルに従って、さらに精製した。精製されたＲＮＡを三つの試験管に分割し、そしてメーカーのプロトコルを利用して「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」とともに、センスＣＬＴとＵＬ１１２／１１３に対してはランダム六量体プライマーを用い、またはアンチセンスＣＬＴに対してはプライマーＩＥＰ２Ｅ（配列番号：１７）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。センスＣＬＴ（スプライスされている）の場合、ネスト増幅（nested amplification）を、最初にプライマーのＩＥＰ１Ｋ（配列番号：１１）とＩＥＰ３Ｄ（配列番号：２１）を用いて３０サイクル行い、次いでプライマーのＩＥＰ１Ｇ（配列番号：９）とＩＥＰ２Ｄ（配列番号：１６）（２０６ｂｐの予想産物）を用いて３０サイクル実施した。なお、サイクルパラメーターは、Ｂサイクルパラメーターであった。アンチセンスＣＬＴ（スプライスされていない）の場合、ネスト増幅を、最初にプライマーのＩＥ２ＡＩＩ（配列番号：１５）とＩＥＰ４Ｊ（配列番号：２８）を用いて３０サイクル行い、次いでプライマーのＩＥＰ３Ｃ（配列番号：２０）とＩＥＰ４ＢＩＩ（配列番号：２５）（３８７ｂｐの予想産物）を用い３０サイクル実施した。なお、サイクルパラメーターは、Ｂサイクルパラメーターであった。スプライスされたＵＬ１１２／１１３転写産物の場合、非対称のネスト増幅を、最初にプライマーの１１２Ａ（配列番号：１）と１１３Ｂ（配列番号：２）（４）を用いて３０サイクル行い（２２８ｂｐの予想産物）、次いでプライマーの１１３Ｄ（配列番号：３）と１１２Ａ（配列番号：１）（４）を用い３０サイクル行った（１５０ｂｐの予想産物）。なお、サイクルパラメーターは、Ａサイクルパラメーターであった。ＲＴ−ＰＣＲの産物を２．５％アガロースゲルの電気泳動法で分離し、次いで試料を、臭化エチジウムで染色する（図１４Ａ、１５Ａおよび１６Ａ）か、または「ＨＹＢＲＩＤＯＮ−Ｎ⁺」膜に移した後、γ³²Ｐ −ＡＴＰ（Amersham 社）で末端を標識化したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッドを形成させることによって、可視化した。使用したプローブは、ＩＥＰ１Ｍ（配列番号：１２、図１４Ｂ）、ＩＥＰ４ＡＰ（配列番号：２４、図１５Ｂ）、または³²ＰｄＣＴＰ（Amersham 社）ランダムプライム標識化ＵＬ１１２／１１３プローブ（図１６Ｂ）であった。レーンＭは、ＨａｅＩＩＩで消化した φＸ１７４ＤＮＡである。図１４Ａ、１４Ｂ、１５Ａ、１５Ｂ、１６Ａおよび１６Ｂ内のレーン１〜１５は、ドナー由来の試料を表し、スタンフォード患者番号（ＳＰＮ）は、それぞれ、８４１、８５４、８５８、８６５、８７２、８７８、９００、９０４、９０７、９３５、９３６、９７２、９９１、９５７および９８７である。図１６Ａと１６ＢのレーンＰは、ＣＭＶについて血清反応陰性のドナー由来の１０⁷個のＢＭ細胞から得たＲＮＡと混合した一つの感染ＨＦ細胞（感染８時間後）から単離したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。センス転写産物は、潜伏特異的プライマー（ＩＥＰ１Ｋ（配列番号：１１）とＩＥＰ３Ｄ（配列番号：２１）、続いてＩＥＰ１Ｇ（配列番号：９）とＩＥＰ２Ｄ（配列番号：１６）を使用）を用いてランダムプライムｃＤＮＡ（ランダムにプライムされているｃＤＮＡ）から増幅して、１５名のドナーのうちの５名に検出された（図１４Ａと１４Ｂ）。アンチセンスＣＬＴは、まず、ＩＥＰ２Ｅ（配列番号：１７）を用いて合成したｃＤＮＡから増幅し、次いで一塊のプライマー（一組のネストプライマーセット、a nested primer set）（ＩＥＰ２ＡＩＩ配列番号：１５とＩＥＰ４Ｊ配列番号：２８、続いてＩＥＰ３Ｃ配列番号：２０とＩＥＰ４ＢＩＩ配列番号：２５を使用）を使用して、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ反応産物は、１５名のドナー中２名に検出できた（図１５Ａと１５Ｂ）。これら試験結果のまとめを下の表４に示す。ドナーの血清反応状態を調べたところ、７名がＣＭＶについて血清反応陽性であることが見出された。そして、これら７名中、２名にセンス転写産物とアンチセンス転写産物が検出され、３名にセンス転写産物だけが検出された（表４）。これらの転写産物は、血清反応陽性のドナーにしか検出されず、６名の血清反応陰性のドナーの誰にも検出されなかった。アンチセンスＣＬＴは、実験のＧＭ− Ｐ潜伏感染では優勢であったが、センスＣＬＴは、骨髄の自然潜伏感染において優勢のようである。これらのドナーが増殖感染を受けているのではなくて潜伏感染を受けていることを確認するため、初期遺伝子の発現（ＵＬ１１２／１１３）およびＨＦ細胞との共生培養を実施した。ＵＬ１１２／１１３の発現は、いずれのドナーにも検出されず（図１６Ａと１６Ｂ）、そしてウイルスは、ＨＦ細胞と１か月を超えて共生培養しても回復しなかった。また、五つのセンスＣＬＴ陽性の試料を、二つの他のＣＭＶの遺伝子転写産物（ＵＬ３６とＴＲＳ１）について、ネストプライマーセットを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析を行ったところ、陰性であることが分かった。この患者グループの２名の宿主（９３６と９８７）は、気管支洗浄検査によってウイルスが単離されたので、ガンシクロビルによる予防治療が必要であったが、血清反応陽性または陰性のドナー検体の宿主のだれもＣＭＶ疾患で死亡しなかった。実施例１４抗ＣＭＶ潜伏関連タンパク質抗体の製造Ａ．潜伏関連ポリペプチドの発現選択された潜伏関連ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメント（例えば、配列番号：６２または配列番号：６６）を、ｐＧＥＸ発現ベクター（Smith の１９８５年と１９８８年の報告）、例えばｐＧＥＸ−ＫＧ（Guan および Dixon の１９９１年の報告）、の中に導入する。プラスミドｐＧＥＸ−ＫＧは、９個のアミノ酸からなるグリシンリッチのリンカーをコードするEcoＲＩフラグメント（Guan と Dixon の１９９１年の報告）を組みこむことによって、ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミド（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在の Pharmacia Biotech 社）から誘導したものである。ｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドは、遺伝子または遺伝子フラグメントとシストソマ・ジャポニカム（Schistosoma japonicum）またはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（Ｓｊ２６またはＧＳＴ、Smith 他の１９８５年の報告）との融合体として、誘導可能な高レベルの細胞内発現を行わせるために設計された。このプラスミドは、化学的に誘導可能な発現を行うためのｔａｃプロモーター、ＧＳＴ遺伝子、トロンビンプロテアーゼ認識部位、多クローン化部位、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＢＲ３２２ｏｒｉ、および内部ｌａｃＩｑ遺伝子を含有している。潜伏関連ポリペプチドのコーディング配列を含有する上記生成ベクターを用いて、ＸＬ−１ Blue 大腸菌（米国カリフォルニア州ラホーヤ所在の Stratagene 社）を形質転換する。上記タンパク質の配列を有する細菌クローンを選択して、１リットルの液体培養物中で、激しく攪拌しながら３７℃で約４時間増殖させる。１００ｍＭイソプロピル-１-チオ-β-D-ガラクトシド（ＩＰＴＧ）の１ｍｌを添加して、タンパク質の発現を誘導し、次にその培養物をさらに約２時間インキュベートする。その細胞をペレット化し、次に１０ｍｌの氷冷リン酸緩衝食塩水中に再懸濁させ、半透明になるまで溶解し、短時間遠心分離にかけて細胞の断片をペレット化し、次いで上澄み液を新しい試験管に移す。予め膨潤させたグルタチオンアガロースビーズの５０％（Ｖ／Ｖ）スラリーの５ｍｌを上記上澄み液に添加し、室温で約１時間ゆるやかに混合して、前記上澄み液中の融合タンパク質を該ビーズに結合させる。そのビーズを３回洗浄して、未結合のタンパク質を除去する。上記の各洗浄は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍｌを添加し、混合し、卓上型遠心分離器を用いて最高回転速度（２０００ ×ｇ）で約５分間遠心分離にかけて、ビーズを集めることからなる洗浄である。融合タンパク質自体は、ビーズから溶離させることができる。あるいは、融合タンパク質の潜伏関連ポリペプチド部分は、トロンビン開裂プロトコル（Ausube l 他の１９８８年の報告）を用いて、溶離させることができる。その開裂プロトコルでは、１０〜２０ｍｌのビーズスラリーを１０ｍｌの開裂緩衝液（Cleavage Buffer）と混合し、２５℃で約１時間インキュベートする。次に、フェニルメチルスルホニルフルオリド（最終濃度０．６ｍＭ）をタンパク質溶出液に添加し、その試料を、「ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ」濃縮器（米国マサチューセッツ州ビバリー所在の Amicon Inc.社）を用いて、０．５ｍｌまで濃縮する。そのタンパク質をゲル濾過法でさらに精製する。タンパク質の濃度は、ウシ血清アルブミンを規準として用いて、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲルの電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した後、タンパク質のバンドをクーマシーブルーで染色することによって評価する。Ｂ．潜伏関連ポリペプチドに対する抗体精製された融合タンパク質は、フロインドアジュバントと混合してウサギの皮下に注射した。約１ｍｇの融合タンパク質を０日目と２１日目に注射し、ウサギの血清を４２日目と５６日目に収集する。下記の細菌培養物からミニライゼート（minilysate）を製造する。（１）ｐＧＥＸを感染させた細菌細胞、（２）潜伏関連ポリペプチド挿入体を含有するｐＧＥＸを感染させた細菌細胞、および（３）潜伏関連ポリペプチド挿入体を含有するλｇｔ１１を感染させた細菌細胞。これらミニライゼートとβガラクトシダーゼタンパク質の対照を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、次いでそのバンドをニトロセルロースフィルターに移して、ウエスタンブロット法を行う（Ausu bel 他の１９８８年の報告）。期待される結果をまとめると、次のとおりである。対照（Ｓｊ２６）ウサギ由来の血清は、Ｓｊ２６およびＳｊ２６融合タンパク質抗原の各々と免疫反応性である。Ｓｊ２６融合タンパク質で免疫化された動物由来の血清は、全てのＳｊ２６抗原、およびλｇｔ１１由来のβガラクトシダーゼ融合タンパク質と反応性である。このことは、潜伏関連ポリペプチド抗原との特異的免疫反応性があることを示している。これら血清は、どれもβガラクトシダーゼ（市販ソースから入手）と免疫反応性でない。潜伏関連ポリペプチド融合タンパク質で免疫化した動物由来の血清中に存在する抗潜伏関連ポリペプチド抗体は、アフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。実施例１５ＧＳＴ融合タンパク質およびイムノブロット分析法を用いて行う健康なＣＭＶ陽性個体中の潜伏ＣＭＶ転写産物に対する抗体の検出ＣＬＴに対する抗体が健康な血清反応陽性の個体の血清中に存在している程度を、イムノブロット分析法を用いて評価した。ＯＲＦ９４センスとＯＲＦ１５２アンチセンスの全体を、ＯＲＦ１５４のａａ６〜１２０と同じく、ｐＧＥＸ発現システムを用いて、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）とのカルボキシル末端融合タンパク質として、大腸菌中にクローン化した（Smith と Johnson の１９８８年の報告）。加えて、ＩＥ１_491aaタンパク質の二つのオーバラップしているフラグメント（ａａ１３２〜２７４とａａ２３２〜４００）も、ＧＳＴ融合タンパク質として発現された。これら発現されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンアガロースビーズでアフィニティー精製を行ったところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって純度が９０％を超えることが分かった。これら融合タンパク質のヒト血清との免疫反応性を試験するため、アフィニティー精製を行ったタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、イムノブロット分析法に付した。全細胞ＲＮＡを、Chirgwin 他の１９７９年の報告の方法を用いて、ＣＭＶ（ＡＤ１６９）に感染したＨＦ細胞から単離した。「ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ」含有の反応液２０μｌ中で、プライマーＨＩＥ４Ａ（配列番号：７６）を用い、上記ＲＮＡの１μｇからｃＤＮＡを合成した。ＥサイクルパラメーターおよびプライマーＨＩＥ４Ａ（配列番号：７６）とＨＩＥ１Ａ（配列番号：７７）によるＣＤＮＡ鋳型の５μｌを用いて、ＰＣＲ増幅を行った。４５８ｂｐの EcoＲＶ-SacＩＩフラグメントのＰＣＲ産物を、EcoＲＶ／SacＩＩで消化した「ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」（ＫＳ＋）中にクローン化して、ｐＯＮ２５００と命名した。ｐＯＮ２５００由来の４７０ｂｐの ClaＩ-SacＩＩフラグメントおよびｐＯＮ３０８Ｇ（Cherrington と Mocarski の１９８９年の報告）由来の６５６ｂｐの SacＩＩ-SpeＩフラグメントを、SpeＩ／ClaＩで消化した「ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」（ＫＳ＋）中に連結して、ｐＯＮ２５０１と命名した。ＧＳＴ融合タンパク質（Smith と Johnson の１９８８年の報告）を、以下のフラグメント（クレノウポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼで断端平滑化を行った後）を適当な SmaＩ消化のｐＧＥＸベクター中にクローン化することによって構築した。すなわち、ＯＲＦ９４_1-94＝ｐＯＮ２５０１由来の３３６ｂｐの H incＩＩフラグメントをｐＧＥＸ−２Ｔにクローン化したもの、ＯＲＦ１５４_6-1 ₂₀ ＝ｐＯＮ３０８Ｇ由来の３５１ｂｐのAccＩ−ApaＩフラグメントをｐＧＥＸ− ３Ｘ中にクローン化したもの、ＯＲＦ１５２_1-152＝ｐＯＮ３０８Ｇ由来の７６４ｂｐのNcoＩ−SphＩフラグメントをｐＧＥＸ−２Ｔ中にクローン化したもの、ＩＥ１_132-274＝ｐＯＮ３０８Ｇ由来の４２９ｂｐのEcoＲＶフラグメントをｐＧＥＸ−３Ｘ中にクローン化したもの、およびＩＥ１_232-400＝ｐＯＮ３０８Ｇ由来の４４４ｂｐのNcoＩとEarＩのフラグメントをｐＧＥＸ−２Ｔにクローン化したものである。得られたベクターは、それぞれｐＯＮ２５０３〜ｐＯＮ２５０７と命名した。ｐＧＥＸ−２ＴとｐＧＥＸ−３Ｘのベクターは、Pharmacia Biotec h 社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）から入手した。クローンは、全て、プライマーＳＥＱＰＲＩＭ（配列番号：７８）を用い、ｆｍｏｌＤＮＡ Sequencing System を利用して、配列を決定した。組換えＧＳＴ融合タンパク質を、メーカーの指示（Pharmacia Bi otech 社）にしたがって、大腸菌ＤＨ５α細胞中に産生させ（Smith と Johnson の１９８８年の報告）、グルタチオンアガロースビーズ（Pharmacia Biotech 社）でアフィニティー精製を行った。特に断らない限り、これら融合タンパク質は、還元されたグルタチオンでビーズから溶離された（Fragioni と Neel の１９９３年の報告）。前記ビーズをＰＢＳ、１％ＳＤＳ中で５分間煮沸することによって、ＧＳＴ−ＯＲＦ９４融合タンパク質を溶出させ、さらに、電気泳動によって得たゲルから溶出させ精製した（Sambrook 他の１９８９年の報告）。次いで、これら精製融合タンパク質をＰＢＳに対して透析し、そしてブラッドフォード検定法（米国カリフォルニア州所在の Bio-Rad Laboratories 社）で定量した。これら融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを使って分離し、先に述べたようにブロットし、次に健康なＣＭＶ陽性個体およびＣＭＶ陰性の対照由来の血清試料でプローブした。ＣＭＶ感染ＨＦから調製した細胞溶解物とＩＥ１_491aa融合タンパク質を正の対照として含め、一方、模擬感染（mock-infected）ＨＦから調製した細胞溶解物およびＧＳＴ単独を負の対照として利用した。代表的なイムノブロットデータを図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄに示す。分析した融合タンパク質は、各レーンの上に示してある。ＣＭＶ陽性の血清試料（図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃ）およびＣＭＶ陰性の血清試料（対照、図１８Ｄ）（５０μｌ）を、４℃で一夜、１ｍｌの大腸菌細胞溶解液に吸着させ、次にマイクロ遠心分離器を用いて、室温にて５〜１０分間、約１２，０００×ｇの遠心分離にかけて透明にした。前記ブロットを、５％の脱脂乳を含有するＰＢＳとともに１時間インキュベートし、次いで、予め吸着させた前記血清を４％の脱脂乳含有ＰＢＳで１／１００に希釈したものとともに２３℃で２時間インキュベートした。これらブロットをＰＢＳで３回洗浄した後、５％の脱脂乳を含有するＰＢＳで１／２０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（米国カリフォルニア州所在の V ector laboratories 社）とともにインキュベートした。ＰＢＳでさらに３回洗浄してから、これらブロットを、メーカーのプロトコルに従って、ＥＣＬ Syste m（Amersham 社）を用いて、増殖させた。合計２７個の血清試料を同様にして分析した。１５個の血清反応陽性の試料の試験結果を下の表５にまとめた。ＥＬＩＳＡ陽性の血清は全てＣＭＶ感染細胞溶解物と反応した。ＣＭＶ陽性試料の内、２７％（４／１５）と４７％（７／１５）は、ＩＥ１_132ー274およびＩＥ１_232ー400の融合タンパク質と反応性であり、４７％（７／１５）はＯＲＦ９４融合タンパク質と反応性で、２０％（３／１５）は弱いがＯＲＦ１５２融合タンパク質と反応性であった。どの試料も、ＯＲＦ１５４融合タンパク質ともＧＳＴ単独とも反応性ではなかった。ＥＬＩＳＡ陰性の血液は、ＣＭＶ感染細胞溶解物ともいずれのＧＳＴ融合タンパク質とも反応しなかった。これらの試験結果は、いくつかのＣＬＴ（例えば、ＯＲＦ９４）に対する抗体が、かなりの比率の個体由来の血清中に存在し、一方、他のＣＬＴ、例えばＯＲＦ１５２、に対する抗体は、あまり蔓延していないことを示している。合わせて見ると、上記の結果は、ＣＬＴおよびＣＬＴがコードするタンパク質が、自然感染した個体中に発現されていることを強く裏付けている。この発明を、特定の方法と実施態様で説明してきたが、この発明から逸脱することなく、種々の変形と変更を行うことができると解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｄ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 ＤＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＤＮＡ配列がコードし、かつ（ｉｉ）潜伏感染中に特異的に産生される精製ポリペプチド。２．請求の範囲１に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、５’からＣＭＶＰＳＳ ie1/ie2 転写出発部位までの約５００ｂｐのＣＭＶゲノム領域由来の配列でコードされているアミノ酸配列を含有していることを特徴とするもの。３．請求の範囲１または２に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、ＣＭＶ ie1/ie2 転写産物のコーディングストランドに対して相補的なストランドから転写されるＲＮＡによってコードされ、そのＲＮＡが ie1/ie2 遺伝子のイントロン２と３にオーバーラップしていることを特徴とするもの。４．請求の範囲３に記載のポリペプチドであって、前記ＲＮＡが配列番号：５７で表されるＤＮＡ配列に相当することを特徴とするもの。請求の範囲３記載のポリペプチド。５．請求の範囲３に記載のポリペプチドであって、そのポリペプチドが、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１および配列番号：７３からなる群から選択されることを特徴とするもの。６．請求の範囲１または２に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、５’からＰＳＳＣＭＶ ie1/ie2 転写出発部までの約５００塩基対のＣＭＶゲノム領域内に転写出発部位が位置しているＲＮＡによってコードされていることを特徴とするもの。７．請求の範囲６に記載のポリペプチドであって、転写出発部位が ie1/ie2 エンハンサー領域内に含まれていることを特徴とするもの。８．請求の範囲６に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、転写出発部位が配列番号：３６または配列番号：３７であるＲＮＡによってコードされていることを特徴とするもの。９．請求の範囲６に記載のポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号：５９、配列番号：６１および配列番号：６３からなる群から選択されることを特徴とするもの。１０．請求の範囲１記載のポリペプチドに免疫反応性である抗体を含有する試料を、当該ポリペプチドと接触させることと、前記抗体の前記ポリペプチドへの結合を検出し、その検出により試料中にＣＭＶが存在することを示すことを含んでなる試料中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を検出する方法。１１．請求項１０に記載の方法であって、前記試料がヒトの血清または血漿の試料であることを特徴とする方法。１２．（ｉ）ＣＭＶＤＮＡ配列によってコードされ、かつ（ｉｉ）潜伏感染中に特異的に産生されるポリペプチドを含有する試料を、前記ポリペプチドに免疫反応性である抗体と接触させることと、前記抗体の前記ポリペプチドへの結合を検出し、その検出により試料中にＣＭＶが存在することを示すことを含んでなる試料中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を検出する方法。１３．請求項１２に記載の方法であって、前記接触が、さらに、試料をゲル上に分画すること、その分画された試料を膜に移すこと、そしてその膜を抗体に曝露することを含んでおり、そして前記検出が、さらに、前記抗体の前記ポリペプチドへの結合を膜上に検出することを含んでいることを特徴とする方法。１４．請求項１２または１３に記載の方法であって、前記抗体が固体支持体に付けられており、そして前記検出が、前記ポリペプチドに特異的に免疫反応性である第二のリポーター抗体を添加することによって達成されることを特徴とする方法。１５．請求項１２〜１４のいずれかに記載の方法であって、前記抗体が固体支持体に付けられており、そして前記検出が、さらに、ポリペプチドの存在について抗体を検査し、その検査は、上記固体支持体をポリペプチドリポーター複合体と反応させることを含み、その場合ポリペプチドがポリペプチドリポーター複合体の抗体への結合と競合するステップと、前期固体支持体に結合したポリペプチドリポーター複合体を検出するステップとを含んでなることを特徴とする方法。１６．請求項１２〜１５のいずれかに記載の方法であって、前記試料がヒトの組織の試料であることを特徴とする方法。１７．請求項１６に記載の方法であって、前記試料が骨髄の試料であることを特徴とする方法。１８．請求項１６に記載の方法であって、前記組織の試料が造血幹細胞を含むことを特徴とする方法。１９．請求項１６に記載の方法であって、前記組織の試料が血液の試料であることを特徴とする方法。２０．（ｉ）ＣＭＶ配列によってコードされ、かつ（ｉｉ）潜伏感染中に特異的に産生されるポリペプチドに特異的に免疫反応性である抗体。２１．請求項２０に記載の抗体であって、前記抗体がモノクローナルであることを特徴とするもの。２２．請求項２０または２１に記載の抗体であって、前記抗体がポリクローナルであることを特徴とするもの。２３．試料中のＲＮＡからｃＤＮＡを生成させるステップと、前記ｃＤＮＡを、二つのプライマーからなる一組のプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応によって増幅し、その場合、前記プライマーは、潜伏感染中に特異的に産生されるＲＮＡ中に含まれている選択されたＣＭＶ領域を定義しているステップと、潜伏感染中に特異的に産生されるＲＮＡに対応する増幅産物の存在を同定するステップとを含んでなるＲＮＡを含有する試料の潜伏サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染を検出する方法。２４．請求項２３に記載の方法であって、前期一組のプライマーのうち少なくとも一つのプライマーが、５’からＣＭＶＰＳＳ ie1/ie2 転写発生部位までの間に位置するＣＭＶ配列から選択されることを特徴とする方法。２５．請求項２３または２４に記載の方法であって、前期一組のプライマーのうち少なくとも一つのプライマーが、ＣＭＶ ie1/ie2 転写産物のコーディング配列に対し相補的であり、前記増幅産物が、ie1/ie2 遺伝子のイントロン２と３にオーバーラップしていることを特徴とする方法。